KR20230043132A - 표면 상의 오염이 감소된 생물공정 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 단백질과 하기 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 수용액을 제공하는 단계:
[화학식 I]

(여기서, R¹-C(=O)는 지방 아실 기이고, R²는 H 또는 치환 또는 비치환된 히드로카르빌 기이고, X¹은 O 또는 NH이고, X²는 O 또는 NH이고, n은 0 또는 1 내지 5의 정수이고, R³은 하기 화학식 II 및 III의 중합 단위를 포함하는 중합체성 기임:
[화학식 II]

[화학식 III]

)
및 (b) 수용액을 생물공정에 적용하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

Description

표면 상의 오염이 감소된 생물공정

본 발명은 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제를 사용하여 생물공정(bioprocess)에서 표면의 오염을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

단백질 또는 다른 생물학적으로-유도된 거대분자로부터 유도된 의약인 생물제제는 전통적인 저분자 약물에 비해 향상된 선택성 및 감소된 부작용으로 인해 중요한 의약 부류로 급부상하였다. 단백질 재료의 상대적으로 취약한 특성으로 인해, 치료학적으로 유익하면서 가공, 분배 및 투여를 견디기에 충분히 안정한 생물학적 활성제의 개발은 여전히 중요한 과제이다. 계면활성제는 계면 상의 단백질 흡착을 방지함으로써 또는 용액에서 보호 구조를 형성함으로써 용액에서 단백질을 안정화하고 보호하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 계면활성제는 보통 생물제제를 생성하는 공정의 다수의 단계와 불상용성이어서, 공정의 매우 후반(예를 들어 최종 제형)까지 첨가되지 않는다. 예를 들어, 계면활성제는 표면에 비가역적으로 흡착되어, 표면을 오염시키고, 기공/막/필터를 막고, 용액 내 계면활성제 농도를 감소시키고, 용액 또는 추가의 하류에서 단백질을 보호하는 능력을 제한함으로써 생물공정을 방해할 수 있다. 추가로 오염 및 막힘은 세정을 위한 더 긴 가동 중지 시간을 초래하여 공정의 처리량 및 생산성을 감소시킬 수 있다. 일부 상황에서, 생물제제는 계면활성제에 의해 차단되지 않는 표면(예를 들어 크로마토그래피 컬럼 또는 필터)에 접근하고/하거나 상호작용하여야 한다.

본 발명은 (a) 단백질 및 하기 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제를 포함하는 수용액을 제공하는 단계:

[화학식 I]

(여기서, R¹-C(=O)는 지방 아실 기이고, R²는 H 또는 치환 또는 비치환된 히드로카르빌 기이고, X¹은 O 또는 NH이고, X²는 O 또는 NH이고, n은 0 또는 1 내지 5의 정수이고, R³은 하기 화학식 II 및 III의 중합 단위를 포함하는 중합체성 기임:

[화학식 II]

[화학식 III]

)

및 (b) 수용액을 생물공정에 적용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본원에 제시된 개념의 이해를 높이기 위해 첨부 도면에서 실시 형태가 예시된다.
도 1은 DLS에 의해 측정할 때 실온에서 24시간 동안 진탕 시 염수 중 0.03 mg/mL 계면활성제 및 0.05 mg/mL 계면활성제에서 상이한 계면활성제 테일 길이에 의한 IgG (20 mg/mL)의 퍼센트 응집률을 나타낸다.
도 2는 DLS에 의해 측정할 때 진탕 전에 염수 중 0.03 mg/mL 계면활성제 및 0.05 mg/mL 계면활성제에서 상이한 계면활성제 테일 길이에 의한 IgG (20 mg/mL)의 퍼센트 응집률을 나타내는 그래프이다.
도 3a는 연구된 6가지 FM1000 유도체와 IgG에 대한 대표적인 DST 트레이스를 나타낸다. 도 3b는 전체 표면 장력 감소에 대한 첫 번째 붕괴로 인한 표면 장력 감소의 퍼센트를 나타낸다. 도 3c는 첫 번째 붕괴에 대한 특성 시간에 의해 정규화된 첫 번째 붕괴 동안의 표면 장력 감소를 나타낸다. 도 3d는 두 번째 붕괴로 인한 표면 장력의 감소를 나타낸다. 도 3e는 두 번째 붕괴의 특성 시간을 나타낸다.
도 4는 QCM-D 데이터를 나타낸다. 도 4a는 흡착된 계면활성제 단독 또는 IgG 단독의 상대 질량을 나타낸다. 도 4b는 헹구어 제거된 계면활성제 단독 또는 IgG 단독의 백분율을 나타낸다. 도 4c는 흡착된 IgG 질량과 흡착된 계면활성제 단독 질량을 사용하여 계면활성제의 차이에 의해 먼저 계산된 후 IgG 단독 샘플에 대한 흡착된 질량에 대해 정규화된, 흡착된 IgG의 상대적인 양(100 임의 단위)을 나타낸다. 도 4d는 헹구어 제거될 수 있는 IgG 및 계면활성제 합계 질량의 백분율을 나타낸다.
도 5는 테일 길이가 증가함에 따른 IgG 및 계면활성제의 흡착 단계들을 나타낸다. 각 다이어그램 세트에서, 가장 왼쪽 것은 짧은 테일 길이 계면활성제와 IgG를 도시하고, 가운데 것은 중간 테일 길이 계면활성제와 IgG를 도시하고, 가장 오른쪽 것은 긴 테일 길이 계면활성제와 IgG를 도시한다. 도 5a는 DST를 통해 밝혀진 계면활성제(첫 번째 붕괴)의 초기 흡착을 도시한다. 도 5b는 QCM-D를 통해 밝혀진 경쟁 흡착을 도시한다. 도 5c는 DST를 통해 밝혀진 평형 흡착(두 번째 붕괴)을 도시한다. 도 5d는 QCM-D를 통해 밝혀진 가역 흡착을 도시한다.
도 6은 PVDF 필터를 통과하는 계면활성제의 회수를 나타낸다. 도 6a 및 도 6b는 여과 동안 상이한 지점에서 샘플링된 FM1000 및 PS80 크로마토그램의 예를 나타낸다. 그래프 오른쪽의 중량(mg 단위)은 여과액의 누적 중량을 나타내고 크로마토그램은 누적 중량이 최대 약 2000 mg인 여과액 분취량을 나타낸다.
도 7은 PES 필터를 통과하는 계면활성제의 회수를 나타낸다. 도 7a 및 도 7b는 여과 동안 상이한 지점에서 샘플링된 FM1000 및 PS80 크로마토그램의 예를 나타낸다. 그래프 오른쪽의 중량(mg 단위)은 여과액의 누적 중량을 나타내고 크로마토그램은 누적 중량이 최대 약 2000 mg인 여과액 분취량을 나타낸다.
도 8은 술포프로필-작용화된 가교결합된 아가로스(SP HP) 컬럼을 통과하는 계면활성제의 회수를 나타낸다. 도 8a 및 도 8b는 용리 동안 상이한 지점에서 샘플링된 FM1000 및 PS80 크로마토그램의 예를 나타낸다. 그래프 오른쪽의 중량(mg 단위)은 용출액의 누적 중량을 나타내고 크로마토그램은 누적 중량이 최대 약 3000 mg인 용출액 분취량을 나타낸다.
도 9는 단백질 A 컬럼을 통과하는 계면활성제의 회수를 나타낸다. 도 9a 및 도 9b는 용리 동안 상이한 지점에서 샘플링된 FM1000 및 PS80 크로마토그램의 예를 나타낸다. 그래프 오른쪽의 중량(mg 단위)은 용출액의 누적 중량을 나타내고 크로마토그램은 누적 중량이 최대 약 3000 mg인 용출액 분취량을 나타낸다.
도 10은 4차 암모늄-작용화된 가교결합된 아가로스(Q HP) 컬럼을 통과하는 계면활성제의 회수를 나타낸다. 도 10a 및 도 10b는 용리 동안 상이한 지점에서 샘플링된 FM1000 및 PS80 크로마토그램의 예를 나타낸다. 그래프 오른쪽의 중량(mg 단위)은 용출액의 누적 중량을 나타내고 크로마토그램은 누적 중량이 최대 약 3000 mg인 용출액 분취량을 나타낸다.

전술한 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명을 위한 것이며, 첨부된 청구범위에서 정의되는 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 임의의 하나 이상의 실시 형태의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.

본원에 사용되는 바와 같이 용어 "포함한다", "포함하는", "포함되다", "포함되는", "갖는다", "갖는", 또는 이들의 임의의 다른 변형어는 비배타적 포함을 망라하는 것이다. 예를 들어, 요소들의 목록을 포함하는 공정, 방법, 물품, 또는 장치는 반드시 그러한 요소만으로 한정되는 것이 아니고, 명확하게 열거되지 않거나 그러한 공정, 방법, 물품, 또는 장치에 고유하지 않은 기타 요소들을 포함할 수도 있다. 또한, 명시적으로 반대로 언급되지 않는 한, "또는"은 포함적 논리합을 말하는 것이며, 배타적 논리합을 말하는 것이 아니다. 예를 들어, 조건 A '또는' B는 다음 중 어느 하나에 의해 충족된다: A가 참(또는 존재)이고 B가 거짓(또는 부존재), A가 거짓(또는 부존재)이고 B가 참(또는 존재), 및 A와 B가 모두 참(또는 존재).

또한, 본원에 기술된 요소들 및 성분들을 설명하기 위해 단수형 명사가 사용된다. 이는 단지 편의상 그리고 본 발명의 범주의 일반적인 의미를 제공하기 위해 행해진다. 이러한 설명은 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 이해해야 하며, 단수형은 명백하게 다른 것을 의미하는 것이 아니라면 복수형도 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 형태의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 아래에 기술된다. 또한, 재료, 방법, 및 예는 단지 예시적인 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다.

양, 농도, 또는 다른 값 또는 파라미터가 범위, 바람직한 범위, 또는 바람직한 상한값 및/또는 바람직한 하한값의 목록으로 주어지는 경우, 이는 범위가 별도로 개시되는지 여부에 관계없이, 임의의 범위 상한 또는 바람직한 값과 임의의 범위 하한 또는 바람직한 값의 임의의 쌍으로부터 형성되는 모든 범위를 구체적으로 개시하는 것으로 이해되어야 한다. 수치의 범위가 본원에 언급되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 범위는 범위의 종점들, 및 범위 내의 모든 정수와 분수를 포함하려는 것이다. 예를 들어, "1 내지 10"의 범위가 언급되는 경우, 언급된 범위는 범위 "1 내지 8", "3 내지 10", "2 내지 7", "1.5 내지 6", 3.4 내지 7.8", "1 내지 2 및 7 내지 10", "2 내지 4 및 6 내지 9", "1 내지 3.6 및 7.2 내지 8.9", "1 내지 5 및 10", "2 및 8 내지 10", "1.5 내지 4 및 8" 등을 포함하는 것으로 이해해야 한다.

본원에 예시적으로 기술된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 적합하게 실시될 수 있다. 조성물 및 방법이 다양한 성분 또는 단계를 "포함하는"과 관련하여 본원에서 기술되지만, 조성물 및 방법은 또한 달리 언급되지 않는 한 다양한 성분 또는 단계로 "본질적으로 이루어진" 또는 "이루어진" 것일 수 있다.

이하에서 기술되는 실시 형태의 상세 사항을 다루기 전에, 일부 용어를 정의하거나 설명한다.

용어 "표면" 및 "계면"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용된다.

수 평균 분자량은 샘플의 총 중량을 샘플 내의 분자의 수로 나눈 것으로서 정의된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "계면활성제/단백질 농도 비"는 수용액 내의 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 농도 대 단백질의 농도의 비를 의미한다. 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 농도 및 단백질의 농도는 본 개시내용에서 중량 부피 비(예를 들어, mg/ml)로 표현된다.

