KR20220075380A - 단백질 정제 및 바이러스 불활성화 - Google Patents

단백질 정제 및 바이러스 불활성화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 친화성 크로마토그래피 단계, 바이러스 불활성화 단계 및 선택적으로 다른 정제 단계를 포함하는, 세포 배양 샘플로부터 표적 단백질을 정제하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 샘플은 표적 단백질, 바이러스 화합물 및 다른 생성물 및 공정 관련 불순물을 포함하고, 친화성 크로마토그래피 단계는:
a) 친화성 크로마토그래피 컬럼에 세포 배양 샘플을 로딩하여 표적 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합시키는 단계;
b) 친화성 크로마토그래피 컬럼을 pH 6 보다 낮고 부형제를 포함하는 용리 완충제와 접촉시킴으로써 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 표적 단백질을 용리시키는 단계 (여기서, 부형제는 이당류, 폴리올 및 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체로 이루어진 군으로부터 선택됨);
c) 단계 (b) 로부터 수득된 표적 단백질을 함유하는 하나 이상의 분획을 수집하는 단계;
d) 잠재적으로 단계 (c) 에서 수득된 분획을 조합하여 용리 생성물 풀을 형성하는 단계를 포함하고,
바이러스 불활성화 단계는:
e) 용리 생성물 풀을 2.5 내지 4.5 의 pH 에서 인큐베이션하는 단계를 포함한다.

Description

단백질 정제 및 바이러스 불활성화
본 발명은 친화성 크로마토그래피 단계, 바이러스 불활성화 단계 및 선택적으로 다른 정제 단계를 포함하는, 세포 배양 샘플로부터 표적 단백질을 정제하기 위한 개선된 방법에 관한 것이며, 여기서 세포 배양 샘플은 표적 단백질, 바이러스 화합물 및 다른 생성물 및 공정 관련 불순물을 포함한다.
단백질 및 특히 모노클로날 항체 (mAb) 에 대한 치료적 적용은 오늘날 의학적 요구에서 증가하는 역할을 한다.
생명공학적으로 생산된 단백질의 다운스트림 처리 동안의 주요 양상은 표적 단백질의 순도 및 공정 수율이다. 따라서, 다운스트림 공정은 최종 생성물이 결국 환자에게 투여되는 치료제로 되는 방식으로 설계될 필요가 있다. 따라서, 최종 치료제가 낮은 수준의 생성물 및 공정 관련 불순물 (예를 들어, 고분자량 응집물) 뿐만 아니라 공정 관련 오염물 (예를 들어, 숙주 세포 단백질 수준, DNA, 내독소, 침출 단백질 A 및 일부 세포 배양 배지 첨가제) 을 나타내는 것이 중요하다. 이 외에도, 공정에서 제품의 안전성을 확보하기 위해 바이러스를 제거하고 불활성화할 수 있어야 한다.
단백질 및 특히 mAb 정제는 전형적으로 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 수반하는 복합적이고 비용 집약적인 다단계 공정이다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피는 복합 세포 배양 배지로부터 출발하여 전형적으로 95% 초과의 mAb 순도를 초래하는 고도로 선택적인 mAb 정제 단계이다. mAb 함유 샘플 용액이 단백질 A 컬럼을 통과할 때, 배지 단백질, 숙주 세포 단백질, 핵산 및 내독소와 같은 불순물은 플로우-쓰루에서 제거되는 반면, mAb 생성물은 컬럼 내에 유지된다. mAb 생성물은 mAb 와 단백질 A 사이의 상호작용을 감소시키는 산성 용리 완충제를 사용하여 pH 를 낮춤으로써 단백질 A 수지로부터 용리된다. 용리 단계 후의 산성 조건은 또한 pH 민감성 바이러스 오염물질의 불활성화에 적합하다. (Yoo, S.M., Ghosh, R. 2012. Simultaneous removal of leached protein-A and aggregates from monoclonal antibody using hydrophobic interaction membrane chromatography. Journal of Membrane Science, 390: 263-269). 따라서, 용리 후, 단백질 A 크로마토그래피로부터의 mAb 생성물은 전형적으로 낮은 pH 에서 인큐베이션에 의해 바이러스 불활성화되는데, 이는 단백질 A 컬럼이 낮은 pH 완충제에서 용리되기 때문이다.
단백질 A 크로마토그래피 및 바이러스 불활성화의 제한은 산성 조건 하에서 단백질 A 수지로부터 단백질 또는 항체의 용리 및 바이러스 불활성화 단계를 수행할 필요성이다. 낮은 pH 처리는 다양한 생명공학 생성물에 대한 레트로바이러스를 성공적으로 불활성화시키는 것으로 나타났다 (Brorson, K., Krejci, S., Lee, K., Hamilton, E., Stein, K., Xu, Y. 2003. bracketed generic inactivation of rodent retroviruses by low pH treatment for monoclonal antibodies and recombinant proteins, Biotechnology and Bioengineering 82, 321-329). 그러나, 낮은 pH 조건에 대한 노출은 생성물 용리 동안 가용성 고분자량 응집체 및/또는 불용성 침전물의 형성을 초래할 수 있다. 고분자량 응집체 형성은 상당한 수준의 생성물 종 응집체의 경우 생성물 수율의 감소를 초래할 수 있다.
단백질 A 크로마토그래피 동안 낮은 pH 에서 단백질 안정화제로서 부형제, 예를 들어 아르기닌 및 우레아를 첨가함으로써 단백질 A 크로마토그래피 동안 단백질 응집을 해결하기 위한 전략이 설명되었다. 우레아의 첨가는 각각 0.5M 및 1M 의 농도에서 온-컬럼 및 인-용액 응집을 감소시키는데 효과적이었다 (Shukla, A.A., Hubbard, B., Tressel, T., Guhan, S., Low, D. 2007. Downstream processing of monoclonal antibodies-application of platform approaches. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 848(1):28-39). 용리제로서 아르기닌 용액을 사용하는 단백질 A 크로마토그래피는 단백질 A 로부터의 용리에 대한 단백질 응집을 방지하는 것으로 밝혀졌다 (Arakawa, T., Philo, J.S., Tsumoto, K., Yumioka, R., Ejima, D. 2004. Elution of antibodies from a protein-A column by aqueous arginine solutions, Protein Expr. Purif. 36, 244-248).
다운스트림 가공에서 낮은 pH 단계 동안 단백질 응집의 위험을 감소시키기 위해 개선된 방법을 규정할 필요가 바이오의약 산업에서 여전히 존재한다. 특히, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에서의 용리 완충제에 약학적으로 허용가능한 안정화 부형제를 첨가하는 것에 대한 접근법이 높은 관심거리인데, 이는 이러한 완충제 시스템이 또한 바이러스 불활성화의 다음의 중요한 가공 단계에서 중요한 역할을 하기 때문이다.
놀랍게도, mAb 와 같은 바이오의약 단백질의 정제 가공에서, 이당류, 폴리올 및 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 중성 부형제를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에서의 용리 완충제에 첨가하는 것이 표적 단백질의 응집 및 침전을 방지하여 용리 생성물 풀에서의 생성물 수율을 향상시킨다는 것이 밝혀졌다. 또한, 선택된 부형제는 바이러스 불활성화 단계에서 낮은 pH 처리 동안 mAb 를 효과적으로 안정화시키고, 낮은 pH 처리 동안 바이러스 불활성화를 방해하지 않는 것으로 밝혀졌다. 선택된 부형제가 표적 mAb 를 포함하는 제약 제제에서 허용가능하고 유용하기 때문에, 추가의 가공 단계에서 부형제를 제거할 필요가 없다.
