CN116348475A - 表面上结垢减少的生物工艺 - Google Patents

表面上结垢减少的生物工艺 Download PDF

Info

Publication number
CN116348475A
CN116348475A CN202180049435.3A CN202180049435A CN116348475A CN 116348475 A CN116348475 A CN 116348475A CN 202180049435 A CN202180049435 A CN 202180049435A CN 116348475 A CN116348475 A CN 116348475A
Authority
CN
China
Prior art keywords
surfactant
protein
aqueous solution
fatty acyl
formula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180049435.3A
Other languages
English (en)
Inventor
J·S·卡茨
S·L·乔丹
H·法雷斯
B·叶泽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nutrition and Biosciences USA 1 LLC
Original Assignee
Nutrition and Biosciences USA 1 LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nutrition and Biosciences USA 1 LLC filed Critical Nutrition and Biosciences USA 1 LLC
Publication of CN116348475A publication Critical patent/CN116348475A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/265—Adsorption chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/06—Organic material
    • B01D71/30—Polyalkenyl halides
    • B01D71/32—Polyalkenyl halides containing fluorine atoms
    • B01D71/34—Polyvinylidene fluoride
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/06—Organic material
    • B01D71/66—Polymers having sulfur in the main chain, with or without nitrogen, oxygen or carbon only
    • B01D71/68—Polysulfones; Polyethersulfones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本公开涉及一种方法，该方法包括：(a)提供蛋白质和具有通式I(I)的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的水溶液，其中R1‑C(＝O)是脂肪酰基，R2是H或取代或未取代的烃基，X1是O或NH，X2是O或NH，n是0或1‑5的整数，R3是包含具有通式II和III(II)(III)的聚合单元的聚合物基团，以及(b)使所述水溶液经受生物工艺。
Figure DDA0004048072670000011

Description

表面上结垢减少的生物工艺
背景
技术领域
本公开涉及一种使用聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂以减少生物工艺中表面结垢的方法。
背景技术
由于其与传统小分子药品相比增强的选择性和减少的副反应，生物制品、衍生自蛋白质的药物或其他生物衍生的大分子作为一类重要的药物迅速出现。由于蛋白质材料相对易碎的性质，开发具有治疗益处且足够稳定以经受住加工、分配和施用的生物活性物质仍然是一项重大挑战。表面活性剂可以用于通过防止蛋白质吸附到界面上或在溶液中形成保护结构来稳定和保护溶液中的蛋白质。然而，表面活性剂通常与生产生物制品的工艺的许多步骤不相容，导致它们直至该工艺的非常后期(例如，最终配制)才被添加。例如，表面活性剂可能通过不可逆地吸附在表面上干扰生物工艺，导致表面结垢、孔/膜/过滤器堵塞，并且降低溶液中的表面活性剂浓度，从而限制其保护溶液中或进一步下游的蛋白质的能力。结垢和阻塞可能额外地导致更长的清洁停工时间，从而降低工艺的生产量和生产率。在一些情况下，生物制品需要接近表面和/或与表面相互作用(例如，色谱柱或过滤器)，该表面不被表面活性剂堵塞。
发明内容
本公开提供了一种方法，其包括：(a)提供包含蛋白质和具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的水溶液
Figure BDA0004048072650000021
其中R1-C(＝O)是脂肪酰基，R2是H或取代或未取代的烃基，X1是O或NH，X2是O或NH，n是0或1-5的整数，R3是包含具有式II和III的聚合单元的聚合物基团，
Figure BDA0004048072650000022
以及(b)使该水溶液经受生物工艺。
附图说明
附图中示出了实施例，以提高对如本文提出的概念的理解。
图1示出了当在室温下摇动24小时时在盐水中在0.03mg/mL表面活性剂和0.05mg/mL表面活性剂下不同表面活性剂尾长的IgG(20mg/mL)的聚集百分比，如通过DLS所测量的。
图2是这样的图表，其示出了在摇动之前在盐水中在0.03mg/mL表面活性剂和0.05mg/mL表面活性剂下不同表面活性剂尾长的IgG(20mg/mL)的聚集百分比，如通过DLS所测量的。
图3A示出了所研究的六种FM1000衍生物以及IgG的代表性DST轨迹。图3B示出了由于第一次衰减导致的表面张力下降相对于总表面张力下降的百分比。图3C示出了第一次衰减期间由第一次衰减的特征时间归一化的表面张力下降。图3D示出了由于第二次衰减导致的表面张力下降。图3E示出了第二次衰减的特征时间。
图4示出了QCM-D数据。图4A示出了所吸附的单独表面活性剂或单独IgG的相对质量。图4B示出了冲洗掉的单独表面活性剂或单独IgG的百分比。图4C示出了所吸附的IgG的相对量，其首先由所吸附的表面活性剂与IgG的质量与所吸附的仅表面活性剂质量的差异计算并然后归一化为单独IgG样品的所吸附的质量(100任意单位)。图4D示出了可以冲洗掉的IgG和表面活性剂组合质量的百分比。
图5描绘了随着尾长增加，IgG和表面活性剂的吸附步骤。在每组图中，最左边的图描绘了短尾长度表面活性剂和IgG，中间的图描绘了中尾长度表面活性剂和IgG，并且最右边的图描绘了长尾长度表面活性剂和IgG。图5A描绘了通过DST阐明的表面活性剂的初始吸附(第一次衰减)。图5B描绘了通过QCM-D阐明的竞争吸附。图5C描绘了通过DST阐明的平衡吸附(第二次衰减)。图5D描绘了通过QCM-D阐明的可逆吸附。
图6示出了通过PVDF过滤器的表面活性剂的回收。图6A和6B示出了在过滤期间在不同点处取样的FM1000和PS80色谱图的实例。图右侧的重量(按mg计)表示滤液的累积重量，并且色谱图表示具有最高达约2000mg的累积重量的滤液等分试样。
图7示出了通过PES过滤器的表面活性剂的回收。图7A和7B示出了在过滤期间在不同点处取样的FM1000和PS80色谱图的实例。图右侧的重量(按mg计)表示滤液的累积重量，并且色谱图表示具有最高达约2000mg的累积重量的滤液等分试样。
图8示出了通过磺丙基官能化的交联琼脂糖(SP HP)柱的表面活性剂的回收。图8A和8B示出了在洗脱期间在不同点处取样的FM1000和PS80色谱图的实例。图右侧的重量(按mg计)表示洗脱液的累积重量，并且色谱图表示具有最高达约3000mg的累积重量的洗脱液等分试样。
图9示出了通过蛋白质A柱的表面活性剂的回收。图9A和9B示出了在洗脱期间在不同点处取样的FM1000和PS80色谱图的实例。图右侧的重量(按mg计)表示洗脱液的累积重量，并且色谱图表示具有最高达约3000mg的累积重量的洗脱液等分试样。
图10示出了通过季铵官能化的交联琼脂糖(Q HP)柱的表面活性剂的回收。图10A和10B示出了在洗脱期间在不同点处取样的FM1000和PS80色谱图的实例。图右侧的重量(按mg计)表示洗脱液的累积重量，并且色谱图表示具有最高达约3000mg的累积重量的洗脱液等分试样。
