KR100372209B1 - 항체정제법 - Google Patents
항체정제법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100372209B1 KR100372209B1 KR1019960704604A KR19960704604A KR100372209B1 KR 100372209 B1 KR100372209 B1 KR 100372209B1 KR 1019960704604 A KR1019960704604 A KR 1019960704604A KR 19960704604 A KR19960704604 A KR 19960704604A KR 100372209 B1 KR100372209 B1 KR 100372209B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- antibody
- support
- protein
- organic polymer
- agarose
- Prior art date
Links
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 157
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 148
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims abstract description 76
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 80
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 43
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 43
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 claims description 37
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 37
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 27
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 claims description 27
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 23
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 16
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 16
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 13
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 10
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 9
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 7
- -1 sulfoethyl Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 claims description 2
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 claims 26
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical compound [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 claims 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 claims 1
- 239000012461 cellulose resin Substances 0.000 claims 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 claims 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 135
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 239000000047 product Substances 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 26
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 23
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 20
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 19
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 17
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 16
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 14
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 13
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 10
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 10
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 10
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 4
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Substances OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 241001437938 Proceps Species 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- MNIQECRMTVGZBM-UHFFFAOYSA-N 3-(1-methylpyrrolidin-2-yl)pyridine;7h-purin-6-amine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC=N2.CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 MNIQECRMTVGZBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000012560 cell impurity Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000739 chaotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920006026 co-polymeric resin Polymers 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003219 hemolytic agent Substances 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/32—Bonded phase chromatography
- B01D15/325—Reversed phase
- B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 항체 분자 단백질의 정제법에 소수성 상호작용 크로마토그래피 조합 크로마토그래피를 적용하는 것에 관한 것이다. 이 방법은 단백질 A 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피의 일련의 단계를 포함할 수 있다. 이 방법에 의해 면역글로불린 응집체, 잘못 포개진 종, 숙주 세포 단백질, 및 단백질 A가 없는 정제된 단량체 IgG 항체를 수거할 수 있다.
Description
발명의 분야
본 발명은 단백질 정제 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 면역 글로불린 G 단량체의 분리에 소수성 상호작용 크로마토그래피 (Hydrophobic Interaction Chromatography) (HIC)를 적용하고 IgG 항체 분자를 정제하기 위한 조합 크로마토그래피적 프로토콜에 HIC를 통합시키는 것에 관한 것이다.
발명의 배경
종래, 단백질 정제 계획은 정제할 단백질과 원치않는 단백질 불순물 사이의 크기, 전하 및 용해도와 같은 분자 성질의 차이에 입각해왔다. 이러한 변수에 기초한 프로토콜에는 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 분별 침전법 등이 있다.
겔 여과 또는 겔 투과 크로마토그래피로도 알려진 크기 배제 크로마토그래피는 이동상 중의 거대분자가 정지상 입자의 세공 내로 침투하는 것에 의존한다. 차동적인 침투는 입자의 수력학적 부피의 함수이다. 따라서, 이상적인 조건하에서는 보다 큰 분자가 입자의 내부로부터 배제되는 반면 보다 작은 입자는 이 공간에 접근할 수 있으며, 용출 부피와 분자량의 로그값 사이에 선형 관계가 존재하기 때문에 용출의 순서를 단백질의 크기에 의해 예측할 수 있다.
가교 결합된 덱스트란을 기재로 한 크로마토그래피용 지지체, 예를 들면 세파덱스(), 구상 아가로오스 비이드, 예를 들면 세파로오스 () (둘 다 스웨덴 웁살라 소재 Pharmacia AB사에서 구입 가능), 가교 결합된 폴리아크릴아미드를 기재로 한 것, 예를 들면 바이오겔 () (미합중국 캘리포니아주 리치몬드 소재 BicRad Laboratories사에서 구입 가능), 또는 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체를 기재로 한 것, 예를 들면 도요펄 (TOYOPEARL) HW65 (일본 도꾜 소재 Toso Haas Co.사에서 구입 가능)가 크기 배제용의 여러 크로마토그래피용 칼럼을 형성하거나, 또는 본 발명의 특정 측면의 실시에서 HIC 크로마토그래피에 유용하다.
침전법은 단백질의 조혼합물에서는 개별 단백질의 용해도가 아주 다양하기 쉽다는 사실에 근거한 것이다. 수성 매질에서의 단백질의 용해도가 여러가지 요소에 의존하기는 하지만, 본 논의의 목적상 일반적으로 단백질과 용매와의 상호작용이 동일하거나 유사한 종류의 단백질 분자와의 상호작용보다 더 큰 경우 그 단백질은 가용성일 것이라고 할 수 있다. 침전 현상을 설명하는 특정한 기계론적인 이론에 구애되기를 원치 않는다 하더라도, 단백질과 물 분자와의 상호작용은 전하를 띠지 않는 수종의 기와 (또는) 정전기적으로 쌍극자인 전하를 띤 기와의 수소 결합에 의해 일어날 수 있으며, 일가 양이온의 염 (예, 황산암모늄)과 같은 침전물은 물 분자를 두고 단백질과 경쟁한다고 생각된다. 따라서, 염의 농도가 높을 때에는 단백질이 "탈수"되어 수성 환경과의 상호작용이 저하되고 동일하거나 유사한 단백질과의 응집이 증가되어 매질로부터의 침전이 일어난다.
이온 교환 크로마토그래피는 샘플 내의 전하를 띤 관능기와 흡착제 표면 상의 반대전하의 이온성 관능기와의 상호작용을 수반한다. 두 가지 일반적인 작용 유형이 공지되어 있다. 음이온 교환 크로마토그래피는 양전하를 띤 표면과 상호작용하는 음전하를 띤 아미노산 측쇄 (예, 아스파르트산 및 글루탐산)에 의해 매개되고 양이온 교환 크로마토그래피는 음전하를 띤 표면과 상호작용하는 양전하를 띤 아미노산 잔기 (예, 리신 및 아르기닌)에 의해 매개된다.
보다 최근에는 친화도 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 기술이 개발되어 보다 전통적인 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피법을 보충해주고 있다. 친화도 크로마토그래피는 단백질과 고정화된 리간드의 특정상호작용에 기초한 것이다. 리간드는 특정한 관련 단백질에 대해 특이적일 수 있는데, 이 경우 리간드는 기질, 기질 유사체, 억제제, 수용체 또는 항체이다. 이와달리, 리간드는 다수의 관련 단백질과 반응할 수도 있다. 아데노신 모노포스페이트, 아데노신. 디포스페이트, 니코틴 아데닌 디뉴클레오티드 또는 일부 염료와 같은 기 특이성 리간드를 사용하여 특정한 종류의 단백질을 수거할 수도 있다.
항체 분자의 정제에 관해서는, 특이적인 친화도 기법 및 일반화된 친화도 기법을 둘다 적용할 수 있다. 항체의 친화도 정제법에 사용하기 위한 리간드 중 가장 구체적인 선택은 목적하는 항체가 반응하는 항원 (또는 그의 에피토프)이다. 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)과 같은 공지의 많은 면역흡착 분석법이 이러한 특정항원/항체 친화도 상호작용에 입각한다.
그러나, 일반화된 친화도 기법도 유용하다. 예를 들면,스타필로코칼(Staphylococcal) 단백질 A는 1gG 부류의 특정 항체와 결합하는 것으로 알려져있다(Ey, P.L. et. al. Immunochemistry 15: 429-36 (1978) 참조). 별법으로, 이형 종에서 생긴 항혈청 (예를 들면, 래빗 안티-마우스 항혈청)은 일반적인 항체 군을 분리하는 데 사용될 수 있다 (Current Protocols in Molecular Biology Supra, Chap 11 참조).
소수성 상호작용 크로마토그래피는 처음에 탄화수소 스페이서 암을 함유하지만 친화도 리간드는 결여되어 있는 친화도 겔에 단백질이 보유될 수 있다는 관찰 결과로부터 개발되었다. 이 분야에서 소수성 크로마토그래피라는 용어를 종종 사용하기는 하지만 이 방법이 용질과 소수성인 겔 사이의 상호작용에 의한 것으로 크로마토그래피적 과정이 아니기 때문에 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)라는 용어가 더 바람직하다. 소수성 상호작용은 이온 강도가 높을 때 가장 강해지므로 이 형태의 분리는 염의 침전 또는 이온 교환 과정에 이어서 편리하게 수행된다. HIC 지지체로부터의 용출은 용매, pH, 이온 강도의 변화에 의해, 또는 카오트로프제 또는 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜과 같은 유기 변성제의 첨가에 의해 이루어질 수 있다. 미합중국 특허 제3,917,527호 및 제4,000,098호에서 소수성 상호작용 크로마토그래피의 일반 원리에 대한 기술을 찾아볼 수 있다. 특정 단백질의 정제에 HIC 를 적용하는 것은 다음 문헌들에 예시되어 있다: 인간 성장 호르몬 (미합중국 특허 제4,332,717호), 톡신 결합체 (미합중극 특허 제4,771,128호), 용혈 방지 인자 (미합중국 특허 제4,743,680호), 종양 괴사 인자 (미합중국 특허 제4,894,439호), 인터류킨-2 (미합중국 특허 제4,908,434호), 인간 림포톡신 (미합중국 특허제4,920,196호), 및 리조자임류 [Fausnaugh, J.L. & F.E. Regnier, J. Chromatog., 359: 131-146 (1986)] 및 가용성 보체 수용체 (미합중국 특허 제5,252,216호). 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)와 관련하여 HIC는 단일 단계 프로토콜에서 무상항체 분자로부터 항체 단편 (예, F(ab')2)을 분리하는 데 사용하여 왔다 (Morimoto, K. et al., J. Biochem. Biophys. Meth. 24: 107-117 (1992)).
친화도 및 HIC 기법 이외에, 하나 이상의 종래의 단백질 정제 계획이 항체 정제에 적용되어 왔다. 예를 들면, 하칼라흐티 (Hakalahti, L.) 등 (J. Immunol. Meth. 117: 131-136 (1989))은 2개의 연속 이온 교환 크로마토그래피 단계를 사용하는 방법 또는 단일 이온 교환 단계에 이어서 HIC 단계를 사용하는 방법을 개시하고 있다. 다니엘슨 (Danielsson A.) 등 (J. Immunol Methods 115: 79-88 (1988))은 각각 음이온 교환, 양이온 교환, 크로마토포커싱 및 HIC에 근거한 단일 단계 방법을 비교하였다.
단백질 A 친화도 칼럼 크로마토그래피가 광범위하게 사용되지만, 이러한 칼럼으로부터 항체의 용출에 의해 지지제로부터 잔류 단백질 A의 침출이 초래될 수 있다는 것도 이해된다. 크기 배제 HPLC (Das et al., Analytical Biochem. 145: 27-36(1985)) 및 음이온 교환 크로마토그래피 (EPO345549호, 1989년 12월 13일 공개)가 이러한 문제점을 다루는 수단으로서 제안되어 왔다.
이제, 놀랍게도 단백질 A 크로마토그래피 지지체로부터 용출되는 IgG 혼합물로부터 단백질 A가 오염되는 것을 막기 위해 HIC를 유용하게 사용할 수 있다는 사실을 발견하였다.
본 발명은 단량체 IgG를 함유하는 혼합물로부터 단량체 IgG를 분리하는 데 HIC를 적용하고 면역글로불린 G 분자를 정제하기 위해 단백직 A 및 이온 교환 크로마토그래피를 조합하는 방법에 HIC를 통합시키는 것에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 항체의 정제 방법의 일례의 플로우 다이아그램이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 면역글로불린 분자의 대규모 정제에 적용가능한 단백질 정제 기술에 관한 것이다. 본 발명은 >95% 단백질 순도의 단량체 IgG를 수거할 수 있기 때문에 특히 유용하다. 본 발명은 수 많은 상이한 면역글로불린 G 분자의 정제에 사용될 수 있다.
항체-유사 단백질은 본 명세서에서 기재된 방법에 의해 정제할 수 있는 단백질이며, 이러한 방법은 필요에 따라 불공정한 실험을 수반하지 않는 일상적인 비-발명성 조정에 의해 변형된다. 이러한 단백질로는 면역글로불린 유전자의 이소타입, 알로타입 및 대립 유전자, 끝을 자른 형태, 변형된 항체, 예를 들면 키메라 항체, 인간화 항체 등, PEG 처리 등에 의해 화학적으로 변형된 형태, 및 면역글로불린 잔기를 함유하는 융합 단백질이 포함된다. 이들 단백질들은 본 발명의 방법에 의해 정제할 수 있는 충분한 면역글로불린 단백질 특성 (예, Fc결정자)을 가지거나 보유하고 있기 때문에 항체-유사로서 언급된다. 구체적으로 달리 확인되지만 않는다면, 용어 항체 또는 면역글로불린 단백질이란 항체-유사 단백질도 포함한다.
본 발명의 면역글로불린 분자는 이에 국한되지는 않지만 면역된 동물의 혈청, 복수증 유체, 하이브리도마 또는 골수종 상등액, 면역글로불린 분자를 발현하는 재조합 세포주의 배양 및 면역글로불린 생성 세포의 모든 세포 추출물로부터 유도된 조절된 매체를 포함하는 여러 공급원으로부터 단리될 수 있다. 본 발명은 항체를 생성하는 다양한 재조합 세포주의 조절된 세포 배양의 배지로부터 항체를 정제하는 데 특히 유용하다. 본 명세서에 개시된 것을 기초로 하여, 각 세포주 마다의 일부 변형 및 다양한 항체 생성물 중의 일부 변형을 기대할 수 있기는 하지만,항체 단백질과 제조 세포주의 특정한 배합에 본 발명을 적용하는 것은 당업자의 범위내에 있다.
일반적으로 항체와 같은 유전자 코딩 단백질들은 폴리펩티드의 목적하는 영역을 코딩하는 DNA 서열을 재조합 DNA 운반자(즉, 벡터)에 혼입하고, 적절한 원핵세포 및 진핵세포 숙주를 형질전환 또는 형질이입시킴으로써 클론될 수 있다. 적절한 원핵세포 숙주는에스체리치아(Escherichia),스트렙토마이세스(Streptomyces),바실러스(Bacillus)등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 적절한 진핵세포 숙주는사카로마이세스(Saccharomyces)등의 효모 및 VERO, HeLa, 마우스 C127, 중국 햄스터 난소(CHO), WI-38, BHK, COS, MDCK, 골수종 등의 배양시 동물 세포, 및 곤충 세포주를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 특히 바람직한 숙주는 ATCC CRL 1793, CRL 9096 등의 디히드로폴레이트 환원 효소가 결핍된 CHO 세포주 및 기타 후술하는 세포주이다. 이와 같은 재조합 기술은 현재 공지되어 있고, 문헌 (Methods in Enzymology(아카데미 출판사) Vol. 65 및 69(1979), 100 및 101(1983)), 및 본 명세서에 인용된 참고문헌들에 기재되어 있다. 가장 통상적으로 사용되는 재조합 DNA 방법론을 구현하는 광범위한 기술 토론은 문헌 (Maniatis et al.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory(1982) 또는Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, Wiley Interscience (1988, 1991, 1993))에서 발견할 수 있다.