특히, 본 발명은 친화성 크로마토그래피 단계, 바이러스 불활성화 단계 및 선택적으로 다른 정제 단계를 포함하는, 세포 배양 샘플로부터 표적 단백질을 정제하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 샘플은 표적 단백질, 바이러스 화합물 및 다른 생성물 및 공정 관련 불순물을 포함하고, 친화성 크로마토그래피 단계는:
a) 친화성 크로마토그래피 컬럼에 세포 배양 샘플을 로딩하여 표적 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합시키는 단계;
b) 친화성 크로마토그래피 컬럼을 pH 6 보다 낮고 부형제를 포함하는 용리 완충제와 접촉시킴으로써 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 표적 단백질을 용리시키는 단계 (여기서, 부형제는 이당류, 폴리올 및 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체로 이루어진 군으로부터 선택됨);
c) 단계 (b) 로부터 수득된 표적 단백질을 함유하는 하나 이상의 분획을 수집하는 단계;
d) 단계 (c) 에서 수득된 분획을 조합하여 용리 생성물 풀을 형성하는 단계
를 포함하고;
바이러스 불활성화 단계는:
e) 용리 생성물 풀을 2 내지 5 의 pH 에서 인큐베이션하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 친화성 크로마토그래피 단계는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계이다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에 따르면, 표적 단백질은 모노클로날 항체이다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에 따르면, 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체는 1,000 g/mol 내지 10,000 g/mol 의 평균 분자량을 갖는다.
본 발명의 유리한 양상에 따르면, 부형제는 수크로스, 트레할로스, 소르비톨, 만니톨 및 PEG4000 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 용리 완충제는 2 중량% 내지 15 중량%, 더욱 바람직하게는 5 중량% 내지 10 중량% 의 부형제 농도를 갖는다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 용리 완충제는 시트레이트 완충제이다.
바람직하게는, 용리 완충제는 pH 가 2,5 내지 5.5 이다.
본 발명의 추가의 유리한 양상에 따르면, 용리 단계 (b) 는 친화성 크로마토그래피 컬럼을 pH 5.5 내지 pH 2.75 의 용리 완충제 구배를 사용하는 용리 완충제와 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 유리한 양상에 따르면, 용리 생성물 풀의 pH 를 인큐베이션 단계 (e) 전에 pH 2 내지 pH 5 범위의 pH 로 조정한다.
본 발명의 또다른 유리한 구현예에 따르면, 인큐베이션 단계 (e) 는 pH 2.5 내지 pH 4.5 에서 수행된다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에 따르면, 인큐베이션 단계 (e) 는 실온에서 수행된다.
발명의 상세한 설명
생물의약 단백질의 다운스트림 가공을 최적화하는데 있어서, 높은 생성물 수율 및 높은 생성물 순도를 얻는 것에 초점을 맞춘다. 그러나, 많은 생물약학적으로 활성인 단백질 및 특히 모노클로날 항체는 친화성 크로마토그래피 단계 및 바이러스 불활성화 단계와 같은 낮은 pH 조건에서 수행되는 가공 단계 동안 이량체, 올리고머 또는 고차 응집체 및 침전물을 형성하는 경향이 있다. 필요한 순도를 갖는 치료 단백질 제품을 제공하기 위해, 이들 응집체 단백질 종은 정제 공정 동안 제거되어야 한다. 본 발명은 이제, 친화성 크로마토그래피 단계, 바이러스 불활성화 단계 및 임의로 다른 정제 단계를 포함하는, 세포 배양 샘플로부터 표적 단백질을 정제하는 방법을 제공하며, 세포 배양 샘플은 표적 단백질, 바이러스 화합물 및 기타 생성물 및 공정 관련 불순물을 포함하고, 친화성 크로마토그래피 단계는 pH 6 보다 작고 이당류, 폴리올 및 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 부형제를 포함하는 용리 완충제로 표적 단백질을 용리하는 것을 포함한다. 선택된 부형제 중 하나를 용리 완충제에 첨가하는 것은 낮은 pH 용액에서 표적 단백질을 안정화시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 표적 단백질의 낮은 단백질 응집 및 높은 수율에 반영된다. 놀랍게도, 선택된 부형제는 또한 낮은 pH 조건에서 수행되는 후속 바이러스 불활성화 단계를 방해하지 않는 것으로 밝혀졌다. 오히려, 선택된 부형제는 또한 낮은 pH 인큐베이션 기간 동안 표적 단백질을 안정화시키는 것으로 밝혀졌다. 선택된 부형제는 약학적으로 허용가능하며, 인간 및 동물에게 안전하게 투여될 수 있기 때문에, 정제 과정에서 이들을 제거할 필요가 없다. 이는 저비용 및 감소된 가공 시간을 향해 생물약학적 단백질의 다운스트림 가공을 최적화할 수 있게 한다.
용어 "친화성 크로마토그래피" 는 예를 들어, 항원과 항체, 효소와 기질, 수용체와 리간드, 또는 단백질과 핵산 간의 매우 특이적인 상호작용을 기반으로 생화학적 혼합물을 분리하는 크로마토그래피 공정을 의미한다. 이러한 크로마토그래피 수지의 예는 단백질 A 수지, 단백질 G 수지, 단백질 L 수지, 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 특정 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼이다.
용어 "단백질 A 친화성 크로마토그래피" 는 단백질 A 를 이용하여 물질 및/또는 입자를 분리 또는 정제하는 것을 의미하며, 단백질 A 는 일반적으로 고체 상에 고정화된다. 단백질 A 는 스타필로코쿠스 아우레우스에서 원래 발견된 40-60 kD 세포벽 단백질이다. 단백질 A 수지에 대한 항체의 결합은 매우 특이적이다. 본원에서 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 사용하기 위한 단백질 A 친화성 크로마토그래피 칼럼은 폴리비닐에테르 고체 상 상에 고정된 단백질 A, 예를 들어, Eshmuno® 칼럼 (Merck, Darmstadt, Germany), 공극 유리 매트릭스 상에 고정된 단백질 A, 예를 들어, ProSep® 칼럼 (Merck, Darmstadt, Germany), 아가로오스 고체 상 상에 고정된 단백질 A, 예를 들어, MABSELECTTM SuReTM 칼럼 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 세포 배양물 유래 표적 단백질의 정제 공정에 공통적으로 적용되는 추가 정제 단계를 포함할 수 있다. 비제한적인 예는 친화성 크로마토그래피 컬럼, 소수성 상호작용 컬럼 및 이온 교환 컬럼과 같은 컬럼 크로마토그래피 단계 뿐만 아니라 한외여과 및 정용여과와 같은 여과 단계이다.
용어 "세포 배양 샘플" 은 세포 배양 배지로부터 유래된 샘플, 즉 세포, 특히 포유류 숙주 세포의 배양, 성장 또는 유지 동안 사용되고, 관심 표적 단백질을 포함하는 용액을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 표적 단백질을 포함하는 세포 배양 샘플은 수확된 세포 배양 유체 샘플일 수 있거나, 선행 여과 및/또는 크로마토그래피 단계로부터의 용리액일 수 있다.