具体实施方式
前面的一般性描述和以下详细描述仅是示例性的和解释性的，并且不限制如所附权利要求所限定的本发明。从以下详细说明并且从权利要求书中，任何一个或多个实施例的其他特征和益处将是明显的。
如本文所用，术语“包含/包括(comprises)”、“包含/包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”或其任何其他变型均旨在涵盖非排他性的包含。例如，包括要素列表的工艺、方法、制品或设备不一定仅限于那些要素，而是可包括未明确列出的或此种工艺、方法、制品或设备所固有的其他要素。此外，除非有相反的明确说明，否则“或”是指包含性的或，而不是指排他性的或。例如，条件A或者B通过以下中的任一个满足：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，以及A和B均为真(或存在)。
而且，使用“一个/种(a/an)”来描述本文所述的要素和组分。这样做只是为了方便并给出本发明范围的一般意义。此描述应当被解读为包括一个/种或至少一个/种，并且单数形式也包括复数形式，除非很明显其另有所指。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。在冲突的情况下，则以本说明书，包括定义为准。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明实施例的实践或测试中，但在下面描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和实例仅为说明性的并且不旨在是限制性的。
当量、浓度、或者其他值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和/或下限优选值给出时，这应当被理解为特别公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任何配对所形成的所有范围，而不论这些范围是否被单独公开。当本文列举数值范围时，除非另有说明，否则该范围旨在包括其端点、以及范围中的所有整数和分数。例如，当列举“1至10”的范围时，所列举的范围应解释为包括“1至8”、“3至10”、“2至7”、“1.5至6”、“3.4至7.8”、“1至2和7-10”、“2至4和6至9”、“1至3.6和7.2至8.9”、“1-5和10”、“2和8至10”、“1.5-4和8”等范围。
在此说明性描述的本披露内容适当地可以在没有未在此具体披露的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下实践。虽然组合物和方法在本文中描述为“包含”各种组分或步骤，但除非另有说明，否则组合物和方法也可以“基本上由各种组分或步骤组成”或“由各种组分或步骤组成”。
在提出下述实施例的详情之前，定义或阐明一些术语。
术语“表面”和“界面”在本文中可互换地使用。
数均分子量定义为样品的总重量除以样品中分子的数量。
如本文所用，术语“表面活性剂/蛋白质浓度比”意指水溶液中具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的浓度与蛋白质的浓度的比率。在本公开中，将具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的浓度和蛋白质的浓度表示为重量体积比(例如，mg/ml)。
聚烷氧基化合物是含有一个或多个具有结构-(-A-O)m-的基团的化合物，其中m是3或更大，并且A是未取代的烷基。基团A可以是直链、支链、环状或其组合。各种-(-A-O)-基团之中的各种A基团可以彼此相同或不同。
脂肪化合物是含有一个或多个脂肪基团的化合物。脂肪基团是含有8个或更多个碳原子的基团，每个碳原子与该基团中的一个或多个其他碳原子键合。聚烷氧基脂肪化合物是既是聚烷氧基化合物又是脂肪化合物的化合物。
烃基是含有氢原子和碳原子的基团。未取代的烃基仅含有氢原子和碳原子。取代的烃基含有一个或多个取代基，该取代基含有一个或多个除氢和碳以外的原子。
蛋白质是其中聚合单元是氨基酸的聚合单元的聚合物。氨基酸通过肽键键合在一起。蛋白质含有一种或多种氨基酸残基的20个或更多个聚合单元。术语蛋白质包括线性多肽链以及含有多肽链的更复杂的结构。
如果蛋白质的分子以溶解的单个分子的形式分布在整个连续的液体介质中，则认为该蛋白质是呈液体介质中的溶液(或同义地，溶解在液体介质中)。如果连续液体介质含有的水量基于该连续液体介质的重量为60重量％或更多，则认为蛋白质溶解在水中。
如果pH值在4.5与8.5之间，使得当化学基团在该pH值下与水接触时，存在的那些化学基团的50摩尔％或更多呈离子形式，则该化学基团是离子基团。
缓冲液为(i)一种化合物，该化合物具有接受质子以形成该化合物的共轭酸的能力并且该化合物的共轭酸具有小于10的pKa，或(ii)一种化合物，该化合物具有释放质子的能力并且该化合物具有大于4的pKa。
如本文所用，术语“FM1000”意指具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂，其中R1是CH3-(CH2)11-CH2-，n是1，X1和X2均为NH，R2是-CH2(C6H5)，并且R3是被CH3封端的PO和EO单元的共聚物，其具有大约1000的数均分子量以及约3:19的PO与EO比率。FM1000具有14个碳长度疏水尾(CH3-(CH2)11-CH2-C(＝O))。
如本文所用，术语“8FM1000”意指具有8个碳疏水尾的FM1000衍生物，即，8FM1000具有与FM1000相同的化学式，除了R1是CH3-(CH2)5-CH2-。类似地，如本文所用，术语“10FM1000”意指具有10个碳疏水尾的FM1000衍生物，即，10FM1000具有与FM1000相同的化学式，除了R1是CH3-(CH2)7-CH2-；如本文所用，术语“12FM1000”意指具有12个碳疏水尾的FM1000衍生物，即，12FM1000具有与FM1000相同的化学式，除了R1是CH3-(CH2)9-CH2-；如本文所用，术语“16FM1000”意指具有16个碳疏水尾的FM1000衍生物，即，16FM1000具有与FM1000相同的化学式，除了R1是CH3-(CH2)13-CH2-；并且如本文所用，术语“18FM1000”意指具有18个碳疏水尾的FM1000衍生物，即，18FM1000具有与FM1000相同的化学式，除了R1是CH3-(CH2)15-CH2-。
术语“FM1000”和“14FM1000”在本文中可互换地使用。
本公开提供了一种方法，其包括：(a)提供包含蛋白质和具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的水溶液
Figure BDA0004048072650000071
其中R1-C(＝O)是脂肪酰基，R2是H或取代或未取代的烃基，X1是O或NH，X2是O或NH，n是0或1-5的整数，R3是包含具有式II和III的聚合单元的聚合物基团，
Figure BDA0004048072650000072
以及(b)使该水溶液经受生物工艺。
如本文所用，术语“生物工艺”意指蛋白质生物工艺的下游部分，其中来自上游(例如，生物化学生产或合成)的蛋白质被加工以满足纯度和品质要求。生物工艺包括储存、输送和纯化。
在一些实施例中，生物工艺选自由以下组成的组：输送、过滤、色谱法、及其组合。
步骤(a)中提供的水溶液包含溶解在其中(例如溶解在水中)的蛋白质和具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂。在一些实施例中，步骤(a)的水溶液中的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的浓度为基于该水溶液的总体积从0.001mg/ml至1mg/ml、或从0.01mg/ml至0.1mg/ml、或从0.01mg/ml至0.05mg/ml。在一些实施例中，步骤(a)的水溶液中的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的浓度为基于该水溶液的总体积不超过1mg/ml、不超过0.5mg/ml、或不超过0.2mg/ml、或不超过0.1mg/ml、或不超过0.08mg/ml、或不超过0.06mg/ml、或不超过0.05mg/ml。在一些实施例中，步骤(a)的水溶液中的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的浓度为基于该水溶液的总体积至少0.001mg/ml、或至少0.002mg/ml、或至少0.005mg/ml、或至少0.01mg/ml、或至少0.02mg/ml、或至少0.03mg/ml。
