CN114560906A - 清洗基于a蛋白的亲和色谱柱的方法 - Google Patents
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- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B08—CLEANING
- B08B—CLEANING IN GENERAL; PREVENTION OF FOULING IN GENERAL
- B08B3/00—Cleaning by methods involving the use or presence of liquid or steam
- B08B3/04—Cleaning involving contact with liquid
- B08B3/08—Cleaning involving contact with liquid the liquid having chemical or dissolving effect
Abstract
本发明提供清洗A蛋白色谱柱的方法，所述A蛋白色谱柱采用包含源自金黄色葡萄球菌的C结构域的A蛋白配体的介质，从而所述柱可以利用酸性和碱性溶液清洗。
Description
本申请是2014年6月19日提交的题为“清洗基于A蛋白的亲和色谱柱的方法”的201480048587.1号中国申请的分案申请。
技术领域
本发明提供清洗A蛋白色谱柱的方法。而且，本发明涉及清洗基于A蛋白的亲和色谱柱的方法，所述亲和色谱柱采用的亲和色谱介质包含基于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白的C结构域的配体。
背景技术
本申请包含以ASCII形式电子提交的序列表，并且其整体援引加入本文。2014年6月3日创建的所述ASCII拷贝名为P13-136PCT_SL.txt，大小为6,289字节。
蛋白纯化的常规方法通常包括细胞培养方法，例如利用重组工程化的哺乳动物或细菌细胞系产生所关注的蛋白，然后：(a)用于去除细胞和细胞碎片的澄清步骤，例如利用差速离心和/或过滤；以及(b)一个或多个下游色谱步骤以分离所关注的蛋白与澄清的细胞培养进料中的各种杂质。
在单克隆抗体和其他包含Fc的蛋白的情况下，纯化的行业标准通常包括多步过程。重要步骤之一是纯化步骤，其采用称作A蛋白的结合抗体的Fc区的亲和配体。通常，在这个步骤中去除大百分比的杂质。虽然，在抗体的纯化中A蛋白亲和色谱是非常有效的步骤，但是使用A蛋白的一个缺点是与离子交换树脂相比其非常昂贵。亲和色谱柱的进一步包装和解包也是非常劳动密集型的，并且带来显著的缓冲液成本。因此，能够清洗、重复使用并消毒A蛋白柱几个循环是可取的。
目前，利用碱性条件或酸性条件清洗采用大多数可商购的A蛋白介质的色谱柱。例如，利用碱性溶液如氢氧化钠清洗采用MabSelect
(GE)、KanCap A(Kaneka)和
AF-rProtein A650F(Tosoh)介质的色谱柱，然而，采用
Ultra Plus介质(EMD Millipore Corporation)的色谱柱使用酸性溶液用于清洗。
发明内容
本发明提供清洗色谱柱的方法，所述色谱柱采用包含固定在固体支持物上的基于金黄色葡萄球菌A蛋白的C结构域的配体的介质，其中所述柱可以利用酸性和碱性两种溶液清洗。
如上文讨论的，由于A蛋白配体或基底基质对延长暴露于酸性或碱性溶液的不稳定性，可以利用酸性溶液或碱性溶液清洗采用大多数可商购的A蛋白介质的色谱柱。相应地建立采用这样的色谱柱的纯化方法，以便适应仅在碱性条件下清洗或仅在酸性条件下清洗。
本发明的方法使得除了在碱性条件下清洗以外或作为在碱性条件下清洗的替代，能够在酸性条件下清洗采用包含固定在固体支持物上的基于A蛋白的C结构域的配体的介质的色谱柱，从而提供更大的操作灵活性。通过使得能够高效清洗采用这样的介质的色谱柱，本文所述的方法能够在许多循环中保留柱的结合能力。此外，通过使得能够清洗采用这样的介质的色谱柱，与单独利用碱性条件或酸性条件清洗相比，实现更大的杂质去除，从而导致更大的产物纯度。
在一些实施方案中，提供一种经历一个或多个亲和纯化循环后仍保留亲和色谱柱的结合能力的方法，所述方法包括在一个或多个亲和纯化循环之后用pH低于3.0的酸性溶液清洗所述色谱柱，其中所述亲和色谱柱包含这样的介质，所述介质包含固定在固体支持物上的源自金黄色葡萄球菌A蛋白的C结构域的A蛋白配体，所述固体支持物包含选自以下的聚合物：聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚碳酸酯。
在一些其他实施方案中，提供一种利用酸性和碱性两种溶液清洗亲和色谱柱的方法，其中所述方法包括：(a)循环之后使所述柱与酸性和碱性两种溶液接触；或者(b)循环之后使所述柱与酸性溶液接触或循环之后使所述柱与碱性溶液接触，从而所述酸性和碱性溶液以交替方式使用，其中所述亲和色谱柱包含这样的介质，所述介质包含固定在固体支持物上的源自金黄色葡萄球菌A蛋白的C结构域的A蛋白配体。
在一些实施方案中，所述A蛋白配体包含选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述固体支持物包含选自以下的聚合物：聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚碳酸酯。在一具体实施方案中，所述固体支持物包含聚乙烯醚聚合物。
在一些实施方案中，所述酸性溶液的pH为1.5，或pH为2.0，或pH为2.5。
在一些实施方案中，所述结合能力在经历10个或更多个循环后仍得以保留。在其他实施方案中，所述结合能力在经历50个或更多个循环后仍得以保留。在其他实施方案中，所述结合能力在经历100个或更多个循环后仍得以保留。在其他实施方案中，所述结合能力在经历200个或更多个循环后仍得以保留。
本文还提供一种在使用之后消毒亲和色谱柱同时保持所述柱的结合能力的方法，其中所述方法包括使所述亲和色谱柱与包含磷酸、乙酸和苯甲醇的溶液接触至少3小时，并且其中所述亲和色谱柱包含固定在固体支持物上的源自金黄色葡萄球菌A蛋白的C结构域的A蛋白配体，所述固体支持物选自聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚碳酸酯。
附图说明
图1为示出实验结果的条形图，所述实验在暴露于以下溶液时测量树脂A、B和C保留的静态结合能力百分比：(1)0.3％盐酸，pH 1.5；(2)0.15M磷酸，pH 1.5；(3)0.1M NaOH；和(4)0.5M NaOH，暴露25hr，这等于100个循环(以15min/循环)。全部3个树脂样品均证实相对于对照，在暴露于0.3％HCl和0.15M H3PO4时，25hr暴露之后保留超过95％结合能力。相对于对照，树脂A和B在暴露于0.1M NaOH时保留超过95％结合能力。相对于对照，树脂A和B在暴露于0.5M NaOH时保留约75％结合能力。相对于对照，树脂C在暴露于0.1M NaOH时保留约65％结合能力。相对于对照，树脂C在暴露于0.5M NaOH时保留约38％结合能力。标准差为约3％。