"단백질" 은 100 개 초과의 아미노산 잔기의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬 또는 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 거대분자이다. 폴리펩티드는 또한 비-펩티드성 성분, 예컨대 탄수화물 기를 포함할 수 있다. 탄수화물 기 및 다른 비-펩티드성 치환기는 그 폴리펩티드가 생산되는 세포에 의해 폴리펩티드에 부가될 수 있고, 세포 유형에 따라 다양할 수 있다. 폴리펩티드는 그들의 아미노산 골격 구조에 따라 본원에서 정의되며, 탄수화물 기 등의 치환기는 일반적으로 명시되지 않지만 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "항체" 는 임의의 형태의 항체 또는 이의 단편을 의미하며, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 단백질이다. 따라서, 이것은 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체를 포함함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포괄한다. "단리된 항체" 는 결합 화합물의 정제 상태를 지칭하고, 이러한 맥락에서 분자는 다른 생물학적 분자, 예컨대 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질, 예컨대 세포 파편 및 성장 배지가 실질적으로 없는 것을 의미한다. 일반적으로, 용어 "단리된" 은 이러한 물질, 또는 물, 완충제, 또는 염이 본원에 기재된 바와 같은 결합 화합물의 실험적 또는 치료적 사용을 실질적으로 방해하는 양으로 존재하지 않는 한, 이러한 물질의 완전한 부재, 또는 물, 완충제, 또는 염의 부재를 지칭하하도록 의도되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 또는 "mAb" 는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 언급하며, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원성 에피토프에 대항하여 유도된다. 대조적으로, 종래의 (폴리클로날) 항체 제제는 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 (또는 그에 대해 특이적인) 다수의 항체를 포함한다. 수식어 "모노클로날" 은 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 얻어진 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특별한 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 여겨져서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용되는 모노클로날 항체는 Kohler et al., (1975) Nature 256: 495 에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호 참조). "모노클로날 항체" 는 또한 예를 들어, Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628 및 Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 에 기재된 기술을 사용하는 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정한 종으로부터 유래된 항체 중의 또는 특정한 항체 부류 또는 서브클래스에 속하는 항체 중의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라성" 항체 (면역글로불린) 를 포함하는 한편, 사슬(들) 의 나머지는 이들이 요망된 생물학적 활성을 나타내는 한, 또다른 항체 부류 또는 서브클래스, 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편에 속하는 또는 또다른 종으로부터 유래되는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).
친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 단량체 형태의 표적 단백질 또는 항체를 회수하기 위해, 흡착에 이어서 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단량체 형태의 흡착된 단백질을 용리시킨다. 흡착된 단백질의 용리는 이전 흡착 단계와 비교하여 컬럼 내 이동상의 pH 조건을 변화시키는 용리 완충제를 적용함으로써 수행될 수 있다.
용어 "이동상" 은 크로마토그래피 컬럼으로부터 폴리펩티드를 회수하기에 적합한 물 및/또는 수성 완충제 및/또는 유기 용매의 임의의 혼합물을 의미한다. 본 문맥에서 용어 "용리" 또는 "용리하기" 는 각각 당업자에게 공지된 바와 같이 사용되며, 고체 또는 흡착제로부터 흡착된 성분(들) 의 용해, 선택적으로 변환을 의미하며, 이는 유체, 즉 성분(들) 이 흡착된 컬럼 물질로 함침된다.
본원에서 사용되는 용어 "완충제" 는 그것의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의해 pH 변화에 저항하는 완충된 용액을 말한다. "용리 완충제" 는 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리하는데 사용되는 완충제이다. 본 발명의 친화성 크로마토그래피 단계를 위한 용리 완충제는 전형적으로 pH 6 미만이다. 당업자는 pH 의 선택이 관심의 표적 단백질의 안정성 프로파일에 크게 의존한다는 것을 알고 있다. 바람직한 구현예에서, pH 는 2.5 내지 5.5 의 범위이다. 이러한 범위 내에서 pH 를 제어할 완충제의 예는 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트 또는 암모늄 완충제, 또는 이들의 조합을 포함한다. 바람직한 이러한 완충제는 시트레이트이다.
본 발명에 있어서, 용리 완충제는 이당류, 폴리올 및 폴리(에틸렌 글리콜)로 이루어진 군에서 선택되는 부형제를 포함한다.
본 발명의 구현예에서, 부형제는 약학적으로 허용가능한 화합물이다. 용어 "약학적으로 허용가능한 화합물" 은 특허에 사용되는 용량 및 농도에서 무독성이며, 약학 제형의 다른 성분과 상용성이 있는 화합물을 말한다.
하나의 구현예에 있어서, 부형제는 이당류이다. 추가 구현예에서, 이당류는 수크로스, 또는 트레할로스이다.
또다른 구현예에 있어서, 부형제는 폴리올이다. 바람직한 구현예에서, 폴리올은 적어도 4 개의 히드록실 기를 갖는 당 알코올을 의미한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 폴리올은 4 개의 자유 히드록실 기를 갖는 테트롤, 또는 5 개의 자유 히드록실 기를 갖는 펜타올, 또는 6 개의 자유 히드록실 기를 갖는 헥사올로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 폴리올은 소르비톨 또는 만니톨이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 부형제는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체이다. 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체가 실질적으로 분자량에 따라 다양하지만, 약 400 g/mol 내지 약 30,000 g/mol 범위의 분자량을 갖는 중합체가 통상적으로 적합하다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 1,000 g/mol 내지 10,000 g/mol, 더욱 바람직하게는 3,000 g/mol 내지 5,000 g/mol 범위의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이 적합하게 선택된다. 본 발명의 실시예에서는 평균 분자량 4,000 g/mol 의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG4000) 을 선택하였다.
바람직한 구현예에서, 용리 완충제는 2 중량% 내지 15 중량%, 더욱 바람직하게는 5 중량% 내지 10 중량% 의 부형제 농도를 갖는다. 임의의 부형제는 의도된 안정화 효과를 달성하는데 필요한 농도보다 높은 농도로 사용될 수 있다. 당업자는 효과가 존재하고 본원에 보고된 방법에서 용인될 수 있다는 점에서 부형제 농도 범위를 결정할 수 있다.
하나의 구현예에서, 하나 이상의 부형제는 표적 단백질, 특히 항체를 용리시키기 위해 크로마토그래피 물질에 적용된 용리 완충제에 존재할 수 있다. 하나의 구현예에서, 용리 완충제는 5 개 이하의 상이한 부형제를 포함한다. 용액 중에 하나 초과의 부형제가 존재하는 경우, 용액 중에 존재하는 모든 부형제의 농도의 합은 바람직하게는 상기 정의된 범위 내에 있다. 임의의 단일 부형제 또는 부형제의 임의의 조합에 대해, 당업자는 용리 완충제 내의 적합한 농도를 결정할 때 개별 용해도를 고려할 것이다.
본 발명의 방법에 따른 바람직한 구현예에서, 결합 및 용리 크로마토그래피 단계는 바이러스 불활성화가 뒤따른다.
바람직하게는, 결합 및 용리 크로마토그래피 (친화성 크로마토그래피 단계) 로부터의 산출물 또는 용리액을 바이러스 불활성화에 적용한다. 바이러스 불활성화는 바이러스를 불활성화시키거나 감염시킬 수 없게 하며, 이는 특히 표적 분자가 치료적 용도로 의도되는 경우에 중요하다.
많은 바이러스는 화학적 변경으로 불활성화될 수 있는 지질 또는 단백질 코트를 포함한다. 단순히 바이러스를 불활성으로 만드는 것이 아니라, 일부 바이러스 불활성화 공정은 바이러스를 완전히 변성시킬 수 있다. 바이러스 불활성화를 위한 방법은 당업자들에게 널리 공지되어 있다. 더욱 널리 사용되는 바이러스 불활성화 공정 중 일부는, 예를 들어, 용매/세제 불활성화 (예를 들어, Triton X 100 을 사용함); 저온살균 (가열); 산성 pH 불활성화; 및 자외선 (UV) 불활성화 중 하나 이상의 사용을 포함한다. 이들 공정 중 2 개 이상을 조합하는 것이 가능하다; 예를 들어, 상승된 온도에서 산성 pH 불활성화를 수행한다.
