KR20160127087A - 알킬 양이온들로의 처리에 의한 단백질 제제들 내의 크로마틴 함량을 감소시키기 위한 방법들 - Google Patents

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Abstract

표적 단백질을 갖는 제제 내의 응집체 함량을 감소시키는 방법은 혼합물을 형성하도록 상기 제제를 알킬 양이온과 접촉시키는 단계 및 과잉의 알킬 양이온을 제거하도록 상기 혼합물을 적어도 하나의 기능화된 고체와 접촉시키는 단계를 포함한다.

Description

알킬 양이온들로의 처리에 의한 단백질 제제들 내의 크로마틴 함량을 감소시키기 위한 방법들{METHODS FOR REDUCING CHROMATIN CONTENT IN PROTEIN PREPARATIONS BY TREATMENT WITH ALKYL CATIONS}
여기에 개시되는 실시예들은 항체들을 포함하여 단백질들의 정제를 향상시키기 위한 방법들에 관한 것이다. 여기에 개시되는 실시예들은 특히 응집체들의 레벨을 감소시키고 세포 배양 수확물 정화의 방법들과 결합될 수 있는 방법들에 관한 것이다. 여기에 개시되는 실시예들은 또한 원하는 레벨의 단백질 순도를 구현하기 위해 다른 정제 방법들과의 그 능력들의 통합에 관한 것이다.
응집체 제거는 단백질 정제의 중요한 측면이다. 황색 형광 헤테로고리 염료 에타크리딘(ethacridine)의 낮은 농도들이 항체 제제들의 응집체 함량을 감소시키며, 이러한 결과가 부분적으로 크로마틴(chromatin) 제거에 기인할 수 있는 것으로 나타났었다(Gan 등의 "J. Chromatography A"(1291 (2013) 33-40)). 에타크리딘은 단백질 침전제로서 가장 긴 역사를 가지고 있다.
계면활성제인 세트리모늄 브로마이드(cetrimonium bromide)가 국소 방부제로 사용된다. 이는 또한 금 나노입자들의 생산에 사용되며, 모발 관리 제품들에 널리 사용된다. 이는 단백질 분석의 분야에 사용되며, 여기서 이는 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔 전기영동에서와 DNA 추출에서 복합 당단백질(glycoprotein)들의 용해를 증진시킨다. 단백질 분별의 분야에서 적용들을 가지는 지는 알려지지 않았다.
본 발명은 단백질들의 정제를 향상시키기 위한 방법들을 제공한다.
표적 단백질을 포함하는 제제 내의 응집체 함량을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 혼합물을 형성하도록 상기 제제를 알킬(alkyl) 양이온과 접촉시키는 단계 및 과잉의 알킬 양이온을 제거하도록 상기 혼합물을 적어도 하나의 기능화된 고체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
여기에 개시되는 방법들은 샘플을 알킬(alkyl) 양이온들로 처리하여 원하는 단백질을 함유하는 샘플 내의 단백질 응집체들(aggregate)을 감소시키는 수단들을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 복합체들 및/또는 응집체들의 감소는 알킬(alkyl) 양이온들의 극히 낮은 레벨들로 구현될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상승된 전도도(conductivity) 값들(상승된 염 농도를 이용하여)에서 처리될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 처리된 샘플은 단백질 제제(protein preparation)로부터 알킬 양이온들 및 응집체들을 선택적으로 제거하는 화학적 모이어티(moiety)들을 지니는 고체 물질들에 후속하여 노출될 수 있다.
또한, 키트(kit)들이 여기에 개시되는 방법들에 의한 단백질들의 정제를 위해 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 하나 또는 그 이상의 알킬 양이온과 이러한 원하는 단백질의 접촉을 통해 항체들 또는 다른 단백질들의 제제들로부터 응집체들의 감소를 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 이른바 생리적 조건들로부터 이러한 조건들보다 3배 또는 그 이상 높은 전도도 값들까지의 전도도 레벨들의 범위에서 수행될 수 있다. 이러한 상승된 전도도 레벨들은 상기 방법이 처리 동안에 침전의 위험이 없이 산성의 단백질들에 적용될 수 있게 하며, 이에 따라 개시되는 방법들이 적용될 수 있는 원하는 단백질 종들의 다양성을 증가시키게 할 수 있다. 판단의 기준으로서, 생리적 전도도는 일반적으로 약 12㎝ 당 밀리지멘스(mS/㎝)부터 약 17mS/㎝까지의 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 그 사이의 임의 값들과 범위들을 포함하여 약 0.01% 내지 약 0.05%와 같이 상기 알킬 양이온들의 극히 낮은 농도들로 수행될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 처리된 단백질 제제를 통상적으로 병행적으로 숙주 단백질 오염을 감소시키고, 응집체 함량을 감소시키는 처리의 전체적인 능력을 향상시키는 고체 물질들과 접촉시키는 단계를 제공하며, 과잉의 알킬 양이온들을 제거하는 추가적인 이점을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 알킬 양이온은 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(cetyl trimethyl ammonium bromide)이다.
일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 동종-응집체(homo-aggregate)들과 같은 원하는 단백질과 비교하여 큰 분자량을 가지는 응집체들의 레벨들의 감소를 제공하며, 또한 이종-응집체(hetero-aggregate)들과 같은 원하는 단백질보다 약간만 큰 유체 역학적 크기(hydrodynamic size)의 응집체들의 레벨들의 감소를 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 응집체들은 상기 원하는 단백질 및 오염물(contaminant)의 이종 응집체들을 포함하며, 이러한 특정 실시예들에서 상기 오염물은 핵산, 뉴클레오티드(nucleotide), 엔도톡신(endotoxin), 금속 이온, 단백질, 지질, 또는 세포 배양 배지 성분이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질의 동종-응집체들의 존재는 실질적으로 제거된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질 및 오염물의 이종-응집체들의 존재는 실질적으로 제거된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질을 포함하지 않는 동종 및 이종 응집체들의 존재는 실질적으로 제거된다.
일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 응집체들의 감소와 함께 DNA, 엔도톡신 및 바이러스 레벨들과 같은 오염물들의 감소를 추가적으로 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 상기 알킬 양이온 자체를 넘어 항바이러스제(antiviral agent)들의 추가적인 포함으로 수행된다.