图2为示出实验结果的条形图，所述实验测量树脂B暴露于以下的100和200个循环之后保留的动态结合能力百分比(在4min停留时间10％)：(1)通过每10个循环交替0.1MNaOH和0.15M磷酸，pH 1.5清洗；(2)仅用磷酸清洗；以及(3)仅用0.1M NaOH碱性溶液清洗。交替暴露于磷酸和NaOH和0.15M H3PO4 200个循环(15min/循环)之后；仅暴露于0.15MH3PO4 200个循环(15min/循环)之后，或者暴露于0.1M NaOH 200个循环(15min/循环)之后未观察到动态结合能力的显著变化(10％突破)。标准差为约10％。
具体实施方式
A蛋白亲和色谱包括包含Fc的蛋白(例如，免疫球蛋白或另一Fc-融合蛋白)结合至包装在柱中的A蛋白树脂或介质(即，固定在固体支持物上的A蛋白配体)，随后从柱洗脱包含Fc的蛋白。原位清洗(CIP)对于色谱柱的高效使用以及最大化柱可以重复使用的循环数至关重要。一般需要有效去除杂质且对色谱树脂无害的清洗方法。通常用于大多数可商购的A蛋白树脂的清洗以及消毒的最常见的清洗溶液之一是氢氧化钠(NaOH)(参见例如，Hagel L et.al.Handbook of Process Chromatography—Development,Manufacturing,Validation and Economics.Second edition.London,UK:Academic Press；2008.Cleaning and Sanitization；pp.147–159；Gronberg et al.,MAbs.2011Mar-Apr；3(2):192–202)。通常，当以柱模式进行许多随后的循环时，在色谱柱上可能存在污染物的逐渐积累，引起柱的污染以及柱的效率和结合能力降低。循环之间的高效清洗方法最小化色谱柱上的污染物积累，从而延长柱的寿命。这也称作柱再生。
虽然利用碱性溶液如氢氧化钠清洗大多数可商购的A蛋白树脂，但是利用磷酸(H3PO4)清洗
Ultra Plus树脂(EMD Millipore Corporation)。
本发明至少是基于令人惊讶和出乎意料的发现，可以用酸性和碱性两种溶液清洗采用介质的色谱柱，所述介质包含固定在固体支持物上的基于金黄色葡萄球菌A蛋白的C结构域的配体。通过使得能够用酸性和碱性两种溶液清洗柱，不仅获得更大的操作灵活性，而且在纯化过程中使用碱性和酸性两种溶液清洗时，获得更大的蛋白纯度。
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。额外的定义在整个详细说明书中示出。
I.定义
如本文所用，术语“SpA”、“A蛋白”或“金黄色葡萄球菌A蛋白”指分离自细菌金黄色葡萄球菌的42kDa多结构域蛋白。SpA通过其称作X结构域的羧基端细胞壁结合区结合至细菌细胞壁。在氨基端区，其包括5个免疫球蛋白结合结构域，称作E、D、A、B和C(Sjodhal,EurJ Biochem.Sep 78(2):471-90(1977)；Uhlen et al.,J Biol Chem.Feb 259(3):1695-702(1984))。这些结构域每个均包含约58个氨基酸残基，并且它们享有65-90％氨基酸相同性。
SpA的E、D、A、B和C结构域每个均具有不同的Ig-结合位点。一个位点是对Fc(Ig的IgG类别的恒定区)，而另一个是对某些Ig分子的Fab部分(负责抗原识别的Ig部分)。已报道每个结构域均包含Fab结合位点。SpA的非Ig结合部分位于C-端，并且命名为X区或X-结构域。
在本文中可交换使用的术语“C结构域”、“SpA的C结构域”、“A蛋白的C结构域”和“金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)A蛋白的C结构域”指其氨基酸序列在SEQ IDNO:1中示出或由例如SEQ ID NO:2示出的核苷酸序列编码的多肽。“C结构域”是折叠为三螺旋束结构的58个氨基酸多肽。其能够通过螺旋1和2表面上的残基结合Fc，或者通过螺旋2和3表面上的残基结合Fab。
如本文所述方法中使用的基于A蛋白的C结构域的A蛋白配体包括具有与SEQ IDNO:1所示氨基酸序列至少80％、或至少85％、或至少90％或至少95％或更多相同的氨基酸序列的配体。
在各种实施方案中，用于本文所述方法的基于A蛋白的C结构域的A蛋白配体包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
如本文所用，术语“色谱”指一种动态分离技术，其将靶分子如靶蛋白(例如，免疫球蛋白或另一包含Fc的蛋白)与混合物中的其他分子分开并允许将其分离。通常，在色谱方法中，流动相(液体或气体)运送包含所关注的靶分子的样品穿过或通过固定相(通常为固体)介质。对固定相的分配或亲和性的差异引起所选分子暂时结合至固定相，而流动相在不同时间带出不同分子。
如本文所用，术语“亲和色谱”指一种色谱模式，其中通过其与固定在色谱树脂上的分子(例如，基于A蛋白的配体)的锁和钥匙相互作用分离待分离的靶分子如蛋白分子(例如，包含Fc的蛋白)。这种特异性相互作用允许靶分子结合，而不期望的分子流过。流动相的温度、pH、离子强度的改变则释放高纯度的靶分子。在本文所述的各种实施方案中，亲和色谱包括将包含靶分子(例如，免疫球蛋白或另一包含Fc的蛋白)添加至携带基于A蛋白的C结构域的配体的固体支持物(称作A蛋白亲和色谱介质或树脂)。
如本文所用，术语“A蛋白亲和色谱”指利用基于A蛋白的C结构域的基于A蛋白或SpA的配体分开或分离物质，如本文描述的那些，其中将SpA或A蛋白配体固定在固体支持物上。
如本文所用，术语“配体”指基于A蛋白的C结构域的生物分子，其固定在固体支持物(例如，多孔表面)上且能够结合包含Fc的蛋白。在本文所述的一些实施方案中，配体包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或者其变体、片段或衍生物。在本文所述的一些其他实施方案中，配体包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或者其变体、片段或衍生物。
术语“固体支持物”一般指连接配体的任何材料(多孔或无孔)。配体连接至固体支持物可以例如在移植的情况下通过共价键(通过醚、硫醚、碳-碳键或其他键)或者通过包被、粘附、吸附和相似机制。用于本文所述方法的示例性固体支持物包括聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚碳酸酯。
本领域已知的A蛋白亲和色谱介质/树脂的实例包括具有固定在可控多孔玻璃骨架上的A蛋白的那些，例如，
A和
vA介质/树脂(EMD MILLIPORE)；具有固定在聚苯乙烯固相上的A蛋白的那些，例如，
50A和