在一些实施例中，步骤(a)的水溶液中的蛋白质的浓度为基于该水溶液的总体积从0.0001mg/ml至300mg/ml、或从0.0001mg/ml至200mg/ml、或从0.0001mg/ml至150mg/ml、或从0.001mg/ml至100mg/ml、或从0.01mg/ml至100mg/ml、或从0.1mg/ml至50mg/ml、或从0.1mg/ml至30mg/ml、或从0.1mg/ml至10mg/ml、或从10mg/ml至30mg/ml。在一些实施例中，步骤(a)的水溶液中的蛋白质的浓度为基于该水溶液的总体积不超过300mg/ml、或不超过250mg/ml、或不超过200mg/ml、或不超过150mg/ml、或不超过100mg/ml、或不超过80mg/ml、或不超过50mg/ml、或不超过40mg/ml、或不超过30mg/ml、或不超过20mg/ml、或不超过10mg/ml。在一些实施例中，步骤(a)的水溶液中的蛋白质的浓度为基于该水溶液的总体积至少0.0001mg/ml、或至少0.001mg/ml、或至少0.002mg/ml、或至少0.005mg/ml、或至少0.01mg/ml、或至少0.02mg/ml、或至少0.05mg/ml、或至少0.1mg/ml、或至少0.2mg/ml、或至少0.5mg/ml、或至少1mg/ml、或至少2mg/ml、或至少5mg/ml、或至少10mg/ml。在本公开中，将具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的浓度和蛋白质的浓度表示为重量体积比(例如，mg/ml)。
在具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂中，R1优选为取代或未取代的脂族基团。在取代的脂族基团之中，优选的取代基是羟基。更优选地，R1是未取代的脂族基团；更优选地，R1是未取代的烷基。优选地，R1是具有9-22个碳原子、或9-18个碳原子、或9-16个碳原子、或10-17个碳原子、或11-17个碳原子、或11-15个碳原子、或10-14个碳原子、或11-13个碳原子的直链烷基。在一些实施例中，R1是CH3-(CH2)11-CH2-或CH3-(CH2)9-CH2-。在一些实施例中，R1是CH3-(CH2)11-CH2-。
在一些实施例(当n不是0时)中，X1是NH。在一些实施例中，X2是NH。
在一些实施例中，n是0或者1、2、3、4或5。在一些实施例中，n是0或1。在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，n是0。
在一些实施例中，n不是0，R2具有20个或更少个原子；优选15个或更少个原子。优选地，如果R2不是氢，则R2含有一个或多个碳原子。优选地，R2是氢或未取代的烃基；更优选地，R2是氢、未取代的烷基、或烷基(其唯一取代基是未取代的芳烃基团)。在未取代的烷基之中，优选的是甲基。在烷基(其唯一取代基是未取代的芳烃基团)之中，优选的是-CH2-(C6H5)，其中-(C6H5)是苯环。优选地，R2表示天然存在的氨基酸的侧链。
在一些实施例中，R3具有600-5000道尔顿、优选800-3000道尔顿的数均分子量。优选地，基团R3是(II)和(III)的统计共聚物或者(II)和(III)的嵌段共聚物；更优选地，基团R3是(II)和(III)的统计共聚物。优选地，-R3具有结构-R4-CH3，其中R4是包含结构(II)和结构(III)的聚合单元的聚合物基团。优选地，除了结构(II)和(III)外，R4没有其他聚合单元。
表征结构(II)的单元与结构(III)的单元的摩尔比(在本文中为“PO/EO比”)是有用的。优选地，PO/EO比是0.01:1至2:1；更优选0.05:1至1:1，特别是0.1:1至0.5:1。如本文所用，术语“PO”意指结构(II)单元，并且如本文所用，术语“EO”意指结构(III)单元。
在一些实施例中，R1是CH3-(CH2)11-CH2-，n是0，X2是NH，并且R3是被CH3封端的PO和EO单元的共聚物，其具有大约1000的数均分子量以及约3:19的PO与EO比率。
在一些实施例中，具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂没有离子基团。
在一些实施例中，具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂选自由以下组成的组：12FM1000、FM1000、16FM1000、18FM1000、及其混合物。在一些实施例中，具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂选自由以下组成的组：12FM1000、FM1000、16FM1000、及其混合物。在一些实施例中，具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂选自由以下组成的组：12FM1000、FM1000、及其混合物。在一些实施例中，具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂选自由以下组成的组：FM1000、16FM1000、及其混合物。在一些实施例中，具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂是FM1000。
具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂可以通过WO2017/044366中公开的方法制造，出于所有目的，将该专利通过援引以其全文并入本文。
具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂可以通过任何合适的方法制造。优选的方法是使具有结构NH2-R3的化合物与选自以下项的化合物反应：具有结构V的化合物
Figure BDA0004048072650000111
和具有结构VI的化合物
Figure BDA0004048072650000112
其中X3是O、S、或NH。R1、X2、R2、R3、和n的优选项与上述的那些相同。优选地，X3是O。
更优选的制造具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的一些实施例的方法如下。在第一步骤中，使酰氯与氨基酸反应以形成羧基官能的脂肪酰胺，如下：
Figure BDA0004048072650000113
然后，在第二步骤中，使该羧基官能的脂肪酰胺与胺封端的聚烷氧基化合物反应，如下：
Figure BDA0004048072650000114
其中PO是结构(II)并且EO是结构(III)。
本公开中包括的优选蛋白质选自由以下组成的组：单克隆抗体、生长因子、胰岛素、免疫球蛋白、多克隆抗体、抗体-药品共轭物、双特异性抗体、三特异性抗体、激素、酶、多肽、肽融合物、糖基化蛋白质、抗原、抗原亚单位、及其组合。优选的蛋白质具有治疗疾病或医学病症或充当疫苗的治疗功效。治疗性蛋白质的实例是免疫球蛋白G(IgG)、阿达木单抗、干扰素α、贝伐单抗、人生长激素、利妥昔单抗、人血清白蛋白、胰岛素、促红细胞生成素α、派姆单抗、依那西普、非格司亭、纳武单抗、曲妥单抗、度伐利尤单抗(durvalumab)、白介素-2、英利昔单抗、绒毛膜促性腺激素、阿维单抗(avelumab)、狄诺塞麦、兰尼单抗、阿柏西普、替西木单抗(tremelimumab)、因子viii、干扰素β、易普利姆玛、阿特朱单抗、阿巴西普、托珠单抗、优特克单抗、培非格司亭、苏金单抗、链激酶、西妥昔单抗、奥马珠单抗、雷莫芦单抗、尿激酶、妥珠单抗、度匹鲁单抗(dupilumab)、杰诺单抗(genolimzumab)、阿地白介素、莫拉司亭、聚乙二醇干扰素α-2b、替雷利珠单抗(tislelizumab)、促滤泡素α、格伐克单抗(gevokizumab)、戈利木单抗、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、康纳单抗、福雷芦单抗(foralumab)、伐立鲁单抗、尼妥珠单抗、红细胞生成素β、依伏库单抗、培精氨酸酶(pegargiminase)、贝迈奇单抗(bermekimab)、卡罗妥昔单抗(carotuximab)、达雷木单抗、依库丽单抗、昂妥昔珠单抗(ontuxizumab)、阿达木单抗、卡瑞利珠单抗、恩波妥珠单抗(enoblituzumab)、白介素-12、利瑞鲁单抗(lirilumab)、帕尼单抗、伽妥珠单抗(gatipotuzumab)、瑞莱单抗(relatlimab)、安德利昔单抗(andecaliximab)、贝利木单抗、卡比拉单抗(cabiralizumab)、isactuzumab