폴리알콕시 화합물은 구조 -(-A-O)_m-(여기서, m은 3 이상이고, A는 비치환된 알킬 기임)을 갖는 하나 이상의 기를 함유하는 화합물이다. 기 A는 선형, 분지형, 환형 또는 이들의 조합일 수 있다. 다양한 -(-A-O)- 기 중에서 다양한 A 기는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

지방 화합물은 하나 이상의 지방 기를 함유하는 화합물이다. 지방 기는 8개 이상의 탄소 원자를 함유하는 기이며, 이들 탄소 원자의 각각은 기 내의 다른 탄소 원자 중 하나 이상에 결합된다. 폴리알콕시 지방 화합물은 폴리알콕시 화합물이면서 지방 화합물인 화합물이다.

히드로카르빌 기는 수소 원자 및 탄소 원자를 함유하는 기이다. 비치환된 히드로카르빌 기는 오직 수소 원자와 탄소 원자만을 함유한다. 치환된 히드로카르빌 기는 수소 및 탄소 이외에 하나 이상의 원자를 함유하는 하나 이상의 치환기를 함유한다.

단백질은 중합 단위가 아미노산의 중합 단위인 중합체이다. 아미노산은 펩티드 결합에 의해 함께 결합된다. 단백질은 하나 이상의 아미노산 잔기의 20개 이상의 중합 단위를 함유한다. 용어 "단백질"은 선형 폴리펩티드 사슬뿐만 아니라, 폴리펩티드 사슬을 함유하는 더 복잡한 구조도 포함한다.

단백질 분자가 연속 액체 매질 전반에 용해된 개별 분자의 형태로 분포된 경우 단백질은 액체 매질 중의 용액인(또는, 같은 의미로, 액체 매질에 용해된) 것으로 간주된다. 연속 액체 매질이 연속 액체 매질의 중량을 기준으로 60 중량% 이상의 양으로 물을 함유하는 경우 단백질은 물에 용해된 것으로 간주된다.

pH 값이 4.5 내지 8.5인 경우 화학 기는 이온성 기이므로, 화학 기가 그러한 pH 값에서 물과 접촉할 때, 존재하는 그러한 화학 기의 50 몰% 이상은 이온 형태가 된다.

완충제는 (i) 양성자를 수용하여 그 화합물의 짝산을 형성할 수 있는 화합물이고, 그 화합물의 짝산은 pKa가 10 미만이거나, 또는 (ii) 양성자를 방출할 수 있는 화합물이고, 이 화합물은 pKa가 4 초과이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "FM1000"은 화학식 I(여기서, R¹은 CH₃-(CH₂)₁₁-CH₂-이고, n은 1이고, X¹ 및 X²는 둘 모두 NH이고, R²는 -CH₂(C₆H₅)이고, R³은 대략적인 수 평균 분자량이 1000이고 PO 대 EO의 비가 약 3:19인, CH₃으로 캡핑된 PO 및 EO 단위의 공중합체임)의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제를 의미한다. FM1000은 14-탄소 길이 소수성 테일 (CH₃-(CH₂)₁₁-CH₂-C(=O))을 갖는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "8FM1000"은 8개의 탄소의 소수성 테일을 갖는 FM1000 유도체를 의미하며, 즉, 8FM1000은 R¹이 CH₃-(CH₂)₅-CH₂-인 점을 제외하고는 FM1000과 동일한 화학식을 갖는다. 유사하게, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "10FM1000"은 10개의 탄소의 소수성 테일을 갖는 FM1000 유도체를 의미하며, 즉, 10FM1000은 R¹이 CH₃-(CH₂)₇-CH₂-인 점을 제외하고는 FM1000과 동일한 화학식을 갖고; 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "12FM1000"은 12개의 탄소의 소수성 테일을 갖는 FM1000 유도체를 의미하며, 즉, 12FM1000은 R¹이 CH₃-(CH₂)₉-CH₂-인 점을 제외하고는 FM1000과 동일한 화학식을 갖고; 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "16FM1000"은 16개의 탄소의 소수성 테일을 갖는 FM1000 유도체를 의미하며, 즉, 16FM1000은 R¹이 CH₃-(CH₂)₁₃-CH₂-인 점을 제외하고는 FM1000과 동일한 화학식을 갖고; 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "18FM1000"은 18개의 탄소의 소수성 테일을 갖는 FM1000 유도체를 의미하며, 즉, 18FM1000은 R¹이 CH₃-(CH₂)₁₅-CH₂-인 점을 제외하고는 FM1000과 동일한 화학식을 갖는다.

용어 "FM1000" 및 "14FM1000"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용된다.

본 발명은 (a) 단백질 및 하기 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제를 포함하는 수용액을 제공하는 단계:

[화학식 I]

(여기서, R¹-C(=O)는 지방 아실 기이고, R²는 H 또는 치환 또는 비치환된 히드로카르빌 기이고, X¹은 O 또는 NH이고, X²는 O 또는 NH이고, n은 0 또는 1 내지 5의 정수이고, R³은 하기 화학식 II 및 III의 중합 단위를 포함하는 중합체성 기임:

[화학식 II]

[화학식 III]

)

및 (b) 수용액을 생물공정에 적용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물공정"은 상류(예를 들어, 생화학적 생성 또는 합성)로부터의 단백질이 순도 및 품질 요건을 충족하도록 처리되는 단백질 생물공정의 하류 부분을 의미한다. 생물공정은 저장, 수송 및 정제를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 생물공정은 수송, 여과, 크로마토그래피, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

단계 (a)에서 제공된 수용액은 그 안에 용해된(예를 들어, 물에 용해된) 단백질 및 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (a)의 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 농도는 수용액의 총 부피를 기준으로 0.001 mg/ml 내지 1 mg/ml, 또는 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml, 또는 0.01 mg/ml 내지 0.05 mg/ml이다. 일부 실시 형태에서, 단계 (a)의 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 농도는 수용액의 총 부피를 기준으로 1 mg/ml 이하, 또는 0.5 mg/ml 이하, 또는 0.2 mg/ml 이하, 또는 0.1 mg/ml 이하, 또는 0.08 mg/ml 이하, 또는 0.06 mg/ml 이하, 또는 0.05 mg/ml 이하이다. 일부 실시 형태에서, 단계 (a)의 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 농도는 수용액의 총 부피를 기준으로 0.001 mg/ml 이상, 또는 0.002 mg/ml 이상, 또는 0.005 mg/ml 이상, 또는 0.01 mg/ml 이상, 또는 0.02 mg/ml 이상, 또는 0.03 mg/ml 이상이다.

일부 실시 형태에서, 단계 (a)의 수용액 중 단백질의 농도는 수용액의 총 부피를 기준으로 0.0001 mg/ml 내지 300 mg/ml, 또는 0.0001 mg/ml 내지 200 mg/ml, 또는 0.0001 mg/ml 내지 150 mg/ml, 또는 0.001 mg/ml 내지 100 mg/ml, 또는 0.01 mg/ml 내지 100 mg/ml, 또는 0.1 mg/ml 내지 50 mg/ml, 또는 0.1 mg/ml 내지 30 mg/ml, 또는 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml, 또는 10 mg/ml 내지 30 mg/ml이다. 일부 실시 형태에서, 단계 (a)의 수용액 중 단백질의 농도는 수용액의 총 부피를 기준으로 300 mg/ml 이하, 또는 250 mg/ml 이하, 또는 200 mg/ml 이하, 또는 150 mg/ml 이하, 또는 100 mg/ml 이하, 또는 80 mg/ml 이하, 또는 50 mg/ml 이하, 또는 40 mg/ml 이하, 또는 30 mg/ml 이하, 또는 20 mg/ml 이하, 또는 10 mg/ml 이하이다. 일부 실시 형태에서, 단계 (a)의 수용액 중 단백질의 농도는 수용액의 총 부피를 기준으로 0.0001 mg/ml 이상, 또는 0.001 mg/ml 이상, 또는 0.002 mg/ml 이상, 또는 0.005 mg/ml 이상, 또는 0.01 mg/ml 이상, 또는 0.02 mg/ml 이상, 또는 0.05 mg/ml 이상, 또는 0.1 mg/ml 이상, 또는 0.2 mg/ml 이상, 또는 0.5 mg/ml 이상, 또는 1 mg/ml 이상, 또는 2 mg/ml 이상, 또는 5 mg/ml 이상, 또는 10 mg/ml 이상이다. 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 농도 및 단백질의 농도는 본 개시내용에서 중량 부피 비(예를 들어, mg/ml)로 표현된다.

화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제에서, R¹은 바람직하게는 치환 또는 비치환된 지방족 기이다. 치환된 지방족 기 중에서, 바람직한 치환체는 히드록실이다. 더욱 바람직하게는 R¹은 비치환된 지방족 기이고; 더욱 바람직하게는, R¹은 비치환된 알킬 기이다. 바람직하게는, R¹은 9 내지 22개의 탄소 원자, 또는 9 내지 18개의 탄소 원자, 또는 9 내지 16개의 탄소 원자, 또는 10 내지 17개의 탄소 원자, 또는 11 내지 17개의 탄소 원자, 또는 11 내지 15개의 탄소 원자, 또는 10 내지 14개의 탄소 원자, 또는 11 내지 13개의 탄소 원자를 갖는 선형 알킬 기이다. 일부 실시 형태에서, R¹은 CH₃-(CH₂)₁₁-CH₂- 또는 CH₃-(CH₂)₉-CH₂-이다. 일부 실시 형태에서, R¹은 CH₃-(CH₂)₁₁-CH₂-이다.

일부 실시 형태에서(n이 0이 아닌 경우), X¹은 NH이다. 일부 실시 형태에서, X²는 NH이다.

일부 실시 형태에서, n은 0 또는 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 일부 실시 형태에서, n은 0 또는 1이다. 일부 실시 형태에서, n은 1이다. 일부 실시 형태에서, n은 0이다.

일부 실시 형태에서, n은 0이 아니고, R²는 20개 이하; 바람직하게는 15개 이하의 원자를 갖는다. 바람직하게는, R²가 수소가 아닌 경우, R²는 하나 이상의 탄소 원자를 함유한다. 바람직하게는, R²는 수소 또는 비치환된 탄화수소 기이며; 더욱 바람직하게는, R²는 수소, 비치환된 알킬 기, 또는 유일한 치환체가 비치환된 방향족 탄화수소 기인 알킬 기이다. 비치환된 알킬 기 중에서, 메틸이 바람직하다. 유일한 치환체가 비치환된 방향족 탄화수소 기인 알킬 기 중에서, -CH₂-(C₆H₅)가 바람직하며, 여기서 -(C₆H₅)는 벤젠 고리이다. 바람직하게는, R²는 천연 아미노산의 측쇄를 나타낸다.

일부 실시 형태에서, R³은 수 평균 분자량이 600 내지 5000 달톤, 바람직하게는 800 내지 3000 달톤이다. 바람직하게는, 기 R³은 (II)와 (III)의 통계 공중합체 또는 (II)와 (III)의 블록 공중합체이며; 더욱 바람직하게는 기 R³은 (II)와 (III)의 통계 공중합체이다. 바람직하게는, -R³은 구조 -R⁴-CH₃을 가지며, 여기서, R⁴는 구조 (II)와 구조 (III)의 중합 단위를 포함하는 중합체성 기이다. 바람직하게는, R⁴는 구조 (II)와 구조 (III) 외에 다른 중합 단위를 갖지 않는다.

구조 (II)의 단위 대 구조 (III)의 단위의 몰비(여기서, "PO/EO 비")를 특성화하는 것이 유용하다. 바람직하게는, PO/EO 비는 0.01:1 내지 2:1; 더욱 바람직하게는 0.05:1 내지 1:1, 특히 0.1:1 내지 0.5:1이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "PO"는 구조 (II) 단위를 의미하고, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "EO"는 구조 (III) 단위를 의미한다.