항체 분자와 같은 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 수득하는 한 가지 방법은 cDNA 클로닝을 통해서이다. 이 방법에서, 전달 RNA(mRNA)는 공지된 세포들로부터 분리하거나 목적하는 단백질을 제조하는 것으로 생각된다. 일련의 효소 반응을 통해, 세포들의 mRNA 개체군은 보체 DNA(cDNA)로 복사된다. 생성된 cDNA 는 그후 클로닝 벡터들로 삽입되어 적절한 원핵세포 또는 진핵세포 숙주를 형질전환하는데 사용된다. 생성된 cDNA "라이브러리(library)"는 형질전환된 숙주 세포들의 개체군으로 이루어지며, 이들 각각은 단일 유전자 또는 유전자 단편을 포함한다. 이론상 전체 라이브러리는 출발 물질로서 사용된 mRNA 혼합물에 존재하는 코딩 정보의 대표적인 샘플을 제공한다. 라이브러리는 특정 DNA 서열을 동정하기 위하여 핵산 또는 항체 프로브를 사용하여 검색될 수 있다. 이들 DNA 서열들은 일단 분리되면, 변형되거나 완전한 유전자로 조합될 수 있다.
항체 유전자의 특정한 단편은 유전자의 나머지 부분에 관계없이 공작될 수 있다. 보체 결정 영역 (CDR)을 코딩하는 DNA 단편은 이형 종으로부터 DNA 프레임워크 서열로 통합되어 변경된 항체를 생성할 수 있다. 이들 변경된 항체는 원치않는 생리적 증상의 처리시에 상당한 유용성을 가진다. 예를 들면, PCT/GB91/01554호 (국제 특허 공개 WO92/04381로서 공개됨)은 호흡기 합포체 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus) (RSV) 감염의 치료 및 예방에 유용한 "인간화" 항체의 생성을 개시하고 있다. 별법으로, 항체 유전자의 전체 가변 영역은 제2 항체의 일정한 도메인에 융합되어 "키메라 항체"로서도 공지된 변경된 항체를 형성할 수 있다. 예를들면, PCT/US92/06194호 (국제 특허 공개 WO93/02108로서 공개됨)는 인간 CD4 수용체와 반응성인 원숭이/인간 키메라 항체를 개시하고 있다.
일단 항체 유전자 또는 유전자 단편이 클론되면, DNA는 발현 벡터에 도입할수 있고, 이러한 구성은 적절한 숙주 세포를 형질전환하는데 사용된다. 형질발현 벡터는 여기에 정의된 형질발현 조절 서열을 가지는 것으로서 특징이 있고, 당해 DNA 서열이 실시가능하게 여기에 연결될 때, 벡터는 벡터를 포함하는 숙주 세포에서 당해 DNA 서열에 의해 코딩된 생성물의 제조를 지시할 수 있다. 본 발명을 구체적으로 참조하여, 형질발현시 항체 분자가 형성되도록 단일 코딩 서열의 단편들을 조합할 수 있다. 재조합 항체 생산에 대한 이러한 프로토콜의 특히 효능있는 적용은 상기에 인용된 바와 같이 문헌 (Harris, et al., 1992. 3, 19.자 공개된 국제 특허 공개 WO92/04381호 및 Newman et al., 1993. 2. 4.자 공개된 국제 특허 공개 WO93/02108호)에서 발견된다.
재조합 생성물이 제조된 후에, 생성물을 수거하는 것은 바람직하다. 만일 생성물이 이를 제조하는 세포에 의해 수송된다면, 생성물은 세포 배양 배지로부터 직접수거될 수 있다. 만일 생성물이 세포내 보유된다면, 세포들은 세포내 생성물을 수득하기 위하여 기계적, 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 물리적으로 파괴되어야 한다.
단백질 생성물의 경우에, 정제 프로토콜은 제조시 전체 단백질에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 95% 이상의 순도를 가지는, 본질적으로 다른 단백질이 없는 단백질 생성물을 제공함은 물론, 다른 숙주 세포 불순물, DNA, RNA, 잠재성 발열인자 등을 제거하거나 허용가능한 수준으로 감소시켜야 한다. 또한, 재조합 발현 시스템에 의한 항체 생성의 관점에서, 보다 고분자량의 종내로 150,000 달톤 IgC 생성물의 응집이 일어날 수 있다는 것이 이해된다. 따라서, 생성물 순도 및 표준화의목적상, 보다 고분자량의 응집체 및 다른 잘못 포개진 형태로부터 본래의 150,000 달톤 단량체 종을 분리하는 것도 유용하다. 150,000 달톤 IgG 종이 4개의 폴리펩티드쇄 (2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)로 이루어진다는 것이 이해되지만, 150,000 달톤 종은 본 명세서에서 "단량체" 또는 "단량체 IgG"로서 언급된다.
상술한 바와 같이, 다양한 숙주 세포들은 본 발명의 항체의 생산에 사용될 수 있다. 특정 숙주 세포의 선택은 특히 항체의 성질, 그의 합성 속도, 그의 부패 속도 및 항체의 형질발현을 지시하는 재조합 벡터의 특성을 고려할 때 당업자의 범위내에 있다. 숙주 세포발현계의 선택에 따라 사용되는 세포배양 과정들의 성질이 크게 좌우된다. 특정 제조 형태는 일단 형질발현제가 선택된다면 회분식 또는 연속식, 스피너 또는 에어 리프트, 액체 또는 고정화를 선택할 수 있다. 따라서 유동층 생반응기, 중공 섬유 생반응기, 롤러 병 배양기 또는 교반 탱크 생반응기가 세포 미세담체를 가지거나 가지지 않거나 다양하게 사용될 수 있다. 이와 같은 선택의 표준은 세포 배양 기술에서 인식된다. 이들은 본 발명의 범위를 벗어나기 때문에 여기에서는 설명하지 않겠다. 본 발명은 조절된 세포 배양 배지, 하이브리도마 상등액, 항혈청, 골수종 상등액 또는 복수증 유체에서 이들의 존재가 부여된 항체의 정제에 관한 것이다.
상술한 바와 같이 본 발명은 특히 항체 분자의 분리 및 정제에 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 적용하는 것에 관한 것이다. 수성 용매 중의 소수성 분자는 스스로 회합될 것이다. 이 회합은 소수성 상호작용에 기인한다. 이제 단백질과 같은 거대분자가 예기되는 친수성기 이외에 그들의 표면상에 광범위한 소수성반점을 갖는다는 것이 이해될 것이다. 부분적으로는, HIC는 크로마토그래피 지지체에 부착된 소수성 리간드와 이들 반점의 상호작용으로 단언된다. 매트릭스에 결합원 소수성 리간드는 본 명세서에서는 HIC 지지체, HIC 겔 또는 HIC 칼럼과 같이 여러가지로 언급된다. 또한, 단백질과 HIC 지지체 사이의 상호작용력은 단백질상의 비극성 대 극성 표면의 비율의 함수일 뿐만 아니라 비극성 표면의 분포 및 HIC 지지체의 화학에 의한다는 것이 이해된다.
많은 크로마토그래피용 지지체가 HIC 칼럼의 제조에 사용될 수 있으며, 아가로오스, 실리카 및 유기 중합체 또는 공중합체 수지가 가장 광범위하게 사용된다. 유용한 소수성 리간드로는 이에 국한되는 것은 아니지만, 부틸, 프로필 또는 옥틸과 같이 탄소 원자수 약 2 내지 약 8의 알킬기: 또는 페닐과 같은 아닐기가 포함된다. 겔 및 칼럼용의 통상적인 HIC 제품은 스웨덴 웁살라 소재의 파마시아 엘케이비 에이비 (Pharmacia LKB AB)와 같은 공급업자로부터의 제품명(), 페닐 또는CL-4B,() FF;FF 및 FF: FF; 일본국 도꾜 도소오 코포레이션 (Tosoh Corporation)으로부터의 상품명 도요펄 (TOYOPEARL) 에테르 650, 페닐 650 또는 부틸 650 (프락토겔(Fractogel)): 이스라엘 레호보트 소재의 마일스-예다 (Miles-Yeda)로부터의 상품명 알킬-아가로오스 (여기서, 알킬기는 탄소 원자수가 2-10임) 및 미합중국 뉴저지주 필스버그 소재의 제이티 베이커 (J.T. Baker)로부터의 상품명 베이커본드(Bakerbond) WP-HI-프로필로서 상업적으로 얻을 수 있다.
또한, 종래의 화학을 사용하여 목적하는 HIC 칼럼을 제조하는 것도 가능하다 (예를들면, Er-el. Z. et al., Biochem. Biophys, Res. Comm. 49:383 (1972) 또는 Ulbrich, V. et al., Coll. Czech. Chem. Commum. 9: 1466 (1964)을 참조).
리간드 농도는 상호작용력 뿐만 아니라 칼럼의 용량에도 영향을 미친다는 점에서 중요한 인자이다. 시판되는 페닐 또는 옥틸 페닐 겔의 리간드 농도는 40 μmoles/ml 겔 층 정도이다. 겔 용량은 문제의 특정 단백질 뿐만 아니라 pH, 온도 및 염의 형태와 농도의 함수이지만, 일반적으로는 3-20 mg/ml 겔 범위내에 드는 것으로 기대될 수 있다.
특정 겔의 선택은 숙련가들에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 단백질 및 HIC 리간드의 상호작용력은 알킬 리간드의 쇄 길이에 따라 증가하지만, 탄소 원자수 약 4 내지 약 8의 리간드가 최상의 분리에 적합하다. 페닐기는 펜틸기와 거의 동일한 소수성을 가지지만, 선택성은 단백질상의 방향족기와의 파이-파이 (pi-pi) 궤도의 상호작용의 가능성으로 인해 상당히 상이할 수 있다. 선택성은 또한 지지 수지의 화학성에 영향 받을 수 있다.
HIC 칼럼으로의 단백질의 흡착은 높은 염 농도에 의해 선호되지만, 실제 농도는 단백질의 특성 및 선택된 특정 HIC 리간드에 따라 광범위하게 변화할 수 있다. 여러 이온들은 그들이 소수성 상호작용 (염출 (salting-out) 효과)를 촉진시키느냐 아니면, 물의 구조를 붕괴시켜서 (혼란 (chaotropic) 효과) 소수성 상호작용이 약해지도록 유도하느냐에 따라 소위 소용성 (soluphobic) 씨리즈로 배열될 수있다. 양이온은 증가하는 염출효과에 의해로서 나열될수 있다. 반면에 음이온은 증가하는 혼란 효과에 의해으로서 나열될 수 있다.
따라서, 다음 관계에 의해 나타내지는 바와 같이 상호작용력에 영향을 미치는 염이 배합될 수 있다.
일반적으로, 약 0.75 내지 약 2 M 황산암모늄 또는 약 1 내지 4 M NaCl의 염 농도가 유용하다.
HIC 분리에 대한 온도의 영향은 일반적으로는 온도의 감소가 상호작용을 감소시키지만 간단하지는 않다. 그러나, 온도를 증가시킴으로써 생기게 된 어떠한 이익도 이러한 증가가 단백질의 안정성에 대해 갖는 부작용과 비교 검토되어야 한다.
용출은 계단식이든 구배 형태이든 여러 방법: (a) 염 농도의 변경, (b) 용매의 극성의 변경 또는 (c) 세정제의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 흡착된 단백질은 염 농도를 감소시킴으로써 증가하는 소수성의 순서로 용출된다. 극성의 변경은 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜 또는 (이소)프로판올과 같은 용매를 첨가하여 소수성 상호작용력을 감소시킴으로써 행해질 수 있다. 세정제는 단백질의 변위제로서 작용하고 우선적으로 막 단백질의 정제와 관련하여 사용되어 왔다.
HIC 크로마토그래피는 단량체 IgG (분자량 150,000)를 응집체 및 잘못 포개진 종으로부터 분리하는 데에만 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌지만, 상술한 바와 같이, HIC는 다른 단백질 정제 기술과 함께 병용될 때 특히 유용하다. 말하자면,다른 단백질 정제법에 의해 부분적으로 정제된 혼합물에 HIC를 적용하는 것이 바람직하다. "부분적으로 정제된"이란 용어는 관심의 대상인 단백질이 5중량% 이상, 보다 바람직하게는 10중량%이상, 가장 바람직하게는 45중량%이상으로 존재하는 단백질 제제를 의미한다. "혼합물"이란 용어는 목적한 단량체 IgC 항체 분자가 바람직하지 않은 오염물, 예를 들어 이에 제한 되는 것은 아니지만, 면역 글로불린 응집체, 잘못 포개진 종, 숙주 세포 단백질, 이전의 크로마토그래피 단계로부터의 잔류물 (예: 사용되었을 경우에 단백질 A)중 하나 이상과 배합되어 있는 것을 의미한다. 따라서, HIC를 적용하는 것은 또한 친화도 정제 모노클론 항체와 같은 면역글로불린 단백질에 대한 전체 정제 프로토콜과 관련이 있는 것으로 여겨질 수 있다. 예를 들면, HIC의 적용에 앞서 부분 정제법을 조절된 세포 배양 배지의 샘플에 적용하는 것이 유용한 것으로 밝혀졌다. "조절된 세포 배양 배지"란 용어는 세포 성장 및(또는) 세포 유지를 지지하고 분비된 생성물을 함유하는 세포 배양 배지를 의미한다. 이러한 배양 배지의 샘플은 HIC 단계의 적용에 앞서 하나 이상의 단백질 정제 단계를 행한다. 샘플은 제1 단계로서 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 단백질 A를 사용하는 친화도 크로마토그래피를 거칠 수 있다. 예를 들면, 조절된 포어 글라스에 공유 결합된 단백질 A로 구성된 프로셉-A (BioProcessing Ltd., U.K. )가 유용하게 사용될 수 있다. 다른 유용한 단백질 A제제로는 단백질 A 세파로오스패스트 플로우 (Pharmacia) 및 도요펄(TOYOPEARL) 650M 단백질 A (TosoHaas)가 있다, 제2 단계로서, 이온 교환 크로마토그래피가 사용될수 있다. 이와 관련하여, 여러 음이온 또는 양이온 치환체는 매트릭스에 부착되어 크로마토그래피용 음이온 또는 양이온 지지체를 형성할 수 있다. 음이온 교환 치환체로는 디에틸아미노에틸기 (DEAE), 4급 아미노에틸기 (QAE) 및 4급 아민기 (Q)가 포함된다. 양이온 교환 치환체로는 카르복시메틸 (CM), 술포에틸 (SE), 술포프로필 (SP), 포스페이트 (P) 및 술포네이트 (S)가 포함된다. DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 및 CM-52와 같은 셀룰로오스상 이온 교환 수지는 영극 켄트 메이드스톤 소재의 와트만 리미티드 (Whatman Ltd.)로부터 이용가능하고 세파덱스기재의 가교 결합된 이온 교환 수지도 알리져 있다. 예를들면, DEAE-, QAE-, CM- 및 SP-세파덱스및 DEAE-, Q-, CM- 및 S-세및 세파로오스패스트 플로우는 모두 파마시아 에이비 (Pharmacia AB)로부터 입수가능하다. 또한, 도요펄 (TOYOPEARL) DEAE-650S 또는 M 및 도요펄 CM-650S 또는 M과 같이 DEAE 및 CM 유도된 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체는 둘다 미합중국 펜실바니아주 필라델피아 소재의 도소 하스 코포레이션 (Toso Haas Co.)으로부터 입수가능하다. 이온 교환 지지체로부터의 용출은 통상 염의 부가를 수반하고, 상술한 바와 같이 HIC는 증가된 염농도하에서 향상되기 때문에, 이온 교환 크로마토그래피 단계 또는 다른 염 매개 정제 단계에 이어서 HIC 단계를 도입하는 것이 특히 바람직하다. 반드시 이에 국한되는 것은 아니지만, 추가의 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 바이러스 불활성화, 농축 및 동결 건조를 포함하여 추가의 정제 프로토콜이 추가될 수도 있다.