완전하고 효과적인 바이러스 불활성화를 보장하기 위해, 바이러스 불활성화는 종종 샘플과 바이러스 불활성화제의 적절한 혼합을 보장하기 위해 일정한 교반으로 연장된 기간에 걸쳐 수행된다. 예를 들어, 오늘날 산업계에서 사용되는 많은 공정에서, 포획 단계로부터의 산출물 또는 용리액은 풀 탱크에서 수집되고, 연장된 기간 (예를 들어, 1 초과 내지 2 시간, 종종 이후 밤새 저장) 에 걸쳐 바이러스 불활성화를 겪는다.
본원에 기술된 다양한 구현예에서, 바이러스 불활성화에 필요한 시간은 인-라인으로 바이러스 불활성화를 수행함으로써 또는 이 단계를 위해 풀 탱크 대신에 서지 탱크를 사용함으로써 상당히 감소될 수 있다.
본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있는 바이러스 불활성화 기술의 예는, 예를 들어 본원에 참고로 인용되는 US2017320909 (A1) 에서 발견될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 바이러스 불활성화는 산성 pH 를 사용하며, 여기서 결합 및 용리 크로마토그래피 단계로부터의 산출물은 서지 탱크 또는 인-라인을 사용하여 바이러스 불활성화를 위해 산성 pH 에 노출된다. 바이러스 불활성화에 사용되는 pH 는 전형적으로 5.0 미만, 또는 바람직하게는 3.0 내지 4.0 이다. 일부 구현예에서, pH 는 약 3.6 또는 이하이다. 인-라인 방법을 사용하는 바이러스 불활성화에 사용되는 시간의 지속기간은 10 분 이하, 5 분 이하, 3 분 이하, 2 분 이하, 또는 약 1 분 이하일 수 있다. 서지 탱크의 경우, 불활성화에 필요한 시간은 전형적으로 1 시간 미만, 또는 바람직하게는 30 분 미만이다.
본원에 기재된 본 발명의 일부 구현예에서, 적합한 바이러스 불활성화제는 크로마토그래피 공정 단계와 공정의 다음 유닛 작업 (예를 들어, 플로우 쓰루 정제) 사이에 인-라인으로 도입된다. 바람직하게는, 튜브 또는 연결 라인은, 산출물이 다음 유닛 작업으로 진행되기 전에, 크로마토그래피 공정 단계로부터의 산출물을 바이러스 불활성화제와 적절하게 혼합하는 것을 보장하는 정적 혼합기를 함유한다. 전형적으로, 결합 및 용리 크로마토그래피로부터의 산출물은 특정 유량으로 튜브를 통해 유동하며, 이는 바이러스 불활성화제와의 최소 접촉 시간을 보장한다. 접촉 시간은 특정 길이 및/또는 직경의 튜브를 사용하여 조정될 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 또는 적합한 완충제를 일정 지속시간 동안 산에 노출시킨 후 튜브 또는 연결 라인에 추가로 도입함으로써, 샘플의 pH 를 다음 단계를 위한 적합한 pH 로 만들고, 여기서 pH 는 표적 분자에 유해하지 않다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 낮은 pH 에 대한 노출뿐만 아니라 염기성 완충제에 대한 노출은 정적 혼합기를 통한 혼합과 함께 인-라인으로 달성된다.
일부 구현예에서, 인라인 정적 혼합기 대신에, 또는 인라인 정적 혼합기에 추가하여, 서지 탱크가 바이러스 불활성화제와 함께 결합 및 용리 크로마토그래피 단계로부터의 산출물을 처리하기 위해 사용되며, 여기서 서지 탱크의 부피는 결합 및 용리 크로마토그래피 단계로부터의 산출물의 총 부피의 25% 이하 또는 결합 및 용리 크로마토그래피 단계로부터의 산출물의 부피의 15% 이하 또는 10% 이하이다. 서지 탱크의 부피가 전형적인 풀 탱크의 부피보다 상당히 작을 때, 바이러스 불활성화제와 샘플의 보다 효율적인 혼합이 달성될 수 있기 때문이다.
일부 구현예에서, 바이러스 불활성화는 친화성 크로마토그래피 단계로부터의 산출물에 산을 첨가하는 것보다는 결합 및 용리 크로마토그래피 단계에서 용리 완충제의 pH 를 변화시킴으로써 달성될 수 있다.
전형적으로, 바이러스 불활성화 후에, 샘플은 플로우-쓰루 정제 공정을 거친다.
일부 구현예에서, 여과 단계는 바이러스 불활성화 후 및 플로우 쓰루 정제 전에 포함될 수 있다. 이러한 단계는, 특히 바이러스 불활성화 후 (즉, 산 및 염기 둘 다의 첨가 후) 샘플의 탁도가 관찰되는 경우에 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, 여과 단계는 미세다공성 필터 또는 심층 필터를 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 정제될 단백질은 안정화될 수 있고, 적합한 부형제의 첨가에 의해 탁도 및 원치 않는 응집이 방지될 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 바이러스 불활성화 단계 및 친화성 크로마토그래피 단계 모두는 이당류, 폴리올 및 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 부형제의 존재 하에 수행된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 첨가된 부형제는 수크로스, 트레할로스, 소르비톨, 만니톨 및 PEG4000 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이러한 방식으로, 바이러스 불활성화를 유지하면서, 원하는 단백질을 정제된 및 안정화된 형태로 수득할 수 있다.
본 발명에서, 친화성 크로마토그래피 단계로부터 수득된 용리 생성물 풀은 pH 바이러스 불활성화에 노출된다. 산성 pH 에 대한 노출은 pH 민감성 바이러스 오염물질을 감소시키거나 완전히 제거한다. pH 바이러스 불활성화 단계는 일정 기간 동안 2 내지 5, 바람직하게는 2.5 내지 4.5, 특히 바람직하게는 2.8 내지 3.6 의 pH 에서 용리 생성물 풀을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 전형적으로, pH 바이러스 불활성화 단계는 pH 를 중화시키고, 필요한 경우, 여과에 의해 미립자를 제거함으로써 종료된다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 용리 생성물 풀의 pH 는 바이러스 불활성화 단계에 대해 원하는 pH 로 조정될 수 있다. 하나의 구현예에서, 용리 생성물 풀의 pH 는 시트르산, 아세트산, 카프릴산, 또는 다른 적합한 산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 산을 첨가함으로써 저하되어야 한다. pH 수준의 선택은 표적 단백질 성분의 안정성 프로파일에 따라 달라진다. 본 발명에 따르면, 용리 생성물 풀에 존재하는 적용된 부형제는 낮은 pH 바이러스 불활성화 동안 표적 단백질의 안정성을 향상시킬 수 있다.
낮은 pH 바이러스 불활성화 동안의 표적 단백질의 안정성은 또한 낮은 pH 인큐베이션의 지속시간에 의해 영향을 받는다. 하나의 구현예에서, 낮은 pH 인큐베이션의 지속시간은 30 분 내지 120 분, 바람직하게는 30 분 내지 60 분이다.
또다른 구현예에서, 바이러스 불활성화는 실온에서 수행된다.
도 1 은 낮은 pH 처리 동안 mAbA 에 대한 특정 부형제의 안정화 효과를 나타낸다. 삼각형 마커를 갖는 상부 곡선은 키네틱 SEC 에 의해 측정된 pH 2.8 에서의 인큐베이션 시간에 걸쳐 안정하거나 증가하는 mAbA 단량체 함량에 의해 지시되는 낮은 pH 처리 동안 mAbA 에 대한 예시적인 중성 부형제 (0.5 M 소르비톨) 의 안정화 효과를 나타낸다. 음성 대조군과 비교하여, 원형 마커를 갖는 하부 곡선은 낮은 pH 조건에서 예시적인 이온성 부형제 (0.5 M 아르기닌 HCl) 의 불안정화 효과를 나타내며, 이는 pH 2.8 에서 인큐베이션 시간에 걸쳐 mAbA 단량체 함량의 유의한 감소에 의해 나타난다 (실시예 1).