일부 실시예들에 있어서, 관심의 대상인 단백질 종들(예를 들면, 정제되는 원하는 단백질)은 재조합 기원이며, 상기 단백질 제제는 세포를 함유하는 세포 배양 수확물(cell culture harvest), 세포 배양 상청액(supernatant), 정화된 세포 배양 상청액, 크로마토그래피 칼럼(chromatography column)으로부터의 용출물(eluate), 또는 정제의 이전의 단계로부터 수득되는 단백질을 함유하는 용액을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제제는 항체를 함유하며, 이러한 특정 실시예들에서 상기 항체는 IgG, IgM 또는 이들의 조각 형태, 혹은 Fc-융합 단백질과 같은 항체 또는 항체 조각의 융합 단백질이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 인자 VIII와 같은 응고 단백질이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 인간 성장 호르몬과 같은 펩티드 호르몬이 될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 상기 샘플의 전도도가 상기 샘플로부터 원하는 단백질의 침전을 실질적으로 회피하기 위해 충분히 높은 레벨에 있도록 수행된다. 전도도는 해당 기술 분야에서 알려진 방법에 따라 염들 또는 희석제들의 첨가에 의해 조정될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 전도도는 상기 원하는 단백질의 실질적인 침전을 회피하기 위해 필요한 것으로 결정되는 레벨보다 큰 5mS/㎝, 10 mS/㎝, 15mS/㎝ 또는 20mS/㎝이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 전도도는 20mS/㎝ 이상, 25mS/㎝, 30mS/㎝, 35mS/㎝, 40mS/㎝, 45ms/㎝ 또는 45mS/㎝ 이상이다. 상승된 전도도들에서 오염물들의 중요한 하위 세트들을 제거하는 상기 방법의 능력은 이들 시스템들 내의 전하 상호작용들이 상승된 전도도들에서 감소되는 것으로 알려져 있기 때문에 개시되는 방법들의 놀라운 특징들을 나타낸다. 25mS/㎝ 및 그 이상의 전도도들에서, 예를 들면, 음성으로 하전된 단백질들의 소수만이 전기양성의 표면들에 결합되는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 방법 이외에도, IgG 항체들의 제제들에 대한 대부분의 전기양성 약제들의 적용은 5mS/㎝ 이하의 전도도들 및 통상적으로 알칼리성 pH의 동작 요구 사항으로 일어난다. 이와 같은 동작 pH는 본 발명의 방법의 요구 사항은 아니다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 상승된 전도도가 응집체들 내의 내부의 정전기적 연관들을 약화시키는 효과를 가질 수 있고, 이에 따라 상기 원하는 단백질과 연관된 응집체들의 해리 및/또는 오염물들의 제거를 구현하는 상기 방법의 능력을 증진시킬 수 있는 점이 분명해질 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 알킬 양이온은 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(cetyl trimethyl ammonium bromide)(IUPAC 명칭: N,N,N-트리메틸(Trimethyl)-1-헥사데칸암모늄 브로마이드(hexadecanaminium bromide), 이의 유사체 또는 이의 염이다. 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드는 또한 세트리모늄 브로마이드(cetrimonium bromide)로 알려져 있다. 유사체들은 분지되거나 선형의 구성이 될 수 있는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 탄소들과 같이 다른 숫자들의 탄소 잔기들을 갖는 알킬 양이온들을 포함한다. 양이온기는 사차 아민(amine), 일차 아민, 이차 아민, 삼차 아민, 또는 트리스(Tris)(2-아미노에틸(aminoethyl))아민(amine)으로 구현되는 양성 전하들의 결합으로 구성될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 알킬 양이온은 응집체들의 원하는 감소의 정도를 촉진시키기에 충분한 실질적으로 가장 낮은 농도로 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 알킬 양이온의 농도(부피 당 중량 기준)는 1%, 0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.05%, 0.04%, 0.025%, 또는 0.001% 이하가 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 전기양성의 유기 첨가제(organic additive)가 0.01%-0.04% 또는 0.02%-0.025%의 농도로 제공된다.
일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 상기 샘플 내의 응집체들의 양을 감소시키면서 원하는 단백질의 침전을 회피하거나 제한하도록 선택되는 pH 레벨들에서 수행된다. 상기 pH 레벨은 종래의 수단들에 의해 조절될 수 있고, 상기 전도도의 선택과 함께 선택될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 pH는 대략 4 내지 대략 9 사이, 대략 5 내지 대략 8 사이, 또는 대략 6 내지 대략 7.5 사이이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상기 알킬 양이온 자체를 넘어 항바이러스제와 추가적으로 접촉된다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 항바이러스제는 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 클로르헥시딘(chlorhexidine), 에타크리딘(ethacridine), 또는 트리(tri)(n-부틸(butyl))포스페이트(phosphate)와 같은 다가가 아닌 유기 양이온이다. 이러한 항바이러스제들은 대략 1%(w/v) 또는 그 이하, 대략 0.1%(w/v) 또는 그 이하, 대략 0.01%(w/v) 또는 그 이하, 혹은 대략 0.001% 또는 그 이하의 양으로 존재할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 우레이드(ureide)가 상기 샘플 내에 용해되지 않기에 충분한 양으로 상기 샘플을 우레이드와 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함한다. 상기 원하는 단백질을 함유하는 상청액은 이후에 침전된 오염물들을 포함하는 상기 샘플의 평형으로부터 분리될 수 있다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 우레이드는 상기 샘플을 상기 전기양성의 유기 첨가제와 접촉시키는 단계 이전에 공급되고, 다른 경우들에서 상기 우레이드는 상기 샘플을 상기 전기양성의 유기 첨가제와 접촉시키는 단계와 실질적으로 동시에 공급되며, 또 다른 경우들에서 상기 우레이드는 상기 샘플을 상기 전기양성의 유기 첨가제와 접촉시키는 단계 후에 공급된다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 우레이드는 요산(uric acid), 히단토인(hydantoin)(이미다졸리딘(imidazolidine)-2,4-디온(dione)), 알클록사(alcloxa), 알디옥사(aldioxa), 헤모케인(hemocane), 우레이도히단토인(ureidohydantoin), 5-우레이도히단토인, 글리옥실우레이드(glyoxylureide), 글리옥실산 디우레이드(glyoxylic acid diureide), 2,5-디옥소(dioxo)-4-이미다졸리디닐 우레아(imidazolidinyl urea)(알란토인(allantoin)), 이미다졸라디닐 우레아, 디이미다졸라디닐 우레아(diimidazolydinyl urea), 그리고 퓨린(purine) 중의 임의의 것이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 우레이드는 알란토인이며, 일부 경우들에서 상기 알란토인은 0.56%(w/v) 이상, 1%, 1.5%, 2%, 또는 그 이상의 농도들로 존재한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 우레이드는 요산이며, 이러한 일부 경우들에서 상기 요산은 0.0025%(w/v) 이상, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 1% 또는 그 이상의 농도들로 존재한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 우레이드가 완전히 용해되는 양으로 샘플을 상기 우레이드와 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함한다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 가용성의 우레이드는 요소(urea), 이미다졸리디날 우레아(imidazolydinal urea) 또는 다른 우레이드가 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 우레이드는 요소이며, 이러한 일부 경우들에서 상기 요소는 0.5M 이상, 또는 1M 이상, 또는 2M 이상, 또는 4M 이상, 또는 6M 이상, 혹은 8M 이상의 농도들로 존재한다. 이는 침전의 회피는 본 발명의 특정 목적인 상기 방법의 놀라운 특성을 다시 강조한다. 요소와 같은 고도로 가용성인 우레이드들은 말하자면 침전물들의 형성에 대향하는 이들의 존재로서 많은 화합물들의 용해도를 증가시키는 일반적인 효과를 가진다.