예시만의 목적으로, 본 발명을 IgG 이소타입의 여러 항체의 정제법에 적용하였다. 보다 구체적으로, 해리스 (Harris) 등의 국제 특허 공개 WO92/04381호 (1992년 3월 19일 공개)에 기재된 RSV 감염의 처리에 유용한 인간화 항체 (이후 "RSHZ-19"로 칭함) 및 뉴만 (Newman) 등의 국제 특허 공개 WO93/02108호 (1993년 2월 4일 공개)에 기재된 CD4 항원에 대해 특히 반응성인 키메라 항체 (이후 CH-CD4로 칭함)에 적용하였다. RSHZ-19 및 CH-CD4 키메라 항체의 생산을 위한 재조합계의 구축은 상기의 PCT 출원에 설명되어 있으며, 그 내용을 본 명세서에서 배경 기술의 목적에서 참고 문헌으로 채택하며, 다음과 같이 요약한다.
RSHZ-19 코딩 서열을 함유하는 발현 플라스미드를 dhfr-요구 중국 햄스터 난소 세포주로 pSV2dhfr과 함께 동시 형질이입시켰다 (CHODUXBII). 형질 이입은 성장 배지에서 행하고 문헌 [DNA Cloning, 글로버 (D.M. Glover) 출판 (제15장, 고르만(C. Gorman))]에 기재되어 있는 바와 같은 칼슘 공침/글리세롤 충격법을 이용하였다. 형질이입에 이어서, 세포를 선택 과정에 앞서 배양 조건 (상술한 바와 같음)하에 46 시간 동안 성장 배지에서 유지시켰다.
선택 및 동시 증폭 과정은 카우프만 (R.J. Kaufman) 등의 문헌 (Mol. Cell. Biol. 제5권: 제1750-1759페이지 (1985년))에 기재된 바와 같이 필수적으로 행하였다. 형질이입한 지 46 시간 후, 세포를 선택성 배지 MEM ALPHA (041-02571), 1 % 원액 글루타민, 1 % 원액 펜/스트렙 (043-05070) 및 투석된 소 태아 송아지 혈청(220-6300AJ) (스코틀랜드 파이슬리 기브코(Gibco))로 변경하였다. 세포를dhfr+군체가 나타날 때까지 8-10 일 동안 선택 배지에서 유지시켰다. 군체를 설정할때, 세포를 메토트렉세이트를 함유하는 선택성 배지 (A6770, 미합중국 몬타나주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 코포레이션 (Sigma Chem. Co.))으로 변경시켰다. 메토트렉세이트 농도는 처음에 0.02 μM이고 5 μM까지 계단식으로 증가하였다. 증폭 과정 동안, 성장하는 세포로부터 성장 배지의 분액을 인체 IgG에 의한 RSHZ-19 생성에 대해 분석하였다. 재조합 세포주를 분비하는 임의의 항체를 사용하여 본 발명에 따른 정제용 조절된 배지를 공급할 수 있지만, 특정 세포주가 꼭 요구되지는 않는다.
RSHZ-19를 생성할 수 있는 형질이입된 CHO 세포주는 여러 세포 배양 기술에 의해 배양할 수 있다. 본 발명을 적용하기에, 특정 배양 방법이 중요하치는 않다.
전술한 바와 같이, 특정 재조합 생산계 및 특정 세포 배양 프로토콜은 본 발명의 범위는 아니다. 상술한 계 및 프로토콜은 당업자에게 이용가능한 많은 선택 중의 대표적인 것이고 여기서는 단지 설명할 목적으로만 포함되어 있다. 본 발명의 주제인 정제 프로토콜는 단지 통상의 변경과 함께, 이들이 제조되거나 배양되는 방법에 관계없이 다양한 재조합 항체 및 항체 유사 단백질에 사용할 수 있다. 예를 들어 CD4에 대한 키메라 단일클론 항체도 본 발명의 방법에 의하여 정제되었다.
본 발명의 방법을 실시하여 얻어지는 정제 항체들은 1) 항체 단백질이 97 중량% 이상이고: 2) 4℃에서 3개월 이상 동안 단백질 가수 분해에 대하여 안정하고; 3) 내 독소 함량이 낮고 (<0.1 E.U./mg 단백질): 4) DNA 함량이 낮고 (< 1 pg/mg단백질): 5) 비 항체 단백질이 5 중량% 미만이고: 6) 바이러스 불활성인 특성을 갖는다. 다음의 실시예들은 추가로 본 발명을 설명하지만 본 명세서의 특허 청구 범위를 제한하지는 않는다.
<실시예 1>
도입
하기에 약술한 방법은 호흡기 합포체 바이러스 (RSV)에 대한 모노클론 항체를 단리 및 정제하기 위하여 전개된다. 이 항체는 CHO 세포로 나타내는 "인간화" IgG이고, 교반 탱크 생반응기에서 성장된 것이다. 이 항체에 대해서는 국제 특허 공개 WO92/04381호에 보다 구체적으로 설명되어 있고, 본 명세서에서는 RSHZ 19로 다르게 언급되고 있다. 본 방법은 숙주 세포, 세포 배양 배지, 또는 다른 원료 물질로부터 생기는 불순물을 제거하는 반면, 순도 95% 이상의 RSHZ-19를 제조하려는 것이다. 이 방법은 가장 바람직한 실시태양에서 3가지 정제 단계 (단백질 A 친화도, 양이온 교환, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피), 2가지 바이러스 불활성 처리단계, 및 생성물을 선택된 최종 완충액으로 교환하는 투석 여과 단계로 이루어진다(도 1에 약술). 모든 단계들은 실온 (18-25℃)에서 수행된다. 모든 완충액은 WFI로 제조되고 사용하기 전에 0.2 미크론 필터 또는 10,000 MWCO 막으로 여과된다. 완충액 조성은 표 1에 나타내었다. 표 2, 4, 6 및 8은 각각 실시예 IA, IB, IC 및 ID의 칼럼 변수를 나타낸 것이다. 표 3, 5, 7 및 9는 각각 실시예 IA, IB, IC 및 ID 정제 과정을 요약한 것이다.
본 방법의 제1 단계 (ProSep A 상의 단백질 A 친화도 크로마토그래피)는 무세포 배양액 (CCF)의 양을 다양하게 하도록 급속도로 순환될 수 있고, 대략 15 g RSHZ-19/ℓ ProSep A의 용량을 갖는다. 예를 들면, 400-500 g의 IgG를 포함하는 CCF 500 ℓ는 5 또는 6회 사이클로 처리될 수 있다. 본 방법의 후속 단계 (양이온 교환 크로마토그래피 (CEC) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC))들은 1 사이클 당 대략 130-140 g RSHZ-19를 수용하도록 되어 있다. 따라서, 400-500 g의 RSHZ-19를 포함하는 배양물 500 ℓ가 ProSep A포획 후의 3개의 후속 사이클에서 처리된다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 단계 (HIC)는 용출 동안 단백질 A 칼럼으로부터 유출되는 잔류 단백질 A를 제거하는 것으로 나타났다 (실시예 IA-ID) 참조). 또한, IgG의 응집체는 실시예 IC 및 ID에 나타난 바와 같이 HIC로 제거될 수 있다.
방법에 대한 설명은 임의의 규모로 표준화되며, 도시된 선형의 유속은 칼럼의 직경과 무관하고, 적재 비율은 단위 칼럼 부피에 대한 무게이다. 실시예에는 1 g, 40 g 및 125 g 규모의 공정 및 수거율이 제공된다 (실시예 IA-ID).
<정제 방법에 대한 설명>
<배양물로부터 세포의 제거>
배양액을 수화하기 위하여, 0.65 미크론의 필터 또는 균등물이 장치된 접선류 마이크로여과 장치 (Prostak)를 사용하여 세포를 제거한다. 생성물을 삼투물에서 수거한다. 작은 부피의 배양물에 대해서는 원심분리를 이용할 수 있다.
<단백질 A 크로마토그래피에 의한 친화도 포획>
사전에 PBS로 평형화시킨 ProSep A (BioProcessing Ltd.) 칼럼 상 흡착 크로마토그래피에 의하여 IgG를 CCF로부터 수거한다. 1000 cm/hr 이하의 유속, 15 g IgG/ℓ 칼럼 체적 이하의 적재 비율로 칼럼에 배지를 넣는다. 칼럼 충전 후에, 0.1 M 글리신을 포함하는 3 칼럼 부피 이상의 PBS로 그를 세척한다. 약 3 칼럼 부피의 용출 완충액을 적용하여 RSHZ-19를 저pH 완충액으로 용출시킨다.
단백질 A 크로마토그래피는 세포 및 배지 유도 불순물 (특히 유동 통과 및 세척 분획의 단백질 및 DNA)을 큰 비율로 제거하며, 후속의 공정을 위하여 용출 완충액 중에 RSHZ-19를 농축시킨다.
<산성 pH에서의 바이러스 불활성 처리 (임의 단계)>
단백질 A 칼럼 용출물을 수거하고, 2.5 M HCl을 첨가하여 pH 3.5로 조정한다. 용액을 제2 용기로 이송하고, 30분 이상 동안 pH 3.5로 유지시켜 바이러스의 불활성을 제공하고, 트리스 완충액을 첨가하여 pH 5.5로 재조정한다. 생성 용액을 예비여과기 (밀리포어 플리가드 (Millipore Polygard) 또는 균등물) 및 멸균 0.2 ㎛ 필터 (밀리포어 밀리팩 (Millipore Millipak) 또는 균등물)를 통과시키고, 4℃에서 멸균 용기 중에 보관하거나, -70℃로 냉동 유지시킨다.
pH 3.5 처리에 의하여 바이러스의 불활성이 제공되고, pH 5.5 조정에 의하여 양이온 교환 크로마토그래피 (CEC)용 용액이 제조된다. pH 3.5 처리는 필요한 경우 생략될 수 있다.
<양이온 교환 크로마토그래피>
pH 불활성 단백질 A 용출물을 CM 세파로오스 FF (Pharmacia LKB) 칼럼 상 CEC 크로마토그래피에 의하여 더 정제한다. 150 cm/hr의 유속 및 ≤20 g 단백질/ℓCM 세파로오스의 적재 비율로 샘플을 평형화된 칼럼에 넣는다. 충전 후에, 3 내지 5 칼럼 부피의 평형 완충액으로 칼럼을 세척한다. 생성물을 3-5 칼럼 부피의 용출 완충액으로 용출시킨다.
양이온 교환 크로마토그래피 단계는 단백질 및 비단백질 불순물을 제거한다.
<구아니딘에 의한 바이러스의 불활성 처리>
1.5 부피의 구아니딘 원액을 (혼합하면서) 서서히 첨가하여 대략 2.0 M 구아니딘 히드로클로라이드로 양이온 교환 용출물을 조정한다. 시약 첨가 속도는 5-15 분동안 첨가되도록 조정한다. 용액을 제2 용기로 이송하고, 30분 동안 유지시켜 바이러스의 불활성화를 달성한다. 유지시킨 후, 동부피의 황산암모늄 원액을 (혼합하면서) 서서히 첨가하고, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 단계를 즉시 행한다. 시약 첨가 속도는 5-15분 동안 첨가되도록 조정한다.
구아니딘 처리는 산 불활성화 단계가 이용되는 경우 제2의 바이러스 불활성화 단계를 제공하며, 황산암모늄 첨가 후에 RSHZ-19 가용성을 유지시키는데, 황산암모늄을 첨가하면 구아니딘이 희석되고 HIC용 용액이 제조된다.
<소수성 상호작용 크로마토그래피>
구아니딘 처리 용액을 평형 완충액로 미리 평형화시킨 도요펄 페닐-650M으로 이루어진 HIC 칼럼에 적용하여 추가 정제하였다. 구아니딘 처리 용액을 150 cm/시의 유속 및 페닐-650M 1 리터 당 단백질 20 g 이하의 적재 비율로 칼럼에 적용하였다. 적재 후, 칼럼을 3 내지 5 칼럼 부피의 평형 완충액로 세척하였다. 황산암모늄을 선형 구배로 감소시키면서 100 내지 150 cm/시의 유속으로 적용하였다. RSHZ-19가 1개의 주피크로 용출되고, 구배 후기에 불순물이 용출되었다. 구배 기울기는 약 20 칼럼 부피이고, 100% 평형 완충액로 출발해서 100% 구배 완충액(1.3M에서부터 OM 황산암모늄)로 종결하였다. 흡광도가 최대 피크 흡광도의 20%로 감소할 때까지 피크를 한데 모으고, 이후에는 생성물 분획 한데 모으기를 종결하였다. 구배가 종결된 후, 칼럼을 약 3 칼림 부피의 스트립 완충액로 세척하였다.