도 2 는 nanoDSF 에 의해 측정된 낮은 pH 처리 동안 특정 부형제 (소르비톨 및 아르기닌 HCl) 의 효과를 나타내는 막대 다이어그램이다 (실시예 1.5). "첨가제 없음 대조군" (예를 들어, 0.5 M 소르비톨에 대해) 보다 높은 Tm-값은 안정화 특성을 나타낸다. 아르기닌 HCl 의 첨가에 대해 불안정화 효과가 관찰되었다.
도 3 은 낮은 pH 처리 동안 mAbA 안정성에 대한 선택된 부형제 (소르비톨, 만니톨, 수크로스, 트레할로스, PEG4000 및 아르기닌 HCl) 의 요약된 효과를 나타내는 막대 다이어그램이다. 키네틱 SE-HPLC 및 nanoDSF 의 결과를 기초로, 선택된 중성 부형제 (소르비톨, 만니톨, 수크로스, 트레할로스 및 PEG4000) 는 양의 델타 값으로 표시된 바와 같이 스트레스 조건 동안 안정화 효과를 나타내었다. 그러나, PEG4000 은 NaCl 의 첨가 없이 시트레이트 완충제 시스템 중의 mAbA 만을 안정화시킬 수 있었다 (실시예 1).
도 4 는 낮은 pH 처리 동안 mAbB 안정성에 대한 선택된 부형제 (소르비톨, 만니톨, 수크로스, 트레할로스, PEG4000 및 아르기닌 HCl) 의 요약된 효과를 나타내는 막대 다이어그램이다. 키네틱 SE-HPLC 및 nanoDSF 의 결과를 기초로, 선택된 중성 부형제 (소르비톨, 만니톨, 수크로스, 트레할로스 및 PEG4000) 는 단량체 및 Tm-값의 증가에서의 감소로 표시된 바와 같이 스트레스 조건 동안 안정화 효과를 나타내었다. 그러나, PEG4000 은 NaCl 의 첨가 없이 시트레이트 완충제 시스템 중의 mAbB 만을 안정화시킬 수 있었다 (실시예 1).
도 5 는 60 분 동안 pH 2.8 에서 낮은 pH 바이러스 불활성화 동안 선택된 중성 부형제 (수크로스, 만니톨, 트레할로스, 및 PEG4000 및 소르비톨) 에 의해 유발된 mAbA 의 개선된 안정성을 보여주는 막대 다이어그램이다 (실시예 4).
도 6 은 60 분 동안 pH 2.8 에서 낮은 pH 바이러스 불활성화 동안 선택된 중성 부형제 (수크로스, 만니톨, 트레할로스, 및 PEG4000 및 소르비톨) 에 의해 유발된 mAbB 의 개선된 안정성을 보여주는 막대 다이어그램이다 (실시예 4).
도 7 은 MLV 바이러스를 사용하여 pH 3.6 에서 낮은 pH 처리를 위한 공정 단계를 나타내는 흐름도이다 (실시예 5).
도 8 은 낮은 pH 처리 동안 인큐베이션 시간에 대한 선택된 중성 부형제 (소르비톨, 만니톨, 수크로스, 트레할로스 및 PEG4000) 의 존재 하에 MLV 에 대한 바이러스 감소 인자를 나타내는 다이어그램이다 (실시예 6).
도 9 는 60 분의 낮은 pH 처리 후 선택된 중성 부형제 (소르비톨, 만니톨, 수크로스, 트레할로스 및 PEG4000) 의 존재 하에 MLV 에 대한 바이러스 감소 인자를 나타내는 막대 다이어그램이다 (실시예 6).
실시예:
실시예 1: 낮은 pH 유도 응집 시험 (시험관 내) 에 대한 선택된 부형제의 안정화 효과
모노클로날 항체의 다운스트림 가공 동안 단백질 A 크로마토그래피 및 바이러스 불활성화 단계를 시뮬레이션하는 낮은 pH 스트레스 조건 동안 mAb 에 대한 중성 부형제의 사용의 효과를 시험관 내에서 평가하였다. 시험관 내 스크리닝 테스트는 NaCl 의 첨가와 함께 또는 첨가 없이 낮은 pH 값에서 두 모델 단백질 (mAbA 및 mAbB) 의 인큐베이션 실험으로 수행되었다. 샘플의 형태 안정성, 단편화 및 응집 거동에 대한 이들 실험의 효과를 키네틱-SEC 및 nanoDSF 를 사용하여 분석하고, 부형제가 없는 대조군 조건에 대해 비교하였다.
또한, 이온성 부형제 (아르기닌 HCl) 를 음성 대조군으로 사용하여 낮은 pH 조건에서 인큐베이션하기 위한 부적합한 부형제의 불안정화 효과를 나타내었다.
실시예 1.1: 0.25 M 시트레이트 완충제 pH 3.0 의 제조
용액 A: 0.25 M 시트르산 일수화물 (C 6 H 8 O 7 ·H 2 O FW = 210.14)
52.5 g 의 시트르산 일수화물 (M = 210.14 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 500 ml milli-Q-물을 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다.
용액 B: 0.25 M 트리소듐 시트레이트, 이수화물 (C 6 H 5 O 7 Na 3 ·2H 2 O FW = 294.12)
18.4 g 의 트리소듐 시트레이트, 이수화물 (M = 294.12 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 500 ml milli-Q-물을 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다.
대략 415 ml 의 용액 A 및 대략 85 ml 의 용액 B 를 혼합하여 대략 500 ml 0.25 M 시트레이트 완충제 pH 3.0 을 수득하였다. pH 는 필요한 경우 1M HCl 용액 또는 1M NaOH 를 사용하여 3.0 ± 0.05 로 조정하였다.
완충제를 0.45 ㎛ HAWP 혼합 셀룰로오스 에스테르 필터 (Merck, Darmstadt, Germany) 를 사용하여 여과하고, 사용 전에 초음파 배쓰에서 20 분 동안 탈기시켰다.
실시예 1.2: 단백질 샘플 제조
시험된 단백질은 mAbA 및 mAbB 이다.
mAbA 는 pI 이 대략 7.01-8.58 인 모노클로날 항체 (대략 152 kDa) 이다. 이것은 포스트 TFF 정제된 mAb 였고, 10 mM 시트레이트 완충제 pH 5.5, 0.1 M NaCl, 0.1 M 글리신으로 제제화하였다. 용액의 농도는 16 mg/mL 이다.
mAbB 는 pI 이 대략 7.6-8.3 인 모노클로날 항체 (대략 145 kDa) 이다. 이것은 포스트 TFF 정제된 mAb 였고, 50 mM 소듐 아세테이트 pH 5.0 으로 제제화하였다. 용액의 농도는 80 mg/mL 이다.
표 1: 시험관 내 부형제 스크리닝을 위한 샘플 제제
Figure pct00001
실시예 1.3: 스트레스 조건
스트레스 조건은 선택된 완충제 조건 (0.1 M 시트레이트 완충제 pH 2,8) 로 mAb-샘플을 1:20 (최종 농도, mAbA 에 대해 0,8 mg/ml 및 mAbB 에 대해 4 mg/ml) 로 희석함으로써 개시하였다. 제 1 샘플을 선택된 완충제로 희석한 후 SE-HPLC 에서 직접 측정하였다. 응집 키네틱은 2 시간 동안 30 분마다 측정을 반복함으로써 모니터링하였다. 모든 샘플을 또한 녹는점 (Tm) 분석을 위해 nano Differential Scanning Fluorimetry (nanoDSF) 로 측정하였다. 이들 스톡 용액을 사용하여 상이한 부형제 제제를 제조하였다 (완충제 조건의 피펫팅 방식은 표 1 을 참조).