MabCaptureTMA介质/树脂(APPLIED BIOSYSTEMS,INC.)；以及具有固定在琼脂糖固体支持物上的A蛋白的那些，例如，rPROTEIN A SEPHAROSE FAST FLOWTM或MABSELECTTM介质或树脂(GE HEALTHCARE)。在各种实施方案中，本文所述方法中采用的A蛋白配体固定在固体支持物上，所述固体支持物选自聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚碳酸酯。
在一具体实施方案中，本文所述方法中使用的配体固定在聚乙烯醚聚合物上。参见例如美国专利第7,951,885号，其整体援引加入本文。
在本文中可交换使用的术语“亲和树脂”或“亲和色谱树脂”或“亲和介质”或“亲和色谱介质”指连接至例如本文所述那些固体支持物的亲和色谱配体(例如，基于A蛋白的C结构域)。一般来说，术语“树脂”和“介质”在本文中可交换使用。
在本文中可交换使用的术语“靶蛋白”或“所关注的蛋白”指可以利用A蛋白的C结构域或者其变体或衍生物纯化的任何蛋白。在各种实施方案中，靶蛋白为包含Fc的蛋白，例如免疫球蛋白或Fc-融合蛋白。
术语“免疫球蛋白”、“Ig”或“抗体”(在本文中可交换使用)指具有由两条重链和两条轻链组成的基本4-多肽链结构的蛋白，例如通过链间二硫键稳定所述链，其具有特异性地结合抗原的能力。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(在本文中可交换使用)指具有由一条重链和一条轻链组成的2-多肽链结构的蛋白，例如通过链间肽接头稳定所述链，其具有特异性地结合抗原的能力。术语“结构域”指包含例如通过β-折叠和/或链内二硫键稳定的肽环(例如，包含3-4个肽环)的重链或轻链多肽的球状区域。基于在“恒定”结构域的情况下在各种类别成员的结构域内相对缺少序列变化，或者在“可变”结构域的情况下在各种类别成员的结构域内的显著变化，结构域在本文中进一步称为“恒定”或“可变”的。抗体或多肽“结构域”在本领域中常可交换地称作抗体或多肽“区”。抗体轻链的“恒定”结构域可交换地称为“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”、“CL”区或“CL”结构域。抗体重链的“恒定”结构域可交换地称为“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“CH”区或“CH”结构域。抗体轻链的“可变”结构域可交换地称为“轻链可变区”、“轻链可变结构域”、“VL”区或“VL”结构域。抗体重链的“可变”结构域可交换地称为“重链可变区”、“重链可变结构域”、“VH”区或“VH”结构域。
免疫球蛋白或抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以以单体或聚合物形式存在，例如以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。术语“片段”指包含比完整或完全抗体或抗体链少的氨基酸残基的部分(part)或部分(portion)抗体或抗体链。可以通过化学或酶促处理完整或完全抗体或抗体链来获得片段。还可以通过重组方式获得片段。示例性片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc和/或Fv片段。
本发明的方法可以在可以结合至A蛋白的任何抗体或其片段的纯化中使用，所述抗体或其片段包括但不限于人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或它们的片段。在一些实施方案中，本文所述方法在治疗性抗体的纯化中使用。
示例性治疗性抗体包括HerceptinTM；RituxanTM；AvastinTM；BexxarTM；CampathTM；ErbituxTM；HumiraTM；RaptivaTM；RemicadeTM；ReoProTM；
SimulectTM；SynagisTM；XolairTM；ZenapaxTM；MylotargTM；和VectibixTM。示例性Fc融合蛋白包括融合至可溶形式的受体或酶以及它们的变体、衍生物或类似物，例如
应当理解利用本文所述方法纯化的靶蛋白是包含Fc区的蛋白，因此可以通过A蛋白纯化。如本文所用，术语“Fc区”或“Fc”指与A蛋白相互作用的免疫球蛋白分子的那些氨基酸残基。Fc区是抗体的可结晶的尾区，并且与称作Fc受体的细胞表面受体相互作用。
术语“Fc-结合”、“结合(binds)至Fc部分”或“结合(binding)至Fc部分”指本文所述的亲和配体结合至抗体的恒定部分(Fc)的能力。在一些实施方案中，本发明的配体以至少10-7M、或至少10-8M或至少10-9M的亲和力结合抗体(例如，人IgG1、IgG2或IgG4)的Fc部分。
如本文所用，术语“片段”指全长包含Fc的蛋白如免疫球蛋白的一部分。片段的实例包括Fab片段、单链抗体分子、双抗体、线性抗体以及形成自抗体片段的多特异性抗体。
利用本文所述方法纯化的免疫球蛋白和其他包含Fc的蛋白可以利用任何合适的表达系统或细胞类型进行表达。在一些实施方案中，免疫球蛋白或另一包含Fc的蛋白在哺乳动物细胞如CHO或NS0细胞、杂交瘤、小鼠细胞等中表达。在另一实施方案中，利用非哺乳动物细胞培养(例如，昆虫细胞、酵母细胞、大肠杆菌(Escherichia coli)等)表达免疫球蛋白或另一包含Fc的蛋白。在细胞培养中表达之后，通常利用澄清方法如深层过滤、离心、絮凝/沉淀(例如，酸沉淀或刺激响应性聚合物)去除不溶性种类。通常将这种澄清的细胞培养物装载至A蛋白柱以分离免疫球蛋白或包含Fc的蛋白与可溶性杂质如宿主细胞蛋白、DNA、病毒或其他杂质。
如本文所用，术语“纯化的多肽”或“纯化的蛋白”是来自利用如本文所述的pH梯度或pH分步方法的A蛋白亲和步骤的洗脱产物。纯化的多肽/蛋白优选主要包含多肽单体。
如本文所用，术语“未纯化的多肽”、“未纯化的蛋白”或“蛋白负载”是A蛋白亲和纯化步骤之前的装载材料或起始材料中的多肽或蛋白。
如本文所用，术语“包含Fc的蛋白的纯度”定义为相对于纯化过程之后A蛋白色谱柱洗脱掉的总蛋白的靶蛋白(即，包含Fc的蛋白)的单体种类，所述纯化过程采用本文所述的清洗方法。因此，纯度可以通过最终洗脱池中总单体比总蛋白的比例来计算。总蛋白可以包含靶蛋白的一种或多种蛋白片段、聚集体、单体种类以及它们的变体。
如本文所用，术语“清洗”指纯化靶蛋白(例如，免疫球蛋白或另一包含Fc的蛋白)的过程中的步骤，其牵涉去除亲和色谱柱如A蛋白柱上剩余的痕量水平的杂质，以便保持柱的性能和完整性。在清洗步骤从柱去除杂质的同时，如利用结合能力(柱可以纯化的靶蛋白的量)和/或分辨率(柱中的树脂或介质分离靶蛋白与不期望的实体的能力)测量的，理想情况下其应当对柱的性能具有最小影响。大多数可商购的亲和色谱柱(例如，采用金黄色葡萄球菌A蛋白或其衍生物)是利用酸性溶液或碱性溶液清洗的。例如，MabSelect
A蛋白柱是用稀释的NaOH清洗的。另一方面，