일부 실시 형태에서, R¹은 CH₃-(CH₂)₁₁-CH₂-이고, n은 0이고, X²는 NH이고, R³은 대략적인 수 평균 분자량이 1000이고 PO 대 EO의 비가 약 3:19인, CH₃으로 캡핑된 PO 및 EO 단위의 공중합체이다.

일부 실시 형태에서, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 이온성 기를 갖지 않는다.

일부 실시 형태에서, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 12FM1000, FM1000, 16FM1000, 18FM1000, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 12FM1000, FM1000, 16FM1000, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 12FM1000, FM1000, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 FM1000, 16FM1000, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 FM1000이다.

화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는, 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에서 참고로 포함된 WO2017/044366호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다.

화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 방법은 구조 NH₂-R³을 갖는 화합물을 하기 구조 V의 화합물:

및 하기 구조 VI의 화합물:

(여기서, X³은 O, S, 또는 NH임)로부터 선택되는 화합물과 반응시키는 것이다. R¹, X², R², R³, 및 n에 대한 선호는 전술한 것과 동일하다. 바람직하게는, X³은 O이다.

화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 일부 실시 형태를 제조하는 더 바람직한 방법은 다음과 같다. 제1 단계에서, 다음과 같이 아실 클로라이드를 아미노산과 반응시켜 카르복실-작용성 지방 아미드를 형성한다:

.

이어서, 제2 단계에서, 다음과 같이, 카르복실-작용성 지방 아미드를 아민-종결된 폴리알콕시 화합물과 반응시킨다:

여기서, PO는 구조 (II)이고 EO는 구조 (III)이다.

본 발명에 포함되기에 바람직한 단백질은 단클론성 항체, 성장 인자, 인슐린, 면역글로불린, 다클론성 항체, 항체-약물 접합체, 이중특이성 항체, 삼중특이성 항체, 호르몬, 효소, 폴리펩티드, 펩티드 융합체, 글리코실화 단백질, 항원, 항원 서브유닛, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 단백질은 질병 또는 의학적 병태를 치료하거나 백신으로서 기능하는 치료 효과를 갖는다. 치료 단백질의 예는 면역글로불린 G (IgG), 아달리무맙, 인터페론 알파, 베바시주맙, 인간 성장 호르몬, 리툭시맙, 인간 혈청 알부민, 인슐린, 에리트로포이에틴 알파, 펨브롤리주맙, 에타너셉트, 필그라스팀, 니볼루맙, 트라스투주맙, 두르발루맙, 인터류킨-2, 인플릭시맙, 융모성 생식선 자극 호르몬, 아벨루맙, 데노수맙, 라니비주맙, 애플리버셉트, 트레멜리무맙, viii 인자, 인터페론 베타, 이필리무맙, 아테졸리주맙, 아바타셉트, 토실리주맙, 우스테키누맙, 페그필그라스팀, 세쿠키누맙, 스트렙토키나제, 세툭시맙, 오말리주맙, 라무시루맙, 우로키나제, 세톨리주맙 페골, 두필루맙, 게놀림주맙, 알데스류킨, 몰그라모스팀, 페그인터페론 알파-2b, 티슬렐리주맙, 폴리트로핀 알파, 게보키주맙, 골리무맙, 스파르탈리주맙, 카나키누맙, 포랄루맙, 발리루맙, 니모투주맙, 에리트로포이에틴 베타, 에볼로쿠맙, 페그아르기미나제, 베르메키맙, 카로툭시맙, 다라투무맙, 에쿨리주맙, 온툭시주맙, 아달리무맙, 캄렐리주맙, 에노블리투주맙, 인터류킨-12, 리릴루맙, 파니투무맙, 가티포투주맙, 렐라틀리맙, 안데칼릭시맙, 벨리무맙, 카비랄리주맙, 이삭투주맙 고비테칸, 모날리주맙, 판크레아틴, 퍼투주맙, 토리팔리맙, 이네빌리주맙, 오파투무맙, 페피네맙, 신틸리맙, 알리로쿠맙, 밀라투주맙, 니다닐리맙, 소타터셉트, 베돌리주맙, 벨투주맙, 베바시주맙 베타, 이사툭시맙, 오를로타맙, 티소투맙 베도틴, 벤라리주맙, 코시벨리맙, 에막투주맙, 가니투맙, 나르소플리맙, 피딜리주맙, 사리루맙, 트라스투주맙 엠탄신, 아네투맙 라브탄신, 베르틸리무맙, 블리나투모맙, 구셀쿠맙, 익세키주맙, 메폴리주맙, 오비누투주맙, 우블리툭시맙, 알렘투주맙, 에미베투주맙, 피클라투주맙, 이파보투주맙, 미리키주맙, 나탈리주맙, 라코투모맙, 실툭시맙, 티미구투주맙, 트라스투주맙 데룩스테칸, 비메키주맙, 브로달루맙, 세트렐리맙, 파레투주맙, 오피너셉트, 릴로나셉트, 토무조툭시맙, 우렐루맙, 아스크린바쿠맙, 브로루시주맙, 클라자키주맙, 쿠사투주맙, 달로투주맙, 이아나루맙, 이톨리주맙, 및 마르게툭시맙이다. 의학적 진단제로서 사용될 수 있거나, 식품 조성물에 대해 유익한 효과를 갖거나, 세정 조성물 또는 코팅 제형에 포함될 수 있는 단백질이 또한 고려된다. 일부 실시 형태에서, 단백질은 면역글로불린이다. 일부 실시 형태에서, 단백질은 면역글로불린 G(IgG)이다. 일부 실시 형태에서, 단백질은 소 면역글로불린 G이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수용액"은 용매가 용매의 총 중량을 기준으로 적어도 90 중량%의 물을 포함하는 용액을 의미한다. 일부 실시 형태에서, 용매는 유기 용매, 예컨대 아세톤, 에탄올, DMSO(디메틸 술폭시드) 및 2-부탄온을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 용매는 물 및 유기 용매를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 용매는 용매의 총 중량을 기준으로 적어도 92 중량%, 또는 적어도 94 중량%, 또는 적어도 96 중량%, 또는 적어도 98 중량%, 또는 적어도 99 중량%의 물을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 용매는 물로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 용매는 물이다. 일부 실시 형태에서, 수용액에는 유기 용매가 실질적으로 없다. 일부 실시 형태에서, 수용액의 액체 매질은 물로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진다.

수용액은 선택적으로 하나 이상의 추가 성분을 포함한다. 추가 성분은 물, 단백질, 및 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제 이외의 화합물이다. 바람직한 추가 성분은 당, 당 알코올, 염, 완충제, 아미노산 또는 아미노산의 염, 또는 이들의 혼합물이다. 그러한 추가 성분이 존재하는 경우, 바람직하게는 모든 추가 성분의 총량은 수용액의 총 부피를 기준으로 300 mg/ml 이하, 또는 250 mg/ml 이하, 또는 200 mg/ml 이하, 또는 150 mg/ml 이하, 또는 100 mg/ml 이하, 또는 80 mg/ml 이하, 또는 60 mg/ml 이하, 또는 40 mg/ml 이하, 또는 30 mg/ml 이하, 또는 20 mg/ml 이하, 또는 10 mg/ml 이하이다.

수용액에 포함시키기 위해, 바람직한 당은 수크로스, 글루코스, 만노스, 트레할로스, 말토스, 덱스트로스 또는 덱스트란, 또는 이들의 혼합물이다. 수용액에 포함시키기 위해 바람직한 당 알코올은 소르비톨, 만니톨 또는 자일리톨이다.

수용액에 포함시키기 위해, 바람직한 염은 수소, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 또는 암모늄, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 양이온을 갖는다. 바람직한 염은 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 포스페이트, 카르보네이트, 아세테이트, 시트레이트 또는 술페이트, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 음이온을 갖는다. 바람직한 완충제는 수소, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 또는 암모늄, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 양이온을 갖는다.

수용액에 포함시키기 위해, 바람직한 아미노산 및 이의 염은 리신, 글리신, 프롤린, 아르기닌, 히스티딘, 및 이들의 혼합물 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시 형태에서, 수용액에는 다른 계면활성제가 실질적으로 없다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "다른 계면활성제"는 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제와는 상이한 계면활성제를 의미한다. 일부 실시 형태에서, 다른 계면활성제는 폴리소르베이트, 폴록사머, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 수용액에는 폴리소르베이트 계면활성제가 실질적으로 없다. 일부 실시 형태에서, 수용액에는 폴록사머 계면활성제가 실질적으로 없다. 일부 실시 형태에서, 수용액 중 다른 계면활성제의 농도는 수용액의 총 부피를 기준으로 0.01 mg/ml 이하, 또는 0.005 mg/ml 이하, 또는 0.002 mg/ml 이하, 또는 0.001 mg/ml 이하, 또는 0.0005 mg/ml 이하, 또는 0.0002 mg/ml 이하, 또는 0.0001 mg/ml 이하이다. 일부 실시 형태에서, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 수용액에 존재하는 유일한 계면활성제이다.

일부 실시 형태에서, 단계 (b)의 생물공정은 여과이며, 즉, 단계 (b)에서는, 단계 (a)에서 제공된 수용액을 여과하여 여과액의 수용액을 형성한다. 이러한 단계 또는 공정에서, 수용액은 필터를 통과하여 단백질 오염물(예를 들어, 숙주 세포 단백질, 핵산, 단백질 응집물 등)의 적어도 일부를 제거한다. 수용액 중 단백질 및 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 함께 필터를 통과하여 여과액을 형성하는 한편, 단백질 오염물은 필터에 의해 유지된다.

일부 실시 형태에서, 필터는 PVDF 필터, PES 필터, 폴리프로필렌 필터, 셀룰로오스 필터, 나일론 필터, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 필터는 PVDF 필터이다. 일부 실시 형태에서, 필터는 PES 필터이다. 전형적으로 필터는 분리막을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "분리 막"은 수용액 내의 성분들을 그의 분자량 또는 크기를 기준으로 분리하는 여과 공정에 사용되는 다공성 막을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "PVDF 필터"는 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)로 제조된 분리막을 갖는 필터를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "PES 필터"는 폴리에테르술폰(PES)으로 제조된 분리막을 갖는 필터를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리프로필렌 필터"는 폴리프로필렌으로 제조된 분리막을 갖는 필터를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "셀룰로오스 필터"는 셀룰로오스로 제조된 분리막을 갖는 필터를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "나일론 필터"는 나일론으로 제조된 분리막을 갖는 필터를 의미한다.

일부 실시 형태에서, 필터 또는 그 안의 분리막은 기공 크기가 약 0.1 μm 내지 약 1 μm, 또는 약 0.1 μm 내지 약 0.5 μm이다. 일부 실시 형태에서, 필터 또는 그 안의 분리막은 기공 크기가 약 0.2 μm이다. 일부 실시 형태에서, 여과 공정은 실온 하에서 수행된다. 일부 실시 형태에서, 여과 공정은 한외여과 및/또는 정용여과를 배제한다.

화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 단백질이 분리막 상에 흡수되거나 손실되는 것을 효과적으로 방지할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 분리막 상의 흡수 또는 손실이 또한 적거나 최소이다. 일부 실시 형태에서, 여과를 위해 필터에 공급된 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 총 중량을 기준으로 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 75% 이상, 또는 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 92% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상, 또는 99% 이상의 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제가 필터를 통과한다.

일부 실시 형태에서, 여과를 위해 필터에 공급된 수용액 중 단백질의 총 중량을 기준으로 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 75% 이상, 또는 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 92% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상, 또는 99% 이상의 단백질이 필터를 통과한다.

일부 실시 형태에서, 단계 (a)에서 제공된 수용액 중 계면활성제/단백질 농도 비는 여과액의 수용액 중 계면활성제/단백질 농도 비와 실질적으로 동일하며, 즉, 수용액 중 계면활성제/단백질 농도 비는 필터를 통과할 때 실질적으로 일정하다. 일부 실시 형태에서, 여과액의 수용액 중 계면활성제/단백질 농도 비는 단계 (a)에서 제공된 수용액 중 계면활성제/단백질 농도 비로부터 ± 5%, 또는 ± 10%, 또는 ± 15%, 또는 ± 20%의 범위 이내이다.