실시예 1.4: 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 조건
컬럼: TSKgel SuperSW3000
시스템: Agilent 1290 UHPLC
흐름: 0.35 ml/min
용리액: 0.025M NaH2PO4·H2O/ 0.025M Na2HPO4/ 0.4M NaClO4·H2O/ pH 6.3
샘플: 낮은 pH 스크리닝 조건에서 mAbA 및 mAbB
부형제 소르비톨 및 아르기닌 HCl 의 단백질 안정화 효과에 관한 결과를 도 1 에 나타내었다. 0.5 M 소르비톨을 첨가하면 단백질 안정화 효과가 관찰되었고; 0.5 M 아르기닌 HCl 을 첨가하면 불안정화 효과가 관찰되었다.
실시예 1.5: NanoDSF 조건
NanoDSF 는 고유 트립토판 또는 티로신 형광을 이용하여 단백질 안정성을 결정하기 위한 변형된 시차 주사 형광측정법이다. 단백질 안정성은 열 언폴딩 실험에 의해 해결될 수 있다. 단백질의 열 안정성은 전형적으로 단백질 집단의 50% 가 펼쳐지는, 접힌 상태에서 펼친 상태로의 전환의 중간점에 해당하는, "용융 온도" 또는 "Tm" 에 의해 기술된다.
분석은 Prometheus NT 48 (NanoTemper Technologies GmbH, Munich, Germany) 로 수행하였다. 샘플 부피는 10 ㎕ 이고, 가열 속도는 1 ℃/분이었던 반면에, 온도 상승은 20℃ 에서 시작되어 95℃ 까지 지속된다.
부형제 소르비톨 및 아르기닌 HCl 의 단백질 안정화 효과에 관한 결과를 도 2 에 나타내었다. 0.5 M 소르비톨을 첨가하면 단백질 안정화 효과가 관찰되었고; 0.5 M 아르기닌 HCl 을 첨가하면 불안정화 효과가 관찰되었다.
도 4 및 도 5 에 나타낸 바와 같이 선택된 부형제 (소르비톨, 만니톨, 수크로스, 트레할로스, PEG4000 및 아르기닌 HCl) 를 사용한 스크리닝 결과에 기초하여, 폴리올 (예를 들어 만니톨, 소르비톨) 및 이당류 (예를 들어 수크로스, 트레할로스) 뿐만 아니라 PEG4000 과 같은 중성 부형제가 낮은 pH 처리 동안 용액 중 mAb 를 효과적으로 안정화시킨다는 것을 발견하였다.
실시예 2: 단백질 A 크로마토그래피용 완충제 및 부형제 용액의 제조
모든 완충제 및 부형제를 0.45 ㎛ HAWP 혼합 셀룰로오스 에스테르 필터 (Merck, Darmstadt, Germany) 를 사용하여 여과하고, 사용 전에 초음파 배쓰에서 20 분 동안 탈기시켰다. 모든 단백질 A 크로마토그래피 실행에 대해, 하기 완충제를 제조하고 사용하였다:
표 2: 단백질 A 크로마토그래피 용 완충제 A1 (pH 5.50)
Figure pct00002
표 3: 단백질 A 크로마토그래피 용 완충제 A2 (pH 7.00)
Figure pct00003
표 4: 단백질 A 크로마토그래피 용 완충제 B (pH 2.75)
Figure pct00004
다음의 부형제는 응집으로부터 항체를 보호하는 능력에 기초하여 선택되었다:
표 5: 적용된 농도, 제조업체 및 품질 표준을 가진 적용된 부형제
Figure pct00005
실시예 2.1: 시트레이트 완충제 pH 5.5 중 0.5 M 수크로스의 제조
171.1 g 수크로스 (M = 342.29 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M HCl 용액을 사용하여 5.5 +/- 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다.
실시예 2.2: 시트레이트 완충제 pH 2.75 중 0.5 M 수크로스의 제조
171.1 g 수크로스 (M = 342.29 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M HCl 용액을 사용하여 2.75 +/- 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다.
실시예 2.3: 시트레이트 완충제 pH 5.5 중 0.5 M 트레할로스의 제조
171.1 g 트레할로스 (M = 342.29 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M HCl 용액을 사용하여 5.5 +/- 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다.
실시예 2.4: 시트레이트 완충제 pH 2.75 중 0.5 M 트레할로스의 제조
171.1 g 트레할로스 (M = 342.29 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M HCl 용액을 사용하여 2.75 +/- 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다.
실시예 2.5: 시트레이트 완충제 pH 5.5 중 0.5 M 만니톨의 제조
91.09 g 만니톨 (M = 182,17 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M HCl 용액을 사용하여 5.5 +/- 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다.
실시예 2.6: 시트레이트 완충제 pH 2.75 중 0.5 M 만니톨의 제조
91.09 g 만니톨 (M = 182,17 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M HCl 용액을 사용하여 2.75 +/- 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다.
실시예 2.7: 시트레이트 완충제 pH 5.5 중 0.5 M 소르비톨의 제조
91.09 g 소르비톨 (M = 182,17 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M HCl 용액을 사용하여 5.5 +/- 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다.
실시예 2.8: 시트레이트 완충제 pH 2.75 중 0.5 M 소르비톨의 제조
91.09 g 소르비톨 (M = 182,17 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M HCl 용액을 사용하여 2.75 +/- 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다.
실시예 2.9: 시트레이트 완충제 pH 5.5 중 5% (w/v) PEG4000 의 제조
50 g PEG4000 (M = 3500 - 4500 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M HCl 용액을 사용하여 5.5 +/- 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다.
실시예 2.10: 시트레이트 완충제 pH 2.75 중 5% (w/v) PEG4000 의 제조
50 g PEG4000 (M = 3500 - 4500 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M HCl 용액을 사용하여 2.75 +/- 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다.
실시예 3: 단백질 A 크로마토그래피
실시예 3.1: 단백질 A 크로마토그래피 수지
Eshmuno® 기재는 폴리비닐에테르를 기반으로 하는 경질 및 친수성 중합체이다. E. 콜라이에서 재조합적으로 생산되는 펜타머 형태의 스타필로코쿠스 아우레우스 단백질 A 의 C 도메인이 그 위에 고정화된다. Eshmuno® A 는 Merck (Darmstadt, Germany) 의 것이고, 컬럼은 Repligen GmbH (Ravensburg, Germany) 로 패킹되었다.
표 6: 적용된 Eshmuno® A 수지의 컬럼 파라미터
Figure pct00006
ProSep® Ultra Plus 수지는 제어된 공극 유리 매트릭스 및 이에 결합된 리간드로서 재조합 고유의 단백질 A 를 갖는다. ProSep® Ultra Plus 는 Merck (Darmstadt, Germany) 의 것이고, 컬럼은 Repligen GmbH (Ravensburg, Germany) 로 패킹되었다.
표 7: 적용된 ProSep® Ultra Plus 수지의 컬럼 파라미터
Figure pct00007
MabSelectTM SuReTM 수지는 아가로스 매트릭스를 갖는다. 티오-에테르를 통해 그 위에 고정화된 것은 C-말단 시스테인을 갖는 조작된 단백질 A 도메인의 재조합적으로 생산된 (E. 콜라이) 테트라머이다. 이 수지는 GE Healthcare (Uppsala, Sweden) 에 의해 제조되었고 컬럼은 Repligen GmbH (Ravensburg, Germany) 로 패킹되었다.