HIC 크로마토그래피 단계는 추가로 단백질 및 비단백질 불순물, 특히 잔류 단백질 A, IgG 응집체 및 숙주 DNA를 제거하였다.
<농축, 투석여과 및 최종 여과>
HIC 용출물을 분자량 30,000 이상 성분 차단 필터가 구비된 접선류(tangential-flow) 한외여과 장치(예: Millipore CUF)를 사용하여 약 10 mg/ml로 농축하고, 적당한 조성의 완충액 내로 투석여과하고, 멸균 0.2 미크론 필터(Millipore Milipak 또는 균등물)을 통해 멸균 용기 내로 여과하였다.
<공정 분석>
공정 중간체에 대해 OD280 또는 브래드포드(Bradford) 분석법에 의해 전체 단백질 농도를 분식하고, HPLC, 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해 RSHZ-19 농도를 분석하였다. 응집 생성물은 TSK3000 SWXL 상에서 크기 배제 HPLC로 분석하고, 단백질 A 잔류물은 ELISA를 이용하여 분석하였다.
<풀링(pooling)의 기준>
단백질 A 포획 및 양이온 교환 단계로부터 얻은 용출물 분획을 크로마토그램상의 UV 트레싱을 근거로 하여 폴링하고, 전체 피크를 한데 모았다. HIC 단계로부터 얻은 용출물을 UV 트레싱을 근거로 하여 풀링하고, 피크의 트레일링 부분의 UV 기록치가 피크 최대치의 20%에 달할 때까지 주피크를 풀링하였다. HIC 테일 분획은 대부분의 단백질 A 및 응집 IgG를 함유하였다.
<실시예 IA, RSHZ-19 정제 (도요펄 페닐-650M 이용, 1 g규모)>
5.0 L (직경 20 cm, 길이 16 cm) ProSep A 친화도 칼럼을 PBS(표 1 참조)로 5.2 l/분의 유속으로 평형화시켰다. 1 l당 0.8 g의 RSHZ-19 단일클론 항체를 함유하는 조절된 배양 배지 100 l를 상기한 바와 같은 마이크로여과로 청정화시키고, 5.2 l/분의 유속으로 칼럼에 적용하였다. 적재 후, 동일 유속으로 칼럼에 약 15 l의 PBS/글리신을 적용하였다. 15 내지 20 l의 ProSep A 용출 완충액을 적용하여 IgG를 용출시켰다. 미결합 피크 및 용출 피크의 분획들을 한데 모으고, HPLC 분석을 이용하여 IgG 함량을 분석하였다. 용출물의 부피는 약 15 l이고, 1 ml 당 약 5 mg의 단백질을 함유하였다.
용출 직후, 2.5 M 염산을 첨가하여 샘플의 pH를 3.5로 조정하고, 약 30분 동안 유지시키고, 1M 트리스 염기 약 350 ml를 첨가하여 pH 5.5로 조정하였다. pH 5.5로 중화시킨 후, 샘플을 멸균 0.2 미크론 밀리팩(Millipak) 200과 연결된 0.1 미크론 폴리가드(Polygarrd) CR 필터를 통해서 멸균 용기 내로 여과시켰다. 여액을 4℃에서 저장하였다. 여액 샘플에 대해 HPLC 분석으로 IgG 함량을 분석하고, 280 nm에서의 흡광도로 전체 단백질 함량을 분석하였다. 또한, 샘플들에 대해 ELISA 분석으로 단백질 A 함량을 분석하였다. 이 pH 3.5의 처리 및 여과된 ProSep A 용출물을 실시예 IA, B 및 C에서 CM 세파로오스 적재물로 사용하였다.
pH 3.5로 처리되고 여과된 ProSep A 용출물 400 ml를 CM 평형 완충액로 미리 평형화된 CM 세파로오스 FF의 220 mL (직경 4.4 cm, 길이 15 cm) 칼림 상에 38 ml/분의 유속으로 직접 적재하였다. 적재 후, 칼럼을 약 700 ml의 CM 평형 완충액로 38ml/분의 유속으로 세척하였다. CM 용출 완충액을 38 ml/분의 유속으로 적용하여 IgG를 용출하였다. 약 1충 부피의 용출 완충액이 통과한 후 IgG가 칼럼으로부터 빠져나왔다. 전체 피크를 CM 세파로오스 용출물로서 한데 모았다. CM 미결합 분획, 용출물 및 스트립 분획을 한데 모으고, IgG 함량, 전체 단백질 함량 및 단백질 A 함량에 대해 상기한 바와 같이 분석하였다. 용출물의 부피는 약 160 ml이었고, 1ml 당 약 12 mg의 단백질을 함유하였다. 이 CM 세파로오스 용출물을 약 80 ml씩 두개의 동일 부분으로 나누고, 실시예 IA 및 IB에서 HIC를 적재하는데 사용하였다. 80 ml의 CM 세파로오스 용출물에 전체 40 ml의 구아니딘 원액을 일정 속도로 교반하면서 서서히 첨가하였다. 이렇게 하여 구아니딘 농도를 바이러스 불활성화를 위해 2M로 만들었다. 구아니딘 처리 용액을 교반하면서, 전체 120 ml의 2.6 M 황산암모늄 원액을 첨가하였다. 얻어진 용액은 구아니딘 농도가 1.0 M이고, 황산암모늄 농도가 1.3 M이었다. 황산암모늄 처리 용액을 페닐 평형 완충액로 미리 평형화시킨 도요펄 페닐-650M 80 mL 칼럼 (직경 3.2 cm, 길이 10 cm)에 적용하였다. 유속은 실험 전반에 걸쳐 20 ml/분이었다. 적재 후, 칼럼을 약 350 ml의 페닐 평형 완충액로 세척하였다. 85% 평형 완충액/15% 구배 완충액로부터 출발하여 O% 평형완충액/100% 구배 완충액로 종결하는 선형 구배를 18 내지 19 칼럼 부피로 적용하여 IgG를 용출하였다. 이것은 황산암모늄의 출발 농도가 약 1.1 M이고 종결 농도가 OM인 것을 나타낸다. 이 구배의 기울기는 약 4.7% 용출 완충액 증가/칼럼 부피, 또는 -0.061 M 황산암모늄/칼럼 부피이었다. IgG는 약 7 칼럼 부피에서 칼럼으로부터 용출되기 시작하고, 약 13 칼럼 부피에서 구배로 종결하였다 (황산암모늄농도 약 0.7 M에서부터 0.3 M로). 용출된 분획을 피크의 테일링 부분의 UV 흡광도가 피크 높이의 20%로 감소할 때까지 한데 모으고, 이후에 또다른 용기에 모았다(테일 분획). 구배가 종결되었을 때, HIC 스트립 완충액 250 ml를 적용하여 칼럼을 재생시켰다. 페닐 미결합 분획, 용출물, 테일 및 스트립 분획을 한데 모으고, 상기한 바와 같이 IgG 함량, 전체 단백질 함량 및 단백질 A 함량에 대해 분석하였다. 용출물의 부피는 약300 ml이고, 1 ml 당 약 2.4 mg의 단백질을 함유하였다.
표 2에 이 실시예의 칼럼 변수를 요약해 놓았다. 각 단계의 생성물 및 단백질 수거 데이타를 단백질 A 함량 (ng/mg: IgG 1 mg 당 단백질 A의 함량(ng))과 함께 표 3에 나타내었다. 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 페닐-650M 상에서의 단백질 A 감소는 약 4배이었고, 수거율은 약 94%이었다.
a : HPLC 분석
b : 280 nm에서의 흡광도 ÷ 1.27 mL mg-1cm-1
c : ELISA 분석
d : 상기 설명 부분에서 기재한 바와 같이 이전의 칼럼으로부터 얻은 전체 용출물의 일부만을 수행함.
e : 단백질 A는 주로 테일 분획에서 이동함.
<실시예 IB. RSHZ-19 정제 (도요펄 부틸-650M 이용, 1g 규모)>
이 실시예에서는 실시예 IA에 기재된 것과 동일한 CM 세파로오스 용출물을 사용하고, HIC 단계는 페닐-650M 대신에 도요펄 부틸-650M을 사용하여 수행하였다. CM 세파로오스 용출물의 제조에 관해서는 상기 실시예 IA에 기재되어 있다. CM 세파로오스 용출물 80 ml에 전체 40 ml의 구아니딘 원액을 일정 속도로 교반하면서 서서히 첨가하였다. 이렇게 하여 바이러스 불활성화를 위해 구아니딘 농도를 2M로 만들었다. 구아니딘 처리 용액을 교반하면서, 전체 120 ml의 2.0M 황산암모늄 원액을 첨가하였다. 얻어진 용액의 구아니딘 농도는 1.0M이고, 황산암모늄 농도는 1.0M 이었다. 황산암모늄 처리 용액을 부틸 평형 완충액로 미리 평형화시킨 도요펄 부틸-650M 80 mL 칼럼 (직경 3.2 cm, 길이 10 cm)에 적용하였다. 유속은 실험 전반에 걸쳐서 20 ml/분이었다. 적재 후, 칼럼을 약 350 ml의 부틸 평형 완충액로 세척하였다. 65% 평형 완충액/35% 구배 완충액로 출발하여 20% 평형 완충액/80% 구배 완충액로 종결하는 선형 구배를 12 내지 13 칼럼 부피로 적용하여 IgG를 용출하였다. 이것은 황산암모늄의 출발 농도가 약 0.65M이고 종결 농도가 약 0.2M이라는 것을 나타낸다. 이 구배의 기울기는 약 3.3% 용출 완충액 증가/칼럼 부피, 또는 -0.033 M 황산암모늄/칼럼 부피를 나타낸다. IgG는 약 2 칼럼 부피에서 칼럼으로부터 용출되기 시작하여 약 9 칼럼 부피에서 구배로 종결되었다 (황산암모늄 농도 약 0.58 M에서부터 약 0.35 M). 용출물 분획을 피크의 테일링 부분의 UV 흡광도가 피크 높이의 10%로 감소될 때까지 한데 모으고, 이후에는 또다른 용기에 모았다. 구배가 종결될 때, 약 250 ml의 부틸 구배 완충액을 적용하여 작은 피크를 용출시켜 한데 모았다. 약 250 ml의 HIC 스트립 완충액을 적용하여 칼럼을 재생시켰다. 부틸 미결합 분획, 용출물, 테일 및 스트립 분획을 한데 모으고, IgG 함량, 전체 단백질 함량 및 단백질 A 함량을 상기한 바와 같이 분석하였다. 용출물의 부피는 약 400 ml이었고, 1ml 당 약 1.5 mg의 단백질을 함유하였다.
표 4에 이 실시예의 칼럼 변수를 요약해 놓았다. 각 단계의 생성물 및 단백질 수거 데이타를 단백질 A 함량(ng/mg; IgG 1 mg 당 단백질 A 함량(ng))과 함께 표 5에 나타내었다. IgG 수거율은 실시예 IA에 비해 감소하였지만 (79% 대 94%), 단백질 A 함량은 HIC 단계로서 부틸-650M을 사용하여 약 20배 감소하였다.
a : HPLC 분석
b : 280 nm에서의 흡광도 ÷ 1.27 mL mg-1cm-1
c : ELISA 분석
d : 상기 설명 부분에서 기재한 바와 같이, 이전의 칼럼으로부터 얻은 전체 용출물의 일부만을 수행함.
e : 단백질 A는 주로 테일 분획에서 이동함.
f : 테일은 적재량의 3%를 함유함.
g : 스트립은 적재된 단백질의 13%를 함유함.
<실시예 IC. 도요펄 페닐-650M을 사용한 40 g규모의 RSHZ-19 정제>
본 제조 방법은 실시예 IA에 기재된 것과 동일한 프로셉(Prosep) A 용출물을 사용하였으며, 이후 단계들은 HIC 배지로서 도요펄 페닐-650M을 사용하여 약 40 g의 단백질에 적합하도록 대량화하였다. CM 세파로오스 적재물의 제조는 상기 실시예 IA에 기재되어 있다. pH 3.5 처리되고 여과된 프로셉 A 용출물 7.8 리터를, CM 평형완충액으로 미리 평형화된 CM 세파로오스 FF 4.2 리터 (직경 25 cm x 길이 8.5 cm)칼럼에 1.2 L/분으로 직접 적재하였다. 적재 후, 칼럼을 1.2 L/분에서 약 8 리터의 CM 평형 완충액으로 세척하였다. IgG는 CM 용출 완충액을 1.2 L/분으로 가함으로써 용출하였다. IgG는 약 1 층 부피의 용출 완충액이 통과된 후 칼럼 밖으로 나왔다. 전체 피크는 CM 세파로오스 용출물로서 수집되었다. CM 미결합 칼럼 분획 및 용출물을 수집하고 상기한 바와 같이 IgG 함량, 총 단백질 함량 및 단백질 A 함량에 대해 분석하였다. 용출물의 부피는 약 5.7 리터였으며, ml 당 약 6 내지 7 mg의 단백질을 함유하였다.
CM 세파로오스 용출물 5.6 리터에 총 2.8 리터의 구아니딘 원액 (중량으로는 3.2 kg)을 일정하게 교반하면서 서서히 가하였다. 이렇게 하여 8.3 리터의 부피에서 바이러스 불활성화에 적당한 2M의 구아니딘 농도가 얻어졌다. 구아니딘 처리된 용액을 교반하는 동안, 총 8.3 리터 (중량으로는 9.7 kg)의 2.6 M 황산암모늄 원액을 가하였다. 생성되는 용액은 구아니딘에 대해서는 1.0 M였으며, 황산암모늄에 대해서는 1.3 M이었고, 최종 부피는 16.7 리터였다. 황산암모늄 처리된 용액을 페닐평형 완충액으로 미리 평형화시킨 도요펄 페닐-650M의 4.6 리터 칼럼 (직경 18 cm x 길이 18 cm)에 가하였다. 칼럼 작동 동안 유속은 0.5 내지 0.6 L/분이었다. 적재 후, 칼럼을 페닐 평형 완충액 약 14 리터로 세척하였다. 100% 평형 완충액에서 출발하여 100% 구배 완충액으로 끝나는 선형 구배를 사용하여 20 칼럼 부피에서 IgG를 용출하였다. 이는 황산암모늄의 출발 농도가 약 1.3 M이며 최종 농도가 0 M임을 나타낸다. 이 구배의 기울기는 칼럼 부피 당 약 5% 의 용출 완충액 증가이거나, 또는 칼럼 부피 당 -0.065 M 황산암모늄이었다. IgG는 약 7 칼럼 부피에서 칼럼으로부터 용출되기 시작하였으며, 구배 (황산암모늄 농도가 약 0.85 M에서부터 0.5 M)로 약 12 칼럼 부피에서 종결되었다. 피크의 테일 부분의 UV 흡광도가 피크 높이의 20%로 감소할 때까지 용출물 분획을 수집한 후, 다른 용기로 바꾸어 수집하였다 (테일). 페닐 미결합 분획, 용출물 및 테일 및 스트립 분획을 수집하고 상기한 바와 같이 IgG 함량, 총 단백질 함량 및 단백질 A 함량에 대해 분석하였다. 용출물의 부피는 약 15.4 리터였으며, ml 당 약 2.2 mg의 단백질을 함유하였다.