화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 상이한 분자량을 갖는 중합체 성분들이 혼합물이다. 전형적으로, 단계 (a)에서 제공된 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 조성(혼합물 중 중합체 성분들 및 그들 각각의 농도)은 여과액의 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 조성과 실질적으로 동일하며, 즉, 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 조성은 필터를 통과할 때 실질적으로 동일하게 유지된다.

일부 실시 형태에서, 단계 (b)의 생물공정은 크로마토그래피이며, 즉, 단계 (b)에서는, 단계 (a)에서 제공된 수용액을 크로마토그래피 컬럼에 함유된 크로마토그래피 수지(고정상)에 통과시켜 단백질 오염물(예를 들어, 숙주 세포 단백질, 핵산, 단백질 응집물 등)의 적어도 일부를 단백질로부터 분리할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 단백질은 크로마토그래피 컬럼 내에 유지되는 반면, 단백질 오염물은 크로마토그래피 컬럼을 통과한다. 이러한 실시 형태에서, 크로마토그래피 후에, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제를 포함하는 회수 수용액은 유지된 단백질을 크로마토그래피 컬럼으로부터 회수하거나 제거하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 회수 수용액은 완충제 용액이다.

일부 실시 형태에서, 단백질 오염물은 크로마토그래피 컬럼 내에 유지되는 반면, 수용액 중 단백질 및 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 크로마토그래피 컬럼을 통과한다. 일부 실시 형태에서, 크로마토그래피 공정은 실온 하에서 수행된다.

크로마토그래피 공정 동안, 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 크로마토그래피 컬럼을 통과한다. 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 크로마토그래피 수지 상의 흡착 또는 손실이 적거나 최소이다. 일부 실시 형태에서, 크로마토그래피 컬럼에 공급된 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 총 중량을 기준으로 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 75% 이상, 또는 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 92% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상, 또는 99% 이상의 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제가 크로마토그래피 컬럼을 통과한다.

전형적으로, 단계 (a)에서 제공된 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 조성은 크로마토그래피 컬럼을 통과한 수용액(즉, 용출액) 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 조성과 실질적으로 동일하며, 즉, 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 조성은 크로마토그래피 컬럼을 통과할 때 실질적으로 동일하게 유지된다.

크로마토그래피 컬럼은 그 안에 함유된 크로마토그래피 수지(고정상)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 크로마토그래피 수지는 술포프로필-작용화된 가교결합된 아가로스, 단백질 A, 4차 암모늄-작용화된 가교결합된 아가로스, 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 당업자는 단백질 A가 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 세포벽에서 본래 발견되는 49 kDa 표면 단백질임을 인지한다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지의 예에는 부틸 치환체를 갖는 아가로스가 포함된다. 일부 실시 형태에서, 크로마토그래피 수지는 술포프로필-작용화된 가교결합된 아가로스이다. 일부 실시 형태에서, 크로마토그래피 수지는 단백질 A이다. 일부 실시 형태에서, 크로마토그래피 수지는 4차 암모늄-작용화된 가교결합된 아가로스이다.

일부 실시 형태에서, 생물공정은 수송이며, 즉, 생물공정은 수용액을 용기 내에서 또는 도관을 통해 수송하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 12FM1000, FM1000, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 FM1000이다. 일부 실시 형태에서, 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 농도는 수용액의 총 부피를 기준으로 약 0.01 mg/ml 내지 약 0.1 mg/ml, 또는 약 0.02 mg/ml 내지 약 0.08 mg/ml, 또는 약 0.02 mg/ml 내지 약 0.06 mg/ml, 또는 약 0.03 mg/ml 내지 약 0.05 mg/ml이다. 일부 실시 형태에서, 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 농도는 수용액의 총 부피를 기준으로 약 0.03 mg/ml이다.

화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 수송 동안 수용액 중 단백질의 응집을 효과적으로 감소시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 일부 실시 형태에서, 수송 종료 시 수용액은 수용액 내의 단백질의 총 중량을 기준으로 적어도 80 중량%의 단량체 단백질, 또는 적어도 85 중량%의 단량체 단백질, 또는 적어도 90 중량%의 단량체 단백질, 또는 적어도 92 중량%의 단량체 단백질, 또는 적어도 94 중량%의 단량체 단백질, 또는 적어도 96 중량%의 단량체 단백질, 또는 적어도 98 중량%의 단량체 단백질, 또는 적어도 99 중량%의 단량체 단백질을 포함한다.

많은 양태 및 실시 형태가 상기에 기술되었고 이는 단지 예시적인 것이며 제한적인 것은 아니다. 본 명세서를 읽은 후에, 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 다른 양태 및 실시 형태가 가능하다는 것을 이해한다.

실시예

본원에 기술된 개념이 다음의 실시예에서 추가로 설명되지만, 이는 청구범위에 기술된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

단백질은 물과 공기, 오일 및 고체 표면 사이의 계면에 흡착되는 것으로 알려져 있으며, 이는 보통 응집 및 변성을 초래한다. 게다가, 수송 중 흔히 발생하는 흔들림은 이러한 유해한 영향을 악화시킬 수 있다. 이러한 치료적 단백질을 안정화하는 일부 방법은 당, 염, 아미노산 및 계면활성제와 같은 부형제의 사용을 포함한다. 계면활성제는 다음 두 가지 메커니즘을 통해 용액 중 단백질을 안정화하고 보호하는 데 특히 유용하다: (1) 경쟁 흡착으로 알려진, 단백질이 변성 및 응집할 수 있는 표면 상의 공간에 대해 단백질과의 경쟁에서 이기는 것에 의한 것, 및 (2) 계면활성제가 단백질과 직접 상호작용하여 단백질 구조를 안정화하거나 응집을 유발할 수 있는 단백질-단백질 상호작용을 방지하는, 우선적 결합에 의한 것.

이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 이러한 두 메커니즘 모두 안정화에 역할을 하는 것으로 여겨지지만 일반적으로 첫 번째 메커니즘이 주요한 것으로 간주된다. 폴리소르베이트 20 및 80과 같이 단백질 안정화에 사용되는 시판 중인 현재의 계면활성제는 이러한 계면활성제가 없는 제형에 비해 단백질 응집을 감소시킨다. 폴리소르베이트 20 및 80과 비교하여, 14FM1000은 단백질-계면활성제 용액이 65℃에서 등온으로 유지될 때 면역글로불린 G(IgG) 응집체의 성장 속도를 감소시킨다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 14FM1000의 성공은 동적 표면 장력(DST) 측정에 의해 나타나는 바와 같이 수성-공기 및 수성-오일과 같은 다양한 계면으로 빠르게 이동 및 흡착할 수 있는 그의 능력 때문일 가능성이 높다.

8 내지 18개의 탄소 범위의 소수성 테일 길이를 갖는 6개의 FM1000 유도체를 합성하고 그의 단백질 안정화 능력을 이해하고 단백질 안정화 효능의 변화를 초래하는 계면활성제 구조 특성을 식별하기 위해 연구하였다. 실험을 통해 소수성 테일 길이는 모델 단백질 치료제인 IgG를 안정화하는 계면활성제의 능력에 상당한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 소수성 테일 길이는 계면활성제 흡착의 동역학 및 가역성에 영향을 미친다. 14개의 탄소와 같이 중간 길이의 소수성 테일 길이(즉, 14FM1000)는 표면 장력의 가장 빠르고 가장 큰 감소와 가장 가역적인 흡착을 갖는다. 이러한 빠른 동역학은 IgG를 안정화하는 계면활성제의 능력과 상관관계가 있으며, 14FM1000이 응집을 가장 최소화하다. 본 개시 내용은 계면활성제 소수성 테일 길이와 단백질 안정화 사이의 구조-기능 관계를 밝힌다.

재료

미리스토일 클로라이드, Amberlite IR-120 강산성 이온 교환 수지 수소 형태, 및 카르보닐디이미다졸은 Sigma Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 구매하였다. Amberlite IRN-78 양이온성 유형 (OH-) 이온 교환 수지는 Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬 소재)로부터 구매하였다. N-히드록시숙신이미드는 Acros Organics(미국 뉴저지주 페어론 소재)로부터 구매하였다. L-페닐알라닌은 TCI chemicals(미국 오리건주 포틀랜드 소재)로부터 구매하였다. Jeffamine M1000은 Huntsman(미국 텍사스주 더 우드랜즈 소재)로부터 입수하였다. 폴리소르베이트 80 및 폴리소르베이트 20은 Sigma로부터 입수하였다. 모든 화학물질은 추가 정제 없이 입수한 그대로 사용하였다.

실리콘 슬래브(Dow Corning C6-150)는 DuPont에 의해 공급되었다. IV 백은 Baxter Healthcare Corp.로부터 입수하고, 절단하여 개봉하고, 기존 염수 용액을 비우고, MilliQ 수로 세척하고, 건조시켰다. 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리에테르술폰(PES), 및 폴리에틸렌(PE)은 0.5 mm의 두께 및 150x150 mm 내지 300x300 mm 범위의 크기로 모두 Goodfellow Corp.로부터 입수하였다. 모든 표면을 3.5x1 cm 조각으로 절단한 후에 다양한 용액에 침지하였다.

PVDF 필터는 Fisher Scientifc(Fisherbrand, 33 mm 직경, 0.2 μm)로부터 입수한 한편, PES 필터는 Millipore Sigma(Millex-GP, 33 mm 직경, 0.22 μm)로부터 입수하였다. 술포프로필-작용화된 가교결합된 아가로스 컬럼 및 단백질 A 컬럼(GE Healthcare)을 비롯한 크로마토그래피 컬럼은 모두 1 mL 용량으로 Cytiva로부터 입수하였다.

물은 MilliQ 등급이었다. 산업 등급 소 IgG(면역글로불린 G)는 MP Biomedicals(미국 캘리포니아주 산타 애나 소재)로부터 구매하였다. 소 IgG를 0.9 중량% 염수 중에 40 mg/mL로 용해시키고, 0.2 μm PVDF 필터를 통해 여과하고, 관련 농도까지 희석하였다.

14개의 탄소의 소수성 테일을 갖는 FM1000 유도체의 합성 (FM1000 또는 14FM1000):

단계 1: 교반 막대가 장착된 500 mL 둥근 바닥 플라스크에 l-페닐알라닌(0.0500 mol, 8.26 g), DI 수(탈이온수)(250 mL) 중 수산화나트륨(0.0500 mol, 2.00 g), 및 트리에틸아민(0.0540 mol, 7.56 mL)을 첨가하였다. 이를 용해될 때까지 RT(실온)에서 1분 동안 교반하였다. 다음으로, 미리스토일 클로라이드(0.0500 mol, 13.6 mL)를 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. 다음으로, 5 mL의 진한 HCl을 천천히 첨가하였다. 산을 첨가하여 형성된 오프-화이트 침전물을 흡인 여과를 통해 수집하고, 500 mL의 물로 세척하고, 하룻밤 건조시켰다. 다음으로, 생성물을 1500 mL의 끓는 에틸 아세테이트에 용해시키고 황산마그네슘으로 건조시켰다. 황산마그네슘을 여과하여 제거하고 에틸 아세테이트를 회전식 증발기를 통해 제거하였다. 다음으로, 생성물을 끓는 헥산에 용해시키고, 냉동고에서 천천히 냉각시켰고, 그 동안 백색 침전물이 형성되었고, 흡인 여과를 통해 수집하였다. NMR에서 미리스트산 불순물이 나타났기 때문에, 생성물을 다시 끓는 헥산에 용해시키고, 냉동고에서 천천히 냉각시켰고, 그 동안 백색 침전물이 형성되었고, 흡인 여과를 통해 수집하였다. 생성된 백색 분말을 진공 데시케이터에서 하룻밤 건조시켰다(7.9741 g, 43%).