govitecan、莫那利珠单抗(monalizumab)、胰液素、帕妥珠单抗、特瑞普利单抗、英比利珠单抗、奥法木单抗、派比耐单抗、信迪利单抗、阿利库单抗、米拉组单抗、尼达利单抗、索特西普(sotatercept)、维多珠单抗、维妥珠单抗、贝伐单抗β、伊沙昔单抗(isatuximab)、奥洛他单抗(orlotamab)、蒂索瘤抑菌素(tisotumabvedotin)、贝那利珠单抗、柯希利单抗、艾马珠单抗、加尼妥单抗、纳索利单抗、匹地利珠单抗、沙利鲁单抗、曲妥珠单抗-厄塔毒素偶联物、雷星-阿奈妥单抗、柏替木单抗、博纳吐单抗、古塞尔库姆单抗(guselkumab)、衣克珠单抗、美泊利单抗、奥匹妥珠单抗(obinutuzumab)、乌布妥昔单抗(ublituximab)、阿仑单抗、依米妥珠单抗(emibetuzumab)、非卡妥珠单抗(ficlatuzumab)、伊波妥组单抗(ifabotuzumab)、米吉珠单抗(mirikizumab)、那他珠单抗、雷妥莫单抗、司妥昔单抗、替米妥珠单抗、曲妥珠单抗-deruxtecan、比美吉珠单抗、布罗达单抗、西利单抗(cetrelimab)、法妥组单抗(farletuzumab)、opinercept、利纳西普、托木妥昔单抗(tomuzotuximab)、乌瑞芦单抗、阿伐苏单抗、溴珠单抗、克拉扎珠单抗、古妥珠单抗(cusatuzumab)、达洛珠单抗、伊利尤单抗、伊曲珠单抗(itolizumab)、以及马吉妥昔单抗(margetuximab)。还考虑了可用作医学诊断剂或对食品组合物具有有益效果，或掺入清洁组合物或涂料配制品中的蛋白质。在一些实施例中，蛋白质是免疫球蛋白。在一些实施例中，蛋白质是免疫球蛋白G(IgG)。在一些实施例中，蛋白质是牛免疫球蛋白G。
如本文所用，术语“水溶液”意指其中溶剂包含基于该溶剂的总重量至少90wt％的水的溶液。在一些实施例中，溶剂进一步包含有机溶剂，如丙酮、乙醇、DMSO(二甲基亚砜)和2-丁酮。在一些实施例中，溶剂包含水和有机溶剂、基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，溶剂包含基于该溶剂的总重量至少92wt％、或至少94wt％、或至少96wt％、或至少98wt％、或至少99wt％的水。在一些实施例中，溶剂基本上由水组成或由水组成。在一些实施例中，溶剂是水。在一些实施例中，水溶液基本上不含有机溶剂。在一些实施例中，水溶液的液体介质基本上由水组成或由水组成。
水溶液任选地包含一种或多种额外的成分。额外的成分是除了水、蛋白质和具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂之外的化合物。优选的额外的成分是糖、糖醇、盐、缓冲液、氨基酸或氨基酸的盐、或其混合物。当存在此类额外的成分时，优选地所有额外的成分的总量为基于该水溶液的总体积不超过300mg/ml、或不超过250mg/ml、或不超过200mg/ml、或不超过150mg/ml、或不超过100mg/ml、或不超过80mg/ml、或不超过60mg/ml、或不超过40mg/ml、或不超过30mg/ml、或不超过20mg/ml、或不超过10mg/ml。
对于水溶液中的包含物，优选的糖是蔗糖、葡萄糖、甘露糖、海藻糖、麦芽糖、右旋糖或葡聚糖、或其混合物。对于水溶液中的包含物，优选的糖醇是山梨糖醇、甘露糖醇或木糖醇。
对于水溶液中的包含物，优选的盐具有选自以下项的阳离子：氢离子、钠离子、钾离子、镁离子、钙离子或铵离子、或其混合物。优选的盐具有选自以下项的阴离子：氟离子、氯离子、溴离子、碘离子、磷酸根、碳酸根、乙酸根、柠檬酸根或硫酸根、或其混合物。优选的缓冲液具有选自以下项的阳离子：氢离子、钠离子、钾离子、镁离子、钙离子或铵离子、或其混合物。
对于水溶液中的包含物，优选的氨基酸及其盐选自由以下组成的组：赖氨酸、甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、以及其混合物和其盐。
在一些实施例中，水溶液基本上不含其他表面活性剂。如本文所用，术语“其他表面活性剂”意指不同于具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的表面活性剂。在一些实施例中，其他表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯、泊洛沙姆、及其混合物。在一些实施例中，水溶液基本上不含聚山梨醇酯表面活性剂。在一些实施例中，水溶液基本上不含泊洛沙姆表面活性剂。在一些实施例中，水溶液中的其他表面活性剂的浓度为基于该水溶液的总体积不超过0.01mg/ml、或不超过0.005mg/ml、或不超过0.002mg/ml、或不超过0.001mg/ml、或不超过0.0005mg/ml、或不超过0.0002mg/ml、或不超过0.0001mg/ml。在一些实施例中，具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂是水溶液中存在的唯一表面活性剂。
在一些实施例中，步骤(b)中的生物工艺是过滤，即，在步骤(b)中，将步骤(a)中提供的水溶液过滤以形成滤液的水溶液。在此种步骤或工艺中，水溶液通过过滤器以去除至少一部分蛋白质污染物(例如，宿主细胞蛋白、核酸、蛋白质聚集体等)。水溶液中的蛋白质和具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂一起通过过滤器以形成滤液，而蛋白质污染物被过滤器截留。
在一些实施例中，过滤器选自由以下组成的组：PVDF过滤器、PES过滤器、聚丙烯过滤器、纤维素过滤器、尼龙过滤器、及其组合。在一些实施例中，过滤器是PVDF过滤器。在一些实施例中，过滤器是PES过滤器。典型地，过滤器包括分离膜。如本文所用，术语“分离膜”意指在过滤工艺中用于基于水溶液中的组分的分子量或尺寸分离这些组分的多孔膜。如本文所用，术语“PVDF过滤器”意指具有由聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的分离膜的过滤器。如本文所用，术语“PES过滤器”意指具有由聚醚砜(PES)制成的分离膜的过滤器。如本文所用，术语“聚丙烯过滤器”意指具有由聚丙烯制成的分离膜的过滤器。如本文所用，术语“纤维素过滤器”意指具有由纤维素制成的分离膜的过滤器。如本文所用，术语“尼龙过滤器”意指具有由尼龙制成的分离膜的过滤器。
在一些实施例中，其中的过滤器或分离膜具有从约0.1μm至约1μm、或从约0.1μm至约0.5μm的孔径。在一些实施例中，其中的过滤器或分离膜具有约0.2μm的孔径。在一些实施例中，过滤工艺在室温下进行。在一些实施例中，过滤工艺不包括超滤和/或渗滤。
发现具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂可以有效地防止蛋白质在分离膜上被吸收或损失。此外，具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂在分离膜上的吸收或损失也是少的或最少的。在一些实施例中，基于进料至过滤器中以过滤的水溶液中的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的总重量，至少60％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少98％、或至少99％的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂通过过滤器。
在一些实施例中，基于进料至过滤器中以过滤的水溶液中的蛋白质的总重量，至少60％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少98％、或至少99％的蛋白质通过过滤器。
在一些实施例中，步骤(a)中提供的水溶液中的表面活性剂/蛋白质浓度比与滤液的水溶液中的表面活性剂/蛋白质浓度比基本上相同，即，当通过过滤器时水溶液中的表面活性剂/蛋白质浓度比基本上不变。在一些实施例中，滤液的水溶液中的表面活性剂/蛋白质浓度比是在步骤(a)中提供的水溶液中的表面活性剂/蛋白质浓度比的±5％、或±10％、或±15％、或±20％的范围内。
具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂是具有不同分子量的聚合物组分的混合物。典型地，步骤(a)中提供的水溶液中的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的组成(混合物中的聚合物组分及其相应的浓度)与滤液的水溶液中的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的组成基本上相同，即，当通过过滤器时水溶液中的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的组成基本上保持不变。