A蛋白柱一般是利用磷酸清洗的。但是，大多数目前可商购的A蛋白树脂在极端的pH下是不稳定的，因此不可以利用酸性和碱性两种溶液清洗。
如本文所用，术语“原位清洗”或“CIP”是一种清洗管道、容器、工艺设备、滤器和相关配件的内表面且不拆卸的方法。利用CIP的益处是清洗更快、较少劳动密集和更可重复，并且对人造成较少的化学暴露风险。对于色谱柱，CIP指清洗树脂材料以及柱体和端部配件且不拆开柱。通常，将运行之后清洗的色谱柱立即重新平衡用于下一运行，或者消毒用于短期或长期储存。
如本文所用，术语“循环”或“亲和循环”或“A蛋白亲和色谱纯化循环”指多步过程，其开始于用中性缓冲液平衡采用基于A蛋白的树脂的色谱柱；然后将澄清的细胞培养进料装载至柱，其中所述澄清的细胞培养进料包含待纯化的包含Fc的蛋白(例如，单克隆抗体)；然后用1-3种不同缓冲液洗涤柱以去除松散结合的杂质，这不干扰包含Fc的蛋白结合至A蛋白树脂；然后利用洗脱缓冲液(例如，pH为2.5-4.5)从A蛋白柱洗脱掉包含Fc的蛋白。这种平衡、装载、洗涤和洗脱的多步过程构成循环或者结合和洗脱循环。循环之后通常是清洗步骤以在下一循环之前去除柱上的痕量水平的杂质。
如本文所用，术语“系列操作(campaign)”指几轮单独的纯化过程或循环，一个接一个运行以在特定时间段内产生期望量的材料。在纯化包括单克隆抗体的包含Fc的蛋白的情况下，系列操作通常包括与随后的纯化步骤一起运行的几个生物反应器，以便递送集合量的纯化的蛋白用于最终填充。虽然，清洗通常在系列操作内的运行之间实施，但是当系列操作完成时，将色谱柱(包括采用基于A蛋白的配体的色谱柱)进一步消毒用于储存，因为柱通常在下一系列操作中再次使用，下一系列操作可以在几天或几周或几个月之后。
如本文所用，术语“消毒(sanitization)”或“消毒(sanitizing)”或“消毒(sanitize)”是完成系列操作之后使用的步骤，并且设计为将微生物群体减少至认为安全或可接受的水平，如FDA或其他监管机构确定的。消毒通常利用加热或化学物质完成。由于热消毒的不可行，待储存直至下一系列操作的色谱柱一般通过化学方式消毒。利用多达0.5M NaOH消毒大多数亲和色谱柱，包括采用大多数可商购的A蛋白配体的那些亲和色谱柱。但是，还已知由于NaOH对A蛋白配体脱酰胺作用，0.5M NaOH显著降低A蛋白亲和色谱树脂的性能。在本文所述的一些实施方案中，将包含磷酸、乙酸和苯甲醇(PAB)的溶液用于消毒。虽然，以前已显示在A蛋白亲和介质的
家族的情况下，PAB(120mM磷酸、167mM乙酸、2.2％苯甲醇)可以用作消毒剂(sanitant)，但是不认为其适合所有A蛋白介质，特别是一般在碱性条件下清洗或消毒的介质。参见，M.Rogers et al.,J.Chromatogr.A 1216(2009)4589–4596。
术语“装载密度”或“加载密度”是每色谱介质体积装载至色谱柱的包含免疫球蛋白或另一包含Fc的蛋白的样品的量。装载密度以g/L测量。在一些实施方案中，以5g/L、或10g/L、或12g/L、或15g/L、或20g/L、或30g/L、或40g/L或更高的装载密度装载样品。
“缓冲液”是通过其酸-碱缀合组分的作用抗pH变化的溶液。可以例如根据期望的缓冲液pH采用的各种缓冲液描述于Buffers.A Guide for the Preparation and Use ofBuffers in Biological Systems,Gueffroy,D.,Ed.Calbiochem Corporation(1975)。
本文中“平衡缓冲液”是用来制备用于装载靶蛋白的固体支持物(具有固定的A蛋白)的缓冲液。
“洗涤缓冲液”在本文中用来指在装载之后和洗脱靶蛋白之前通过固体支持物(具有固定的A蛋白)的缓冲液。
术语“结合能力”指会结合至给定体积的树脂或介质的分子的量，所述给定体积的树脂或介质包装在给定条件下运行的柱中。结合能力可以测量为静态结合能力或动态结合能力。在静态结合能力的情况下，确定当分子和树脂接触无限量的时间时结合至给定体积的树脂的分子的量。静态结合能力测量树脂可以结合的最高量的靶分子。实际上，通常通过以最小或没有流动使过量的靶分子与树脂接触等于或长于4小时来获得该值。另一方面，动态结合能力是在设定流速下每体积的树脂可以结合的靶分子的量。任何树脂的动态结合能力高度依赖于基础条件。一般来说，流速越低，动态结合能力越高。当流速接近0时，结合能力接近最大可获得的能力–静态结合能力。没有适当清洗和消毒，在多个结合和洗脱循环之后A蛋白树脂的结合能力通常将至低于初始值。当结合能力低于色谱方法/过程开发中设定的某个值时，大量靶蛋白可以“突破”，或者与包含杂质的流过集分共洗脱，导致产物损失。利用合适的化学物质适当清洗可以在延长的时间中保持树脂结合能力。这通常利用碱性溶液如0.1M NaOH或酸性溶液如0.15M H3PO4完成，基于对不同可商购的树脂设定的条件。但是，在本文所述方法的情况下，酸性和碱性溶液均可以用于清洗，同时保留树脂的结合能力。
II.A蛋白色谱
A蛋白色谱是一种亲和色谱形式，最常用于纯化包含Fc的蛋白如免疫球蛋白或抗体。一般来说，在合适的细胞培养中表达靶蛋白(例如，免疫球蛋白或另一包含Fc的蛋白)，并且使细胞培养进料进行澄清，然后将澄清的进料装载至A蛋白色谱介质，例如，包装在色谱柱中。
A蛋白色谱一般采用固体支持物如多孔珠或树脂，具有固定在其上的合适的A蛋白配体。然后将A蛋白结合的固体支持物包装在色谱柱中。可以首先将柱用合适的平衡缓冲液平衡。这通常通过使3-10个柱体积(CV)的中性pH缓冲液如磷酸盐缓冲液或pH 7-7.5的Tris缓冲液流过A蛋白树脂来完成。然后通过用包含靶蛋白的样品(例如，包含靶蛋白的澄清的细胞培养进料)装载柱来使包含靶蛋白的澄清进料与柱中的固体支持物接触。通过进料中包含Fc的蛋白的浓度(滴度)以及在设定流速下包含Fc的蛋白对A蛋白树脂的结合能力确定装载的澄清进料的量。通常，可溶性杂质如宿主蛋白和DNA不结合至A蛋白，因此在流过中去除并转移至废物中。装载完成之后，通常用1-3种不同缓冲液洗涤柱以去除松散结合的杂质，这不干扰靶蛋白结合至A蛋白树脂。这个步骤也称作中间洗涤步骤。当随后利用洗脱缓冲液(例如，pH为2.5-4.5)从A蛋白柱洗脱掉时，其进一步提高靶蛋白纯度。常用洗脱缓冲液为乙酸和柠檬酸，pH 2.5-4.5。洗脱的典型流速范围为60个柱体积(CV)/小时至5个CV/小时。在梯度洗脱的情况下，通常洗脱进行5-60个柱体积。在一些实施方案中，将高pH缓冲液和低pH缓冲液混合以产生范围为pH 7.0-3.0的pH梯度。在一些实施方案中，pH梯度开始于7.0、或约6.8、或约6.6、或约6.4、或约6.2、或约6.0、或约5.8、或约5.6、或约5.4、或约5.2、或约5.0、或约4.8、或约4.6、或约4.4、或约4.2、或约4.0，并且pH梯度结束于3.0、或约3.2、或约3.4、或约3.6、或约3.8。
