JP6306189B2 - プロテインa系親和性クロマトグラフィーカラムを洗浄する方法 - Google Patents
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Description
本明細書で使用する場合、「SpA」、「プロテインA」または「スタフィロコッカス アウレウスプロテインA」は、細菌であるスタフィロコッカス アウレウスから単離された、42kDaのマルチドメインタンパク質を意味する。SpAは、このカルボキシ末端細胞壁結合領域を介して、細菌の細胞壁に結合している。この領域は、Xドメインと呼ばれる。アミノ末端領域には、SpAは、5つの免疫グロブリン結合ドメインを含む。このドメインは、E、D、A、BおよびCと呼ばれる(Sjodhal,Eur J Biochem.Sep 78(2):471−90(1977);Uhlen et al.,J Biol Chem.Feb 259(3):1695−702(1984))。これらの各ドメインは、約58個のアミノ酸残基を含み、これらは、65から90%のアミノ酸配列同一性を共有する。
プロテインAクロマトグラフィーは、Fc含有タンパク質、例えば、免疫グロブリンまたは抗体等の精製に最も一般的に使用されている親和性クロマトグラフィーの形式である。一般的には、ターゲットタンパク質(例えば、免疫グロブリンまたは別のFc含有タンパク質)は、適切な細胞培養物中で発現され、細胞培養物フィードが浄化に供され、その後、例えば、クロマトグラフィーカラムに充填されたプロテインAクロマトグラフィー媒体上に浄化されたフィードを充填する。
本発明に基づく方法は、プロテインAのCドメインに基づくプロテインAリガンドを使用する。一部の実施形態では、本明細書に記載された方法に使用されるリガンドは、配列番号1に説明されたアミノ酸配列に対して、少なくとも80%または少なくとも85%または少なくとも90%または少なくとも95%またはそれ以上同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載された方法に使用されるプロテインAリガンドは、配列番号3に説明されたアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書に記載された方法に使用されるプロテインAリガンドは、配列番号4に説明されたアミノ酸配列を含む。Fc含有タンパク質に結合する、これらの配列の変異体、フラグメントおよび誘導体も、本発明に包含される。
一部の実施形態では、本明細書に記載された方法に使用されるプロテインAリガンドは、支持体、例えば、固体支持体または可溶性支持体に固定化されて、生体分子、例えば、免疫グロブリンおよび他のFc含有タンパク質等の分離に適した、親和性クロマトグラフィー媒体または樹脂を生成する。
クロマトグラフィーカラムの洗浄は、カラム性能を維持し、カラムの寿命を延ばすのに、各サイクル後に一般的に使用される実務である。通常、各ランが完了した後、洗浄液が、カラムに15から30分間充填され、続けて、再平衡化バッファーまたは(カラムが保存準備されている場合)衛生化バッファーが充填される。一般的な洗浄液は、0.05から0.3M NaOHまたは0.15M H3PO4である。洗浄中の流速は、典型的には、使用される具体的な樹脂およびクロマトグラフィーシステムに基づいて決定される。NaOHが、生物薬学産業において一般的に使用される洗浄液であるが、酸性溶液、例えば、0.15M H3PO4も、汚染を効果的に除去することができ、特定の例において使用される。
SpAリガンドの生成
配列番号3および配列番号4に説明されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする合成遺伝子が、DNA2.0(Menlo Park,CA)から取得される。各合成遺伝子の5’端は、開始メチオニンについてのコドンを含む。各遺伝子の5’および3’端はそれぞれ、NdeIおよびBamHI制限部位を含む。これらの合成遺伝子および使用される発現ベクター、即ち、pET11a(EMD Millipore Corporation,Billerica,MA)を、NdeIおよびBamHI(NEW ENGLAND BIOLABS,Ipswich,MA)により消化し、DNAフラグメントを、0.7% アガロースTAEゲル上で分離し、適切なDNAフラグメントを、QIAGEN(Valencia,CA)からのゲル抽出キットを使用して、切除および精製する。精製したインサートを、pET11aまたは任意の他の適切な発現ベクターの骨格内に、T4 DNAリガーゼ(NEW ENGLAND BIOLABS,Ipswich,MA)を使用してライゲートする。