단계 2: 교반 막대가 장착된 25 mL 둥근 바닥 플라스크에 n-미리스토일 페닐알라닌(단계 1로부터의 생성물)(0.00100 mol, 0.375 g) 및 DCM (디클로로메탄, 10 mL)을 첨가하였다. 둥근 바닥 플라스크를 격막으로 덮고 N₂로 퍼징하였다. 다음으로, CDI(1,1'-카르보닐디이미다졸, 0.00120 mol, 0.194 g)를 반응 혼합물에 첨가하고, 격막을 교체하고, 혼합물을 N₂로 다시 퍼징하였다. 이어서 반응 혼합물을 RT에서 4시간 동안 교반하였다. 다음으로, Jeffamine M1000(0.00120 mol, 1.17 g)을 용융시키고 주사기를 통해 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 68시간 동안 교반하였다. 다음으로, DCM을 회전식 증발기를 통해 증발시키고, 메탄올로 사전 세척한 교환 수지, 즉 Amberlite IRN-78 양이온성 유형 (OH-) 이온 교환 수지 및 Amberlite IR-120 강산성 이온 교환 수지 수소 형태와 함께 150 mL의 메탄올을 첨가하였다. 이 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반하였다. 프릿을 사용하여 진공 여과를 통해 수지를 제거하였다 진공 여과로부터 생성된 용액에서 메탄올을 증발시켰다. 다음으로, 생성물을 400 mL의 10% 메탄올/DCM에 용해시키고 SiO₂ 플러그에 통과시켰다. 여과액을 회전식 증발기를 통해 농축하여 백색 왁스를 수득하였고, 이것을 진공 오븐 내에서 60℃에서 하룻밤 건조시켰다(1.6 g, 49%).

진탕 연구

모든 샘플은 0.9 중량% 염수(1000 mL MilliQ 수 중의 9 g NaCl) 중에서 제조되었고 20 mg/mL IgG를 함유하였다. 대조군 샘플은 계면활성제 없이 제조하였다. 상이한 테일 길이를 갖는 0.03 또는 0.05 mg/mL의 계면활성제를 함유하는 다른 샘플을 또한 진탕 연구를 위해 제조하였다. 계면활성제는 8FM1000, 10FM1000, 12FM1000, 14FM1000, 16FM1000 및 18FM1000이었고, 여기서 8, 10, 12, 14, 16 및 18은 각각 계면활성제 테일 길이(탄소 원자의 수)를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "테일 길이"는 R¹의 길이를 의미한다. 예를 들어, 14FM1000은 14-탄소 소수성 테일 길이를 갖는다(CH₃-(CH₂)₁₁-CH₂-C(=O)).

교반을 사용하여 IgG 단백질 응집을 유도하였다. 샘플을 Thermo 왕복식 진탕기에서 4중으로 188 스트로크/분으로 24시간 동안 실온에서 진탕하였다. 연구를 위한 각각의 샘플은 대략 1 mL, 8x43 mm 유리 바이알(Kimble 제품 번호 60831D-843) 내에 0.7 mL이었고 Piercable TPE Lyo Capcluster-96 (미국 펜실베이니아주 애스턴 소재의 Micronic) 스토퍼로 마개를 덮었다. 바이알을 맞춤형 알루미늄 홀더에 96-웰 레이아웃으로 배열하였다. 진탕 후에, 샘플을 Wyatt DynaPro II 기기(미국 캘리포니아주 산타바바라 소재의 Wyatt Technology)에서 동적 광 산란(DLS)을 통해 분석하여 교반-유발 응집을 방지하는 계면활성제의 효능을 결정하였다. 또한, "무-진탕" 대조군(즉, "0시간 진탕")으로서 동일한 샘플을 진탕 전에 DLS를 통해 분석하였다. 각각의 웰을 획득당 5초로 5회 스캔하였다. 정규화 피팅을 사용하여 IgG 집단 크기 및 유체역학적 반경을 결정하였다. 10 nm를 초과하는 집단은 응집된 IgG로 간주되었고 따라서 Rayleigh 구를 가정하여 질량 퍼센트에 의해 정량화하여 강도 퍼센트로부터 질량 퍼센트로 전환하였다.

진탕 연구는 단백질을 안정화하는 계면활성제의 능력을 이해하기 위해 사용되는데, 진탕은 소수성 표면의 일정한 변동을 통해 불안정화를 가속하기 때문이다. 추가로, 교반은 IgG 응집을 증가시키는 수송 조건과 유사하다. 도 1 및 도 2에서, 가장 왼쪽 막대는 계면활성제를 함유하지 않는 대조군 샘플을 나타낸다. 도 1은 24시간 진탕 후의 IgG 응집을 나타내고, 도 2는 진탕 전의 IgG 응집을 나타낸다. 도 2에 나타나 있는 바와 같이, 무-진탕 대조군에서는, 연구된 두 가지 농도에서 모든 계면활성제에 대해 IgG 응집이 본질적으로 0%이다. 도 1은 14FM1000이 수용액의 총 부피를 기준으로 0.03 mg/ml 및 0.05 mg/ml의 농도에서 IgG 단백질 응집을 효과적으로 방지할 수 있음을 보여준다. 도 1은 또한 12FM1000이 수용액의 총 부피를 기준으로 0.05 mg/ml의 농도에서 IgG 단백질 응집을 효과적으로 방지할 수 있음을 보여준다.

일반적으로 중간-테일 길이가 IgG 응집을 가장 많이 방지하고, 더 짧은 테일 길이 및 더 긴 테일 길이는 더 많은 IgG 응집을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 0.03 mg/mL 내지 0.05 mg/mL의 계면활성제 농도에서 IgG 응집을 비교할 때, 12FM1000은 또한 더 높은 농도의 계면활성제(0.05 mg/mL)에서 대략 0% 응집을 갖지만, 0.03 mg/mL의 더 낮은 농도에서 약간의 응집(1 내지 2%)이 관찰되는 것으로 밝혀졌다. 8FM1000 및 10FM1000 계면활성제 샘플은 0.03 mg/mL에서 다량의 응집(4 내지 7%)을 가졌다. 0.05 mg/mL의 더 높은 농도에서, 8FM1000은 더 낮은 농도에서와 대략 동일한 양의 응집을 가졌지만, 10FM1000은 더 적은 응집(2 내지 3%)을 가졌다. 10FM1000에 대한 농도의 증가에 따른 IgG 응집의 이러한 감소는 12FM1000의 농도가 또한 증가할 때 나타나는 경향과 유사하다. 16FM1000 및 18FM1000 둘 모두는 연구된 두 가지 농도 사이에서 크게 변하지 않는 약 2 내지 3%의 응집을 가졌다.

동적 표면 장력 측정

모든 샘플은 0.9 중량% 염수(1000 mL MilliQ 수 중의 9 g NaCl) 중에서 제조되었다. 계면활성제는 각각 8FM1000, 10FM1000, 12FM1000, 14FM1000, 16FM1000 및 18FM1000이었고, 단백질은 IgG였다. 7개의 샘플을 제조하였는데, 1개는 0.9% 염수 중의 10 mg/mL의 IgG를 함유하고 나머지 6개는 각각 0.9% 염수 중의 0.05 mg/mL의 농도로 각각의 종류의 계면활성제를 함유하였다.

Teclis Tracker 펜던트 드롭 장력계(프랑스 시브리외 다제르게 소재의 Teclis Scientific)에서 RT에서 표면 장력 측정을 수행하였다. 25 ml 큐벳에 샘플을 채웠다. 18-게이지 J자형 바늘을 사용하여 기포를 생성하였다. 드롭은 기기의 피드백 컨트롤러를 사용하여 일정한 면적으로 유지되었다. Laplace 방정식에 기포 윤곽을 피팅하여 표면 장력을 계산하였다. 샘플의 표면 장력을 3000초(12FM1000, 14FM1000, 16FM1000, 18FM1000, 및 IgG) 또는 6000초(8FM1000 및 10FM1000) 동안 삼중으로 모니터링하였다. 처음에는 0.1초마다 측정을 수행하였다. 10초 후에는, 1초마다 측정을 수행하였다.

동적 표면 장력(DST) 측정은 계면에서 재료 흡착 및 재배열의 동역학을 이해하는 데 유용하다. 공기/물 계면에서의 DST를 각각의 계면활성제에 대해 0.05 mg/mL에서 그리고 IgG에 대해 10 mg/mL에서 측정하였다(도 3a 참조). 계면에서의 흡착 및 재배열 동역학을 정성적으로 나타내기 위해 각각의 DST 곡선을 이중 지수 붕괴 함수에 피팅하였다(식 1).

는 시간

에서의 표면 장력이고

는 평형 상태에서의 또는 무한 시간 후의 표면 장력이다. 또한,

은 더 빠른 붕괴의 특징적인 시간이고

은 첫 번째 붕괴로 인한 표면 장력의 감소이다.

및

는 더 느린 더 느린 붕괴에 해당한다.

[식 1]

화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 친수성 헤드 (-R³) 및 소수성 테일(-R¹) 재배열 및 표면 상의 흡착을 거치는 것으로 여겨진다. 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제가 두 가지 유형의 표면 장력 붕괴, 즉 초기 흡착 및 일부 형태의 형태적 조정(중합체성 친수성 헤드(-R³)로 인해 가능함)을 갖는다고 가정하면, 첫 번째 붕괴는 표면에 대한 계면활성제의 초기 흡착(

,

)에 해당하고 두 번째 붕괴는 계면활성제 분자의 평형 배향으로의 형태 변화(

,

)에 해당하는 것으로 여겨진다. 중합체성 친수성 헤드와 탄화수소 소수성 테일(-R¹)의 형태적 조정이 있을 수 있다.

14FM1000은 첫 번째 붕괴에서 가장 큰 백분율의 표면 장력을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(도 3b 참조). 14FM1000에 비해, 테일 길이가 증가하거나 감소함에 따라, 첫 번째 붕괴로 인한 표면 장력 감소의 퍼센트가 감소한다. 이는 14FM1000의 테일 길이로 인해 다른 계면활성제에 비해 최대 초기 흡착이 가능하다는 것을 나타낸다. 게다가, 도 3c에 나타난 바와 같이, 그러한 감소에 대한 시간-상수에 의해 초기 감소를 정규화함으로써, 14FM1000은 가장 짧은 시간에 가장 많이 표면 장력을 감소시켰다. 따라서, 14FM1000은 표면에 먼저 도달하는 속도가 비교적 훨씬 더 빠르다.

흥미롭게도, 두 번째 붕괴로 인한 표면 장력 감소의 양을 보면 반대 경향이 발생한다: (14FM1000과 비교하여) 더 짧은 테일 및 더 긴 테일 둘 모두는 두 번째 붕괴 동안 표면 장력을 가장 많이 감소시켰다(도 3d 참조). 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 잠재적으로 이러한 경향은 평형에 도달하기 위해 더 많은 형태적 변화가 필요한 더 긴 테일 길이 및 더 짧은 테일 길이 때문일 수 있다. 더 긴 테일의 경우, 소수성 테일은 그의 대부분이 평형 배향으로 흡착될 수 있도록 재배열되어야 한다. 연구된 모든 계면활성제에 대해, 잠재적으로 친수성 헤드는 PEO(폴리에틸렌 옥시드), PPO(폴리프로필렌 옥시드) 또는 페닐알라닌 영역 중 어느 하나를 통해 흡착되어 표면 장력을 크게 감소시킬 수 있다. 테일 자체는 소수성이 아니기 때문에, 이러한 친수성 헤드 흡착은 더 짧은 테일에 대해 더 두드러질 수 있다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 14FM1000의 빠른 흡착은 소수성 테일이 충분히 짧아서 크게 재배열할 필요가 없기 때문일 수 있지만, 이것은 또한 PEO, PPO 또는 페닐알라닌이 평형 상태에서 크게 흡착되지 않기에 충분히 또한 소수성이다. 이는 재배열로 인한 매우 최소한의 표면 장력 감소를 초래한다. 두 번째 붕괴(

)에 대해 특징적인 시간은 소수성 테일 길이가 증가함에 따라 감소한다(도 3e 참조). 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 이는 더 소수성인 테일이 재배열되고 그의 (높은) 에너지를 최소화하도록 하는 더 강한 열역학적 동인 때문이다. 두 번째 붕괴에 대한 특성 시간에서의 추세는 덜 소수성인 (더 작은) 테일에 아마도 더 중요한 중합체성 친수성 헤드 재배열에 의해 추가로 영향을 받을 수 있다. 중합체성 친수성 헤드는 고분자량으로 인해 테일에 비해 형태를 변화시키는 데 상당히 더 오래 걸리기 때문에, 재배열을 위한 이러한 시간은 tau 2의 경향에 영향을 미칠 수 있다. 도 3은 14FM1000이 표면 장력의 빠르고 큰 초기 감소를 모두 갖는 이상적인 소수성 테일 길이를 가짐을 보여준다.