平衡、装载、洗涤和洗脱的步骤构成循环或者结合和洗脱循环。典型的A蛋白纯化循环的这种结合和洗脱循环之后通常是清洗步骤以去除柱上的痕量水平的杂质，然后是另一结合和洗脱循环。典型的纯化系列操作构成多个结合和洗脱循环，一个接一个，在循环之间或每个循环之后进行清洗步骤。
通常在每个循环之后实施A蛋白亲和树脂的清洗以确保树脂在树脂的寿命周期中一致地进行纯化，或者换句话说，以便保留树脂的结合能力。清洗对于A蛋白亲和色谱树脂特别重要，这是因为两个原因：(1)与离子交换或疏水相互作用(HIC)树脂相比，A蛋白树脂具有很高的初始成本，以及；(2)A蛋白色谱树脂通常暴露于包含高水平杂质的澄清的细胞培养物。因此，一些残余的杂质可以结合至A蛋白树脂，从而导致在树脂重复使用时丧失结合能力或增加洗脱池杂质。在制造环境中这是非常不可取的，因为其导致生产力下降(因为结合能力下降)和产物纯度较差。因此，每个A蛋白结合和洗脱循环之后的常规清洗对于确保一致的树脂性能至关重要，这导致一致的产物纯度和方法产量。
清洗通常用极端pH完成，例如，使用0.15M H3PO4(pH 1.5)或0.1M NaOH(pH＝13)，这是两种常用的清洗试剂。例如，已推荐0.15M H3PO4并用于A蛋白亲和树脂的
家族。H3PO4清洗的优点是其清洗树脂而不牺牲A蛋白树脂的结合能力。另一方面，推荐0.1MNaOH并用于A蛋白亲和树脂的MabSelect
家族；但是，由于蛋白配体的脱酰胺，碱性溶液如NaOH可能随着时间降低A蛋白树脂的结合能力。
在本文所述的一些实施方案中，利用酸性和碱性两种溶液进行清洗。在一些实施方案中，在每个循环之后使色谱柱与酸性溶液以及碱性溶液两者接触。在其他实施方案中，在一个循环之后使色谱柱与酸性溶液或碱性溶液接触，从而在整个纯化系列操作中以交替方式使用酸性和碱性溶液。例如，如果在第一个循环之后使色谱柱与碱性溶液接触，则在第二个循环之后使其与酸性溶液接触，然后在第三个循环之后再次碱性溶液，依此类推。相反地，如果在第一个循环之后使色谱柱与酸性溶液接触，则在第二个循环之后使其与碱性溶液接触，然后在第三个循环之后再次酸性溶液，依此类推。
相对于仅使用酸性或碱性溶液，将酸性和碱性溶液用于清洗导致协同去除杂质。换句话说，将酸性和碱性两种溶液用于清洗(如本文所述在循环之后使用两种或以交替方式使用)导致杂质的去除，所述杂质的去除大于在整个纯化过程中仅使用单独的酸清洗或单独的碱清洗去除的总和。不希望被理论束缚，考虑酸性和碱性溶液各自去除不同类型的杂质。
III.用于本文所述方法的示例性配体
本发明的方法采用基于A蛋白的C结构域的A蛋白配体。在一些实施方案中，用于本文所述方法的配体包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少80％、或至少85％、或至少90％或至少95％或更多相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，用于本文所述方法的A蛋白配体包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，用于本文所述方法的A蛋白配体包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。本发明还涵盖结合包含Fc的蛋白的这些序列的变体、片段和衍生物。
IV.用于本文所述方法的示例性固体支持物
在一些实施方案中，将用于本文所述方法的A蛋白配体固定在支持物上，例如固体支持物或可溶性支持物，以便产生适合分离生物分子如免疫球蛋白和其他包含Fc的蛋白的亲和色谱介质或树脂。
示例性固体支持物包括基于合成聚合物的那些固体支持物，例如，聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚碳酸酯。
示例性固体支持物形式包括但不限于珠(球形或不规则的)、中空纤维、固体纤维、垫、凝胶、膜、盒、柱、芯片、玻片、板或整体柱。
任何合适的技术均可以用于将本文所述的配体连接至固体支持物。例如，在一些实施方案中，可以通过常规偶联技术利用例如配体中存在的氨基和/或羧基基团将配体连接至固体支持物。例如，双环氧化合物(bisepoxide)、表氯醇、CNBr、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)是公知的偶联试剂。在一些实施方案中，在固体支持物和配体之间引入间隔，其提高配体的可用性并促进配体化学偶联至支持物。
在本发明涵盖的一些实施方案中，将配体上一个以上的位点连接至固体支持物(即，通过多点连接)。
一般来说，基于A蛋白的色谱配体连接至固体支持物可以通过许多不同方式完成，大多数是本领域公知的，以及本文所述的那些方式。参见例如，Hermanson et al.,Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press,pp.51-136(1992)。
V.A蛋白色谱柱的清洗和消毒
色谱柱的清洗是在每个循环之后常用的措施以维持柱性能并延长柱寿命。通常，在每个运行完成之后，将清洗溶液装载在柱上15-30min，然后是重新平衡缓冲液或消毒缓冲液(如果柱准备储存)。常用的清洗溶液为0.05-0.3M NaOH或0.15M H3PO4。清洗期间的流速通常是基于使用的特定树脂和色谱系统来确定的。虽然，NaOH是生物制药产业中常用的清洗溶液，但是酸性溶液如0.15M H3PO4也可以高效去除污染物并在某些情况下使用。
对于A蛋白色谱，通常使用H3PO4清洗
家族的产品，而NaOH用于清洗MabSelect 
家族的产品。但是，大多数可商购的A蛋白介质仅可以用碱性溶液或酸性溶液清洗。
但是，在本文所述方法的情况下，固定在固体支持物上的基于金黄色葡萄球菌的C结构域的A蛋白树脂可以利用酸性和碱性两种溶液清洗。与单独每种溶液相比，利用碱性和酸性两种溶液导致协同去除不期望的杂质。
色谱柱的消毒通常在柱已用于系列操作之后且其准备储存之前进行。以预置流速将消毒溶液装载在柱上3-5个柱体积。然后停止流一段设定时间用于使消毒剂以其方式工作，实现靶向微生物杀死。然后用储存缓冲液代替消毒剂，并且柱准备储存。虽然，NaOH是离子交换和疏水相互作用色谱的常用消毒剂，但是对于A蛋白亲和色谱其较不耐用。已知NaOH攻击蛋白上的天冬酰胺，这导致蛋白的降解。A蛋白配体也不例外。已努力通过突变天冬酰胺来提高A蛋白配体的碱稳定性；但是，NaOH仍以相对于野生型较慢的速度降解A蛋白。对于消毒这特别是个问题，因为与用NaOH(0.1-0.3M)清洗15-30min相比，消毒采用较高浓度的NaOH(0.5M)较长时间(即，3-4hr)。
本文描述了一种更有效的消毒溶液，称作PAB。其由120mM磷酸、167mM乙酸、2.2％苯甲醇组成。PAB有效且快速地杀死微生物。以前已描述PAB用于仅可以利用酸性溶液清洗的
家族的产物，并且由Genentech和EMD Millipore Corporation共同开发(M.Rogers et al.J.Chromatogr.A 1216(2009)4589–4596)。