SpA系リガンドの発現および精製
任意の適切な微生物発現系が、本明細書に記載された種々のSpAリガンドを発現させるのに使用され得る。例えば、このタンパク質は、pETベクター、例えば、pET11a(EMD)を使用して、大腸菌株、例えば、BL21(DE3)株(PROMEGA,Madison WI)中で発現されてもよい。
SpA系リガンドの固体支持体への付着
実施例1および2に記載されたように、種々のリガンドの生成および発現後に、リガンドを、多点付着により、固体支持体に固定する。
酸性溶液およびアルカリ性溶液への樹脂A、BおよびCの長期暴露
この実験において、上記した樹脂A、BおよびCをそれぞれ、種々の酸性溶液およびアルカリ性溶液に暴露する。下記溶液:HCl(0.3%、v/v)、pH1.5;H3PO4(0.15M)、pH1.5;0.1M NaOHおよび0.5M NaOHが調製される。
長期のアルカリおよび酸暴露前後での、樹脂A、BおよびCの静的結合能評価
この実験では、(1mL容量における)樹脂A、BおよびCそれぞれを、コントロールサンプルと共に、0.3% HCl;0.15M H3PO4;0.1M NaOH;または0.5M NaOHに暴露し、150mM NaClを含む20% エタノールの保存バッファー中に保存し、Milli−Q(R)水(EMD Millipore Corporation,Billerica,MA)中で、10%スラリーに調製する。1mLの各樹脂スラリーを、10mM リン酸緩衝生理食塩水中において、15mLのポリクローナルIgG(SERACARE、1mg/mL)に添加し、室温で4時間穏やかに混合する。280nmにおけるUV吸光の低下を、酸またはアルカリ暴露前後における、樹脂IgG結合能を算出するのに使用する。保持されたIgG結合能の割合を、酸またはアルカリ暴露後のIgG結合能を、酸またはアルカリ条件に暴露されていないコントロールサンプルの同結合能で割ることにより算出する。
長期の酸暴露前後での樹脂Bの動的結合能評価
この実験では、市販のポリクローナルIgGを使用して樹脂の動的能力を試験するための標準的な方法を使用する。簡潔に、本発明に基づく樹脂Bを、50mM Tris w、25mM NaCl、5mM ETDA、pH7.2(EQバッファー)中のOmnifitカラム(6.6mm×50mm)内に充填する。流速を、100cm/時間に設定する。充填したカラムを、10カラム容量(CV)のEQバッファーで平衡化する。UV280nmが、最初のIgG濃度の50%超に達するまで、ポリクローナルIgG(Seracare、EQバッファーにおける2mg/mL、pH7.2)を、カラム上に充填する。平衡化バッファーによる洗浄後、IgGを、0.1M酢酸、pH3.0で溶出する。最初のランのEQバッファーを使用するカラム平衡化後に、樹脂を、0.15M H3PO4を使用して、流速50cm/時間で25時間洗浄し、続けて、更なるIgG動的能力を測定する。0.15M H3PO4への更なる25時間の暴露を行い、続けて、3回目の動的結合能測定を行う。暴露サイクルを、15分間の暴露として定義する。従って、25時間の暴露は、合計100サイクルを表現している。2回の25時間暴露は、合計200サイクルの暴露を表現する。
長期のアルカリ暴露前後での樹脂Bの動的結合能評価
この実験では、市販のポリクローナルIgGを使用して樹脂の動的能力を試験するための標準的な方法を使用する。簡潔に、本発明に基づく樹脂Bを、50mM Tris w、25mM NaCl、5mM ETDA、pH7.2中のOmnifitカラム(6.6mm×50mm)内に充填する。流速を、100cm/時間に設定する。充填したカラムを、10カラム容量(CV)のEQバッファーで平衡化する。UV280nmが、最初のIgG濃度の50%超に達するまで、ポリクローナルIgG(Seracare、EQバッファーにおける2mg/mL、pH7.2)を、カラム上に充填する。平衡化バッファーによる洗浄後、IgGを、0.1M酢酸、pH3.0で溶出する。最初のランのEQバッファーを使用するカラム平衡化後に、樹脂を、0.1M NaOHを使用して、流速50cm/時間で25時間洗浄し、続けて、更なるIgG動的能力を測定する。0.1M NaOHへの更なる25時間の暴露を行い、続けて、3回目の動的結合能測定を行う。暴露サイクルを、15分間の暴露として定義する。従って、25時間の暴露は、合計100サイクルを表現している。2回の25時間暴露は、合計200サイクルの暴露を表現する。暴露サイクルを、15分間の暴露として定義する。このため、25時間の暴露は、合計100サイクルを表現している。