在一些实施例中，步骤(b)中的生物工艺是色谱法，即，在步骤(b)中，使步骤(a)中提供的水溶液通过色谱柱中含有的色谱树脂(固定相)，使得至少一部分蛋白质污染物(例如，宿主细胞蛋白、核酸、蛋白质聚集体等)可以从蛋白质中分离。在一些实施例中，蛋白质被截留在色谱柱中，而蛋白质污染物通过色谱柱。在此类实施例中，在色谱法之后，包含具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的回收水溶液可以用于回收或去除来自色谱柱的截留蛋白质。在一些实施例中，回收水溶液是缓冲液溶液。
在一些实施例中，蛋白质污染物被截留在色谱柱中，而水溶液中的蛋白质和具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂通过色谱柱。在一些实施例中，色谱法工艺在室温下进行。
在色谱法工艺期间，水溶液中的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂通过色谱柱。具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂在色谱树脂上的吸收或损失是少的或最少的。在一些实施例中，基于进料至色谱柱中的水溶液中的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的总重量，至少60％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少98％、或至少99％的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂通过色谱柱。
典型地，步骤(a)中提供的水溶液中的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的组成与通过色谱柱的水溶液(即，洗脱液)中的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的组成基本上相同，即，当通过色谱柱时水溶液中的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的组成基本上保持不变。
色谱柱包括其中含有的色谱树脂(固定相)。在一些实施例中，色谱树脂选自由以下组成的组：磺丙基官能化的交联琼脂糖、蛋白质A、季铵官能化的交联琼脂糖、疏水相互作用色谱树脂、及其组合。本领域技术人员应理解，蛋白质A是49kDa表面蛋白质，其最初发现于细菌金黄色葡萄球菌的细胞壁中。疏水相互作用色谱树脂的实例包括具有丁基取代基的琼脂糖。在一些实施例中，色谱树脂是磺丙基官能化的交联琼脂糖。在一些实施例中，色谱树脂是蛋白质A。在一些实施例中，色谱树脂是季铵官能化的交联琼脂糖。
在一些实施例中，生物工艺是输送，即，生物工艺包括在容器中或通过导管输送水溶液。在一些实施例中，具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂选自由以下组成的组：12FM1000、FM1000、及其混合物。在一些实施例中，具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂是FM1000。在一些实施例中，水溶液中的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的浓度为基于该水溶液的总体积从约0.01mg/ml至约0.1mg/ml、或从约0.02mg/ml至约0.08mg/ml、或从约0.02mg/ml至约0.06mg/ml、或从约0.03mg/ml至约0.05mg/ml。在一些实施例中，水溶液中的具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的浓度为基于该水溶液的总体积约0.03mg/ml。
发现具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂可以有效地减少输送期间蛋白质在水溶液中的聚集。在一些实施例中，输送结束时的水溶液包含基于该水溶液中蛋白质的总重量至少80wt％的单体蛋白、或至少85wt％的单体蛋白、或至少90wt％的单体蛋白、或至少92wt％的单体蛋白、或至少94wt％的单体蛋白、或至少96wt％的单体蛋白、或至少98wt％的单体蛋白、或至少99wt％的单体蛋白。
许多方面和实施例已在上文中描述并且仅是示例性的且非限制性的。在阅读本说明书后，技术人员应理解，在不背离本发明的范围的情况下，其他方面和实施例是可能的。
实例
本文描述的概念将在以下实例中进一步描述，这些实例不限制权利要求中所述的本发明的范围。
已知蛋白质吸附在水与空气、油和固体表面之间的界面上，这通常导致聚集和变性。此外，在输送期间经常发生的搅动可能加剧这些有害影响。稳定这些治疗蛋白质的一些方法包括使用赋形剂，如糖、盐、氨基酸、和表面活性剂。表面活性剂通过两种机制特别地可用于稳定和保护溶液中的蛋白质：(1)通过在蛋白质可能变性和聚集的表面上竞争蛋白质的空间(被称为竞争性吸附)，以及(2)通过优先缔合，其中表面活性剂与蛋白质直接相互作用以稳定蛋白质结构或防止可能引起聚集的蛋白质-蛋白质相互作用。
不希望受理论的束缚，据信这两种机制都起到稳定的作用，但通常，第一个机制被认为是主要的。与没有此类表面活性剂的配制品相比，市场上用于蛋白质稳定的现有表面活性剂，如聚山梨醇酯20和80，减少了蛋白质聚集。与聚山梨醇酯20和80相比，当蛋白质-表面活性剂溶液等温地保持在65℃时，14FM1000导致免疫球蛋白G(IgG)聚集体的生长速率降低。不希望受理论的束缚，据信14FM1000的成功可能是由于其能够快速移动和吸附到不同的界面(如水-空气和水-油)，如通过动态表面张力(DST)测量所示。
合成并研究了具有范围从8至18个碳的疏水尾长的六种FM1000衍生物，以了解其蛋白质稳定能力并辨别导致蛋白质稳定功效变化的表面活性剂结构特性。通过实验发现疏水尾长显著影响表面活性剂稳定模型蛋白治疗物IgG的能力。疏水尾长影响表面活性剂吸附的动力学和可逆性。中等长度的疏水尾长如14个碳(即，14FM1000)具有最快且最大的表面张力下降和最可逆的吸附。这些快速动力学与表面活性剂稳定IgG的能力相关，其中14FM1000最大程度地减少了聚集。本公开阐明了表面活性剂疏水尾长与蛋白质稳定之间的结构-功能关系。
材料
肉豆蔻酰氯(Amberlite IR-120强酸性离子交换树脂氢型)和羰基二咪唑购自西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)(密苏里州圣路易斯市)。Amberlite IRN-78阳离子型(OH-)离子交换树脂购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)(马萨诸塞州沃尔瑟姆市)。N-羟基琥珀酰亚胺购自阿克洛斯有机物公司(Acros Organics)(新泽西州费尔劳恩市)。L-苯丙氨酸购自TCI化学品公司(TCI chemicals)(俄勒冈州波特兰市)。Jeffamine M1000从亨斯迈公司(Huntsman)(得克萨斯州伍德兰市)获得。聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20购自西格玛公司(Sigma)。所有化学品均未经进一步纯化按接收原样使用。
硅酮板(Dow Corning C6-150)由杜邦公司(DuPont)供应。IV袋从百特医疗有限公司(Baxter Healthcare Corp.)获得，将其切开并倒空现有的盐水溶液，用超纯(MilliQ)水洗涤、并干燥。聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚醚砜(PES)和聚乙烯(PE)的板都从顾特服公司(Goodfellow Corp.)获得，其中厚度为0.5mm并且尺寸为范围在150×150mm与300×300mm之间。在将所有表面沉浸到不同溶液中之前，将它们切割成3.5×1cm的片。
PVDF过滤器从飞世尔科技公司(Fisher Scientific)(Fisherbrand，33mm直径，0.2μm)获得，而PES过滤器从密理博西格玛公司(Millipore Sigma)(Millex-GP，33mm直径，0.22μm)获得。色谱柱从思拓凡公司(Cytiva)获得，包括磺丙基官能化的交联琼脂糖柱和蛋白质A柱(GE医疗公司(GE Healthcare))，容量均为1mL。