通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应当理解为限制性的。本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及图均援引加入本文。
实施例
实施例1：SpA配体的产生
编码具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的蛋白的合成基因获得自DNA 2.0(Menlo Park,CA)。每个合成基因的5’端包括起始甲硫氨酸的密码子。每个基因的5’和3’端分别包含NdeI和BamHI限制性位点。用NdeI和BamHI(NEW ENGLAND BIOLABS,Ipswich,MA)消化这些合成基因以及使用的表达载体，即pET11a(EMD MilliporeCorporation,Billerica,MA)，在0.7％琼脂糖TAE凝胶上分离DNA片段，切除适当的DNA片段并利用来自QIAGEN(Valencia,CA)的凝胶抽提试剂盒进行纯化。利用T4DNA连接酶(NEWENGLAND BIOLABS,Ipswich,MA)将纯化的插入物连接入pET11a的骨架或任何其他合适的表达载体。
按照制造商的说明书，将连接反应转化入DH5α感受态大肠杆菌(E.coli)(INVITROGEN,Carlsbad,CA)，平板接种在包含100μg/mL氨苄西林的Technova LB平板上并在37℃下温育过夜。为了获得纯化的DNA，挑取单克隆并在包含100μg/mL氨苄西林的LB中培养过夜。利用来自QIAGEN(Valencia,CA)的旋转mini-prep试剂盒纯化DNA。通过利用NdeI和BamHI(NEW ENGLAND BIOLABS,Ipswich,MA)进行限制性消化分析证实重组质粒的特性。
实施例2：基于SpA的配体的表达和纯化
任何合适的细菌表达系统均可以用于表达本文所述的各种SpA配体。例如，可以利用pET载体如pET11a(EMD)在大肠杆菌(Escherchia coli)菌株如菌株BL21(DE3)(PROMEGA,Madison WI)中表达蛋白。
从平板选择单克隆并使其在包含100μg/mL氨苄西林的LB培养基中于37℃下生长过夜。将过夜培养物100倍稀释入包含100μg/mL氨苄西林的新鲜LB培养基并使其生长至一定的细胞密度，从而在600nm下的光密度为～0.8。添加1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷之后，使细胞生长额外的2小时。通过SDS-PAGE分析和蛋白印迹证实表达。
通过离心(4000rpm，4℃，5分钟)收获细胞并将其重悬于3mL包含20mM咪唑的磷酸盐缓冲盐水中。通过超声处理将细胞裂解，并且通过离心(4000rpm，4℃，30分钟)使细胞碎片成团。利用50mL IgG亲和树脂(固定在可控多孔玻璃上的多克隆hIgG)，应用500mL细胞裂解物纯化SpA配体。用30mL磷酸盐缓冲盐水洗涤柱，并且在0.1M柠檬酸，pH 3中洗脱SpA。将SpA透析入
水(EMD Millipore Corporation,Billerica,MA)过夜。利用UV分光计基于理论消光系数证实蛋白浓度(Pace et.al.,Protein Science4:2411(1995)。
实施例3：将基于SpA的配体连接至固体支持物
如实施例1和2所述产生并表达各种配体之后，通过多点连接将配体固定至固体支持物。
在示例性实验中，通过在1～1.1M Na2SO4的存在下固体支持物上的环氧基与配体上的许多氨基的反应过夜来将A蛋白配体(SEQ ID NO:3中示出的氨基酸序列，10～20mg/mL)固定至交联的聚乙烯醚固体支持物(Merck KgaA专利材料)。(Hermansonet.al.Academic Press,1992,page 118)。将树脂命名为树脂A。
具有SEQ NO:4所示氨基酸序列的配体和天然A蛋白(Lonza,Ltd.,Switzerland)的偶联方法与上述方法相似，并且将相应的树脂命名为树脂B和树脂C。
实施例4：将树脂A、B和C延长暴露于酸性和碱性溶液
在这个实验中，将上述树脂A、B和C各自暴露于各种酸性和碱性溶液。制备以下溶液：HCl(0.3％,v/v),pH 1.5；H3PO4(0.15M),pH 1.5；0.1M NaOH和0.5M NaOH。
将树脂A、B和C(将2ml的每种树脂一式两份用于每个溶液条件)转移入5”一次性柱(Evergreen Scientific,Los Angeles,CA)并在上述溶液之一中适应5min。通过真空去除溶液并将树脂转移至15mL聚丙烯锥形管(ThermoFisher,Waltham,MA)中，然后添加10mL的相应溶液。在室温下将相应溶液中的树脂浆管装在
旋转器(ThermoFisher,Waltham,MA)中25hr，然后在Evergreen 5”一次性柱中洗涤5次，用4mL的
水(EMDMillipore Corporation,Billerica,MA)洗涤3次。
表1：样品和测试条件。每个样品一式两份使用。
| HCl,0.3％,v/v | H<sub>3</sub>PO<sub>4</sub>,0.15M | 0.1M NaOH | 0.5M NaOH | |
| 树脂A | + | + | + | + |
| 树脂B | + | + | + | + |
| 树脂C | + | + | + | + |
实施例5：延长的碱性和酸性暴露之前和之后树脂A、B和C的静态结合能力评价
在这个实验中，将暴露于0.3％HCl；0.15M H3PO4；0.1M NaOH；或0.5M NaOH的树脂A、B和C(1mL体积)连同储存在20％乙醇与150mM NaCl的储存缓冲液中的对照样品制备为
水(EMD Millipore Corporation,Billerica,MA)中的10％浆。将1mL的每种树脂浆添加至15mL的10mM磷酸盐缓冲液中的多克隆IgG(SERACARE,1mg/mL))中，并且在室温下温和混合4小时。在280nm下UV吸光度的减少用来计算酸或碱暴露之前和之后的树脂IgG结合能力。通过酸或碱暴露之后的IgG结合能力除以未暴露于酸或碱条件的对照样品的IgG结合能力来计算保留的IgG结合能力百分比。
图1示出这样的实验的结果。全部3个树脂样品均证实在暴露于0.3％HCl或0.15MH3PO4 25hr时，相对于对照保留超过95％的初始结合能力。树脂A和B在暴露于0.1M NaOH时，相对于对照保留超过95％结合能力，而在暴露于0.5M NaOH时，相对于对照保留约75％结合能力。树脂C在暴露于0.1M NaOH时，相对于对照保留约65％结合能力，而在暴露于0.5MNaOH时，相对于对照保留约38％结合能力。测试的标准差为约1-3％。因此，认为树脂A和B在碱性溶液暴露时保留的结合能力相同。
实施例6：延长的酸暴露之前和之后树脂B的动态结合能力评价