交互法における長期の酸およびアルカリ暴露前後での樹脂Bの動的結合能評価
この実験では、市販のポリクローナルIgGを使用して樹脂の動的能力を試験するための標準的な方法を使用する。簡潔に、本発明に基づく樹脂Bを、50mM Tris w、25mM NaCl、5mM ETDA、pH7.2中のOmnifitカラム(6.6mm×50mm)内に充填する。流速を、100cm/時間に設定する。充填したカラムを、10カラム容量(CV)のEQバッファーで平衡化する。UV280nmが、最初のIgG濃度の50%超に達するまで、ポリクローナルIgG(Seracare、EQバッファーにおける2mg/mL、pH7.2)を、カラム上に充填する。平衡化バッファーによる洗浄後、IgGを、0.1M酢酸、pH3.0で溶出する。最初のランのEQバッファーを使用するカラム平衡化後に、まず、樹脂を、0.1M NaOHを使用して、流速50cm/時間で、2.5時間(各15分の10サイクル)洗浄し、続けて、中性のEQバッファーに30分間暴露する。これを、工程1と呼ぶ。その後、樹脂を、0.15M H3PO4を使用して、流速50cm/時間で、2.5時間洗浄し、続けて、EQバッファーに30分間暴露する。これを、工程2と呼ぶ。ついで、工程1および2を、もう4回繰り返し、25時間または100サイクルの合計酸およびアルカリ暴露に達することにより、交互に酸およびアルカリ条件に樹脂を暴露する。その後、更なるIgG動的能力測定を行い、続けて、上記した交互の0.1M NaOHおよび0.15M H3PO4への更なる25時間の暴露を行う。この後、更なる動的結合能測定を行う。10%の動的結合能を、UV280nmが最初のIgG濃度の10%に達した時点での、充填したIgG量に基づいて算出する。25時間および50時間の交互の酸およびアルカリ暴露前後で測定された動的結合能を比較し、図2に示す。リン酸およびNaOHへの合計200サイクル(15分/サイクル)の交互暴露に対する樹脂の動的結合能において、顕著な変化は観察されない。
長期の酸暴露後、長期のアルカリ暴露後ならびに長期の酸およびアルカリ暴露後の樹脂Bにより得られた生成物の純度
ポリクローナルIgG(Seracare,Milford,MA)を、非発現CHO−Sフィード(Xcellerex,Marlborough,MA)に添加し、0.22μmの滅菌フィルタを通してろ過する。ろ過したフィード中の最終的なIgG濃度は、3.5mg/mLである。このフィードを、実施例6(酸暴露)、7(アルカリ暴露)および8(酸およびアルカリの交互暴露)からのクロマトグラフィーカラム、ならびに、保存溶液(150mM NaClを含む20%エタノール)中の樹脂Bが充填したコントロールカラム上に、樹脂1mLあたり20mgのIgGにおいて、4分の滞留時間で充填する。樹脂を、0.1M クエン酸塩、pH5.5で洗浄し、0.1M 酢酸、pH3.0で溶出する。溶出プールを、Cygnus(Southport,NC)3G CHO−S ELISAキットを使用して、宿主細胞タンパク質レベルについて分析する。生成物の純度を、以下の表2に示す。
PAB溶液への暴露に対して保持された樹脂の静的結合能研究
樹脂AおよびB(各5mL、各条件についてダプリケートで使用される。)を、PAB溶液(120mM リン酸、167mM 酢酸、2.2%(v/v) ベンジルアルコール)中に、4時間または24時間のいずれかで浸す。ついで、PAB浸漬樹脂サンプルを、直ちにリン酸緩衝生理食塩水(10mM、pH7.4)により、2カラム容量で少なくとも3回フラッシュする。ついで、樹脂を、1mL容量のMilli−Q(R)水(EMD Millipore Corporation,Billerica,MA)に添加し、ついで、10%スラリーに調製する。1mLのこのスラリーを、10mM リン酸緩衝生理食塩水中において、15mLのポリクローナルIgG(SERACARE、1mg/mL)に添加し、室温で4時間回転させる。280nmにおけるUV吸光の低下を、PAB暴露前後における能力を算出するのに使用する。保持されたIgG結合能を、4時間および24時間でのPAB暴露後のIgG結合能を、PABに暴露されていないコントロールの同結合能で割ることにより算出する。表3に示されたように、4時間および24時間の暴露後に、静的結合能における顕著な変化は観察されない。