일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들의 유용성은 이들이 또한 세포 배양 수확물들 내의 세포 파편들의 침강을 가속화시키고, 존재할 때에 DNA, 엔도톡신 및 바이러스의 레벨들을 실질적으로 감소시키는 사실에 의해 향상된다. 실험 데이터는 응집체들, 엔도톡신 또는 바이러스와 우선적으로 상호작용하는 일부 우레이드들의 능력이 이들 결과들에 기여하는 점과 용해된 우레이드들의 낮은 레벨들이 우레이드들의 부존재에서 다가의 양이온들로의 처리와 비교하여 이들이 유지하는 보다 높은 항체 회수에 기여할 수 있는 점을 제시한다. 처리에 후속하여, 고체 물질들은 침강이나 여과에 의해 제거될 수 있고, 상기 상청액 내에 실질적으로 응집체가 없는 단백질이 남을 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 샘플을 비이온성 유기 중합체, 유기 용매, 계면활성제, 또는 우레이드와 같은 가용성의 유기 조정자(organic modulator)와 접촉시키는 추가적인 단계를 구비하여 수행될 수 있다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플을 상기 유기 조정자와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 상기 전기양성의 유기 첨가제와 접촉시키는 단계 이전에 수행된다. 다른 경우들에서, 상기 샘플을 상기 유기 조정자와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 상기 전기양성의 유기 첨가제와 접촉시키는 단계와 실질적으로 동시에 수행된다. 또 다른 경우들에서, 상기 샘플을 상기 유기 조정자와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 상기 전기양성의 유기 첨가제와 접촉시키는 단계 후에 수행된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조정자는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol) 및 폴리부틸렌 글리콜(polybutylene glycol)과 같은 비이온성 유기 중합체이며, 이러한 특정 실시예들에서 상기 비이온성 유기 중합체는 대략 1000D 또는 그 이하, 500D 또는 그 이하, 250D 또는 그 이하, 혹은 100D 또는 그 이하의 평균 분자량을 가진다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조정자는 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 부틸렌 글리콜(butylene glycol), 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide), 에탄올(ethanol) 또는 페녹시에탄올(phenoxyethanol)과 같은 유기 용매이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조정자는 대략 1%(w/v) 또는 그 이상의 농도로 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조정자는 트윈(Tween), 트리톤(triton), CHAPS, CHAPSO 또는 옥틸 글루코시드(octyl glucoside)와 같은 계면활성제이며, 이러한 특정 실시예들에서 상기 계면활성제는 대략 1%(w/v) 또는 그 이하, 대략 0.1% 또는 그 이하 혹은 대략 0.02%(w/v) 또는 그 이하의 농도로 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조정자는 아포화되는 양으로 제공되는 우레이드이며, 이러한 특정 실시예들에서 상기 우레이드는 요소, 히단토인 또는 알란토인이다.
일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 개시되는 방법들 중의 특정 방법들의 편리한 수행을 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 하나 또는 그 이상의 다가의 유기 양이온들, 우레이드들, 유기 조정자들, 항바이러스제들, 그리고 전도도의 조절을 위한 시약들과 같이 개시되는 방법들의 수행을 위해 유용한 시약들을 제공할 수 있다. 상기 키트는 단백질들의 정제에 사용되기 위해 개시되는 방법들의 수행에 맞추어진 양들 및 농도들로 물질들을 제공할 수 있다. 이러한 키트들은 IgG 또는 IgM 항체들과 같은 특정 단백질들로의 사용을 위해 맞추어질 수 있으며, 단백질 제제 및 정제의 특정 규모들을 위해 적합한 양들에 맞추어질 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 추가적인 처리 이전에 샘플로부터 과잉의 알킬 양이온들 또는 다른 샘플 성분들을 선택적으로 제거하는 효과를 갖는 고체들의 의도로 고체 물질들과 상기 샘플의 접촉이 수반될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 정제의 보다 높은 레벨들을 구현하거나 다른 오염물들을 제거하기 위해 종래의 단백질 정제 방법들과 결합될 수 있다. 예를 들면, 개시되는 방법들은 침전, 크로마토그래피 및 액상-액상 추출 방법들을 포함하는 종래의 정제 방법들의 준비로 수행될 수 있다. 이들 방법들을 위한 적절한 조건들을 개발하고, 이들을 생성물의 원하는 정제를 구현하기 위해 여기서 설명되는 개시되는 방법들과 통합하는 것은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 능력 이내가 될 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 동작 조건들은 응집체들이 감소되고 원하는 단백질은 용액 내에 남는 정도를 조절하기 위해 pH에 대해 및/또는 킬레이트제(chelating agent)들, 유기 중합체들이나 용매들, 계면활성제들, 카오트로프(chaotrope)들 그리고 염들의 다양한 종들의 존재에 의해 변화될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 표적 단백질을 포함하는 제제 내의 응집체 함량을 감소시키는 방법들이 제공되며, 상기 방법은 혼합물을 형성하도록 상기 제제를 알킬 양이온과 접촉시키는 단계 및 과잉의 알킬 양이온을 제거하도록 상기 혼합물을 적어도 하나의 기능화된 고체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 방법들은 상기 혼합물을 아릴(aryl) 양이온과 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 아릴 양이온은 에타크리딘 또는 메틸렌 블루(methylene blue)일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 알킬 및 아릴 양이온들의 결합된 농도는 상기 알킬 양이온이 단독으로 사용될 때와 동일한 농도가 될 수 있다. 이러한 실시예들에 있어서, 상기 알킬 양이온은 영(zero)이 아닌 양으로 존재한다.