14FM1000이 흡착하는 양과 속도는 표면 흡착에 대해 그의 능력이 IgG를 능가하도록 촉진하여 궁극적으로 IgG 응집을 방지하는 것으로 여겨진다. 더욱이, 조합된 DST 및 응집 데이터는 (14FM1000과 비교하여) 더 긴 테일 및 더 짧은 테일이 표면에 더 느리게 흡착되기 때문에 IgG 응집을 덜 방지하여 IgG가 소수성 표면에 흡착 및 응집되는 시간을 허용함을 나타낸다. 이러한 신속한 흡착 동역학은 단백질 응집 방지에서 14FM1000이 폴리소르베이트 20 및 80을 능가하는 이유라고 또한 여겨진다. 또한, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제가 IgG를 대체할 수 있다 하더라도, 표면에 더 빨리 도달하여 이를 수행할 수 있다면, 계면활성제는 더 많은 단백질을 대체하여 더 많은 응집을 방지할 수 있다고 여겨진다. 흥미롭게도, 8FM1000은 약 5초 후에 측정된 모든 시간에 대해 IgG보다 더 높은 표면 장력 값을 갖는 유일한 계면활성제이다(도 3a 참조). 이는 8FM1000이 표면을 IgG만큼 빠르게 또는 그만큼 잘 코팅하지 않는다는 것을 나타내며, 이는 8FM1000이 연구된 농도에서 IgG 응집을 잘 방지하지 못하는 이유를 나타낼 수 있다.

소산 연구를 이용한 석영 결정 미세저울

모든 샘플은 0.9 중량% 염수 용액(1000 mL MilliQ 수 중의 9 g NaCl) 중에서 제조되었다. 계면활성제는 각각 8FM1000, 10FM1000, 12FM1000, 14FM1000, 16FM1000 및 18FM1000이었고, 단백질은 IgG였다. 샘플 용액은 염수 중 0.05 mg/mL 계면활성제 단독을 갖거나, 염수 중 1 mg/mL IgG 단독을 갖거나, 또는 염수 중 0.05 mg/mL 계면활성제와 1 mg/mL IgG의 조합을 갖도록 제조되었다.

SiO₂-코팅된 석영 결정(모델 QSX 303)을 사용하는 QSense Analyzer(스웨덴 고텐베르크 소재의 Biolin Scientific)에서 소산을 이용한 석영 결정 미세저울(QCM-D) 측정을 수행하였다. 평형 상태에 도달할 때까지 150 μL/분의 속도로 석영 결정 위로 샘플 용액을 유동시켜 흡착된 물질의 양을 결정하였다. 다음으로, 평형 상태에 도달할 때까지 150 μL/분의 속도로 석영 결정 위로 0.9 중량% 염수의 용액을 유동시켜, 결정에 흡착된 후 얼마나 많은 계면활성제 및/또는 단백질을 헹구어 제거할 수 있는지 결정하였다. 제3 고조파 주파수 변화를 모니터링하여 흡착된 질량이 주파수 변화에 비례한다고 가정하는 Sauerbrey 관계에 따라 흡착된 상대 질량을 결정하였다. 계면활성제 단독 또는 계면활성제와 IgG 용액이 시작된 후 처음 10 내지 40분을 평균하여 흡착된 상대 질량을 결정하였다. 염수 헹굼 전에 흡착된 상대 질량을 취하여 40분의 염수 헹굼에 걸쳐 평균된 흡착된 질량의 변화와 비교함으로써, 헹구어 제거된 퍼센트를 결정하였다. 추가로, 각각의 계면활성제에 대해 IgG를 사용한 경우 및 사용하지 않은 경우 10분 내지 40분에 걸쳐 흡착된 평균 질량 사이의 차이를 취하여, 흡착된 IgG 퍼센트(도 4c)를 계산하였다. 모든 데이터는 IgG 단독 샘플에 대해 흡착된 평균 질량에 대해 정규화되었다(100 임의 단위).

QCM-D를 사용하여 실리콘-코팅된 석영 결정의 공진 주파수 변화를 모니터링함으로써 고체 소수성 표면에 흡착된 IgG 및 계면활성제 질량을 밝혀내었다. 흡착이 가역적인지 또는 비가역적인지를 이해하기 위해 헹굼-제거 연구를 추가로 사용하여, 계면활성제 및 IgG가 표면과 상호 작용하는 방식을 밝힐 수 있다. 0.05 mg/mL 계면활성제 단독의 샘플 용액을 결정 표면 위로 유동시키고, 시간 경과에 따른 공진 주파수 변화를 측정하였다. 일반적으로, 계면활성제 테일 길이가 증가함에 따라, 흡착된 계면활성제의 질량이 증가한다(도 4a 참조).

다음으로, 0.9 중량% 염수 용액을 결정 표면 위로 유동시켜 얼마나 많은 계면활성제를 헹구어 제거하고 가역적으로 탈착시킬 수 있는지를 측정하였다. 14FM1000에서 시작하여, 테일이 더 길수록, 헹구어 제거할 수 있는 계면활성제가 더 적은 것으로 밝혀졌다(도 4b 참조). 8FM1000에서 14FM1000까지, 테일이 더 길수록, 더 많은 백분율의 계면활성제를 헹구어 제거할 수 있다(도 4b 참조). (14FM1000과 비교하여) 더 짧은 테일 및 더 긴 테일을 갖는 계면활성제에 대한 표면 상의 계면활성제 재배열로 인해 이러한 계면활성제는 더 비가역적으로 흡착되는 것으로 여겨진다. 이는 DST 측정 결과와 일치한다. 또한 IgG는 최소한의 가역 흡착을 갖는 것으로 밝혀졌다. 도 4a 및 도 4b는 계면활성제 단독 샘플 및 IgG 단독 샘플의 QCM-D 측정치이다.

IgG 및 계면활성제를 모두 함유하는 샘플 용액을 결정 표면 위로 유동시켰다. 계면활성제 단독 샘플을 위로 유동시킬 때에 비해 흡착된 질량이 증가하는 것은 흡착된 IgG 때문인 것으로 여겨진다. 도 4c에 도시된 바와 같이, 일반적으로 계면활성제의 테일이 더 길수록, 더 적은 IgG가 흡착되었지만, 16FM1000 및 18FM1000의 경우에는, 아마도 DST에서 나타나는 바와 같이 더 느린 흡착 동역학으로 인해, 흡착된 IgG가 다소 더 많아서 초기에 IgG가 16FM1000 및 18FM1000을 능가할 수 있었다. 도 4c의 흡착된 IgG의 상대적인 양은 먼저 계면활성제와 IgG 둘 모두를 함유하는 상응하는 샘플에 대한 흡착된 질량에서 계면활성제 단독 샘플에 대한 흡착된 질량을 감산하고, 이어서 감산된 결과를 IgG 단독 샘플에 대한 흡착된 질량으로 나누어서 계산하였다(즉, 감산된 결과를 IgG 단독 샘플에 대한 흡착된 질량에 대해 정규화하였다(100 임의 단위)). 이 데이터는, 14FM1000이 빠르게 흡착되고 IgG 흡착을 방지하고/하거나, 이미 흡착된 모든 IgG를 비가역적으로 흡착되기 전에 대체하기 위한 최적의 테일 길이를 갖는다는 DST의 결론과 일치한다. 게다가, IgG 및 계면활성제를 함께 헹구어 제거하였을 때, 더 긴 테일 길이를 갖는 계면활성제 또는 IgG(더 짧은 테일 길이를 갖는 계면활성제를 사용할 때)의 비가역적 흡착으로 인해 더 긴 테일 길이 및 더 짧은 테일 길이와 비교하여 14FM1000 계면활성제에 대한 최대 가역 흡착이 마찬가지로 관찰되었다(도 4d 참조).

진탕 연구와 DST 및 QCM-D 실험은 소수성 테일 길이가 계면활성제의 흡착 속도, 양, 및 가역성에 영향을 미친다는 것을 입증하며, 이는 각각의 계면활성제가 IgG 흡착 및 후속 응집을 방지하는 능력에 영향을 미치는 것으로 여겨진다 (도 5 참조). 계면활성제의 초기 흡착의 경우, 8FM1000과 같은 짧은 테일은 표면에 대해 최소 구동력을 가지므로 거의 흡착되지 않는다. 추가로, 18FM1000과 같은 더 긴 테일은 첫 번째 붕괴 동안 흡착 속도가 느리므로 IgG도 흡착된다. 14FM1000 또는 다른 중간-길이 테일은 빠르고 강한 계면활성제 흡착을 갖는다(도 5a 참조). 중간-길이 테일 계면활성제 14FM1000은 재배열 없이 빠르게 흡착되고 표면 장력을 상당히 떨어뜨리는 능력으로 인해 표면에 대한 흡착에서 IgG를 능가할 수 있다. 더 짧은 테일의 계면활성제(예를 들어, 8FM1000)는 표면 장력을 낮추기 위해 형태적 재배열이 필요하기 때문에 강력하게 흡착되지 않는다. 따라서, IgG는 이들을 능가할 수 있으며 표면에서 응집되기 시작한다. 대조적으로, 18FM1000 및 다른 더 긴 테일의 것은 표면으로의 높은 추진력을 갖고 IgG를 능가할 수 있지만 일부 IgG는 충분한 18FM1000이 도착하기 전에 이미 응집되어 있었다(도 5b 참조). 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 8FM1000의 소수성 테일은 충분히 소수성이 아니므로, 페닐알라닌, PPO, 또는 PEO 단위와 같은 계면활성제의 다른 부분이 흡착할 가능성이 있는 것으로 여겨진다. 추가로, 18FM1000의 소수성 테일은 형태를 변화시킬 수 있으므로 긴 테일은 표면에서 효과적으로 조립될 것이다. 이는 표면 가역성에 영향을 미치는 평형 흡착을 초래한다(도 5C 참조). 마지막으로, QCM-D에서 염수 헹굼에 의해 나타난 바와 같이, 14FM1000은 더 가역적으로 흡착된다(도 5d 참조). 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 이것은, 14FM1000이 표면에 더 많이 달라붙게 만들 수 있는 형태적 변화가 적음을 나타내는, 두 번째 붕괴에서의 표면 장력의 작은 감소와 관련이 있는 것으로 여겨진다. 다른 한편, 8FM1000 및 18FM1000과 같은 계면활성제 및 IgG는 안정화를 시도하며 더 비가역적으로 흡착된다. 또한, 염수 헹굼은 수송 중과 같이 임의의 움직임 또는 흔들림 동안 표면적의 변화를 시뮬레이션하며, 이는 형성된 새로운 표면에서 IgG가 응집되는 것을 방지하고 다른 일시적 표면에 달라붙지 않도록 하는 데 14FM1000이 가장 적합할 것임을 나타낸다.