水是超纯级。工业级牛IgG(免疫球蛋白G)购自MP生物医疗公司(MP Biomedicals)(加利福尼亚州圣安娜)。将牛IgG在0.9wt％盐水中以40mg/mL溶解，通过0.2μm PVDF过滤器过滤并稀释到相关浓度。
具有14个碳疏水尾的FM1000衍生物(FM1000或14FM1000)的合成：
步骤1：向配备有搅拌棒的500mL圆底烧瓶中添加l-苯丙氨酸(0.0500mol，8.26g)、在DI(去离子的)水(250mL)中的氢氧化钠(0.0500mol，2.00g)、和三乙胺(0.0540mol，7.56mL)。使其在RT(室温)下搅拌1分钟直至溶解。接下来，缓慢添加肉豆蔻酰氯(0.0500mol，13.6mL)。使反应混合物在RT下搅拌1小时。接下来，缓慢添加5mL的浓HCl。经由吸滤收集通过添加酸形成的米白色沉淀物，将其用500mL的水洗涤并使其干燥过夜。接下来，将产物溶解在1500mL的沸腾的乙酸乙酯中并经硫酸镁干燥。过滤掉硫酸镁并经由旋转蒸发器去除乙酸乙酯。接下来，将产物溶解在沸腾的己烷中，在冷冻器中缓慢冷却(在此期间形成白色沉淀物)，并经由吸滤收集。由于NMR示出肉豆蔻酸杂质，因此将产物再次溶解在沸腾的己烷中，在冷冻器中缓慢冷却(在此期间形成白色沉淀物)，并经由吸滤收集。将所得白色粉末在真空干燥器中干燥过夜(7.9741g，43％)。
步骤2：向配备有搅拌棒的25mL圆底烧瓶中添加正肉豆蔻酰基苯丙氨酸(来自步骤1的产物)(0.00100mol，0.375g)和DCM(二氯甲烷，10mL)。将圆底烧瓶用隔板盖住，并用N2吹扫。接下来，将CDI(1,1’-羰基二咪唑，0.00120mol，0.194g)添加到反应混合物中，将隔板放回原处，并将混合物再次用N2吹扫。然后将反应混合物在RT下搅拌4小时。接下来，将Jeffamine M1000(0.00120mol，1.17g)溶化并经由注射器添加到反应混合物中。将反应混合物在RT下搅拌68小时。接下来，经由旋转蒸发器蒸发DCM，并将150mL的甲醇连同用甲醇预洗涤的交换树脂、Amberlite IRN-78阳离子型(OH-)离子交换树脂和Amberlite IR-120强酸性离子交换树脂氢型一起添加。将此混合物在RT下搅拌2小时。使用玻璃料(frit)经由真空过滤去除树脂。从真空过滤得到的溶液中蒸发掉甲醇。接下来，将产物溶解在400mL的10％甲醇/DCM中并贯穿SiO2塞。经由旋转蒸发器浓缩滤液，产生白色蜡状物，将其在真空烘箱中在60℃干燥过夜(1.6g，49％)。
摇动研究
将所有样品在0.9wt％盐水(在1000mL超纯水中的9g NaCl)中制备并含有20mg/mLIgG。在没有表面活性剂的情况下制备对照样品。对于摇动研究，还制备了含有0.03或0.05mg/mL的具有不同尾长的表面活性剂的其他样品。这些表面活性剂是8FM1000、10FM1000、12FM1000、14FM1000、16FM1000和18FM1000，其中8、10、12、14、16和18分别意指表面活性剂尾长(碳原子的数目)。如本文所用，术语“尾长”意指R1的长度。例如，14FM1000具有14个碳疏水尾长(CH3-(CH2)11-CH2-C(＝O))。
使用搅拌引起IgG蛋白质聚集。在室温下将样品以一式四份在热往复摇动器上以188冲程/分钟摇动24小时。研究的每个样品在大约1mL的8×43mm玻璃小瓶(肯堡公司(Kimble)产品编号60831D-843)中是0.7mL，并且用可刺穿的TPE Lyo Capcluster-96(微尼克公司(Micronic)，宾夕法尼亚州阿斯顿镇)塞子盖住。将小瓶在定制铝支架上以96孔布局排列。摇动后，将样品在Wyatt DynaPro II仪器(怀雅特技术公司(Wyatt Technology)，加利福尼亚州圣巴巴拉市)上经由动态光散射(DLS)分析，以确定表面活性剂在防止搅拌引起的聚集方面的功效。此外，将相同的样品在摇动之前作为“无摇动”对照物经由DLS分析(即，“0小时摇动”)。将每个孔扫描5次，其中每次采集5秒。使用正则化拟合来确定IgG群体尺寸和流体动力学半径。超过10nm的群体被认为是聚集的IgG，并且因此通过假设瑞利(Rayleigh)球将强度百分比转换为质量百分比，以质量百分比来量化。
摇动研究用于理解表面活性剂稳定蛋白质的能力，因为摇动通过疏水表面的不断波动而加速不稳定。此外，搅拌类似于增加IgG聚集的输送条件。在图1和图2中，最左边的条表示不含表面活性剂的对照样品。图1示出了24小时摇动后的IgG聚集，并且图2示出了在摇动之前的IgG聚集。如由图2所示，在无摇动对照物中，在所研究的两种浓度下的所有表面活性剂的IgG聚集率基本上为0％。图1展示了14FM1000在基于水溶液的总体积0.03mg/ml和0.05mg/ml的浓度下可以有效地防止IgG蛋白质聚集。图1还展示了12FM1000在基于水溶液的总体积0.05mg/ml的浓度下可以有效地防止IgG蛋白质聚集。
发现通常中尾长度最能防止IgG聚集，并且较短和较长尾长则展现出更多的IgG聚集。当比较0.03mg/mL与0.05mg/mL表面活性剂浓度之间的IgG聚集时，发现在表面活性剂浓度较高(0.05mg/mL)时，12FM1000也具有大约0％聚集率，但在0.03mg/mL的较低浓度下，观察到一些聚集(1％-2％)。8FM1000和10FM1000表面活性剂样品在0.03mg/mL下具有大量的聚集(4％-7％)。在0.05mg/mL的较高浓度下，8FM1000具有与它在较低浓度下具有的大约相同量的聚集，但10FM1000具有较少的聚集(2％-3％)。随着10FM1000浓度的增加，IgG聚集的这种减少与同样增加12FM1000浓度时看到的趋势相似。16FM1000和18FM1000二者均具有约2％-3％的聚集率，其在所研究的两种浓度之间没有显著变化。
动态表面张力测量
所有样品在0.9wt％盐水(在1000mL超纯水中的9g NaCl)中制备。表面活性剂分别是8FM1000、10FM1000、12FM1000、14FM1000、16FM1000和18FM1000，并且蛋白质是IgG。制备了七个样品，一个样品含有在0.9％盐水中的10mg/mL IgG，并且其他六个样品分别含有在0.9％盐水中在0.05mg/mL的浓度下的每种表面活性剂。
在RT下在Teclis Tracker悬滴张力计(泰克利斯科学公司(Teclis Scientific)，法国瑟维利阿塞格(Civrieux d’Azergues))上进行表面张力测量。用样品填充25ml液槽。使用18号J形针头产生气泡。使用仪器上的反馈控制器将液滴保持在恒定的区域。通过将气泡轮廓拟合到拉普拉斯方程(Laplace equation)中来计算表面张力。以一式三份，将样品的表面张力监测3000秒(12FM1000、14FM1000、16FM1000、18FM1000、和IgG)或6000秒(8FM1000和10FM1000)。最初，每0.1秒进行一次测量。10秒后，每1秒进行一次测量。
动态表面张力(DST)测量可用于理解界面处材料的吸附和重排的动力学。对于0.05mg/mL的每种表面活性剂和10mg/mL的IgG，测量空气/水界面处的DST(参见图3A)。使每个DST曲线拟合到双指数衰减函数中，以定性地表示界面处的吸附和重排动力学(等式1)。σ(t)是在时间t时的表面张力，并且σeq是在平衡时或在无限时间后的表面张力。此外，τ1是较快衰减的特征时间，并且θ1是由于第一次衰减导致的表面张力的下降。τ2和θ2对应于较慢衰减的特征时间和表面张力的下降。
Figure BDA0004048072650000231
据信，具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂经历了在表面上的亲水头(-R3)和疏水尾(-R1)重排和吸附。假设具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂具有两种类型的表面张力衰减、初始吸附和某种形式的构象调整，这可能是由于其聚合物亲水头(-R3)，据信第一次衰减对应于表面活性剂对表面的初始吸附(τ1，θ1)，并且第二次衰减对应于表面活性剂分子向其平衡取向的构象变化(τ2，θ2)。可以对聚合物亲水头和烃疏水尾(-R1)进行构象调整。
发现14FM1000在第一次衰减中其表面张力下降的百分比最大(参见图3B)。相对于14FM1000，随着尾长增加或减少，由于第一次衰减导致的表面张力降低的百分比减小。这表明相对于其他表面活性剂，14FM1000的尾长允许初始吸附最大化。此外，通过用初始下降减少的时间常数对该下降进行归一化，如图3C所看到的，14FM1000在最段的时间内最大程度的降低了表面张力。因此，14FM1000在首次到达表面时相对快得多。