일부 실시예들에 있어서, 여기에 개시되는 방법들은 상기 제제의 응집체 함량을 더 감소시키도록 상기 혼합물을 적어도 하나의 전기양성의 고체와 동시에 또는 연속하여 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 알킬 양이온은 세트리모늄(cetrimonium), 세틸 트리메틸 암모늄(cetyl trimethyl ammonium), N,N,N-트리메틸(Trimethyl)-1-헥사데칸암모늄(hexadecanammonium), N,N,N-트리메틸(trimentyl)-1-헵타데칸암모늄(heptadecanammonium), N,N,N-트리메틸(Trimethyl)-1-옥타데칸암모늄(octadecanammonium), N,N,N-트리메틸(Trimethyl)-1-펜타데칸암모늄(pentadecanammonium) 그리고 N,N,N-트리메틸(Trimethyl)-1-테트라데칸암모늄(tetradecanammonium)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사차 암모늄 양이온의 브롬화물 또는 염화물 염을 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 알킬 양이온은 (a) 약 0.001%부터 약 1%까지; (b) 약 0.01%부터 약 1%까지; 및 (c) 약 0.02%부터 약 0.03%까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 농도 범위 내에 존재한다.
일부 실시예들에 있어서, 알란토인은 (a) 약 0.6%부터 약 50%까지; (b) 약 1%부터 약 10%까지; 및 (c) 약 1%부터 약 2%까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 농도 범위 내에 존재한다.
일부 실시예들에 있어서, 동작 전도도는 (a) 약 0.1mS/㎝부터 약 50 mS/㎝까지; (b) 약 1mS/㎝부터 약 30mS/㎝까지; 및 (c) from 약 5mS/㎝부터 약 15 mS/㎝까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 이내이다.
일부 실시예들에 있어서, 동작 pH는 (a) 약 4부터 약 10까지; (b) 약 5부터 약 9까지; 및 약 6부터 약 8까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 이내이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 혼합물은 상기 알킬 양이온이 아닌 항바이러스제를 더 포함하며, 상기 항바이러스제는 클로르헥시딘, 벤잘코늄 클로라이드, 메틸렌 블루, 에타크리딘 및 트리(tri)(n-부틸(butyl))포스페이트(phosphate)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 기능화된 고체의 표면은 정전기적 상호작용들, 소수성 상호작용들, 수소 결합 및 금속 친화도로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화학적 상호작용을 촉진시킨다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 기능화된 고체는 미립자이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 표적 단백질은 재조합 단백질, 항체, 성장 호르몬 및 응고 인자(clotting factor)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제제는 세포를 함유하는 세포 배양 수확물, 실질적으로 세포가 없는 세포 배양 수확물 및 부분적으로 정제된 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나이다.
일부 실시예들에 있어서, 여기에 개시되는 방법의 편리한 수행을 위한 키트들이 제공된다. 이러한 키트들은 지시들과 함께 상기 방법들을 수행하기 위한 모든 필요한 시약을 포함할 수 있다.
다음의 용어들은 개시되는 방법들이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 정의된다. 추가적인 정의들은 상세한 설명에 전체적으로 설시된다.
"응집체(aggregate)(들)"은 생리적 조건들에서 안정하고, 넓은 범위의 pH 및 전도도 조건들에 걸쳐 안정하게 남을 수 있는 둘 또는 그 이상의 분자들의 연관을 언급한다. 응집체들은 흔히 단백질, 핵산, 또는 지질 및 다른 분자나 금속 이온과 같은 적어도 하나의 생체 분자를 포함한다. 상기 연관은 화학적 상호작용들의 임의의 유형이나 임의의 결합을 통해 일어날 수 있다. 항체들의 응집체들은 두 가지 범주들로 분류될 수 있다. "동종-응집체들(homo-aggregates)"은 동일한 조성의 둘 또는 그 이상의 단백질들의 안정한 연관을 언급하며, "이종-응집체들(hetero-aggregates)"은 선택적으로 하나 또는 그 이상의 비-단백질 분자들과 연관된 동일하거나 다른 조성의 하나 또는 그 이상의 단백질들의 안정한 연관을 언급한다. 상기 비-단백질 성분은 뉴클레오티드, 엔도톡신, 금속 이온, 지질, 또는 세포 배양 배지 성분으로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 실체(entity)들로 구성될 수 있다.
"항체(antibody)"는 면역글로불린(immunoglobulin), 복합체 또는 이의 조각형태를 언급한다. 상기 용어는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 인간화, 인간, 단일 사슬, 키메라, 합성, 재조합, 혼성, 돌연변이, 그라프트(graft)된 것들 및 생체 외로 생성된 항체들과 같이 자연이나 유전적으로 변형된 형태들을 포함하여 인간이나 다른 포유동물 세포주들로부터 유래되는 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM의 다클론성(polyclonal) 또는 단일클론성(monoclonal) 항체들을 포함할 수 있다. "항체"는 또한, 이에 한정되는 것은 아니지만, 면역글로불린 모이어티(moiety)를 함유하는 융합 단백질들을 포함하는 복합체 형태들을 포함할 수 있다. "항체"는 또한 이들이 항원-결합 기능을 유지하던지 또는 그렇지 않던지 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, Fc 및 다른 조성들과 같은 항체 조각들을 포함할 수 있다.
"엔도톡신(eEndotoxin)"은 세포 용해에 따라 세포로부터 해리되는 그람 음성의(gram-negative) 박테리아의 외막 내에 존재하는 독성의 열에 안정한 지질다당류(lipopolysaccharide)를 언급한다.
"비이온성 유기 중합체(non-ionic organic polymer)"는 하전된 기들이 결핍된 연결된 반복되는 유기 서브 유닛들로 구성된 자연 또는 합성 탄화수소를 언급한다. 이는 선형일수 있거나, 일부 분지들을 갖는 주로 선형일 수 있거나, 또는 주로 분지될 수 있다. 개시되는 방법들을 수행하기에 적합한 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리비닐피르롤리돈(polyvinylpyrrolidone: PVP)을 포함한다. PEG는 HO-(CH2-CH2-O)n-H의 구조식을 가진다. 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 100달톤(dalton) 이하로부터 1000달톤 이상까지의 평균 중합체 분자량을 갖는 조성물들을 포함한다.