14FM1000은 표면에 눈에 띄게 빠르게 흡착함으로써 IgG 흡착 및 그에 따른 응집을 방지할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 14FM1000은 연구된 다른 계면활성제에 비해 초기 흡착 속도가 가장 빠르다. 짧은 테일의 계면활성제는 표면에 느리게 흡착되며 눈에 띄게 흡착되지 않아 IgG 흡착을 허용한다. 긴 테일의 계면활성제는 또한 느리게 흡착되므로 IgG가 흡착 및 응집될 수 있지만, 그의 평형 흡착은 강하다. 추가로, 14FM1000은, 일시적 표면에 빠르게 탈착 및 흡착하는 능력을 개선할 가능성이 있으므로 각각의 새로운 소수성 표면에서 IgG를 보호하고 응집을 방지하는, 가장 가역적으로 흡착된 계면활성제이다. 계면활성제와 단백질 안정화 사이의 구조-활성 관계를 이해하면 단백질 치료제의 안정성과 유용성이 증가된 계면활성제를 설계하는 데 도움이 된다.

접촉각 측정

다양한 중합체 표면에서 폴리소르베이트 80(PS80) 및 폴리소르베이트 20(PS20)과 비교하여 10FM1000, 14FM1000(FM1000) 및 18FM1000의 단백질 방오 활성을 조사하기 위해 접촉각 측정을 수행하였다. 생물공정에서, 생물제제는 흡착할 수 있는 다수의 중합체 표면(튜브, 필터, 보관 용기 등)에 노출된다. 이는 가치 있는 재료의 손실, 생물제제 응집의 위험성 증가뿐만 아니라, 치료제의 구조 섭동 및 기능 섭동을 초래할 수 있다. 계면활성제는 계면에서 빠른 동역학을 통해 표면 오염을 방지할 수 있다. (문헌[Wang W. Protein aggregation and its inhibition in biopharmaceutics, Int J Pharm 2005 Jan. 31; 289(1-2): 1-30]).

접촉각 측정에서, 물방울과 그 아래 표면 사이의 각도를 측정함으로써 표면의 친수성을 평가하였다. 각도가 클수록 표면이 더 소수성임을 나타내는 반면, 각도가 작을수록 친수성 표면에 대한 물의 친화력을 나타낸다. 다양한 생물공정 재료를 나타내기 위해 선택된 다양한 표면을, 면역글로불린 G(IgG)를 함유하는 염수 용액, 염수, 또는 염수 중 계면활성제와 IgG의 혼합물 중에 담갔다. 여기에 사용된 염수는 0.9 중량% 염수 용액(1000 mL MilliQ 수 중의 9 g NaCl)이다. 표면들은 염수 대조군과 더 큰 접촉각을 갖는 경향이 있었지만(그들의 고유한 거동에 가까움), 표면들을 (염수 중) IgG 단독에 담그는 것은 친수성 코팅을 생성하였고 이는 측정되는 접촉각을 감소시켰다. 상이한 농도의 계면활성제(0.001 내지 0.1 mg/mL)를 함유하는 염수 용액을 사용하여 얻은 접촉각 값은 염수의 접촉각 값과 IgG 대조군의 접촉각 값 사이에 있었다. 염수 대조군에 더 가까운 값은 단백질 오염을 방지하는 계면활성제 능력을 나타낸 반면, IgG 대조군에 더 가까운 값은 표면의 단백질 흡착이 방지되지 않았음을 나타내었다. 중간 계면활성제 농도에서 부분적인 단백질 오염이 관찰될 수 있었다. 14FM1000 활성을 더 짧은 소수성 테일 또는 더 긴 소수성 테일을 갖는 유도체(10FM1000 및 18FM1000)뿐만 아니라 폴리소르베이트와 비교하였다.

모든 계면활성제 용액은 염수 중에서 제조되었다. 20 내지 40 mg의 계면활성제를 10 내지 20 mL의 염수 중에 용해시켜 2 mg/mL의 스톡 용액을 제조하였다. 계면활성제가 완전히 용해될 때까지 모두 60℃에서 교반하였다. 이어서 용액을 추가 사용 전에 실온으로 되돌렸다. IgG 스톡 용액을 또한 보통 40 mg/mL(150 내지 225 mL 염수 중의 6 내지 9 g)로 제조하고 격렬하게 교반하여 단백질을 용해시켰다. 모든 IgG 용액을 최종 제형으로 희석하기 전에 0.2 μm 폴리에테르술폰 필터(PES, ThermoFisher)를 사용하여 여과하였다.

IgG 대조군, 염수 대조군, 및 IgG (20 mg/mL)와 계면활성제(0.001 내지 0.1 mg/mL 범위의 계면활성제 농도)를 함유하는 다양한 염수 용액을 15 mL의 총 부피로 바이알에서 제조하였다. 모든 최종 용액은 염수 중에서 제조되었다. 상이한 표면의 조각을 실온에서 24시간 동안 용액에 침지한 후에 질소로 건조시켰다. Ossila 기기에서 카메라와 밝은 배경 사이에 놓인 표면에 물방울(3 μL x 4 내지 6 방울)을 분배하여 접촉각 측정을 수행하였다. Ossila 소프트웨어(v.1.1.02)를 사용하여 세실 드롭(sessile drop)의 이미지를 캡처하였다. 평균 접촉각을 추출하기 위한 분석을 또한 Ossila 소프트웨어(v.3.0.6)를 사용하여 수행하였다. 각 표면에 대해 JMP 소프트웨어(v.15)를 사용하여 4 내지 6개의 액적을 평균하였다. 결과가 표 1 내지 표 4에 나타나 있다.

[표 1] 0.1 mg/mL의 계면활성제 농도를 사용한 접촉각 결과

[표 2] 0.05 mg/mL의 계면활성제 농도를 사용한 접촉각 결과

[표 3] 0.02 mg/mL의 계면활성제 농도를 사용한 접촉각 결과

[표 4] 0.001 mg/mL의 계면활성제 농도를 사용한 접촉각 결과

표 1 내지 표 4에 대한 비고: (1) 염수 대조군 이외의 모든 용액은 20 mg/mL IgG를 함유하였다. (2) 염수 대조군은 IgG 및 계면활성제가 없는 0.9% 염수였다. (3) IgG 대조군은 계면활성제가 없는 0.9% 염수 중 20 mg/mL IgG였다. (4) PVC는 폴리비닐 클로라이드이다. (5) PES, PE, PVDF, PVC, 실리콘 및 PTFE는 표면의 중합체성 재료를 나타낸다.

필터 및 크로마토그래피 컬럼에 대한 표면 손실 측정

하류 처리에서, 생물학적 치료제는 다수의 정제 단계를 거친다. 이들은 다수의 크로마토그래피 컬럼 및 필터로 이루어지며, 여기서 증가된 상호작용은 단백질 흡착 또는 응집으로 이어질 수 있다(문헌[Li et al., Protein Instability at Interfaces During Drug Product Development - Fundamental Understanding, Evaluation, and Mitigation. AAPS series, Springer 2021. ISSN 2210-7371]). 폴리소르베이트와 같은 계면활성제는 이들 단백질을 안정화하는 데 도움이 될 수 있지만 보통 표면에 흡착될 수 있기 때문에 처리 후에 제형에 첨가된다(문헌[Zhou et al., Non-specific binding and saturation of Polysorbate-20 with aseptic filter membranes for drug substance and drug product during mAb production. Journal of Membrane Science 2008, 325 (2), 735-741]; 문헌[Mahler et al., Adsorption Behavior of a Surfactant and a Monoclonal Antibody to Sterilizing-Grade Filters. Journal of Pharmaceutical Sciences 2010, 99 (6), 2620-2627]). 이 문제에 대해 제안된 해결책은 필터 막을 계면활성제로 사전-포화시키는 것으로 이루어진다. 그러나, 필터 내의 유지된 부피의 완충제로 인해 단백질 생성물이 희석될 수 있기 때문에 이것이 항상 실현 가능한 것은 아니다. 따라서 이러한 예방 조치는 가치 있는 생성물의 손실 및 더 낮은 수율을 초래하는 생성물의 희석을 막도록, 계면활성제와 생성물 둘 모두를 함유하는 용액으로 플러싱하는 것을 필요로 할 수 있다(문헌[Mahler et al., Adsorption Behavior of a Surfactant and a Monoclonal Antibody to Sterilizing-Grade Filters. Journal of Pharmaceutical Sciences 2010, 99 (6), 2620-2627]).

따라서, 생물공정에서 계면활성제의 성공적인 구현을 위해, 필터 및 컬럼 재료에 덜 부착되는 분자를 찾는 것이 바람직하다. 또 다른 중요한 요인은 활성이 보존되도록 보장하기 위해 계면활성제가 정제 표면을 만난 후 계면활성제의 무결성을 검사하는 것이다. 여기서는, 널리 사용되는 필터(PVDF, PES) 및 컬럼(술포프로필-작용화된 가교결합된 아가로스, 단백질 A 및 4차 암모늄-작용화된 가교결합된 아가로스)을 통해 계면활성제 용액을 플러싱하였고, 액체 크로마토그래피를 사용하여 여과액 및 용출액을 검사하였다. 14FM1000 및 더 짧은 테일을 갖는 그의 유도체와 더 긴 테일을 갖는 그의 유도체의 용리를 폴리소르베이트 80(PS80)의 용리와 비교하였다. 폴리소르베이트 80의 크로마토그램의 조사 결과는 처음에는 부분적으로 회수된 후에 일관되지 않게 완전히 회수됨을 나타내었다.

표면 손실 연구에서는, 제조된 스톡 원액을 물에 1 mg/mL로 희석하여 milliQ 수 중의 0.03 mg/mL(30 ppm)로 계면활성제 용액을 제조하였다. 주사기(Becton Dickinson, BD Luer-Lok™ 3 mL 또는 10 mL)를 사용하여 필터 또는 크로마토그래피 컬럼을 통해 용액을 유동시켰다. 주사기 표면이 계면활성제를 유지할 수 있는 것으로 관찰되었기 때문에, 모두를 0.03 mg/mL 계면활성제 용액을 사용하여 3x 주사기 부피로 사전 세척하였다. 주사기를 세척하고 새로운 계면활성제 용액으로 채운 후, 약 100 내지 200 mg의 용액을 저-부피 삽입물(Thermo Scientific)이 담긴 바이알(12 x 32 mm, Thermo Scientific)로 전달하였다. 첫 번째 샘플은 항상 어떠한 필터 또는 컬럼에도 통과시키지 않고 주사기로부터 직접 수집하였는데, 후속 여과액을 비교하기 위한 대조군을 제공하였기 때문이다. 필터 연구에서는, 삽입물의 하부로의 용액의 전달을 촉진하는 바늘(BD 21G, 0.8 mm x 50 mm)에 시린지를 부착하였다. 대조군을 수집한 후에 바늘을 공기로 퍼징하여 임의의 남아 있는 용액을 비우고, 필터 출구에 부착하였다. 용액 중량의 정확한 결정을 위해 약 100 내지 200 mg의 간격으로 여과액을 사전 및 사후 칭량 바이알에 또한 수집하였다. 컬럼 실험에서, 컬럼을 약 15 컬럼 부피의 물로 사전 세척하여 저장 용액을 제거하고 컨디셔닝하였다. 이어서 이것을 계면활성제의 0.03 mg/mL 용액이 담긴 사전 세척된 주사기(필터와 마찬가지로 계면활성제 용액으로 헹굼)에 부착하고, 1 mL/분의 권장 속도로 용액을 전달하도록 설정된 수직으로 배치된 주사기 펌프(Kd Scientific)를 사용하여 용리를 수행하였다. 필터 연구와 유사한 간격으로 샘플 수집을 수행하였으며, 용액 중량이 정확하게 결정되었다.