30,000 MWCO 오메가 멤브레인(Filtron Corp.)이 장착되고 적당한 배합 완충액에 대해 연속적으로 투석여과함으로써 완충액이 교환되는 접선류 한외 여과 장치 (CUF, Millipore Corp.)를 사용하여 페닐 용출물을 약 16 mg/ml로 농축시켰다.
표 6은 본 실시예의 칼럼 변수들을 요약해준다. IgG mg 당 단백질 A ng 단위(ng/ml)로 표현되는 단백질 A 함량 및 총 IgG의 %로 표현되는 IgG 응집체 함량과 함께 각 단계에서의 생성물 및 단백질 수거율에 대한 데이타를 표 7에 나타내었다. 표 7에서 나타나는 바와 같이, 페닐-650 M 상에서의 단백질 A 감소는 약 3배였으며, 수거율은 약 90%였다. IgG 응집체는 CM 세파로오스 용출물에서는 0.5%에서배합된 생성물에서는 0.06 %로 감소하였다.
a HPLC에 의함.
b 280 nm에서의 흡광도 ÷ 1.27 ml mg-1cm-1에 의함.
c ELISA에 의함.
d 총 프로셉 A 용출물의 일부만을 수행함.
e 단백질 A 및 IgG 응집체는 주로 테일 분획에서 이동함.
<실시예 ID. 도요펄 페닐-650M을 사용한 125 g규모의 RSHZ-19 정제>
5.5 리터 (직경 20 cm x 길이 18 cm) 프로셉 A 친화도 칼럼을 4.8 리터/분에서 PBS(표 1 참조)로 평형화하였다. 리터 당 0.94 g의 RSHZ-19 단일클론 항체를 함유하는 조절된 배양 배지 450 리터를 상기한 바와 같이 마이크로 여과에 의해 청정화하고, 4개의 개별 90 내지 95 리터 부분 및 하나의 40 리터 부분으로 칼럼에 4.8리터/분의 유속으로 가하였다. 칼럼 작동의 각 사이클은 하기와 같다: 적재 후, 약 17 리터의 PBS/글리신을 칼럼에 같은 속도로 가하였다. 프로셉 A 용출 완충액 15 내지 20 리터를 가하여 IgG를 용출하였다. 미결합 피크의 분획 및 용출 피크를 수집하고 HPLC 분석을 사용하여 IgG 함량을 분석하였다. 각 사이클로부터의 용출물은 부피가 약 9 리터였으며, ml 당 약 5 내지 10 mg의 단백질을 함유하였다. 용출 직후, 2.5 N 염산을 첨가하여 프로셉 A 용출물의 pH를 3.5로 조절하고, 약 30분 동안 유지하고, 1 M 트리스 염기 약 250 ml를 가하여 pH를 5.5로 조절하였다. pH 5.5로 중화시킨 후, 용출물을 함께 모으고, 멸균 0.2 미크론 밀리팩 200이 연결된 0.1 미크론 폴리가드 CR 필터를 통해 5 리터 분취량으로 멸균 용기에 여과하였다. 여액을 4℃에 저장하였다. 여액의 샘플을 HPLC를 사용하여 IgG에 대해 분석하였으며, 280nm에서의 흡광도에 의해 총 단백질을 측정하였다. 또한 샘플에 대해 ELISA법을 사용하여 단백질 A 함량을 분석하고, HPLC에 의해 IgG 응집체를 분석하였다.
이후 단계들은 약 120 내지 140 g의 단백질에 적합하도록 대량화하였다. 약 130 g의 단백질을 함유하는 pH 3.5 처리되고 여과된 프로셉 A 용출물 16.3 리터를 CM 평형 완충액으로 미리 평형화된 CM 세파로오스 FF의 14.4 리터 (직경 35cm x 길이 15cm) 칼럼에 2.4 L/분으로 직접 적재하였다. 적재 후, 칼럼을 2.4 L/분에서 약 45 리터의 CM 평형 완충액으로 세척하였다. IgG는 CM 용출 완충액을 2.4 L/분에서 가함으로써 용출하였다. IgG는 약 1 내지 2 층 부피의 용출 완충액이 통과된 후 칼럼 밖으로 나왔다. 전체 피크는 CM 세파로오스 용출물로서 수집되었다. CM 미결합 분획 및 용출물을 수집하고 IgG 함량, 총 단백질 함량 및 IgG 응집체에 대해 분석하였다. 용출물의 부피는 약 21 리터였으며, 약 120 g의 단백질을 함유하였다.
CM 세파로오스 용출물 19.4 리터에 총 9.7 리터의 구아니딘 원액을 일정하게 교반하면서 서서히 가하였다. 이렇게 하여 29.1 리터의 부피에서 바이러스 불활성화에 적당한 2M의 구아니딘 농도가 얻어졌다. 구아니딘 처리된 용액을 교반하는 동안, 총 29.1 리터의 2.6 M 황산암모늄 원액을 가하였다. 생성되는 용액은 구아니딘에 대해서는 1.0 M였으며, 황산암모늄에 대해서는 1.3 M였고, 최종 부피는 58.2 리터였다. 황산암모늄 처리된 용액을, 페닐 평형 완충액으로 미리 평형화시킨 도요펄페닐-650M의 12.4 리터 칼럼 (직경 30 cm x 길이 18 cm)에 가하였다. 칼럼 작동 동안 유속은 1.1 내지 1.3 L/분이었다. 적재 후, 칼럼을 페닐 평형 완충액 약 37리터로 세척하였다. 80% 평형 완충액/20% 구배 완충액에서 출발하여 20% 평형완충액/80% 구배 완충액으로 끝나는 선형 구배를 사용하여 12 칼럼 부피에서 IgG를 용출하였다. 이는 황산암모늄의 출발 농도가 약 1.0 M이며 최종 농도가 약 0.26 M임을 나타낸다. 이 구배의 기울기는 칼럼 부피 당 약 5% 구배 완충액 증가였거나, 또는 칼럼 부피 당 -0.065 M 황산암모늄이었다. IgG는 사실상 구배 중간에서 용출되어 나왔으며, 피크는 약 0.8 M의 황산암모늄을 함유하였다. 피크의 테일 부분의 UV 흡광도가 피크 높이의 20%로 감소할 때까지 용출물 분획을 수집한 후, 다른 용기로 바꾸어 수집하였다 (테일). 페닐 미결합 분획, 용출물 및 테일 및 스트립 분획을 수집하고 상기한 바와 같이 IgG 함량, 총 단백질 함량 및 IgG 응집체에 대해 분석하였다. 용출물의 부피는 약 29 리터였으며, 약 100 g의 단백질을 함유하였다.
30,000 MWCO 오메가 멤브레인(Filtron Corp.)이 장착되고 적당한 배합 완충액에 대해 연속적으로 투석여과함으로써 완충액이 교환되는 접선류 한외 여과 장치 (CUF, Millipore Corp.)를 사용하여 페닐 용출물을 약 10 mg/ml로 농축시켰다. 생성물은 IgG 함량, 총 단백질 함량, 및 단백질 A 및 IgG 응집체에 대해 분석하였다.
표 8은 본 실시예의 칼럼 변수들을 요약해준다. IgG mg 당 단백질 A ng 단위(ng/ml)로 표현되는 단백질 A 함량 및 총 IgG의 %로 표현되는 IgG 응집체 함량과 함께 각 단게에서의 생성물 및 단백질 수거율에 대한 데이타를 표 9에 나타내었다. 표 9에서 나타나는 바와 같이, CM 세파로오스 및 페닐-650 M 상에서의 단백질 A 감소는 약 7배였으며, 누적 수거율은 약 70%였다. IgG 응집체는 CM 세파로오스용출물에서는 0.4%에서 배합된 생성물에서는 0.06 %로 감소하였다.
a 역상 HPLC에 의함.
b 280 nm에서의 흡광도 ÷ 1.27 ml mg-1cm-1에 의함.
c 브레드포드(Bradford) 분석에 의함.
d 이후 단계 용량은 약 140 g: 총 프로셉 A 용출물의 일부만을 수행함.
a 환원 SDS-PAGE의 주사 농도측정법(scanning densitometry)에 의해 측정됨; IgG의 중쇄 및 경쇄 면적의 합.
b RSHZ-19 농도 (A280에 의해 측정됨)에 대한 활성도 (소 RS 바이러스 결합 ELISA에 의해 측정됨)의 계산된 비율.
c RSHZ-19 농도 (HPLC에 의함)에 대한 활성도(소 RS 바이러스 결합 ELISA에 의함)의 계산된 비율.
<실시예 II>
안티-CD4 단일클론 항체 CH-CD14를 세포 배양 기술에 의해 제조하고 단백질 A 및 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여, 음이온 교환 수지가 사용된 것을 제외하면 실시예 1에서 사용한 것과 유사한 방법으로 부분 정제하였다. 아미콘 칼럼 (직경 1 cm x 높이 10 cm)을 페닐 도요펄 650M 수지 (lot #65PHM01 H) 8 ml로 충전시켰다. 유속을 모든 단계에서 2 ml/min으로 유지하였다. 칼럼을 평형 완충액 (1M 황산암모늄, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0) 20ml로 평형화하였다. 부분 정제된 CH-CD4단일클론 항체 (280 nm에서의 흡광도에 의한 농도 17 mg/ml) 5 ml을 취해, 6 M 구아니딘 HCl, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0 2.5ml을 가하고, 혼합하고, 30분 동안 방치한 후, 2N 황산암모늄, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0 7.5 ml을 가함으로써 칼럼 적재용 생성물을 제조하였다. 적재물의 최종 황산암모늄 농도는 1 M, 최종 구아니딘 HCl 농도는 1 M, 샘플을 취한 후의 최종 부피는 12 ml 및 생성물의 최종 농도는 5.6 mg/ml이었다. 이어서 이 물질을 칼럼에 2 ml/분으로 적재한 후, 10 칼럼 부피의 평형 완충액에서 50 mM 인산나트륨, pH 7.0으로의 선형 구배로 용출하였다. 약 4 ml의 분획을 칼럼으로부터 용출된 생성물로서 취하였다.
결과를 표 11에 제시하였다. 모든 생성물이 결국은 구배에서 용출되었다. 단백질 A 또한 용출되었으며, 구배로부터 나증 분획에서 농후해졌다. 최종 생성물에서 단백질 A의 감소를 달성하기 위해서는 구배의 말기에 일부 분획을 제외하여 생성물의 수율을 감소시키는 것이 필수적이었다. 단백질 A의 2배 감소는 생성물 수율86%로 가능하였으며 3배 감소는 50% 수율로 가능하였다.
a 제거율은 초기 용출물로부터 목적하는 분획의 용출물까지의 용출물 분획을 합하고, 적재 중의 초기 단백질 A를 합한 용출물 분획 중의 단백질 A ng/mg로 나눔으로써 계산하였다. 예를 들어, 제거율 8.6은 분획 1 내지 3에서의 단백질 A의 합을 분획 1 내지 3에서의 생성물의 합으로 나눔으로써 4 ng/mg을 얻었다. 이어서 이수를 적재물 중의 35 ng/mg으로 나눔으로써 8.6을 얻었다.
<실시예 11B;>
CH-CD4 단일클론 항체를 부분 정제하고, 실시예 IIA에서와 같이 HIC 칼럼 적재용으로 제조하였다. 실시예 IIA에 기재된 것과 동일한 칼럼, 유속, 평형화 및 적재를 사용하였다. 본 실시예에서는, 칼럼을 적재하고 평형 완충액으로 세척한 후, 세척 완충액 (M 황산암모늄, 50 mM 시트르산 나트륨, pH 3.5) 18ml로 세척하였다. 이어서 평형 완충액 (실시예 IIA에 기재된 것) 13.5 ml로 다시 세척하였다. 실시예 IIA에 기재된 바와 같이 구배를 사용하여 칼럼을 용출하고 물로 세척하였다. 칼럼 용출물을 14 ml 분획으로 나누고, 이어서 생성물 및 단백질 A에 대해 분석하였다. 결과를 표 12에 제시하였다. 단백질 A는 90% 수율에서 6배 감소시킬 수 있었으며, 78% 수율에서는 8배 감소시킬 수 있었다.
1 표 11의 각주 "a"와 같음.
실시예 IIB의 결과를 실시예 IIA와 비교해 본 결과, pH 3.5 세척액을 사용하였을때 약 80 % 수율에서 단백질 A가 6 내지 8배 감소한 것으로 나타났으나, pH3.5 세척액 없이는 CH-CDH 수율 80%에서 약 2배만 감소되었다.
<실시예 IIC:>
본 실시예는 규모가 커진 것을 제외하면 실시예 IIB와 유사한 방법으로 수행되었다. 평형화 및 세척 완충액은 실시예 IIB에 기재되었다. 칼럼의 직경은 5 cm, 높이는 28 cm, 유속은 50 ml/분이었다. 실시예 IIA에 기재된 바와 같이, CH-CD4 단일클론 항체를 제조하고 부분 정제하였다. 부분 정제 생성물 440 ml을 6 M 구아니딘 HCl 220 ml과 31분 동안 혼합하였다. 이어서 2 M 황산암모늄, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0 660 ml을 가하였다. 최종 황산암모늄 농도는 1 M였으며, 최종 항체 농도는 5.3 mg/ml이었다. 샘플 채취 후, 적재 부피는 1,290 ml이었다.
칼럼을 2 칼럼 부피의 평형 완충액으로 평형화하고, 칼럼에 적재하였다. 이어서 칼럼을 평형 완충액 630 ml, 세척 완충액 1,000 ml, 평형 완충액 800 ml 및 이어서 0.75 M 황산암모늄, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0으로부터 50 mM 인산나트륨, pH 7.0으로의 구배 5 칼럼 부피로 용출하였다. 용출하는 동안 분획을 수집하였다.
결과를 표 13에 제시하였다. 단백질 A는 70% 수율에서 100 배 감소하거나,또는 80%의 항체 수율에서 30배 감소하였다.