"알킬 양이온(alkyl cation)"은 적어도 하나의 양성의 전하를 지니는 계속적으로 선형이거나 분지된 구성으로 12개 또는 그 이상의 탄소 원자들로 구성되는 유기 양이온들 언급하며, 여기서 상기 양성의 전하는 추가적인 탄소 원자들을 포함할 수 있다. 하나의 예는 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드이다. 알킬 양이온들은 다른 것들 중에서 브롬화물들, 염화물들 및 스테아레이트(stearate)들을 포함하는 염들로 사용될 수 있다.
"아릴 양이온(aryl cation)"은 질소 원자 또는 황 원자를 통해 표현될 수 있는 적어도 하나의 양성의 전하를 지니는 동일 평면 배이 내의 3개의 고리들로 구성되는 유기 양이온을 언급한다. 예들은 에타크리딘(ethacridine)(7-에톡시아크리딘(ethoxyacridine)-3,9-디아민(diamine); 2-하이드록시프로피온산(hydroxypropanoic acid)) 및 메틸렌 블루(methylene blue) (7-(디메틸아미노(dimethylamino))페노티아진(phenothiazin)-3-일리덴(ylidene)]-디메틸아자늄(dimethylazanium))뿐만 아니라 이의 유사체들, 유도체들 및 염들을 포함한다.
"유기 용매(organic solvent)"는 액체 상태로 존재하는 자연 또는 합성 유기 화합물을 언급한다. 개시되는 방법들을 수행하기에 적합한 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 디메틸 술폭시드, 에탄올 및 페녹시에탄올을 포함한다.
"유기 중합체(organic polymer)"는 유기 단량체의 자연 또는 합성 중합체를 언급한다. 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 다른 것들 중에서 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 덱스트란(dextran) 또는 셀룰로오스(cellulose)를 포함한다.
"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 사슬 내에 공유 결합으로 결합된 다중의 뉴클레오티드 단량체들로 구성되는 생물고분자를 언급한다. DNA(데옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산)는 폴리뉴클레오티드들의 예들이다.
"단백질(protein)"은 탄소, 수소, 산소, 질소 및 통상적으로 황을 함유하고, 주로 펩티드 결합들에 의해 연결되는 아미노산의 하나 또는 그 이상의 사슬들로 구성되는 복합 유기 고분자들의 그룹의 임의의 것을 언급한다. 상기 단백질은 자연이나 재조합 기원이 될 수 있다. 단백질들은 글리코실레이션(glycosylation), 페길레이션(pegylation) 등을 통한 바와 같이 비-아미노산 모이어티(moiety)들로 변형될 수 있거나, 다른 화학적 모이어티들과 접합될 수 있다. 단백질들의 예들은 이에 한정되는 것은 아니지만, 항체들, 응고 인자(clotting factor)들, 효소들 및 펩티드 호르몬들을 포함한다.
"용해되지 않은 우레이드(undissolved ureide)"는 특정 단백질 제제 내에 일반적인 조건들 하에서 그 최대 용해도를 초과하는 우레이드의 양을 함유하는 용액을 언급한다. 일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 샘플을 위한 조건들 하에서 이러한 샘플 내의 우레이드의 용해도보다 큰 양으로 우레이드를 포함하는 샘플을 제공하여, 이러한 우레이드들의 일부 부분이 상기 샘플 내에 용해되지 않은 형태로 존재한다.
"계면활성제(surfactant)"는 일반적으로 소수성 부분 및 친수성 부분을 구현하여 이들이 양쪽 친매성으로 언급되게 하는 유기 분자들의 클래스와 같은 "표면활성제(surface active agent)"들을 포함한다. 수성 용액들 내의 충분한 농도들에서, 계면활성제들은 물과의 접촉을 최소화하도록 중심에 농축되는 소수성 부분들 및 물과의 접촉을 최대화하도록 외측으로 방사되는 친수성 부분들을 갖는 클러스터(cluster)로 자기 연관될 수 있다. 특히 소수성 특성을 가지거나 소수성 특성의 영역들을 지니는 물질들을 함유하는 생물학적 제제들의 존재에서, 상기 계면활성제들의 소수성 부분은 상기 소수성 물질의 일부 부분들과 자발적으로 연관되는 경향이 있으며, 상기 계면활성제의 친수성 부분의 영향을 통해 이들의 용해도를 증가시킨다. 이들은 또한 수성 용매 내에 모두 용해되는 다른 소수성 물질들 사이에 일어나는 소수성 상호작용들을 조절하는 데 사용될 수 있다. 개시되는 방법들의 일부 실시예들을 수행하기 위해 적합한 계면활성제들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리소르베이트(polysorbate) 계면활성제들(예를 들면, 트윈(Tween) 20, 폴리옥시에틸렌(Polyoxyethylene) (20) 소르비탄 모노로레이트(sorbitan monolaurate) 및 트윈 80 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올리에이트(sorbitan monooleate)) 및 트리톤(Triton)(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸(tetramethylbutyl))-페닐 에테르(phenyl ether))과 같은 비이온성 계면활성제들 그리고 CHAPS (3-[(3-콜라도프로필(Cholamidopropyl))디메틸암모니오(dimethylammonio)]-1-프로판술포네이트(propanesulfonate)), CHAPSO (3-[(3-콜라도프로필(cholamidopropyl))디메틸암모니오(dimethylammonio)]-2-하이드록시(hydroxy)-1-프로판술포네이트(propanesulfonate)) 및 옥틸 글루코시드(octyl glucoside)(예를 들면, (2R,3S,4S, 5R,6R)-2-(하이드록시메틸(hydroxymethyl))-6-옥톡시옥산(octoxyoxane)-3,4,5-트리올(triol))과 같은 쌍성 이온성 계면활성제들을 포함한다.
"바이러스(virus)" 또는 "비리온(virion)"은 살아있는 숙주들, 주로 박테리아, 식물들 및 동물들의 세포들 내에서만 복제되는 극히 미소한(대략 20㎚ 내지 300㎚의 직경), 대사적으로 불활성인 감염원을 언급하며, RNA 또는 DNA 코어(core), 단백질 코트 및 보다 복합한 유형들에서는 둘러싸는 외피로 구성된다.
일부 실시예들에 따른 개시되는 방법들을 이용하는 제제에 있어서, 알킬 양이온을 선택하는 것이 필요할 것이다. 실험 데이터는 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드가 바이러스를 불활성화시키는 이의 능력 이외에도 응집체들을 감소시키는 이의 효과에 대하 바람직한 것으로 나타낸다. 이의 항말라리아약(anti-malarial drug) 및 메트헤모글로빈혈증(methemoglobinemia)의 치료를 위한 치료제로서의 사용은 생체 내로의 사람 사용과 양립 가능성을 강조하며, 미국 약전에 등재되어 있다.