표 8: 적용된 MabSelectTM SuReTM 수지에 대한 컬럼 파라미터
Figure pct00008
실시예 3.2: 단백질 샘플 제조
첫 번째 모델 단백질은 pI ~ 7.01-8.58 의 모노클로날 항체 mAbA (대략 152 kDa) 이다. 이를 정화된 세포 배양 수확물로서 사용하였고, 이를 0.8/0.2 ㎛ Supor® 멤브레인 (Pall Corporation, NY, USA) 을 갖는 VacuCap® 90 PF 필터 유닛을 사용하여 여과하였다. 상기 용액의 농도는 0.943 mg/mL 이고, pH 는 7.0 이며, 전도도는 12 mS/cm 이다.
두 번째 모델 단백질은 pI ~ 7.6-8.3 의, Merck (Darmstadt, Germany) 에서 제조된 모노클로날 항체 mAbB (대략 145 kDa) 이다. 이를 정화된 세포 배양 수확물로서 사용하였고, 이를 0.8/0.2 ㎛ Supor® 멤브레인 (Pall Corporation, NY, USA) 을 갖는 VacuCap® 90 PF 필터 유닛을 사용하여 여과하였다. 상기 용액의 농도는 1.45 mg/mL 이고, pH 는 7.0 이며, 전도도는 12.87 mS/cm 이다.
실시예 3.3: 단백질 A 크로마토그래피 방법
단백질 A 크로마토그래피는 다음 방법 파라미터를 사용하여 수행하였다:
표 9: 단백질 A 크로마토그래피를 위한 방법 파라미터
Figure pct00009
pH 5.5 내지 pH 2.75 의 30CV 의 선형 구배를 적용함으로써 정의된 구배 기울기에서 용리를 수행하였다.
실시예 4: 크기 배제 크로마토그래피
용리 후, 실온에서 1 시간 동안 낮은 pH 에서 용액을 유지함으로써 단백질 A 크로마토그래피로부터의 mAb 함유 용리 생성물 풀을 바이러스 불활성화시킨 후, 4.0 내지 8.0 범위의 원하는 pH 로 중화시켰다. 1 M HCl 로 적정하여 용리 생성물 풀의 pH 를 pH 2.8 ± 0.05 로 조정함으로써 바이러스 불활성화 공정 단계를 모방하는 낮은 pH 처리를 개시하였다. 안정화 부형제를 첨가하거나 첨가하지 않은 상이한 모델 단백질에 대한 낮은 pH 인큐베이션의 효과를 후속적으로 고성능-크기 배제 크로마토그래피 (HP-SEC) 에 의해 분석하였다.
HP-SEC 분석 조건:
Figure pct00010
도 5 및 도 6 은 HP-SEC 분석 결과를 나타낸다. 선택된 중성 부형제 (소르비톨, 만니톨, 수크로스, 트레할로스 및 PEG4000) 를 함유하는 샘플 중 단량체 mAb 의 높은 함량은 이들 부형제가 단백질 A 크로마토그래피 및 후속적인 낮은 pH 바이러스 불활성화 단계 동안 단백질 안정성에 대해 전체적인 긍정적인 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 5: 바이러스 불활성화 실험을 위한 완충제 및 부형제 용액의 제조
실시예 5.1: 1 M 시트르산 용액의 제조
21.01 g 의 시트르산 일수화물 (M = 210.14 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 100 ml milli-Q-물을 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. 이 용액은 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 여과되었다.
실시예 5.2: 0.1 M 시트레이트 완충제, pH 3.5 의 제조
용액 A: 0.1 M 시트르산 일수화물 (C 6 H 8 O 7 ·H 2 O FW = 210.14)
21.01 g 의 시트르산 일수화물 (M = 210.14 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 1000 ml milli-Q-물을 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다.
용액 B: 0.1 M 트리소듐 시트레이트, 이수화물 (C 6 H 5 O 7 Na 3 ·2H 2 O FW = 294.12)
29.41 g 의 트리소듐 시트레이트, 이수화물 (M = 294.12 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 1000 ml milli-Q-물을 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다.
대략 700 ml 의 용액 A 및 대략 300 ml 의 용액 B 를 혼합하여 대략 1000 ml 0.1 M 시트레이트 완충제 pH 3.5 을 수득하였다. 용액의 pH 는 필요한 경우 1M 시트르산 용액 또는 1M NaOH 를 사용하여 3.5 ± 0.05 로 조정하였다.
실시예 5.3: 0.1M 시트레이트 완충제 pH 3.5 중 0.5 M 소르비톨의 제조
9.1 g 소르비톨 (M = 182,17 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 80 ml 0.1M 시트레이트 완충제 pH 3.5 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M 시트르산 용액 또는 1M NaOH 를 사용하여 3.5 ± 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 100.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M 시트레이트 완충제 pH 3.5 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다. 이 용액은 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 여과되었다.
실시예 5.4: 0.1M 시트레이트 완충제 pH 3.5 중 0.5 M 만니톨의 제조
9.1 g 만니톨 (M = 182,17 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 80 ml 0.1M 시트레이트 완충제 pH 3.5 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M 시트르산 용액 또는 1M NaOH 를 사용하여 3.5 ± 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 100.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M 시트레이트 완충제 pH 3.5 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다. 이 용액은 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 여과되었다.
실시예 5.5: 0.1M 시트레이트 완충제 pH 3.5 중 0.5 M 수크로스의 제조
17.1 g 수크로스 (M = 342.29 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 80 ml 0.1M 시트레이트 완충제 pH 3.5 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M 시트르산 용액 또는 1M NaOH 를 사용하여 3.5 ± 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 100.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M 시트레이트 완충제 pH 3.5 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다. 이 용액은 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 여과되었다.
실시예 5.6: 0.1M 시트레이트 완충제 pH 3.5 중 0.5 M 트레할로스의 제조
17.1 g 트레할로스 (M = 342.29 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 80 ml 0.1M 시트레이트 완충제 pH 3.5 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M 시트르산 용액 또는 1M NaOH 를 사용하여 3.5 ± 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 100.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M 시트레이트 완충제 pH 3.5 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다. 이 용액은 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 여과되었다.
실시예 5.7: 0.1M 시트레이트 완충제 pH 3.5 중 0.5 M PEG4000 의 제조
5 g PEG4000 (M = 3500-4500 g/mol) 을 적절한 플라스크에 칭량하였다. 대략 80 ml 0.1M 시트레이트 완충제 pH 3.5 를 첨가하고, 성분이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반하였다. pH 는 1M 시트르산 용액 또는 1M NaOH 를 사용하여 3.5 ± 0.05 로 조정하였다. 그 후, 용액을 100.0 ml 부피 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1 M 시트레이트 완충제 pH 3.5 로 표시선까지 충전하고, 완전히 혼합하였다. 이 용액은 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 여과되었다.
실시예 6: 낮은 pH 불활성화 유지 동안 바이러스 감소에 대한 부형제의 효과
바이러스 감소 실험을 위한 모델 바이러스로 제노트로픽 (xenotropic) 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 를 사용하였다. MLV 는 결함이 없는 감마 레트로바이러스를 나타낸다. MLV 의 포함은 CHO 세포주 및 모노클로날 항체 생성물로부터 유래된 생물학적 생성물에 필수적이다.
표 10: 적용된 모델 바이러스
Figure pct00011
적용된 모델 단백질은 실시예 1.2 에 기재된 바와 같이 mAbB 였다.
표 11: 적용된 모델 단백질
Figure pct00012
모든 어세이는 TCID50 감염성 방법을 사용하여 수행하였다.