<실시예 IID>
실시예 IIA에 나타난 바와 같이, 부분 정제된 CH-CD4 단일클론 항체를 제조하였다. 평형화 및 세척 완충액은 실시예 IIB에 기재되었다. 6 M구아니딘 HCl, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0 4 ml를 부분 정제된 CH-CD4 단일클론 항체의 9.5 mg/ml 용액 8ml에 가하고 30 분 동안 배양하였다. 이어서, 2 M 황산암모늄, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0 12 ml을 서서히 가하였다. 칼럼의 직경은 0.5 cm, 높이는 20 cm (4 ml), 모든 단계에서 유속은 0.5 ml/분이었다. 칼럼을 각각 2 칼럼 부피의 물 및 평형완충액으로 린스하였다. 이어서, 적재 용액 22 ml을 칼림에 통과시킨 후, 칼럼 방출물의 pH가 3.5가 될 때까지 세척 완충액을 통과시켰다. 이어서 방출물의 pH가 7.0이 될 때까지 평형 완충액을 통과시켰다. 칼럼을 0.3 M 황산암모늄, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0으로 용출하였다. UV 추적기가 증가하기 시작한 후, 용출물 12.6 ml을 수집하고 생성물 및 단백질 A에 대해 분석하였다. 생성물의 수율은 80 %였으며 단백질 A는 28 ng/mg에서 6 ng/mg으로 4.7배 감소하였다.
본 발명은 IgG 단량체를 함유하는 혼합물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체와 접촉시키고 지지체로부터 단량체를 선택적으로 용출시키므로써 이 혼합물 중의 응집체로부터 IgG단량체를 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 일면은 IgG 항체를 함유하는 조절된 세포 배양 배지에 순차적으로 (a) 단백질 A, (b) 이온 교환 크로마토그래피, 및 (c) 소수성 상호작용 크로마토그래피를 적용시키는 것을 포함함을 특징으로하는, IgG 항체를 함유하는 조절된 세포 배양 배지로부터 이 IgG 항체를 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 일면은 단백질 A 및 항체를 포함하는 혼합물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체와 접촉시키고 이 지지체로부터 항체를 선택적으로 용출시키는 것을 포함함을 특징으로 하는, 상기 혼합물로부터 단백질 A를 제거하는 방법을 제공한다.
Claims (41)
- 단백질 A 및 단량체 IgG 항체를 함유하는 혼합물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체와 접촉시키고 지지체로부터 단량체를 선택적으로 용출시키는 것을 포함함을 특징으로 하는, 단백질 A 및 단량체 IgG 항체를 함유하는 혼합물로부터 이 항체를 정제하는 방법.
- 제1항에 있어서, IgG가 안티-RSHZ-19 및 CH-CD4로 구경되는 군으로부터 선택되는 방법.
- 제1항에 있어서, HIC 지지체가 알킬 C2-C8 아가로오스, 아릴-아가로오스, 알킬-실리카, 아릴-실리카, 알킬 유기 중합체 수지 및 아릴 유기 중합체 수지로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
- 제3항에 있어서, 지지체가 부틸-아가로오스, 페닐-아가로오스, 옥틸-아가로오스, 부틸-유기 중합체 수지, 페닐-유기 중합체 수지 및 에테르-유기 중합체 수지로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
- 제4항에 있어서, 지지체가 페닐-유기 중합체 수지인 방법.
- 제4항에 있어서, 지지체가 부틸-유기 중합체 수지인 방법.
- 제1항에 있어서, 항체가 저염 완충액을 사용하여 선택적으로 용출되는 방법.
- 제7항에 있어서, 항체가 50 mM 포스페이트, pH 7.0으로 감소하는 염의 구배를 사용하여 선택적으로 용출되는 방법.
- IgG 항체를 함유하는 조절된 세포 배양 배지를 순차적으로 (a) 단백질 A 친화도 크로마토그래피, (b) 이온 교환 크로마토그래피, 및 (c) 소수성 상호작용 크로마토그래피시키는 것을 포함함을 특징으로 하는, IgG 항체를 함유하는 조절된 세포 배양 배지로부터 이 항체를 정제하는 방법.
- 제9항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피에 CM 23-셀룰로오스, CM-32-셀룰로오스, CM-52-셀룰로오스: CM-가교 결합 덱스트란, SP-가교 결합 덱스트란, CM-아가로오스, S-아가로오스, CM-유기 중합체 수지; DEAE-QAE-Q-가교 결합 덱스티안; DEAE-결합 아가로오스, QAE-결합 아가로오스, Q-결합 아가로오스; 및 DEAE 유기 중합체 수지로 구성되는 군으로부터 선택되는 지지체를 사용하고, 용출이 완충 염 용액에 의해 이루어지는 방법.
- 제10항에 있어서, 지지체가 CM-아가로오스 패스트 플로우이고 염이 NaCl인방법.
- 제10항에 있어서, 완충 염 용액이 100 mM NaCl, pH 6.0을 함유하는 40 mM 시트레이트인 방법.
- 제9항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 알킬 C2-C8 아가로오스, 아릴-아가로오스, 알킬-실리카, 아릴-실리카, 알킬-유기 중합체 수지 및 아릴-유기 중합체 수지로 구성되는 군으로부터 선택되는 지지체를 사용하는 방법.
- 제13항에 있어서, 지지체가 부틸-아가로오스, 페닐-아가로오스, 옥틸-아가로오스, 부틸-유기 중합체 수지, 페닐-유기 중합체 수지 및 에테르-유기 중합체 수지로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
- 제14항에 있어서, 지지체가 페닐-유기 중합체 수지 또는 부틸-유기 중합체 수지인 방법.
- 제9항에 있어서, 지지체가 페닐-유기 중합체 수지 또는 부틸-유기 중합체 수지이고 항체가 저염 완충액을 사용하여 선택적으로 용출되는 방법.
- 제16항에 있어서, 항체가 50 mM 인산나트릅 완충액, pH 7.0으로 감소하는 구배를 사용하여 선택적으로 용출되는 방법.
- 제9항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피에 지지체로서 조절된 포어글라스에 결합된 단백질 A를 사용하고 저pH 완충액에 의해 용출되는 방법.
- 제18항에 있어서,상기 완충액이 25 mM시트레이트, pH 3.5인 방법.
- (a) 항체를 단백질 A 크로마토그래피 지지체상에 흡착시키는 단계;(b) 흡착된 항체를 1종 이상의 완충액으로 세척하는 단계;(c) 단계 (b)에서 세척된 항체를 용출시키는 단계:(d) 단계 (c)에서 용출된 항체를 이온 교환 크로마토그래피 지지체상에 흡착시키는 단계;(e) 흡착된 항체를 1종 이상의 완충액으로 세척하는 단계;(f) 단계 (e)에서 세척된 항체를 선택적으로 용출시키는 단계;(g) 단계 (f)에서 용출된 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체상에 흡착시키는 단계;(h) 흡착된 항체를 1종 이상의 완충액으로 세척하는 단계;(i) 흡착된 항체를 용출시키는 단계; 및(J) 용출된 항체를 수거하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 조절된 세포배지로부터 항체를 정제하는 방법.
- 제20항에 있어서, 바이러스가 존재할 경우 이를 불활성화시키는 하나 이상의 임의 단계를 포함하는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화 단계를 단계 (f) 후 단계(g) 이전에 수행하는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화 단계가 용출물을 구아니딘 염산염으로 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 처리한 후 황산암모늄 용액을 첨가하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제23항에 있어서, 구아니딘 염산염이 2.0 M로 존재하고 단계 (f)로부터의 후속 처리 용출물이 1.3 M 황산암모늄으로 조정되는 방법.
- 제22항에 있어서, 추가의 바이러스 불활성화 단계를 단계 (c) 후 단계(d) 이전에 수행하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 추가의 바이러스 불활성화 단계가 단계 (c)로부터의 용출물을 산으로 처리하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제26항에 있어서, 용출물의 pH를 pH 3.5로 조정하고 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 이 pH에서 유지하고 pH를 5.5로 조청하므로써 처리를 종료하는 방법.
- 제20항에 있어서, 단계 (d)의 이온 교환 지지체가 카르복시메틸 (CM), 술포에틸 (SE), 술포프로필 (SP), 포스페이트 (P), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 4급 아미노에틸 (QAE), 및 4급 아민 (Q) 치환된 셀룰로오스 수지, 가교 결합된 덱스트란, 아가로오스 및 유기 중합체 수지로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
- 제28항에 있어서, 양이온 지지체가 CM-아가로오스인 방법.
- 제20항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체가 알킬 C2-C8-아가로오스, 아릴-아가로오스, 알킬-실리카, 아릴-실리카, 알킬-유기 중합체 수지 및 아릴-유기 중합체 수지로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
- 제30항에 있어서, 지지체가 부틸-아가로오스, 페닐-아가로오스, 옥틸-아가로오스, 페닐-유기 중합체 수지, 에테르-유기 중합체 수지 및 부틸-유기 중합체 수지로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
- 제31항에 있어서, 지지체가 페닐-유기 중합체 수지 또는 부틸-유기 중합체 수지인 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 단백질을 크로마토그래피 단계 (i)로부터의 단백질을 함유하는 분획을 한외여과에 의해 풀링시키고 농축시키므로써 수거하는 방법.
- 제20항에 있어서, 단계 (a)의 크로마토그래피 지지체가 조절된 포어 글라스에 결합된 단백질 A인 방법.
- 제20항에 있어서, 단계 (h)의 흡착된 항체를 제1 평형 완충액 및 제2 저pH 세척 완충액으로 세척하는 방법.
- 제35항에 있어서, 제2 완충액의 pH가 4.0 미만인 방법.
- 제36항에 있어서, 제2 완충액이 1 M 황산암모늄, 50 mM 소듐 시트레이트, pH 3.5인 방법.
- 단백질 A 및 항체를 함유하는 혼합물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체와 접촉시키고 지지체로부터 항체를 선택적으로 용출시키는 것을 포함함을 특징으로 하는, 단백질 A 및 항체를 함유하는 혼합물로부터 이 단백질을 제거하는 방법.
- 제38항에 있어서, pH가 7.0 미만인 완충액으로 용출시키기 전에 지지체를 세척하는 것을 포함하는 방법.
- 제39항에 있어서, 세척 완충액의 pH가 4.0 미만인 방법.