사용을 위한 알킬 양이온들의 평가의 과정에 있어서, 일부 실시예들에서, 적용을 위한 조건들이 다음과 같이 조사될 수 있다. 알킬 양이온들의 사용은 일부 실시예들에서 상기 방법을 수행하는 데 이용될 수 있는 조건들에 대해 일부 제한들을 잠재적으로 부여한다. 예를 들면, 상기 알킬 양이온들 및 관심의 대상인 단백질 사이의 강한 상호작용들을 실질적으로 방지하는 조건들을 채용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 조건들의 근사치를 얻기 위한 간단한 방법은 관심의 대상인 단백질을 음이온 교환에 적용시키고, 염의 차이에서 이를 용리시키는 것이다. 단백질이 용리되는 문턱 값보다 약간 높은 염 농도로 상기 방법이 가장 효과적으로 수행될 수 있는 최소의 전도도가 대략적으로 확인된다. 이러한 농도는 pH에 의해 영향을 받을 것이며, 이는 동일한 수단들에 의해 모델로 될 수 있다. 상기 방법이 세포 배양 상청액에 적용되는 것으로 정해지면, IgG 항체는 상당한 손실들을 회피하도록 염의 추가나 pH의 변경을 필요로 하지 않을 수 있다. IgM 항체들은 심지어 30mS/㎝(생리적보다 약 2배 높은)에 근접하는 전도도 값들까지 염의 첨가를 필요로 할 수 있다. 용해되지 않은 우레이드들 및 전기양성의 유기 첨가제들의 사용을 포함하는 일부 실시예들에 있어서, IgG 적용들은 잠재적으로 1mS/㎝ 또는 그 이하의 값들을 포함하여 생리적 전도도보다 낮게 수행될 수 있고, 이 경우에 숙주 단백질들의 실질적인 양들이 분리되는 응집체들과 함께 제거될 수 있다. 이러한 적용들은 상기 알킬 양이온들의 농도가 숙주 단백질들과의 결합을 통해 손실되는 양을 보상하도록 증가되는 것을 필요로 할 수 있다. 일부 상황들에서 보다 낮은 동작 전도도들 또한 DNA, 엔도톡신 및 바이러스의 제거를 향상시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 일반적으로 95% 이상이고 통상적으로 98-99%의 항체 회수를 유지할 것이다. 상기 샘플의 전도도 및 pH 조건들은 통상적으로 상기 우레이드 또는 상기 알킬 양이온들을 첨가하기 전에 확립되어야 한다.
일부 실시예들에 있어서, IgG 단일클론성 항체들을 함유하는 정화된 세포 배양 상청액들을 위한 조건들을 평가하는 하나의 효과적인 수단은 0.01% 내지 0.1%의 알킬 양이온들의 범위 및 생리적인 경우의 반으로부터 2배까지의 범위의 전도도들을 커버하는 것이다. 상기 범위들은 결과들이 그렇게 하는 것이 유용할 수 있는 것을 나타낼 경우에 확장될 수 있거나, 보다 미세한 증분들로 좁아지고 평가될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 정화된 세포 배양 상청액들을 위해 개시되는 방법들에 따른 정제 과정을 개발하기 위해 편리한 출발점은 0.025%의 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드를 사용하는 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 이러한 수행이 항체 회수를 향상시킬 수 있기 때문에 상기 전기양성의 유기 첨가제를 첨가하기 전에 상기 단백질 제제 내에 유기 조정자를 분산시켜 시작하는 것이 유리할 수 있다. 상기 전기양성의 유기 첨가제의 첨가 전의 긴 배양은 불필요한 것으로 나타나며, 비록 보다 긴 배양에 대한 단점은 나타나지 않았지만 15분 또는 그 이하가 적절하다. 실험 데이터는 대체로 약 1%의 과포화되는 농도로 알란토인의 첨가가 IgG의 회수를 증가시키는 점을 나타낸다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 알킬 양이온이 상기 단백질 제제 전체에 걸친 이의 빠른 분산을 가능하게 하도록 상기 샘플에 대한 이의 첨가 전에, 예를 들면 물이나 완충액 내에 용해되는 것이 권고된다. 예를 들면, 상기 용해된 알킬 양이온들을 잘 혼합된 서스펜션(suspension) 내로 점차적으로 주입하여 지속적인 국소적 과잉들을 회피하도록 주의를 기울여야 한다. 배양 시간은 적어도 15분, 바람직하게는 30분이어야 하지만, 60분 이상의 기간들로부터 상당한 이점은 나타나지 않았다.
상기 방법은 일반적으로 주위 온도에서 수행될 수 있지만, 예를 들면 4℃부터 37℃까지 범위의 보다 높거나 보다 낮은 온도들에서 수행될 수 있다. 실험 데이터는 온도가 수득되는 결과들을 실질적으로 변경시키지 않으며, 이는 단백질의 안정성 요구 사항들이 동작 온도들의 선택에서 결정적인 인자로 남게 할 것인 점을 나타낸다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 알킬 양이온은, 예를 들면 물이나 완충액 내에 용해되거나 분산되며, pH는 상기 샘플에 대한 이의 첨가 이전에 조정된다. 이는 유리 염기 형태들과 같은 알킬 양이온들의 특정 제제들이 알칼리성이고, 의도하지 않은 방식으로 실험 조건들을 실질적으로 변경시키는 잠재성을 가지기 때문이다.
과포화된 우레이드들 및 알킬 양이온들 모두의 사용을 포함하는 일부 실시예들에 있어서, 상기 우레이드와 알란토인을 구비하는 경험이 이러한 수행이 항체 회수를 향상시킬 수 있는 점을 나타내기 때문에, 상기 알킬 양이온들을 첨가하기 전에 상기 단백질 제제 내에 상기 우레이드를 분산시켜 시작하는 것이 일반적으로 유리할 수 있다. 상기 전기양성의 유기 첨가제의 첨가 이전의 긴 배양은 불필요한 것으로 나타나며, 비록 보다 긴 배양에 대해 단점은 나타나지 않았지만 15분 또는 그 이하가 적절하다.