在这个实验中，使用利用商业多克隆IgG测试树脂动态能力的标准方法。简单地说，将本发明的树脂B在50mM Tris w 25mM NaCl,5mM ETDA,pH 7.2(EQ缓冲液)中包装入Omnifit柱(6.6mm x 50mm)，并且将流速设置为100cm/hr。将包装的柱用EQ缓冲液平衡10个柱体积(CV)。将多克隆IgG(Seracare，在EQ缓冲液中2mg/mL，pH 7.2)装载至柱直至UV280nm达到超过初始IgG浓度的50％。用平衡缓冲液洗涤之后，用0.1M乙酸，pH 3.0洗脱IgG。第一次运行的利用EQ缓冲液柱平衡之后，利用0.15M H3PO4以50cm/hr的流速洗涤树脂25hr，然后是另一IgG动态能力测量。进行另一25hr的暴露于0.15M H3PO4，然后是第三次动态结合能力测量。暴露循环定义为暴露15min。因此，25hr暴露代表总计100个循环。2次25hr暴露代表总计200个循环的暴露。
基于在UV280nm达到初始IgG浓度的10％时装载的IgG量计算在10％突破的动态结合能力。将25hr和50hr暴露之前和之后测量的动态结合能力比较并在图2中示出。在暴露于0.15M H3PO4 200个循环(15min/循环)时未观察到树脂动态结合能力的显著变化。
实施例7：延长的碱暴露之前和之后树脂B的动态结合能力评价
在这个实验中，使用利用商业多克隆IgG测试树脂动态能力的标准方法。简单地说，将本发明的树脂B在50mM Tris w 25mM NaCl,5mM ETDA,pH 7.2中包装入Omnifit柱(6.6mm x 50mm)，并且将流速设置为100cm/hr。将包装的柱用EQ缓冲液平衡10个柱体积(CV)。将多克隆IgG(Seracare，在EQ缓冲液中2mg/mL，pH 7.2)装载至柱直至UV280nm达到超过初始IgG浓度的50％。用平衡缓冲液洗涤之后，用0.1M乙酸，pH 3.0洗脱IgG。第一次运行的利用EQ缓冲液柱平衡之后，利用0.1M NaOH以50cm/hr的流速洗涤树脂25hr，然后是另一IgG动态能力测量。进行另一25hr的暴露于0.1M NaOH，然后是第三次动态结合能力测量。暴露循环定义为15min的暴露。因此，25hr暴露代表总计100个循环。2次25hr暴露代表总计200个循环的暴露。暴露循环定义为暴露15min。因此，25hr暴露代表总计100个循环。
基于在UV280nm达到初始IgG浓度的10％时装载的IgG量计算10％的动态结合能力。将25hr和50hr暴露之前和之后测量的动态结合能力比较并在图2中示出。在暴露于0.1MNaOH 200个循环(15min/循环)时未观察到树脂动态结合能力的显著变化。
实施例8：交替方式的延长的酸和碱暴露之前和之后树脂B的动态结合能力评价
在这个实验中，使用利用商业多克隆IgG测试树脂动态能力的标准方法。简单地说，将本发明的树脂B在50mM Tris w 25mM NaCl,5mM ETDA,pH 7.2中包装入Omnifit柱(6.6mm x 50mm)，并且将流速设置为100cm/hr。将包装的柱用EQ缓冲液平衡10个柱体积(CV)。将多克隆IgG(Seracare，在EQ缓冲液中2mg/mL，pH 7.2)装载至柱直至UV280nm达到超过初始IgG浓度的50％。用平衡缓冲液洗涤之后，用0.1M乙酸，pH 3.0洗脱IgG。在第一次运行的利用EQ缓冲液柱平衡之后，首先利用0.1M NaOH以50cm/hr的流速洗涤树脂2.5hr(每个15min的10个循环)，然后暴露于中性EQ缓冲液30min，称作步骤一。随后利用0.15M H3PO4以50cm/hr的流速洗涤树脂2.5hr，然后暴露于EQ缓冲液30min，称作步骤二。然后再重复步骤一和二4次以达到25hr或100个循环的总酸和碱暴露，从而将树脂以交替方式暴露于酸和碱条件。随后，进行另一IgG动态能力测量，然后如上文所述进行另一25hr的暴露于交替的0.1M NaOH和0.15M H3PO4。这之后是另一动态结合能力测量。基于在UV280nm达到初始IgG浓度的10％时装载的IgG量计算10％的动态结合能力。将25hr和50hr交替的酸和碱暴露之前和之后测量的动态结合能力比较并在图2中示出。在交替暴露于磷酸和NaOH总计200个循环(15min/循环)时未观察到树脂动态结合能力的显著变化。
实施例9：延长的酸暴露之后、延长的碱暴露之后以及延长的交替的酸和碱暴露之后用树脂B获得的产物纯度
将多克隆IgG(Seracare,Milford,MA)添加至非表达的CHO-S进料(Xcellerex,Marlborough,MA)中，并且通过0.22um无菌滤器进行过滤。过滤的进料中的最终IgG浓度为3.5mg/mL。将这种进料装载至来自实施例6(酸暴露)、7(碱暴露)和8(酸和碱交替暴露)的色谱柱以及用储存溶液(20％乙醇与150mM NaCl)中的树脂B包装的对照柱，以4min停留时间装载至20mg的IgG每mL树脂。将树脂用0.1M柠檬酸盐，pH 5.5洗涤，并且用0.1M乙酸，pH 3.0洗脱。利用Cygnus(Southport,NC)3G CHO-S ELISA试剂盒分析洗脱池的宿主细胞蛋白水平。产物纯度在下文表2中示出。
虽然这些样品的宿主细胞蛋白(HCP)水平全部很低，但是用交替的酸和碱溶液清洗的树脂样品表现出洗脱池中最低水平的HCP，可能是由于酸和碱清洗的协同清洗效应。
表2
| 树脂，暴露 | 宿主细胞蛋白(ng/mg的IgG) |
| 树脂B对照(没有酸或碱暴露的原始树脂) | 8.4 |
| 树脂B，200个循环酸暴露 | 5.9 |
| 树脂B，200个循环碱暴露 | 6.9 |
| 树脂B，200个循环酸/碱暴露 | 3.2 |
实施例10：在暴露于PAB溶液时树脂保留的静态结合能力研究
将树脂A和B(各5mL，一式两份用于各条件)浸泡在PAB溶液(120mM磷酸、167mM乙酸、2.2％(v/v)苯甲醇)中4hr或24hr。然后将PAB浸泡的树脂样品立即用2个柱体积的磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.4)冲洗至少3次。然后将树脂添加至在
水(EMD MilliporeCorporation,Billerica,MA)中1mL体积，然后制备为10％浆。将1mL的这种浆添加至15mL的10mM磷酸盐缓冲液中的多克隆IgG(SERACARE,1mg/mL))中，并且在室温下旋转4小时。在280nm下UV吸光度的减少用来计算PAB暴露之前和之后的能力。通过在4hr和24hr的PAB暴露之后的IgG结合能力除以没有PAB暴露的对照的IgG结合能力来计算保留的IgG结合能力。如表3所示，4hr和24hr暴露之后未观察到静态结合能力的显著变化。
表3：相对于对照，在暴露于PAB溶液4和24hr之后树脂A和B保留的静态结合能力平均百分比
实施例11：用非表达的CHO进料的树脂A和B清洗研究
H3PO4和NaOH对暴露于澄清的细胞培养物的A蛋白树脂的清洗能力可能不同，因为H3PO4是极度酸性的，而NaOH是高度碱性的。