有趣地是，当观察由于第二次衰减导致的表面张力下降量时，出现了相反的趋势：较短和较长尾(与14FM1000相比较)在第二次衰减期间均能最大程度的降低表面张力(参见图3D)。不希望受理论的束缚，这种趋势可能潜在地是由于较长和较短尾长需要更多构象变化来达到平衡。对于较长尾，疏水尾必须重排，使得其大部分可以在平衡取向上被吸附。对于所研究的所有表面活性剂，亲水头潜在地可能通过PEO(聚环氧乙烷)、PPO(聚环氧丙烷)或苯丙氨酸区域吸附，导致表面张力大幅下降。这种亲水头吸附对于较短尾可能更突出，因为尾本身不是作为疏水性的。不希望受理论的束缚，14FM1000的快速吸附可能是由于疏水尾足够短，使得其不必显著重排，但它也足够疏水，使得在平衡时PEO、PPO或苯丙氨酸不显著吸附。由于重排，这导致表面张力下降非常小。第二次衰减的特征时间(τ2)随着疏水尾长的增加而减小(参见图3E)。不希望受理论的束缚，这是因为更疏水的尾重排和最小化其(较高)能量的热力学驱动较强。第二次衰减的特征时间趋势可能进一步受到聚合物亲水头重排的影响，这对于疏水更低(较小)的尾可能更重要。由于聚合亲水性头部由于其高分子量而需要比尾部更长的时间来改变构象，因此这种重排的时间可能影响τ2的趋势。图3展示，14FM1000具有理想的疏水尾长，其表面张力初始下降迅速且大幅下降。
据信，14FM1000吸附的量和速度促进了其在表面吸附方面胜过IgG的能力，最终阻止了IgG的聚集。而且，组合的DST和聚集数据表明较长和较短尾(与14FM1000相比较)防止较少的IgG聚集，因为它们较慢吸附到表面，这使得IgG有时间吸附并聚集在疏水表面上。还据信，这些快速吸附动力学是14FM1000在防止蛋白质聚集方面优于聚山梨醇酯20和80的原因。进一步据信，即使具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂可以代替IgG，如果它能够更快到达表面，表面活性剂可以代替更多的蛋白质，从而防止更多的聚集。有趣的是，8FM1000是在大约5秒后测量的所有时间中具有比IgG更高的表面张力值的唯一表面活性剂(参见图3A)。这表明8FM1000没有像IgG一样快速或良好地包覆表面，这可能表明8FM1000在所研究的任一浓度下都没有良好地防止IgG聚集的原因。
带损耗的石英晶体微天平研究
所有样品在0.9wt％盐水溶液(在1000mL超纯水中的9g NaCl)中制备。表面活性剂分别是8FM1000、10FM1000、12FM1000、14FM1000、16FM1000和18FM1000，并且蛋白质是IgG。将样品溶液制备成在盐水中具有0.05mg/mL单独表面活性剂，或在盐水中具有1mg/mL单独IgG，或在盐水中具有0.05mg/mL表面活性剂和1mg/mL IgG的组合。
使用SiO2涂覆的石英晶体(型号QSX 303)在QSense分析仪(百欧林科学公司(Biolin Scientific)，瑞典哥德堡)上进行带损耗的石英晶体微天平(QCM-D)测量。使样品溶液以150μL/min的速率流过石英晶体直至达到平衡，以确定所吸附的材料量。接下来，使0.9wt％盐水的溶液以150μL/min的速率流过石英晶体直至达到平衡，以确定在吸附到晶体上后有多少表面活性剂和/或蛋白质可以冲洗掉。监测第三次谐波频率变化，以根据索伯列夫(Sauerbrey)关系确定吸附的相对质量，该关系假定吸附的质量与频率变化成比例。在单独的表面活性剂或表面活性剂和IgG溶液开始之后的最初10至40分钟进行平均，以确定吸附的相对质量。通过取在盐水冲洗前吸附的相对质量，并将其与盐水冲洗40分钟内平均的吸附的质量变化进行比较，确定冲洗掉的百分比。此外地，吸附的IgG百分比(图4C)通过取每种表面活性剂在有和没有IgG的情况下在10至40分钟内吸附的平均质量之间的差异来计算。将所有数据归一化为单独IgG样品的吸附的平均质量(100任意单位)。
QCM-D用于通过监测硅涂覆的石英晶体的共振频率变化来阐明吸附在固体疏水表面上的IgG和表面活性剂质量。冲洗掉研究可以进一步用于理解吸附是可逆还是不可逆，这阐明了表面活性剂和IgG如何与表面相互作用。使0.05mg/mL单独表面活性剂的样品溶液流过晶体表面，并且测量了共振频率随时间的变化。通常，随着表面活性剂尾长的增加，吸附的表面活性剂的质量增加(参见图4A)。
接下来，使0.9wt％盐水溶液流过晶体表面，以测量有多少表面活性剂可以冲洗掉并可逆地解吸。发现从14FM1000开始，尾越长，可以冲洗掉的表面活性剂越少(参见图4B)。从8FM1000到14FM1000，尾越长，可以冲洗掉的表面活性剂的百分比越大(参见图4B)。据信，对于具有较短和较长尾的表面活性剂(与14FM1000相比较)，表面上的表面活性剂重排使此类表面活性剂更不可逆地吸附。这与DST测量结果一致。还发现IgG具有最小的可逆吸附。图4A和4B是单独表面活性剂样品和单独IgG样品的QCM-D测量。
使含有IgG和表面活性剂二者的样品溶液流过晶体表面。据信，相对于当单独表面活性剂样品流过时吸附的质量的增加是由于所吸附的IgG。如图4C所示，通常表面活性剂的尾越长，吸附的IgG越少，然而对于16FM1000和18FM1000，吸附的IgG稍微较高，这可能是由于它们如DST中所看到的吸附动力学较慢，使得IgG在早期期间胜过16FM1000和18FM1000。图4C中吸附的IgG的相对量通过以下方式计算：首先从含有表面活性剂和IgG的相应样品的所吸附的质量中减去单独表面活性剂样品的所吸附的质量，并且然后将相减结果除以单独IgG样品的所吸附的质量(即将相减结果归一化为单独IgG样品的所吸附的质量(100任意单位))。此数据与来自DST的结论一致，14FM1000具有最佳尾长以快速吸附和防止IgG吸附和/或在其不可逆地吸附之前代替任何已经吸附的IgG。此外，当IgG和表面活性剂一起被冲洗掉时，再次观察到由于具有较长尾长的表面活性剂或IgG的不可逆吸附(当使用具有较短尾长的表面活性剂时)，与较长或较短尾长相比，14FM1000表面活性剂的可逆吸附最大(参见图4D)。
摇动研究和DST和QCM-D实验证明疏水尾长影响表面活性剂速率、量、和吸附可逆性，据信其影响每种表面活性剂防止IgG吸附和随后聚集的能力(参见图5)。对于表面活性剂的初始吸附，短尾(如8FM1000)对表面的驱动力最小，因此很少吸附。此外，较长尾如18FM1000在第一次衰减期间吸附缓慢，因此IgG也吸附。14FM1000或其他中等长尾具有快速且强的初始表面活性剂吸附(参见图5A)。中等长尾表面活性剂14FM1000，由于其能够快速吸附并显著降低表面张力而无需重排，能够在表面吸附方面胜过IgG。较短尾表面活性剂(例如，8FM1000)不太可能被强烈吸附，因为它们需要构象重排以降低表面张力。因此，IgG能够胜过它们并开始在表面上聚集。相比之下，18FM1000和其他较长尾对表面具有高的驱动力并且可以胜过IgG，而一些IgG在足够的18FM1000可能到达之前已经聚集(参见图5B)。不希望受理论的束缚，据信8FM1000的疏水尾不够疏水，因此表面活性剂的其他部分如苯丙氨酸、PPO、或PEO单元也可能吸附。此外，18FM1000的疏水尾可以改变构象，因此长尾将在表面处有效组装。这导致影响表面可逆性的平衡吸附(参见图5C)。最后，如由QCM-D中的盐水冲洗所示，14FM1000被更可逆地吸附(参见图5D)。不希望受理论的束缚，据信这与第二次衰减中的表面张力的小幅下降有关，这表明可能使14FM1000更多地粘附至表面的构象变化较少。另一方面，表面活性剂如8FM1000和18FM1000以及IgG尝试稳定并更不可逆地吸附。此外，盐水冲洗模拟了在任何移动或摇动期间(如在输送期间)表面区域的变化，这表明在保护IgG免于在形成的新表面上聚集并且不以其他方式粘在瞬时表面上时，14FM1000将是最佳的。
发现14FM1000能够通过明显地快速吸附到表面上防止IgG吸附，从而防止聚集。与所研究的其他表面活性剂相比，14FM1000具有最快的初始吸附速率。短尾表面活性剂缓慢地并且没有明显地吸附到表面上，从而允许IgG吸附。虽然长尾表面活性剂吸附也缓慢，从而允许IgG吸附并聚集，但它们的平衡吸附很强。此外，14FM1000是最可逆吸附的表面活性剂，可能提高其快速解吸和吸附到瞬时表面的能力，因此保护在每个新疏水表面处的IgG并防止聚集。理解到表面活性剂与蛋白质稳定之间的结构-活性关系有助于设计具有增强的稳定性和蛋白质治疗物效用的表面活性剂。
接触角测量