방법 개발이든지 제조든지 상기 방법에 의해 구현되는 응집체 해리 또는 제거를 모니터링하기 위한 다중의 선택 사항들이 존재한다. 가장 간단한 것은 적합한 선택성을 갖는 칼럼에 대해 분석적 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 수행하고, 280㎚의 UV 파장에서 모니터하는 것이다. 이들이 통상적으로 응집되지 않은 생성물의 크기의 배수들로 적절하게 확인되는 유체역학적 치수를 구현하기 때문에 이는 HMW(고분자량) 응집체들을 나타낼 수 있다. 이종-응집체들은 이들의 유체역학적 치수들이 응집되지 않은 생성물의 경우보다 약간만 클 수 있기 때문에 이러한 방법에 의해서는 통상적으로 간과된다. 이러한 경우들에서, 상기 응집체의 이형의 조성은 280㎚에서의 흡수에 대한 254㎚에서의 UV 흡수의 비율을 계산하고, 이후에 연관된 오염물들이 완전히 없는 것으로 여겨지는 정제된 단백질에 대한 흡수 비율과 상기 값을 비교하여 나타날 수 있다. 예를 들면, DNA를 함유하는 이종-응집체들은 254/280의 상승된 비율로 나타날 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 후속되는 정제 이전에 상기 알킬 양이온들 및 잠재적으로 상기 샘플의 다른 성분들을 제거하기 위한 처리와 통합될 수 있다. 이러한 처리들은 이들이 상기 알킬 양이온들을 상기 샘플의 나머지로부터 격리시키는 목적으로 상기 알킬 양이온들의 특성들에 대한 이들의 성질이 보상되는 화학적 모이어티들을 지니는 고체들에 대한 상기 샘플의 노출을 포함할 수 있다. 알킬 양이온들이 양성으로 하전되며 소수성인 것으로 이해되기 때문에, 소수성의 음성으로 하전된 표면들을 포함하여 음성으로 하전된 표면들이 과잉의 알킬 양이온들을 격리시키기 위해 특히 유용해야 하는 점이 수반된다. 다른 표면 조성의 고체들은 상기 샘플의 다른 성분들을 격리시키도록 포함될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 생물 친화 크로마토그래피(biological affinity chromatography)의 단백질 A 및 다른 형태들, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정 금속 친화 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography), 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 또는 다른 혼합 모드 크로마토그래피(mixed mode chromatography) 및/또는 침전과 액상-액상 추출과 같은 비-크로마토그래피 방법들을 포함하는 하나 또는 그 이상의 정제 방법들과 통합될 수 있다. 특정 항체의 필수적인 정제를 구현하기 위해 다양한 방법들을 위한 적절한 조건들을 개발하고 이들을 여기에 개시되는 방법들과 통합하는 것은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 이해의 범위 내가 될 것이다.
실험예들
실험예 1. 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB) 대 에타크리딘의 독립적인 효과들. 약 2g/L의 농도로 IgG1 단일클론성 항체를 함유하는 세포 배양 수확물이 원심분리 및 미세여과에 의해 정화되었다. 응집체 함량은 21.2%였고, 숙주 단백질 함량은 IgG의 225,906백만분율(ppm)이었다. 일련의 대조 실험들에서, 정화된 수확물들 다른 부분 표본(aliquot)들이 0.01%, 0.02% 및0.05%의 에타크리딘과 혼합되었고, 2시간 교반 교반되면서 배양되었다. 다른 일련의 실험들에서, CTAB가 동일한 농도들로 별도의 부분 표본들에 첨가되었다. 고체들은 원심분리에 의해 제거되었다. CTAB는 응집체들을 2.5%-2.6%까지 감소시켰고. 에타크리딘은 응집체들을 1.8%-2.0%까지 감소시켰다. 그러나, 에타크리딘이 경쇄의 소집단을 분명한 경쇄 이합체(dimer)로 전환시키는 것으로 지속적으로 관찰된 반면, CTAB는 그렇지 않았다.
실험예 2. 기능화된 고체들과의 접촉이 수반되는 알란토인과 혼합된 CTAB. 약 2g/L의 농도로 IgG1 단일클론성 항체를 함유하는 세포 배양 수확물이 원심분리 및 미세여과에 의해 정화되었다. 응집체 함량은 10.5%였고, 숙주 단백질 함량은 IgG의 277,980ppm이었다. 알란토인이 1%(w/v)의 양으로 첨가되었다. CTAB 브롬화물이 0.05%의 양으로 첨가되었고, 혼합물은 2시간 동안 배양되었다. 응집체들은 2.5%까지 감소되었고, 숙주 단백질들은 156,002ppm까지 감소되었다. 양성으로 하전된 입자들(바이오-워크스(Bio-Works) 트렌 하이(TREN high))이 5%(v/v)의 양으로 첨가되었고, incubated mixing for 4시간 동안 혼합되면서 배양되었다. 고체들은 원심분리 및 미세여과에 의해 제거되었다. 응집체들은 1.2%까지 감소되었고, 92%의 IgG 회수와 함께 숙주 단백질은 127,959ppm까지 감소되었다.
실험예 3. 실험예 2의 병행 실험예에서, 동일한 소스 물질을 사용하였지만, 0.05%의 CTAB가 0.05%의 메틸렌 블루로 대체되었던 경우, 응집체들은 CTAB에 의한 2.5%에 비해 5.4%까지 감소되었고, 숙주 단백질들은 CTAB에 의한 156,002ppm에 비해 223,612ppm까지 감소되었다. TREN 입자들과 접촉시킨 후, 응집체들은 1.2%까지 감소되었고, 숙주 단백질들은 메틸렌 블루에 의해 94,780ppm까지 감소되었다.
실험예 4. 실험예 2 및 실험예 3의 병행 실험예에서, 동일한 소스 물질을 사용하였지만, 0.05%의 CTAB가 0.025%의 에타크리딘으로 대체되었던 경우, 응집체는 CTAB에 의한 2.5%에 비해 3.5%까지 감소되었고, 숙주 단백질은 CTAB에 의한 156,002ppm에 비해 174,210ppm까지 감소되었다. TREN 입자들과 접촉시킨 후, 응집체들은 CTAB에 의한 1.2%에 비해 에타크리딘에 의해 1.2%까지 감소되었고, 숙주 단백질들은 CTAB에 의한 127,959ppm에 비해 에타크리딘에 의해 93,424ppm까지 감소되었다.