Chromeleon 소프트웨어(v 7.3, Thermo Scientific)에 의해 제어되는 하전 에어로졸 검출기(CAD)가 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템(Vanquish, Thermo Scientific)에서 계면활성제 정량화를 수행하였다. 20℃로 설정된 오토샘플러 챔버에 모든 샘플을 로딩하였다. 아세토니트릴(J.T. Baker) 및 pH 5로 고정된 물 중 10 mM 암모늄 아세테이트(LC-MS 등급, Sigma Aldrich)를 함유하는 이동상과 함께 Acclaim™ 계면활성제 컬럼(Thermo Scientific, 3 x 150 mm, 입자 크기 3 μm)을 분리에 사용하였다. 용리는 0.6 mL/분으로 설정되었으며 90%의 수성 이동상에서 시작한 다음 95% 아세토니트릴까지 증가시켰고 두 용액 사이의 전이는 2분에 걸쳐 일어났다. 계면활성제 용리는 고도로 유기성인 이동상의 존재 하에 일어났다. 0.06 mg/mL 내지 0.0005 mg/mL 범위의 농도로 스톡 용액으로부터 제조된 계면활성제 보정 곡선을 또한 동일한 방법으로 측정하고 여과액 분취량에서 계면활성제를 정량화하는 데 사용하였다. 모든 샘플 크로마토그램에서 MilliQ 수 신호를 감산하였다. 모든 분석을 Chromeleon 소프트웨어에서 수행하였으며, 그 후에 Excel 및 JMP v.15로 계산하였다. 결과가 도 6 내지 도 9에 나타나 있다.

도 6은 PVDF 필터를 통과할 때 계면활성제 손실을 나타낸다. FM1000 피크는 크게 변하지 않았지만, PS80은 4개의 피크로 나타났으며, 그 중 가장 오른쪽에 있는 2개의 피크는 필터를 통과한 직후에 나타났고 왼쪽 두 개의 피크는 여과를 통해 변하였다(도 6b 참조). 이는 PS80 조성의 일부 성분(가장 오른쪽에 있는 2개의 피크로 나타남)은 PVDF 필터에 흡착되지 않는 반면, PS80 조성의 다른 성분(가장 왼쪽에 있는 2개의 피크로 나타남)은 PVDF 필터에 흡착되어 손실됨을 입증하였다. 따라서, 여과 동안 PS80 조성 및 특성이 변한다. 이에 비해, FM1000은 균일한 피크로서 PVDF 필터를 통과하였다(도 6a 참조). 이는 여과 동안 FM1000 조성 및 특성이 변하지 않음을 입증하였다.

도 7은 PES 필터를 통과할 때 계면활성제 손실을 나타낸다. FM1000 피크는 크게 변하지 않았지만, PS80은 4개의 피크로 나타났으며, 그 중 가장 오른쪽에 있는 2개의 피크는 필터를 통과한 직후에 나타났고 왼쪽 두 개의 피크는 여과를 통해 변하였다(도 7b 참조). 이는 PS80 조성의 일부 성분(가장 오른쪽에 있는 2개의 피크로 나타남)은 PES 필터에 흡착되지 않는 반면, PS80 조성의 다른 성분(가장 왼쪽에 있는 2개의 피크로 나타남)은 PES 필터에 흡착되어 손실됨을 입증하였다. 따라서, 여과 동안 PS80 조성 및 특성이 변한다. 이에 비해, FM1000은 균일한 피크로서 PES 필터를 통과하였다(도 7a 참조). 이는 여과 동안 FM1000 조성 및 특성이 변하지 않음을 입증하였다.

도 8은 술포프로필-작용화된 가교결합된 아가로스 (SP HP) 크로마토그래피 컬럼을 통과할 때 계면활성제 손실을 나타낸다. FM1000 피크는 크게 변하지 않았지만, PS80은 4개의 피크로 나타났으며, 그 중 가장 오른쪽에 있는 두 개의 피크는 왼쪽 두 개의 피크보다 컬럼을 통과한 후 훨씬 더 빨리 나타났다(도 8b 참조). 이는 PS80 조성의 일부 성분(가장 오른쪽에 있는 2개의 피크로 나타남)은 술포프로필-작용화된 가교결합된 아가로스 컬럼에 흡착되지 않는 반면, PS80 조성의 다른 성분(가장 왼쪽에 있는 2개의 피크로 나타남)은 술포프로필-작용화된 가교결합된 아가로스 컬럼에 흡착되어 손실됨을 입증하였다. 따라서, 크로마토그래피 동안 PS80 조성 및 특성이 변한다. 이에 비해, FM1000은 균일한 피크로서 술포프로필-작용화된 가교결합된 아가로스 컬럼을 통과하였다(도 8a 참조). 이는 크로마토그래피 동안 FM1000 조성 및 특성이 변하지 않음을 입증하였다.

도 9는 단백질 A 크로마토그래피 컬럼을 통과할 때 계면활성제 손실을 나타낸다. FM1000 피크는 크게 변하지 않았지만, PS80은 4개의 피크로 나타났으며, 그 중 가장 오른쪽에 있는 두 개의 피크는 왼쪽 두 개의 피크보다 컬럼을 통과한 후 훨씬 더 빨리 나타났다(도 9b 참조). 이는 PS80 조성의 일부 성분(가장 오른쪽에 있는 2개의 피크로 나타남)은 단백질 A 컬럼에 흡착되지 않는 반면, PS80 조성의 다른 성분(가장 왼쪽에 있는 2개의 피크로 나타남)은 단백질 A 컬럼에 흡착되어 손실됨을 입증하였다. 따라서, 크로마토그래피 동안 PS80 조성 및 특성이 변한다. 이에 비해, FM1000은 균일한 피크로서 단백질 A 컬럼을 통과하였다(도 9a 참조). 이는 크로마토그래피 동안 FM1000 조성 및 특성이 변하지 않음을 입증하였다.

도 10은 4차 암모늄-작용화된 가교결합된 아가로스(Q HP) 크로마토그래피 컬럼을 통과할 때 계면활성제 손실을 나타낸다. FM1000 피크는 크게 변하지 않았지만, PS80은 4개의 피크로 나타났으며, 그 중 가장 오른쪽에 있는 두 개의 피크는 왼쪽 두 개의 피크보다 컬럼을 통과한 후 훨씬 더 빨리 나타났다(도 10b 참조). 이는 PS80 조성의 일부 성분(가장 오른쪽에 있는 2개의 피크로 나타남)은 4차 암모늄-작용화된 가교결합된 아가로스 컬럼에 흡착되지 않는 반면, PS80 조성의 다른 성분(가장 왼쪽에 있는 2개의 피크로 나타남)은 4차 암모늄-작용화된 가교결합된 아가로스 컬럼에 흡착되어 손실됨을 입증하였다. 따라서, 크로마토그래피 동안 PS80 조성 및 특성이 변한다. 이에 비해, FM1000은 균일한 피크로서 4차 암모늄-작용화된 가교결합된 아가로스 컬럼을 통과하였다(도 10a 참조). 이는 크로마토그래피 동안 FM1000 조성 및 특성이 변하지 않음을 입증하였다.

계면활성제 양의 90 중량%에 도달하기 위해 얼마나 많은 부피의 계면활성제 용액이 필요한지 알아내기 위해 분석을 수행하였다. 다시 말해, 여과액/용출액에 함유된 계면활성제의 누적량을 분석 및 계산하여 (여과액/용출액에 함유된) 계면활성제의 누적량이 필터/컬럼에 공급된 (계면활성제 용액에 함유된) 계면활성제의 총량의 90 중량%에 도달하는 지점(여과액/용출액 부피)을 알아내었다. 결과를 표 5에 요약하였다.

표 5에서, 맨 위의 행은 계면활성제의 종류를 나타내고 왼쪽 열은 필터 또는 크로마토그래피 컬럼의 종류를 나타낸다. 표에서 양은 여과액/용출액에서 계면활성제 회수율의 90 ± 1 중량%에 도달하는 데 필요한 여과액/용출액의 부피(mL)를 나타낸다. 부피가 클수록, 여과액/용출액에서 계면활성제를 회수하는 데 더 오래 걸린다. 표 5에서, 부피 값은 여과액/용출액 분취량 중 각 성분의 HPLC-CAD 피크를 적분한 다음, 이를 여과하지 않았거나 컬럼에 통과시키지 않은 샘플의 양(100%로 간주됨)으로 나누어 구하였다. 각 실행에서 90 중량% 임계값에 도달한 첫 번째 분취량에 대한 부피 값을 기록하였다.

[표 5]

전반적인 설명 또는 실시예에서 전술한 모든 행위가 요구되는 것은 아니며, 특정 행위의 일부가 요구되지 않을 수 있고, 기재된 것 이외에 하나 이상의 추가 행위가 수행될 수 있음에 유의한다. 또한, 행위의 나열 순서가 반드시 행위의 수행 순서는 아니다.

전술한 명세서에서, 특정 실시 형태를 참조하여 개념을 설명하였다. 그러나, 당업자는 하기 청구범위에 기술된 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해한다. 따라서, 본 명세서는 제한적인 의미라기보다는 예시적인 의미로 간주되어야 하고, 그러한 모든 수정은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

이득, 다른 이점, 및 문제 해결책을 특정 실시 형태와 관련하여 상기에 기술하였다. 그러나, 이득, 이점, 문제 해결책, 그리고 임의의 이득, 이점, 또는 해결책을 발생시키거나 더 명확하게 할 수 있는 임의의 특징(들)은, 임의의 또는 모든 청구범위의 중요하거나 필수적이거나 본질적인 특징인 것으로 해석되어서는 안 된다.

명확성을 위해 개별적인 실시 형태의 맥락에서 본원에 기재된 특정 특징들이 또한 단일 실시 형태에서 조합으로 제공될 수 있음을 이해해야 한다. 반대로, 간결성을 위해 단일 실시 형태의 맥락에서 기재된 다양한 특징들이 또한 개별적으로 또는 임의의 하위 조합으로 제공될 수 있다.

Claims (15)

1. (a) 단백질 및 하기 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제를 포함하는 수용액을 제공하는 단계:
   [화학식 I]
   

   

   
   (여기서, R¹-C(=O)는 지방 아실 기이고, R²는 H 또는 치환 또는 비치환된 히드로카르빌 기이고, X¹은 O 또는 NH이고, X²는 O 또는 NH이고, n은 0 또는 1 내지 5의 정수이고, R³은 하기 화학식 II 및 III의 중합 단위를 포함하는 중합체성 기임:
   [화학식 II]
   

   

   
   [화학식 III]
   

   

   )
   (b) 수용액을 생물공정에 적용하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 12FM1000, FM1000, 16FM1000, 18FM1000, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
3. 제1항에 있어서, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 FM1000인, 방법.
4. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 수용액을 여과하는 것을 포함하는, 방법.
5. 제4항에 있어서, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 FM1000, 16FM1000, 18FM1000, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
6. 제4항에 있어서, 필터는 PVDF 필터, PES 필터, 폴리프로필렌 필터, 셀룰로오스 필터, 나일론 필터, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
7. 제6항에 있어서, 필터는 PVDF 필터 또는 PES 필터인, 방법.
8. 제4항에 있어서, 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 조성은 필터를 통과할 때 실질적으로 동일하게 유지되는, 방법.
9. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 수용액을 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 것을 포함하는, 방법.
10. 제9항에 있어서, 크로마토그래피 수지는 술포프로필-작용화된 가교결합된 아가로스, 단백질 A, 4차 암모늄-작용화된 가교결합된 아가로스, 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
11. 제10항에 있어서, 크로마토그래피 수지는 술포프로필-작용화된 가교결합된 아가로스, 단백질 A, 또는 4차 암모늄-작용화된 가교결합된 아가로스인, 방법.
12. 제9항에 있어서, 수용액 중 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제의 조성은 크로마토그래피 컬럼을 통과할 때 실질적으로 동일하게 유지되는, 방법.
13. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 수용액을 수송하는 것을 포함하는, 방법.
14. 제13항에 있어서, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 12FM1000, FM1000, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
15. 제14항에 있어서, 화학식 I의 폴리알콕시 지방 아실 계면활성제는 FM1000인, 방법.

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