출발 재료 제조
스파이킹에 앞서, 재료를 37℃ ± 1℃ 의 수조에서 부드럽게 뒤집으면서 해동하였고, 얼음이 완전히 용융되는 즉시 용기를 수조로부터 제거하였다.
낮은 pH 로드 샘플의 경우, 샘플을 130 mg/ml 로 수용하고, 완충제 단독 (실시예 5.2 에 따른 0.1 M 시트레이트 완충제 pH 3.5) 또는 시트레이트 완충제 중 부형제 (실시예 4.3 내지 4.7 에 따른) 를 사용하여 10 mg/ml 의 최종 농도로 희석하였다.
원하는 단백질 농도로 조절하기 위해, 1/13 희석으로 제조하는 것, 예를 들어 시트레이트 완충제 중의 12 부 완충제 또는 부형제에 1 부 낮은 pH 로드를 첨가하는 것이 필요하였다.
샘플을 조작 및 낮은 pH 유지 전반에 걸쳐 혼합하였다. 샘플 온도가 20℃ ± 0,5℃ 에 도달하면, 1M 시트르산 및/또는 1M 트리스를 사용하여 pH 를 pH 3.6 으로 조정하였다.
스파이킹을 위해, 50 ml 의 pH 조정된 샘플을 스파이킹하였다. 1M Tris 를 사용하여 나머지를 pH 6.0 내지 pH 8.0 으로 조정하고, 5 ml 샘플을 스파이킹을 위해 분배하였다. 이 샘플은 시간 제로 중화된 대조군이었고, 5% (v/v) MLV 로 스파이킹되었다.
바이러스 스파이크 (5% v/v) 를 중화된 대조군 샘플에 첨가하였다. 이어서, 샘플을 동등하게 분할하여 중화된 로드 샘플 및 로드 유지 샘플을 생성하였다. 중화된 로드 샘플의 pH 를 확인하고, 적정 전에 샘플을 얼음 상에 두었다. 로드 유지 샘플을 벌크 샘플과 동일한 온도에서 유지하였다.
대략 5% (v/v) 의 바이러스 스파이크를 pH 조정된 50 ml 샘플에 첨가하였다. 스파이킹 5 분 후 (T = 5 분), 샘플을 제거하고 1M Tris 로 즉시 중화시켰다.
낮은 pH 처리는 20℃ ± 0,5℃ 에서 pH 3.6 내지 3.64 (표적 pH 3.6) 에서 수행하였다. pH 를 인큐베이션 기간 동안 모니터링하고 필요한 경우 표적 pH 로 (pH 3.6) 조정하였다.
샘플을 T = 15 분 및 T = 30 분에 제거하였다. 샘플의 pH 를 1M Tris 를 사용해 pH 6.0 내지 pH 8.0 으로 즉시 조정하였다. pH 3.6 에서 60 분 후, 1M Tris 를 사용하여 나머지를 pH 6.0 내지 pH 8.0 으로 조정하였다.
공정 단계
차트 레코더를 사용하여 각 실험 동안 온도를 모니터링하였다. 녹화 간격은 1 분마다 있었다. 모든 공정 단계는 도 7 에 제시되고 아래 설명되어 있으며 도 7 에서 참조하는 모든 부피는 대략적인 부피이다.
바이러스 스파이크를 첨가한 후, 임의의 추가 조작 및 임의의 샘플의 수집 전에 물질을 완전히 혼합하였다.
수집 후, 모든 샘플을 완전히 혼합하고, 필요한 경우 1M Tris 를 사용하여 pH 6.00 내지 8.00 의 범위로 즉시 중화시켰다. 어세이를 위해 필요한 부피를 얼음 위에 놓고 적정 직전에 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 여과하였다. 0.45 ㎛ 여과된 및 여과되지 않은 양성 대조군을 접종하였다.
도 8 및 도 9 는 부형제가 없는 샘플과 비교하여, 선택된 중성 부형제 (소르비톨, 만니톨, 수크로스, 트레할로스 및 PEG4000) 의 존재 하에 낮은 pH 불활성화 유지 동안 바이러스 감소 실험의 결과를 나타낸다.
바이러스 감소 인자 및 강건성의 평가에 기초하여, 단위 작동은 효과적, 비효과적 또는 적당히 효과적으로서 분류될 수 있다 (FDA Q5A, 1998). "효과적인" 단계는 적어도 4 log10 의 감소 인자를 제공하고, 공정 변수에서 작은 섭동에 의해 영향을 받지 않는다. "비효과적인" 단계는 1 log10 이하의 감소 인자를 제공하고, "적당히 효과적인" 단계는 이들 두 극값 사이에 있다 (EMD Millipore, 2013).
선택된 부형제의 사용은 선택된 부형제를 사용하거나 사용하지 않는 모든 경우에 효과적인 바이러스 감소 단계 (4 log10 초과의 감소 인자) 를 여전히 가능하게 한다. 이는 선택된 부형제가 바이러스 불활성화 공정 단계에 부정적인 영향을 미치지 않음을 분명히 나타낸다.

Claims (13)

  1. 친화성 크로마토그래피 단계, 바이러스 불활성화 단계 및 선택적으로 다른 정제 단계를 포함하는, 세포 배양 샘플로부터 표적 단백질을 정제하기 위한 방법으로서, 여기서 세포 배양 샘플은 표적 단백질, 바이러스 화합물 및 다른 생성물 및 공정 관련 불순물을 포함하고, 친화성 크로마토그래피 단계는:
    a) 친화성 크로마토그래피 컬럼에 세포 배양 샘플을 로딩하여 표적 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합시키는 단계;
    b) 친화성 크로마토그래피 컬럼을 pH 6 보다 낮고 부형제를 포함하는 용리 완충제와 접촉시킴으로써 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 표적 단백질을 용리시키는 단계 (여기서, 부형제는 이당류, 폴리올 및 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체로 이루어진 군으로부터 선택됨);
    c) 단계 (b) 로부터 수득된 표적 단백질을 함유하는 하나 이상의 분획을 수집하는 단계;
    d) 단계 (c) 에서 수득된 분획을 조합하여 용리 생성물 풀을 형성하는 단계
    를 포함하고,
    바이러스 불활성화 단계는:
    e) 용리 생성물 풀을 2 내지 5 의 pH 에서 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는 정제 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 단계가 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계인 정제 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 표적 단백질이 모노클로날 항체인 정제 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체가 1,000 g/mol 내지 10,000 g/mol 의 평균 분자량을 갖는 정제 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 부형제가 수크로스, 트레할로스, 소르비톨, 만니톨 및 PEG4000 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정제 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충제가 2 중량% 내지 15 중량% (PEG4000 의 경우) 의 부형제 농도 또는 이당류 및 폴리올의 경우 용액 중 1 mM 내지 1,5 M 범위의 농도를 갖는 정제 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충제가 5 중량% 내지 10 중량% (PEG4000 의 경우) 의 부형제 농도 또는 이당류 및 폴리올의 경우 용액 중 5 mM 내지 500 M 범위의 농도를 갖는 정제 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충제가 시트레이트 완충제인 정제 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충제의 pH 가 2.5 내지 5.5 인 정제 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 단계 (b) 는 친화성 크로마토그래피 컬럼을 pH 5.5 내지 pH 2.75 의 용리 완충제 구배를 사용하는 용리 완충제와 접촉시키는 것을 포함하는 정제 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 단계 (e) 전에 용출 생성물 풀의 pH 를 pH 2 내지 pH 5 범위의 pH 로 조정하는 정제 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 단계 (e) 가 pH 2.5 내지 pH 4.5 에서 수행되는 정제 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 단계 (e) 가 실온에서 수행되는 정제 방법.
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