실험예 5. 실험예 2-실험예 4와 동일한 소스 물질을 사용하지만 0.01%의 CTAB가 0.04%의 메틸렌 블루와 결합되었던 실험예에서, 응집체들은 2.5%의 응집체들인 CTAB 단독에 비해 3.4%까지 감소되었고, 숙주 단백질은 156,002ppm인 CTAB 단독에 비해 157,483ppm까지 감소되었다. TREN 입자들과 접촉시킨 후, 결합은 응집체들을 1.2%인 0.05%의 CTAB 단독에 비해 1.3%까지 감소시켰고, 숙주 단백질들을 93,424ppm의 HCP에 비해 88,923ppm까지 감소시켰다.
실험예 6. 실험예 2-실험예 5와 동일한 소스 물질을 사용하지만 0.01%의 CTAB가 0.025%의 에타크리딘과 결합되었던 실험예에서, 응집체들은 2.5%의 응집체들인 CTAB 단독에 비해 3.2%까지 감소되었고, 숙주 단백질은 156,002ppm인 CTAB 단독에 비해 155,788ppm까지 감소되었다. TREN 입자들과 접촉시킨 후, 결합은 응집체들을 1.2%의 응집체들인 0.05%의 CTAB 단독에 비해 1.2%까지 감소시켰고, 숙주 단백질들을 93,424ppm의 HCP에 비해 81,669ppm까지 감소시켰다.
실험예 7. 실험예 2에 기재된 바와 같이 0.05%의 CTAB에 의해 생성된 경우에 후-TREN 처리된 물질로 개시되는 실험예에서, 샘플은 이후에 한 쌍의 텝스 필터(depth filter)들(PB1 및 PC1, 사르토리우스(Sartorius))을 통과하였다. 응집체들은 0.2%까지 감소되었고, 숙주 단백질들은 31,987ppm까지 감소되었다.
해당 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 앞서의 실험예들에서 기재된 경우들과 같은 실험들로부터의 결과들을 이들의 요구 사항들을 충족시키도록 요구되는 부피가 어떻든지 어떻게 규모를 증가시키고 규모를 축소시키는 지를 이해할 것이다.
여기서 언급되는 모든 참고 문헌들은 각각의 개별적인 공개특허들이나 특허들 또는 특허출원들이 모든 목적들을 위해 그 전체 개시 사항들이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타내어지는 것과 같은 정도까지 그 전체 개시 사항들이 모든 목적들을 위해 참조로 포함된다. 참조로 포함되는 공개특허들이나 특허들 또는 특허출원들이 본 명세서에 포함되는 개시 사항에 모순되지 않는 정도까지 본 명세서는 임의의 이러한 모순적인 문제를 대체하거나 및/또는 우선하도록 의도된다.
본 명세서와 특허청구범위에서 사용되는 구성 성분들, 크로마토그래피 조건들 등을 나타내는 모든 숫자들은 모든 예들에서 "약(about)"이라는 용어에 의해 변경되는 것으로 이해된다. 이에 따라, 다르게 기재되지 않는 한, 본 명세서와 첨부된 특허청구범위에서 설정되는 수치적 변수들은 본 발명의 개시되는 방법들에 의해 수득되는 것으로 간주되는 원하는 성능에 따라 변화될 수 있는 근사치들이다.
여기에 개시되는 방법들의 많은 변형들과 변화들이 해당 기술 분야의 숙련자에게는 분명한 바와 같이 이들의 사상과 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 여기에 개시되는 특정 실시예들은 단지 예로써 제시되는 것이며, 어떠한 방식으로도 제한하는 것을 의미하지 않는다. 본 명세서와 실험예들은 다음의 특허청구범위에 의해 나타나는 여기에 개시되는 방법들의 진실한 사상과 범주 내에서 단지 예시적인 것들로 간주되도록 의도된다.

Claims (15)

  1. 표적 단백질을 포함하는 제제(preparation) 내의 응집체 함량을 감소시키는 방법에 있어서,
    혼합물을 형성하도록 상기 제제를 알킬(alkyl) 양이온과 접촉시키는 단계; 및
    과잉의 알킬 양이온을 제거하도록 상기 혼합물을 적어도 하나의 기능화된 고체와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 혼합물을 아릴(aryl) 양이온과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 아릴 양이온은 에타크리딘(ethacridine) 또는 메틸렌 블루(methylene blue)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제 내의 응집체 함량을 더 감소시키도록 상기 혼합물을 적어도 하나의 전기양성의 고체와 동시에 또는 연속하여 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알킬 양이온은 세트리모늄(cetrimonium), 세틸 트리메틸 암모늄(cetyl trimethyl ammonium), N,N,N-트리메틸(Trimethyl)-1-헥사데칸암모늄(hexadecanammonium), N,N,N-트리메틸(trimentyl)-1-헵타데칸암모늄(heptadecanammonium), N,N,N-트리메틸(Trimethyl)-1-옥타데칸암모늄(octadecanammonium), N,N,N-트리메틸(Trimethyl)-1-펜타데칸암모늄(pentadecanammonium) 및 N,N,N-트리메틸(Trimethyl)-1-테트라데칸암모늄(tetradecanammonium)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사차 암모늄 양이온의 브롬화물 또는 염화물 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알킬 양이온은 (a) 약 0.001%부터 약 1%까지; (b) 약 0.01%부터 약 1%까지; 및 (c) 약 0.02%부터 약 0.03%까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 농도 범위 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 알란토인(allantoin)이 (a) 약 0.6%부터 약 50%까지; (b) 약 1%부터 약 10%까지; 및 (c) 약 1%부터 약 2%까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 농도 범위 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 동작 전도도는 (a) 약 0.1mS/㎝부터 약 50mS/㎝까지; (b) 약 1mS/㎝부터 약 30mS/㎝까지; 및 (c) 약 5mS/㎝부터 약 15mS/㎝까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 이내인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 동작 pH는 (a) 약 4부터 약 10까지; (b) 약 5부터 약 9까지; 및 약 6부터 약 8까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 내인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 상기 알킬 양이온이 아닌 항바이러스제(antiviral agent)를 더 포함하며, 상기 항바이러스제는 클로르헥시딘(chlorhexidine), 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 메틸렌 블루, 에타크리딘 및 트리(tri)(n-부틸(butyl))포스페이트(phosphate)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 기능화된 고체의 표면은 정전기적 상호작용들, 소수성 상호작용들, 수소 결합 및 금속 친화도로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화학적 상호작용을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 기능화된 고체는 미립자인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 재조합 단백질, 항체, 성장 호르몬 및 응고 인자(clotting factor)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 제제는 세포를 함유하는 세포 배양 수확물(cell culture harvest), 실질적으로 세포가 없는 세포 배양 수확물 및 부분적으로 정제된 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 방법의 편리한 수행을 제공하는 키트.
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