非発現CHOフィードによる樹脂AおよびBの洗浄研究
浄化した細胞培養物に暴露したプロテインA樹脂についてのH3PO4およびNaOHの洗浄能は、H3PO4が極端に酸性であり、一方、NaOHが非常にアルカリ性であるため、おそらく異なる。
実施例11からの抽出物の樹脂抽出および分析
実施例11におけるカラムの上部からの樹脂を、平衡化バッファーでさらに洗浄し、pH7.0、50℃での20mM Trisにおける2% SDSで、250rpmでのインキュベータ中で一晩抽出する。翌日、サンプルを、微量遠心分機において、13500rpmでスピンする。
Claims (20)
- 1回以上の親和性精製サイクルにわたって、親和性クロマトグラフィーカラムの結合能を保持する方法であって、
1回以上の親和性精製サイクル後に前記クロマトグラフィーカラムを、3.0より低いpHを有する酸性溶液またはアルカリ性溶液で洗浄することを含み、
前記親和性クロマトグラフィーカラムが、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーを含む固体支持体上に固定されたスタフィロコッカス アウレウス プロテインAのCドメインに由来するプロテインAリガンドを含むプロテインA媒体を含む、
方法。 - プロテインAリガンドが、配列番号3および配列番号4から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 酸性溶液が、2.5のpHを含む、請求項1に記載の方法。
- 酸性溶液が、2.0のpHを含む、請求項1に記載の方法。
- 酸性溶液が、1.5のpHを含む、請求項1に記載の方法。
- 10回以上のサイクルにわたって、結合能が保持される、請求項1に記載の方法。
- 50回以上のサイクルにわたって、結合能が保持される、請求項1に記載の方法。
- 100回以上のサイクルにわたって、結合能が保持される、請求項1に記載の方法。
- 200回以上のサイクルにわたって、結合能が保持される、請求項1に記載の方法。
- 固体支持体が、ポリビニルエーテルポリマーを含む、請求項1に記載の方法。
- 酸性溶液が、リン酸を含む、請求項1に記載の方法。
- カラムの結合能を維持しながら、結合および溶出の複数のサイクル後の親和性クロマトグラフィーカラムを衛生化する方法であって、
前記親和性クロマトグラフィーカラムを、リン酸、酢酸およびベンジルアルコールを含む溶液と、少なくとも3時間接触させること、またはアルカリ性溶液と接触させることを含み、
前記親和性クロマトグラフィーカラムが、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーを含む固体支持体上に固定化されたスタフィロコッカス アウレウス プロテインAのCドメインに由来するプロテインAリガンドを含むプロテインA媒体を含む、
方法。 - プロテインAリガンドが、配列番号3および配列番号4から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の方法。
- 固体支持体が、ポリビニルエーテルポリマーを含む、請求項12に記載の方法。
- 酸性およびアルカリ性両方の溶液を使用して、親和性クロマトグラフィーカラムを洗浄する方法であって、
a.親和性精製サイクルのサイクル間に、カラムを、酸性溶液およびアルカリ性溶液の両方と接触させること;または、
b.酸性溶液およびアルカリ性溶液が、交互に使用されるように、前記カラムを、一サイクル後に前記酸性溶液、または、一サイクル後に前記アルカリ性溶液のいずれかと接触させることを含み、
前記親和性クロマトグラフィーカラムが、固体支持体上に固定されたスタフィロコッカス アウレウス プロテインAのCドメインに由来するプロテインAリガンドを含むプロテインA媒体を含む、
方法。 - 固体支持体が、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項15に記載の方法。
- 酸性溶液が、リン酸を含む、請求項15に記載の方法。
- アルカリ性溶液が、水酸化ナトリウムを含む、請求項15に記載の方法。
- 方法が、不純物の相乗的な除去をもたらす、請求項15に記載の方法。
- リガンドが、配列番号3または配列番号4から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項15に記載の方法。
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