基于H3PO4和NaOH清洗之后污染的A蛋白树脂上遗留了什么来检测并比较清洗能力的差异。
将非表达的CHO-S澄清的细胞培养物用来污染用树脂A和B包装的柱以理解酸或碱溶液的清洗能力。将树脂A和B包装入Omnifit柱(6.6mm i.d.x 3cm床高)，各2个柱(2个柱的树脂A和2个柱的树脂B)。将这个测试的流速设置为100cm/hr。如上文所述将全部4个柱用EQ缓冲液平衡，并且用细胞培养液装载/再循环24hr。将树脂A和B的一套柱用0.1M NaOH清洗30min，然后用EQ缓冲液重新平衡30min。将树脂A和B的另一套柱用0.15M H3PO4，pH 1.5清洗30min，然后用EQ缓冲液重新平衡30min。然后取出每个柱的顶部1厘米的树脂用于分析。
实施例12：来自实施例11的提取物的树脂提取和分析
将来自实验11中柱的顶部的树脂用平衡缓冲液进一步洗涤，并且用pH 7.0的20mMTris中的2％SDS提取，在恒温箱中以250rpm于50℃下过夜。第二天，将样品在微量离心机中以13500rpm离心。
然后去除SDS，并且利用Centricon装置(3KD,EMD Millipore Corporation,Billerica,MA)在至少5次缓冲液交换之后交换为平衡缓冲液。通过SDS-PAGE，2D凝胶和/或LC-MS分析小等份的缓冲液交换的树脂提取物。
如观察到的，对于树脂A，酸清洗和碱清洗去除不同宿主蛋白种类至不同程度。这证实酸和碱清洗可以各自从污染的柱去除不同杂质。因此，用酸溶液如H3PO4和碱溶液如NaOH交替清洗导致A蛋白柱的协同去除杂质和更高效的清洗效果，因此，延长柱的寿命。
根据本说明书内引用的参考文献的教导最全面地理解本说明书，所述参考文献援引加入本文。本说明书内的实施方案提供本发明中的实施方案的说明，并且不应当理解为限制其范围。技术人员容易地认识到本发明涵盖许多其他实施方案。所有出版物和发明均整体援引加入本文。如果援引加入的材料与本说明书矛盾或不一致，则本说明书会取代任何这样的材料。本文中任何参考文献的引用不是承认这类参考文献是本发明的现有技术。
除非另有说明，本说明书(包括权利要求书)中使用的所有表示成分、细胞培养、处理条件等的量的数字应当理解为在所有条件下受到术语“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，数值参数为近似值，并且可以根据通过本发明试图获得的期望特性而变化。除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员会认识到或者能够利用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。以下权利要求书意图涵盖这类等同物。
本领域技术人员会清楚，可以进行本发明的许多修改和变化而不背离其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅通过实例的方式提供，并不意味着以任何方式限制。本发明的真正范围和精神通过以下权利要求书示出，说明书和实施例仅认为是示例性的。
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65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Lys Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
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Claims (20)
1.一种经历一个或多个亲和纯化循环仍保留亲和色谱柱的动态结合能力的方法，所述方法包括：
清洗步骤，所述清洗步骤基本上包括在一个或多个亲和纯化循环之后用pH低于3.0酸性溶液清洗所述色谱柱，所述酸性溶液基本上包含磷酸，其中所述亲和色谱柱包含A蛋白介质，所述A蛋白介质包含固定在固体支持物上的源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)A蛋白的C结构域的A蛋白配体，所述固体支持物包含选自以下的聚合物：聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚碳酸酯，
其中所述动态结合能力保持50-200个循环。
2.权利要求1的方法，其中所述A蛋白配体包含选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
3.权利要求1的方法，其中所述酸性溶液包含2.5的pH。
4.权利要求1的方法，其中所述酸性溶液包含2.0的pH。
5.权利要求1的方法，其中所述酸性溶液包含1.5的pH。
6.权利要求1的方法，其中所述动态结合能力保持50-100个循环。
7.权利要求1的方法，其中所述动态结合能力保持100-200个循环。
8.权利要求1的方法，其中所述固体支持物包含聚乙烯醚聚合物。
9.一种使用酸性和碱性溶液清洗亲和色谱柱的方法，所述方法包括：
清洗步骤，所述清洗步骤基本上包括
a)在亲和纯化循环之间使所述柱与酸性和碱性两种溶液接触，其中所述酸性溶液基本上包含酸，并且所述碱性溶液基本上包含碱；或者
b)使所述柱在循环之后与酸性溶液接触或在循环之后与碱性溶液接触，其中所述酸性溶液基本上包含酸，并且所述碱性溶液基本上包含碱，从而所述酸性和碱性溶液以交替方式使用，
其中所述亲和色谱柱包含A蛋白介质，所述A蛋白介质包含固定在固体支持物上的源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)A蛋白的C结构域的A蛋白配体，
其中所述动态结合能力保持50-200个循环。
10.权利要求9的方法，其中所述固体支持物包含选自以下的聚合物：聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚碳酸酯。
11.权利要求9的方法，其中所述酸性溶液基本上包含磷酸。
12.权利要9的方法，其中所述碱性溶液基本上包含氢氧化钠。
13.权利要求9的方法，其中所述方法导致协同去除杂质。
14.权利要求9的方法，其中所述配体包含选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
15.权利要求1的方法，其中所述碱性溶液为0.1M氢氧化钠至0.5M氢氧化钠。
16.权利要求9的方法，其中所述氢氧化钠溶液为0.1M氢氧化钠至0.5M氢氧化钠。
17.权利要求9的方法，其中所述动态结合能力保持50-100个循环。
18.权利要求9的方法，其中所述动态结合能力保持100-200个循环。
19.权利要求1的方法，其中在经历50-200个循环后动态结合能力没有显著变化。
20.权利要求9的方法，其中在经历50-200个循环后动态结合能力没有显著变化。
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