- 제40항에 있어서, 완충액이 1 M 항산암모늄, 50 mM 소듐 시트레이트, pH 3.5인 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/200,126 US5429746A (en) | 1994-02-22 | 1994-02-22 | Antibody purification |
| US08/200,126 | 1994-02-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR100372209B1 true KR100372209B1 (ko) | 2003-04-10 |
Family
ID=22740445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019960704604A KR100372209B1 (ko) | 1994-02-22 | 1995-02-21 | 항체정제법 |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5429746A (ko) |
| EP (1) | EP0746398B1 (ko) |
| JP (1) | JP4198751B2 (ko) |
| KR (1) | KR100372209B1 (ko) |
| CN (1) | CN1146730A (ko) |
| AT (1) | ATE218387T1 (ko) |
| AU (1) | AU689552B2 (ko) |
| BR (1) | BR9507100A (ko) |
| CA (1) | CA2183888C (ko) |
| CZ (1) | CZ292001B6 (ko) |
| DE (1) | DE69526929T2 (ko) |
| DK (1) | DK0746398T3 (ko) |
| ES (1) | ES2177632T3 (ko) |
| HK (1) | HK1013806A1 (ko) |
| HU (1) | HU217850B (ko) |
| MX (1) | MX9603637A (ko) |
| NO (1) | NO319182B1 (ko) |
| NZ (1) | NZ281480A (ko) |
| PT (1) | PT746398E (ko) |
| SI (1) | SI0746398T1 (ko) |
| WO (1) | WO1995022389A1 (ko) |
| ZA (1) | ZA951372B (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011136533A2 (ko) * | 2010-04-27 | 2011-11-03 | ㈜셀트리온 | 크로마토그래피 장치 및 방법 |
| KR20130128020A (ko) * | 2005-03-11 | 2013-11-25 | 와이어쓰 엘엘씨 | 약한 분배성 크로마토그래피법 |
Families Citing this family (164)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9022545D0 (en) | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Culture medium |
| US5935800A (en) * | 1994-10-31 | 1999-08-10 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Assays and kits for determining male fertility |
| US5641870A (en) * | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
| IL130061A (en) * | 1996-11-27 | 2001-09-13 | Genentech Inc | Affinity purification of polypeptide on protein a matrix |
| JP2001510483A (ja) | 1997-06-13 | 2001-07-31 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | タンパク質の回収 |
| US5993653C1 (en) * | 1997-08-11 | 2001-11-06 | Phenomenex | Composition and column used in hplc |
| CN1088605C (zh) * | 1997-09-30 | 2002-08-07 | 中国科学院新疆化学研究所 | 生产石油磺酸钠的质量控制方法 |
| IL121900A (en) * | 1997-10-07 | 2001-12-23 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | A method for the purification of immunoglobulins |
| ATE370961T1 (de) * | 1998-05-06 | 2007-09-15 | Genentech Inc | Reinigung von antikörpern durch ionenaustauschchromatographie |
| EP1308455B9 (en) * | 1998-05-06 | 2006-06-14 | Genentech, Inc. | A composition comprising anti-HER2 antibodies |
| TR200504220T2 (tr) | 1998-12-17 | 2007-04-24 | Biogen Idec Ma Inc. | Aktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimeAktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimerik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştrik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştırılması için bir yöntem.ırılması için bir yöntem. |
| GB9907553D0 (en) * | 1999-04-01 | 1999-05-26 | Cantab Pharma Res | Purification of biological preparations |
| DE19932782A1 (de) * | 1999-07-14 | 2001-01-18 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Fraktionierung von Plasma oder Serum, so erhaltene Präparate und deren Verwendung |
| EP1268514B1 (en) | 2000-03-27 | 2006-06-07 | Genetics Institute, LLC | Methods for purifying highly anionic proteins |
| SE0001128D0 (sv) * | 2000-03-30 | 2000-03-30 | Amersham Pharm Biotech Ab | A method of producing IgG |
| US7064191B2 (en) * | 2000-10-06 | 2006-06-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for purifying antibody |
| WO2002072615A1 (fr) | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methode de purification de proteines |
| WO2002086070A2 (en) * | 2001-04-18 | 2002-10-31 | Dyax Corp. | Binding molecules for fc-region polypeptides |
| ATE421536T1 (de) * | 2001-06-05 | 2009-02-15 | Genetics Inst Llc | Verfahren zur reinigung stark anionischer proteine |
| US7452539B2 (en) * | 2001-12-19 | 2008-11-18 | Genentech, Inc. | Stabilizing polypeptides which have been exposed to urea |
| WO2003066662A2 (en) * | 2002-02-05 | 2003-08-14 | Genentech, Inc. | Protein purification |
| NZ535276A (en) † | 2002-02-28 | 2008-04-30 | Microsens Biophage Ltd | Binding of pathological forms of prion proteins |
| US20160279239A1 (en) | 2011-05-02 | 2016-09-29 | Immunomedics, Inc. | Subcutaneous administration of anti-cd74 antibody for systemic lupus erythematosus and autoimmune disease |
| GB0220894D0 (en) * | 2002-09-09 | 2002-10-16 | Millipore Uk Ltd | Method of separation |
| JP5525118B2 (ja) * | 2002-09-11 | 2014-06-18 | 中外製薬株式会社 | タンパク質精製方法 |
| EP1549342A4 (en) * | 2002-09-17 | 2006-05-10 | Gtc Biotherapeutics Inc | ISOLATION OF IMMUNOGLOBULIN MOLECULES TO WHICH HE LACKS DISULFIDE LINKS BETWEEN HEAVY CHAINS |
| GB0304576D0 (en) * | 2003-02-28 | 2003-04-02 | Lonza Biologics Plc | Protein a chromatography |
| AU2004215653B2 (en) * | 2003-02-28 | 2011-03-17 | Lonza Biologics Plc. | Antibody purification by protein A and ion exchange chromatography |
| JPWO2004087761A1 (ja) * | 2003-03-31 | 2006-07-27 | 麒麟麦酒株式会社 | ヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の精製 |
| NZ544924A (en) | 2003-06-27 | 2009-03-31 | Biogen Idec Inc | Modified binding molecules comprising connecting peptides |
| US6913695B2 (en) * | 2003-07-08 | 2005-07-05 | Bayer Healthcare Llc | Sanitization of chromatographic media |
| NZ544797A (en) * | 2003-07-18 | 2011-04-29 | Amgen Fremont Inc | Specific antibodies that bind HGF and neutralise binding of HGF to met |
| SI1648940T1 (sl) * | 2003-07-28 | 2016-08-31 | Genentech, Inc. | Zmanjševanje izluževanja proteina A med afinitetno kromatografijo proteina A |
| US7166212B2 (en) * | 2003-09-30 | 2007-01-23 | Chromba, Inc. | Multicapillary column for chromatography and sample preparation |
| US20070017870A1 (en) | 2003-09-30 | 2007-01-25 | Belov Yuri P | Multicapillary device for sample preparation |
| DE602004026343D1 (de) | 2003-10-24 | 2010-05-12 | Amgen Inc | Verfahren zur aufreinigung von proteinen in einer durchflussfraktion aus der chromatographie mit hydrophoben wechselwirkungen |
| US7750129B2 (en) * | 2004-02-27 | 2010-07-06 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Process for the purification of antibodies |
| SE0400501D0 (sv) * | 2004-02-27 | 2004-02-27 | Amersham Biosciences Ab | Antibody purification |
| DK1730191T3 (da) | 2004-03-30 | 2011-10-17 | Glaxo Group Ltd | Immunglobulin som binder HOSM |
| SE0400886D0 (sv) * | 2004-04-02 | 2004-04-02 | Amersham Biosciences Ab | Process of purification |
| TWI307630B (en) | 2004-07-01 | 2009-03-21 | Glaxo Group Ltd | Immunoglobulins |
| DK1827691T3 (en) * | 2004-10-21 | 2017-02-13 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | chromatography matrix |
| KR20070115871A (ko) * | 2004-12-23 | 2007-12-06 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 항체 결합 친화 리간드 |
| WO2006074399A2 (en) | 2005-01-05 | 2006-07-13 | Biogen Idec Ma Inc. | Multispecific binding molecules comprising connecting peptides |
| US20080160577A1 (en) * | 2005-02-04 | 2008-07-03 | Glaxo Group Limited | Optimization of Heterologous Polypeptide Expression |
| US20160355591A1 (en) | 2011-05-02 | 2016-12-08 | Immunomedics, Inc. | Subcutaneous anti-hla-dr monoclonal antibody for treatment of hematologic malignancies |
| DE102005012594A1 (de) * | 2005-03-18 | 2006-09-21 | Bayer Technology Services Gmbh | Elektrofiltrationsverfahren |
| TWI391399B (zh) * | 2005-05-25 | 2013-04-01 | Hoffmann La Roche | 測定溶離多肽之鹽濃度之方法 |
| US20070049732A1 (en) * | 2005-09-01 | 2007-03-01 | Zurlo Eugene J | Ultra-high yield intravenous immune globulin preparation |
| AU2006292739A1 (en) * | 2005-09-15 | 2007-03-29 | Wyeth | Protein floculation using salts |
| GB0525662D0 (en) | 2005-12-16 | 2006-01-25 | Glaxo Group Ltd | Immunoglobulins |
| KR101391457B1 (ko) | 2005-12-20 | 2014-05-19 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 조성물 및 조성물의 제조 방법 |
| AR058568A1 (es) | 2005-12-20 | 2008-02-13 | Bristol Myers Squibb Co | Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo |
| JP2009520469A (ja) * | 2005-12-22 | 2009-05-28 | コンジュクヘム ビオテクフノロギエス インコーポレイテッド | アルブミンと治療薬との前もって形成された抱合体の産生のための方法 |
| CN101935665B (zh) * | 2006-03-17 | 2013-08-28 | 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 | 一种重组蛋白a基因及其表达产物的制备方法和用途 |
| DE102006014579A1 (de) * | 2006-03-29 | 2007-10-04 | Epcos Ag | Verfahren zur Reinigung einer Monomer-Lösung und Herstellungsverfahren für ein elektrisches Bauelement umfassend das Reinigungsverfahren |
| WO2007117490A2 (en) | 2006-04-05 | 2007-10-18 | Abbott Biotechnology Ltd. | Antibody purification |
| JP2010510963A (ja) * | 2006-06-14 | 2010-04-08 | グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | セラミックヒドロキシアパタイトを使用する抗体の精製方法 |
| SG10201510384UA (en) | 2006-09-13 | 2016-01-28 | Abbvie Inc | Cell culture improvements |
| AU2007351548B2 (en) * | 2006-11-01 | 2012-08-16 | Biogen Ma Inc. | Method of isolating biomacromolecules using low pH and divalent cations |
| US7589183B2 (en) * | 2006-11-28 | 2009-09-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Prevention of leaching of ligands from affinity-based purification systems |
| WO2009007993A2 (en) * | 2007-04-23 | 2009-01-15 | Arvind Mallinath Lali | A process for purification of immunoglobulins using a pseudobioaffinity adsorbent |
| JP5064558B2 (ja) | 2007-06-01 | 2012-10-31 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 免疫グロブリン精製 |
| WO2009045897A1 (en) * | 2007-10-03 | 2009-04-09 | Dyax Corp. | Systems and methods for purifying proteins |
| HUE037409T2 (hu) | 2007-10-30 | 2018-08-28 | Genentech Inc | Antitest-tisztítás kationcserés kromatográfiával |
| WO2009058769A1 (en) * | 2007-10-30 | 2009-05-07 | Schering Corporation | Purification of antibodies containing hydrophobic variants |
| BRPI0820156B8 (pt) * | 2007-11-12 | 2021-05-25 | Chreto Aps | processo para purificação de uma biomolécula alvo |
| WO2009121034A2 (en) * | 2008-03-28 | 2009-10-01 | Pelican Group Holdings, Inc. | Multicapillary sample preparation devices and methods for processing analytes |
| AU2009228086B2 (en) * | 2008-03-28 | 2015-04-23 | Biotix Inc. | Sample preparation devices and methods for processing analytes |
| BRPI0911249A2 (pt) * | 2008-04-16 | 2017-05-23 | Biogen Idec Inc | método de isolamento de biomacromoléculas usando polialquileno glicol e metais de transição |
| CA2733782A1 (en) * | 2008-08-14 | 2010-02-18 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methods for purifying antibodies using protein a affinity chromatography |
| AU2009347206C1 (en) * | 2008-10-20 | 2016-12-08 | Abbvie Inc. | Isolation and purification of antibodies using Protein A affinity chromatography |
| CA2738499A1 (en) * | 2008-10-20 | 2010-04-29 | Abbott Laboratories | Viral inactivation during purification of antibodies |
| SG195574A1 (en) * | 2008-10-20 | 2013-12-30 | Abbott Lab | Antibodies that bind to il-18 and methods of purifying the same |
| JP2012506384A (ja) * | 2008-10-20 | 2012-03-15 | アボット・ラボラトリーズ | Ｉｌ−１２に結合する抗体およびそれを精製する方法 |
| UY32341A (es) | 2008-12-19 | 2010-07-30 | Glaxo Group Ltd | Proteínas de unión antígeno novedosas |
| JP2012513425A (ja) | 2008-12-22 | 2012-06-14 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 免疫グロブリンの精製 |
| AU2010203836B2 (en) * | 2009-01-08 | 2015-05-28 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Separation method using single polymer phase systems |
| JP5681166B2 (ja) | 2009-03-31 | 2015-03-04 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 疎水性モノマー、疎水的に誘導体化された支持体、並びにその製造及び使用方法 |
| WO2011050071A2 (en) * | 2009-10-20 | 2011-04-28 | Abbott Laboratories | Isolation and purification of anti-il-13 antibodies using protein a affinity chromatography |
| WO2011080050A2 (en) | 2009-12-11 | 2011-07-07 | Novartis Ag | Binding molecules |
| PT3272764T (pt) | 2009-12-18 | 2024-04-24 | Novartis Ag | Método para cromatografia de afinidade |
| EA023700B1 (ru) | 2010-01-28 | 2016-07-29 | Глаксо Груп Лимитед | Cd127-связывающие белки |
| UA108227C2 (xx) | 2010-03-03 | 2015-04-10 | Антигензв'язуючий білок | |
| WO2011133894A2 (en) | 2010-04-23 | 2011-10-27 | Purdue Research Foundation | Protein drug formulations and packages |
| UY33421A (es) | 2010-06-03 | 2011-12-30 | Glaxo Wellcome House | Proteinas de union al antígeno humanizados |
| EP2583973B1 (en) * | 2010-06-21 | 2018-03-21 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Method for purifying protein using amino acid |
| CA2805035A1 (en) | 2010-07-22 | 2012-01-26 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Novel antigen binding proteins |
| US20130260419A1 (en) * | 2010-12-06 | 2013-10-03 | Thomas C. Ransohoff | Continuous processing methods for biological products |
| CA2820095C (en) | 2010-12-21 | 2019-02-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Isoform enriched antibody preparation and method for obtaining it |
| EP3318571B1 (en) | 2011-03-16 | 2021-02-17 | F. Hoffmann-La Roche AG | Ion exchange chromatography with improved selectivity for the separation of polypeptide monomers, aggregates and fragments by modulation of the mobile phase |
| SG193545A1 (en) | 2011-03-29 | 2013-11-29 | Glaxosmithkline Llc | Buffer system for protein purification |
| EP2702077A2 (en) | 2011-04-27 | 2014-03-05 | AbbVie Inc. | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
| CA2831572C (en) | 2011-05-02 | 2019-11-26 | Immunomedics, Inc. | Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration |
| PT2726101T (pt) | 2011-06-30 | 2018-11-21 | Genzyme Corp | Inibidores da ativação de células t |
| WO2013004587A1 (en) * | 2011-07-01 | 2013-01-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for separation of monomeric polypeptides from aggregated polypeptides |
| EP2734232B1 (en) | 2011-07-19 | 2017-11-01 | Philogen S.p.A. | Sequential anti-ctla4 and targeted il-2 therapy |
| UY34317A (es) | 2011-09-12 | 2013-02-28 | Genzyme Corp | Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß |
| US8685241B1 (en) | 2011-12-21 | 2014-04-01 | Sepragen Corporation | Axial and radial flow columns with inflatable seals to facilitate packing and unpacking |
| ES2567091T3 (es) * | 2012-04-05 | 2016-04-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compuestos de amina para la preparación selectiva de muestras biológicas |
| WO2013158273A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Abbvie Inc. | Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution |
| US9067990B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-06-30 | Abbvie, Inc. | Protein purification using displacement chromatography |
| US9150645B2 (en) | 2012-04-20 | 2015-10-06 | Abbvie, Inc. | Cell culture methods to reduce acidic species |
| US9249182B2 (en) | 2012-05-24 | 2016-02-02 | Abbvie, Inc. | Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography |
| EP2855504B1 (en) * | 2012-05-31 | 2018-10-24 | Agency For Science, Technology And Research | Chromatographic purification of immunoglobulin g preparations with particles having multimodal functionalities |
| EP2889617B1 (en) * | 2012-08-27 | 2017-10-11 | Asahi Kasei Medical Co., Ltd. | Antibody purification method by means of temperature-responsive chromatography |
| US9206390B2 (en) | 2012-09-02 | 2015-12-08 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
| US9512214B2 (en) | 2012-09-02 | 2016-12-06 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
| JOP20200308A1 (ar) | 2012-09-07 | 2017-06-16 | Novartis Ag | جزيئات إرتباط il-18 |
| RU2015114330A (ru) | 2012-09-17 | 2016-11-10 | У.Р. Грейс Энд Ко.-Конн. | Хроматографические среды и устройства |
| CN103073616A (zh) * | 2013-01-06 | 2013-05-01 | 西北大学 | 使用混合模式层析技术去除抗体聚集体的方法 |
| CA2905010A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-09-18 | Abbvie Inc. | Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same |
| US10023608B1 (en) | 2013-03-13 | 2018-07-17 | Amgen Inc. | Protein purification methods to remove impurities |
| WO2014151878A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides |
| US9017687B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-28 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography |
| WO2014159579A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Abbvie Inc. | MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE |
| WO2014141150A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited | Methods for purifying antibodies |
| JP6472786B2 (ja) * | 2013-03-15 | 2019-02-20 | アルダー・バイオファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド | 抗体の精製及び純度のモニタリング |
| US20160083453A1 (en) * | 2013-05-13 | 2016-03-24 | Medlmmune, Llc | Separation of recombinant polyclonal antibody multimers with minimal separation of monomers |
| ES2531459B1 (es) * | 2013-06-10 | 2015-12-28 | Antonio VILA SANJURJO | Método para la separación física de "traductomas" convolucionados |
| TWI596107B (zh) * | 2013-06-25 | 2017-08-21 | 卡地拉保健有限公司 | 單株抗體之新穎純化方法 |
| BR112016004437A2 (pt) | 2013-09-13 | 2017-10-17 | Genentech Inc | métodos de imunoteste e de seleção de linhagem de células, anticorpos e kit |
| SG10201802525QA (en) | 2013-09-13 | 2018-04-27 | Genentech Inc | Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides |
| EP3048899B1 (en) * | 2013-09-25 | 2021-09-08 | Bioverativ Therapeutics Inc. | On-column viral inactivation methods |
| EP3052640A2 (en) | 2013-10-04 | 2016-08-10 | AbbVie Inc. | Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins |
| US9085618B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-07-21 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
| US8946395B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-02-03 | Abbvie Inc. | Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography |
| US9181337B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same |
| EP3069137A1 (en) | 2013-11-05 | 2016-09-21 | Novartis Ag | Organic compounds |
| WO2015073884A2 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
| SG11201605712SA (en) | 2014-01-16 | 2016-08-30 | Grace W R & Co | Affinity chromatography media and chromatography devices |
| TWI709569B (zh) | 2014-01-17 | 2020-11-11 | 美商健臻公司 | 無菌層析樹脂及其用於製造方法的用途 |
| TWI671312B (zh) | 2014-01-17 | 2019-09-11 | 美商健臻公司 | 無菌層析法及製法 |
| KR20160127087A (ko) * | 2014-02-27 | 2016-11-02 | 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 | 알킬 양이온들로의 처리에 의한 단백질 제제들 내의 크로마틴 함량을 감소시키기 위한 방법들 |
| HUE048782T2 (hu) * | 2014-03-10 | 2020-08-28 | Richter Gedeon Nyrt | Immunoglobulin tisztítása elõtisztítási lépések alkalmazásával |
| US10435670B2 (en) | 2014-04-15 | 2019-10-08 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Methods, apparatuses, and systems for continuously inactivating a virus during manufacture of a biological product |
| EP3137209B1 (en) | 2014-05-02 | 2022-10-05 | W.R. Grace & CO. - CONN. | Functionalized support material and methods of making and using functionalized support material |
| US10266563B2 (en) | 2014-06-24 | 2019-04-23 | Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab | Chromatography method |
| AR102198A1 (es) | 2014-10-09 | 2017-02-08 | Regeneron Pharma | Proceso para reducir partículas subvisibles en una formulación farmacéutica |
| WO2016059602A2 (en) | 2014-10-16 | 2016-04-21 | Glaxo Group Limited | Methods of treating cancer and related compositions |
| DK3215528T3 (da) | 2014-11-06 | 2019-10-07 | Hoffmann La Roche | Fc-regionvarianter med modificeret FcRn-binding og anvendelsesfremgangsmåder |
| GB201506868D0 (en) | 2015-04-22 | 2015-06-03 | Ucb Biopharma Sprl | Method for protein purification |
| PL3302784T3 (pl) | 2015-06-05 | 2022-01-17 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Adsorbentowe środki klarujące do bioprzetwarzania oraz sposoby ich wytwarzania i stosowania |
| CN108368505B (zh) | 2015-10-09 | 2023-02-21 | 建新公司 | 改善的flare(流式细胞术减弱报道蛋白表达)技术用于快速批量分选 |
| SG11201807824UA (en) | 2016-03-11 | 2018-10-30 | Boehringer Ingelheim Int | Methods for continuously inactivating a virus during manufacture of a protein |
| US10688412B2 (en) | 2016-07-25 | 2020-06-23 | Cehpalon, Inc. | Affinity chromatography wash buffer |
| AU2017312785A1 (en) | 2016-08-16 | 2019-01-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for quantitating individual antibodies from a mixture |
| AU2017323583A1 (en) | 2016-09-07 | 2019-03-14 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Methods for purifying antibodies |
| CA3039598A1 (en) | 2016-10-07 | 2018-04-12 | Genzyme Corporation | Early post-transfection isolation of cells (epic) for biologics production |
| EP4071469A3 (en) | 2016-10-25 | 2022-12-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and systems for chromatography data analysis |
| GB201622343D0 (en) * | 2016-12-29 | 2017-02-15 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | Method in bioprocess purification system |
| WO2018187074A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-11 | Immunomedics, Inc. | Subcutaneous administration of antibody-drug conjugates for cancer therapy |
| JP7097433B2 (ja) * | 2017-08-17 | 2022-07-07 | ジャスト－エヴォテック バイオロジックス、インコーポレイテッド | 宿主細胞ガレクチンおよび他の夾雑物からグリコシル化タンパク質を精製する方法 |
| CA3073935A1 (en) | 2017-09-19 | 2019-03-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of reducing particle formation and compositions formed thereby |
| US20200406232A1 (en) * | 2018-03-08 | 2020-12-31 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Anionic exchange-hydrophobic mixed mode chromatography resin |
| EP3769083A1 (en) | 2018-03-21 | 2021-01-27 | Waters Technologies Corporation | Non-antibody high-affinity-based sample preparation, sorbents, devices and methods |
| EA202190163A1 (ru) | 2018-07-02 | 2021-03-30 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Системы и способы получения полипептида из смеси |
| AU2019332764A1 (en) | 2018-08-31 | 2021-05-06 | Genzyme Corporation | Sterile chromatography resin and use thereof in manufacturing processes |
| CA3135032A1 (en) | 2019-04-03 | 2020-10-08 | Genzyme Corporation | Anti-alpha beta tcr binding polypeptides with reduced fragmentation |
| HU231498B1 (hu) | 2019-04-04 | 2024-05-28 | Richter Gedeon Nyrt | Immunglobulinok affinitás kromatográfiájának fejlesztése kötést megelőző flokkulálás alkalmazásával |
| PL439809A1 (pl) * | 2019-06-10 | 2022-12-05 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Metody wytwarzania przeciwciała anty-alfa4beta7 |
| CN114907430B (zh) * | 2022-06-21 | 2023-12-01 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种mRNA的分离纯化方法 |
| US12054552B2 (en) | 2022-09-21 | 2024-08-06 | Sanofi Biotechnology | Humanized anti-IL-1R3 antibody and methods of use |
| CN117327189B (zh) * | 2023-09-21 | 2024-06-11 | 南京京达生物技术有限公司 | 一种交联型异嗜性抗体阻断剂的生产工艺 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR970007941A (ko) * | 1995-07-31 | 1997-02-21 | 배순훈 | 브이.씨.알의 드럼모터 장치 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4639513A (en) * | 1984-02-02 | 1987-01-27 | Cuno Inc. | Intravenously injectable immunoglobulin G (IGG) and method for producing same |
| DK166763B1 (da) * | 1983-03-16 | 1993-07-12 | Immuno Ag | Immunoglobulin-g-holdig fraktion |
| US5268306A (en) * | 1988-02-29 | 1993-12-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Preparation of a solid phase matrix containing a bound specific binding pair |
| US4983722A (en) * | 1988-06-08 | 1991-01-08 | Miles Inc. | Removal of protein A from antibody preparations |
| US5115101A (en) * | 1988-06-08 | 1992-05-19 | Miles Inc. | Removal of protein A from antibody preparations |
| DE3825429C2 (de) * | 1988-07-27 | 1994-02-10 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines intravenös verabreichbaren polyklonalen Immunglobulin-Präparates mit hohem IgM-Gehalt |
| AU6355790A (en) * | 1989-08-04 | 1991-03-11 | Peter Grandics | An integrated cell culture-protein purification system for the automated production and purification of cell culture products |
| JPH0778025B2 (ja) * | 1990-03-20 | 1995-08-23 | 日本赤十字社 | 免疫グロブリンｇの製造方法 |
| ATE122054T1 (de) * | 1990-03-22 | 1995-05-15 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur herstellung eines intravenös verträglichen immunglobulin-g-präparates. |
| JPH0480959A (ja) * | 1990-07-24 | 1992-03-13 | Seiko Epson Corp | 半導体装置 |
| GB9019812D0 (en) | 1990-09-11 | 1990-10-24 | Scotgen Ltd | Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man |
| SK285046B6 (sk) | 1991-07-25 | 2006-05-04 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Chimérna protilátka, ktorá sa špecificky viaže na ľudský antigén, farmaceutický prostriedok s jej obsahom, spôsob jej výroby a použitie |
| US5252216A (en) * | 1992-03-24 | 1993-10-12 | Smithkline Beecham Corporation | Protein purification |
-
1994
- 1994-02-22 US US08/200,126 patent/US5429746A/en not_active Ceased
-
1995
- 1995-02-20 ZA ZA951372A patent/ZA951372B/xx unknown
- 1995-02-21 HU HU9602313A patent/HU217850B/hu unknown
- 1995-02-21 BR BR9507100A patent/BR9507100A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-02-21 CN CN95192680A patent/CN1146730A/zh active Pending
- 1995-02-21 DK DK95910250T patent/DK0746398T3/da active
- 1995-02-21 EP EP95910250A patent/EP0746398B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-21 CZ CZ19962481A patent/CZ292001B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-02-21 NZ NZ281480A patent/NZ281480A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-02-21 MX MX9603637A patent/MX9603637A/es unknown
- 1995-02-21 AU AU18433/95A patent/AU689552B2/en not_active Expired
- 1995-02-21 PT PT95910250T patent/PT746398E/pt unknown
- 1995-02-21 KR KR1019960704604A patent/KR100372209B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-02-21 AT AT95910250T patent/ATE218387T1/de active
- 1995-02-21 CA CA002183888A patent/CA2183888C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-21 SI SI9530606T patent/SI0746398T1/xx unknown
- 1995-02-21 JP JP52187995A patent/JP4198751B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-21 DE DE69526929T patent/DE69526929T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-21 ES ES95910250T patent/ES2177632T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-21 WO PCT/US1995/001823 patent/WO1995022389A1/en active IP Right Grant
-
1996
- 1996-08-21 NO NO19963475A patent/NO319182B1/no not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-12-15 HK HK98113495A patent/HK1013806A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-05-27 US US11/140,525 patent/USRE40070E1/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-05-18 US US11/804,729 patent/USRE41555E1/en not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-03-13 US US12/403,799 patent/USRE41595E1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR970007941A (ko) * | 1995-07-31 | 1997-02-21 | 배순훈 | 브이.씨.알의 드럼모터 장치 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130128020A (ko) * | 2005-03-11 | 2013-11-25 | 와이어쓰 엘엘씨 | 약한 분배성 크로마토그래피법 |
| KR101482791B1 (ko) * | 2005-03-11 | 2015-01-21 | 와이어쓰 엘엘씨 | 약한 분배성 크로마토그래피법 |
| KR101660575B1 (ko) | 2005-03-11 | 2016-09-27 | 와이어쓰 엘엘씨 | 약한 분배성 크로마토그래피법 |
| WO2011136533A2 (ko) * | 2010-04-27 | 2011-11-03 | ㈜셀트리온 | 크로마토그래피 장치 및 방법 |
| WO2011136533A3 (ko) * | 2010-04-27 | 2012-04-19 | ㈜셀트리온 | 크로마토그래피 장치 및 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69526929D1 (de) | 2002-07-11 |
| CA2183888C (en) | 2008-06-17 |
| NO963475L (no) | 1996-10-21 |
| NO319182B1 (no) | 2005-06-27 |
| ATE218387T1 (de) | 2002-06-15 |
| AU689552B2 (en) | 1998-04-02 |
| BR9507100A (pt) | 1997-09-16 |
| WO1995022389A1 (en) | 1995-08-24 |
| CZ292001B6 (cs) | 2003-07-16 |
| ES2177632T3 (es) | 2002-12-16 |
| EP0746398A4 (en) | 1997-10-08 |
| AU1843395A (en) | 1995-09-04 |
| NZ281480A (en) | 1998-06-26 |
| CN1146730A (zh) | 1997-04-02 |
| US5429746A (en) | 1995-07-04 |
| USRE41595E1 (en) | 2010-08-31 |
| JP4198751B2 (ja) | 2008-12-17 |
| EP0746398B1 (en) | 2002-06-05 |
| USRE41555E1 (en) | 2010-08-24 |
| NO963475D0 (no) | 1996-08-21 |
| HK1013806A1 (en) | 1999-09-10 |
| ZA951372B (en) | 1995-10-24 |
| SI0746398T1 (en) | 2002-10-31 |
| MX9603637A (es) | 1997-04-30 |
| CA2183888A1 (en) | 1995-08-24 |
| JPH09509658A (ja) | 1997-09-30 |
| USRE40070E1 (en) | 2008-02-19 |
| HUT74845A (en) | 1997-02-28 |
| DK0746398T3 (da) | 2002-09-16 |
| HU9602313D0 (en) | 1996-10-28 |
| CZ248196A3 (en) | 1997-04-16 |
| PT746398E (pt) | 2002-10-31 |
| DE69526929T2 (de) | 2003-01-02 |
| HU217850B (hu) | 2000-04-28 |
| EP0746398A1 (en) | 1996-12-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100372209B1 (ko) | 항체정제법 | |
| US9957318B2 (en) | Protein purification methods to reduce acidic species | |
| KR101226353B1 (ko) | 면역글로불린 정제 | |
| AU2004286938B2 (en) | Removal of high molecular weight aggregates using hydroxyapatite chromatography | |
| JP3335629B2 (ja) | 蛋白質精製 | |
| JP5873016B2 (ja) | アミノ酸を利用したタンパク質の精製方法 | |
| KR102058067B1 (ko) | 단백질 a 기반 친화성 크로마토그래피 컬럼의 세정 방법 | |
| EP2089429B1 (en) | Process for preparing unaggregated antibody fc domains | |
| US20120149875A1 (en) | Affinity chromatography matrix | |
| KR20130020950A (ko) | 단백질 정제하는 동안 샘플 중의 하나 이상의 불순물 양을 감소시키는 방법 | |
| JP2012067108A (ja) | プロテインａおよびイオン交換クロマトグラフィーによる抗体精製 | |
| EA013504B1 (ru) | Способ очистки белков | |
| CN107188960A (zh) | 从样品的一或多种杂质中纯化靶蛋白的方法 | |
| Necina et al. | Capture of human monoclonal antibodies from cell culture supernatant by ion exchange media exhibiting high charge density | |
| CN109641969A (zh) | 用于分开单克隆抗体的同种型的方法 | |
| CN115975046A (zh) | 一种纯化融合蛋白的方法 | |
| KR20150070711A (ko) | 혼합 방식 크로마토그래피를 이용한 침출된 단백질 a 제거 방법 | |
| CN114539417A (zh) | 一种有效去除双特异性抗体同源二聚体的层析纯化工艺 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20131227 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20141230 Year of fee payment: 13 |
|
| EXPY | Expiration of term |