进行接触角测量，以探讨10FM1000、14FM1000(FM1000)和18FM1000与聚山梨醇酯80(PS80)和聚山梨醇酯20(PS20)相比在不同聚合物表面上的蛋白质防结垢活性。在生物加工中，使生物制品暴露于它们可以吸附的多个聚合物表面(管、过滤器、存储容器等)。这可能导致有价值材料的损失，增加生物制品聚集的风险，以及扰乱治疗物的结构和干扰其功能。表面活性剂可以通过界面处的快速动力学来防止表面结垢。(Wang W.Proteinaggregation and its inhibition in biopharmaceutics[蛋白质聚集及其在生物药物中的抑制作用],Int J Pharm[国际药学杂志]2005年1月31日；289(1-2):1-30)。
在接触角测量中，通过测量水滴与它下方的表面之间的角度来评估表面的亲水性。较大的角度表明表面更疏水，而较小的角度表明水对亲水表面的亲和力。将被选择以表示各种生物加工材料的不同表面浸泡在含有免疫球蛋白G(IgG)、盐水、或表面活性剂与IgG在盐水中的混合物的盐水溶液中。在此使用的盐水是0.9wt％盐水溶液(在1000mL超纯水中的9g NaCl)。虽然表面倾向于与盐水对照物具有较大的接触角–接近其自然行为–但将它们浸泡在单独IgG(在盐水中)中产生了亲水涂层，其降低了测量的接触角。用含有不同浓度(0.001–0.1mg/mL)表面活性剂的盐水溶液获得的接触角值落在盐水和IgG对照物的接触角值之间。接近盐水对照物的值表明表面活性剂防止蛋白质结垢的能力，而接近IgG对照物的值表明蛋白质在表面上的吸附没有被阻止。在中等表面活性剂浓度下，可以观察到部分蛋白质结垢。对14FM1000活性与具有较短或较长疏水尾的衍生物(10FM1000和18FM1000)以及聚山梨醇酯进行比较。
在盐水中制备所有表面活性剂溶液。通过将20–40mg的表面活性剂溶解在10–20mL的盐水来制备2mg/mL储备溶液。将它们均在60℃下搅拌直至表面活性剂完全溶解。然后使溶液在进一步使用前回到室温。还在盐水中制备IgG储备溶液(通常为40mg/mL(在150–225mL盐水中的6–9g))，并剧烈搅拌以溶解蛋白质。在最终配制品中稀释之前，使用0.2μm聚醚砜过滤器(PES，赛默飞世尔(ThermoFisher))过滤所有IgG溶液。
在总体积为15mL的小瓶中制备IgG对照物、盐水对照物、以及含有IgG(20mg/mL)和表面活性剂(在范围从0.001至0.1mg/mL的表面活性剂浓度下)的各种盐水溶液。在盐水中制备所有最终溶液。在室温下将不同表面的片浸入溶液持续24h，此后将它们用氮气干燥。接触角测量是通过将水滴分散在置于Ossila公司仪器中的照相机与明亮背景之间的表面上(3μL×4–6个液滴)来进行的。使用Ossila软件(1.1.02版)捕捉固着液滴的图像。还使用Ossila软件(3.0.6版)进行了提取平均接触角的分析。对于每个表面，使用JMP软件(15版)对4至6个液滴进行平均。结果示于表1-4中。
表1.表面活性剂浓度为0.1mg/mL的接触角结果
Figure BDA0004048072650000301
表2.表面活性剂浓度为0.05mg/mL的接触角结果
Figure BDA0004048072650000302
表3.表面活性剂浓度为0.02mg/mL的接触角结果
Figure BDA0004048072650000303
表4.表面活性剂浓度为0.001mg/mL的接触角结果
Figure BDA0004048072650000304
Figure BDA0004048072650000311
表1-4注意：(1)除盐水对照物之外，所有溶液含有20mg/mL IgG。(2)盐水对照物是0.9％盐水，没有IgG和表面活性剂。(3)IgG对照物是在0.9％盐水中的20mg/mL IgG，没有表面活性剂。(4)PVC是聚氯乙烯。(5)PES、PE、PVDF、PVC、硅酮和PTFE表示表面的聚合物材料。
过滤器和色谱柱上的表面损失测量
在下游加工中，使生物制品治疗物经受多个纯化步骤。这些由多个色谱柱和过滤器组成，其中增加的相互作用可能导致蛋白质吸附或聚集(Li等人,Protein Instabilityat Interfaces During Drug Product Development–Fundamental Understanding,Evaluation,and Mitigation[药品产品开发期间界面处的蛋白质不稳定性–基本理解、评价和缓解].AAPS系列,Springer[斯普林格出版社]2021.ISSN 2210-7371)。表面活性剂，如聚山梨醇酯，可有助于稳定这些蛋白质但由于它们可能吸附到表面上，因此通常在配制品后加工中添加(Zhou等人,Non-specific binding and saturation of Polysorbate-20with aseptic filter membranes for drug substance and drug product during mAbproduction[mAb生产期间聚山梨酸酯-20与原料药和药品产品的无菌过滤膜的非特异性结合和饱和].Journal of Membrane Science[膜科学杂志]2008,325(2),735-741；Mahler等人,Adsorption Behavior of a Surfactant and a Monoclonal Antibody toSterilizing-Grade Filters[表面活性剂和单克隆抗体对灭菌级过滤器的吸附行为].Journal of Pharmaceutical Sciences[药物科学杂志]2010,99(6),2620-2627)。这个问题的建议解决方案包括用表面活性剂预饱和过滤膜。然而，这并不总是可行的，因为过滤器中截留的缓冲液体积可能导致蛋白质产品稀释。因此，这种预防措施可能需要用含有表面活性剂和产品二者的溶液冲洗，以免稀释后者(Mahler等人,Adsorption Behavior of aSurfactant and a Monoclonal Antibody to Sterilizing-Grade Filters[表面活性剂和单克隆抗体对灭菌级过滤器的吸附行为].Journal of Pharmaceutical Sciences[药物科学杂志]2010,99(6),2620-2627)，导致有价值产品的损失以及较低的产率。
因此，为了在生物加工中成功实施表面活性剂，希望寻找较少粘附到过滤器和柱材料上的分子。另一个重要因素是在表面活性剂遇到净化表面后检查其完整性，以确保其活性得以保持。在此，将表面活性剂溶液冲洗通过广泛使用的过滤器(PVDF、PES)和柱(磺丙基官能化的交联琼脂糖、蛋白质A和季铵官能化的交联琼脂糖)，并且使用液相色谱法检查滤液和洗脱液。将14FM1000及其具有较短和较长尾的衍生物的洗脱与聚山梨醇酯80(PS80)的洗脱相比较。检查聚山梨醇酯80的色谱图揭示首先是部分回收，接着是不一致的完全回收。
在表面损失研究中，通过以1mg/mL在水中稀释制备的储备溶液，在超纯水中制备0.03mg/mL(30ppm)的表面活性剂溶液。使用注射器(贝克顿迪金森公司(BectonDickinson)，BD Luer-LokTM 3mL或10mL)使溶液流动通过过滤器或色谱柱。观察到由于注射器表面可能保留有表面活性剂，因此使用0.03mg/mL表面活性剂溶液将它们都用3倍注射器体积预洗涤。一旦注射器被新鲜的表面活性剂溶液洗涤并填充，就将大约100–200mg的溶液递送到含有低体积嵌件(赛默科技公司(Thermo Scientific))的小瓶(12×32mm，赛默科技公司)中。第一样品总是直接从注射器中收集，而不通过任何过滤器或柱，因为该第一样品提供了与随后的滤液进行比较的对照。在过滤器研究中，将注射器附接至针头(BD 21G，0.8mm×50mm)，该针头有助于溶液递送至嵌件底部。收集对照物后，将针头用空气吹扫以清空针头中的任何剩余溶液，并附接至过滤器出口。还每隔大约100–200mg在称量前和称量后的小瓶中收集滤液，以准确测定溶液重量。在柱实验中，用大约15个柱体积的水预洗涤柱，以去除储存溶液并调节这些柱。然后将它们附接至含有0.03mg/mL表面活性剂溶液的预洗涤注射器(用表面活性剂溶液冲洗，与过滤器一样)，并且使用竖直定位的注射器泵(Kd科学公司(Kd Scientific))来进行洗脱，该注射器泵被设置成以1mL/min的推荐速率递送溶液。以类似于过滤器研究的间隔进行样品收集，并准确测定溶液重量。
在由Chromeleon软件(7.3版，赛默科技公司)控制的配备有带电气溶胶检测器(CAD)的高效液相色谱(HPLC)系统(Vanquish，赛默科技公司)上进行表面活性剂定量。将所有样品装载到设置为20℃的自动进样器室中。AcclaimTM表面活性剂柱(赛默科技公司，3×150mm，粒度3μm)用于用流动相进行分离，该流动相含有固定在pH 5的在水中的10mM乙酸铵(LC-MS等级，西格玛奥德里奇公司)以及乙腈(杰帝贝柯公司(J.T.Baker))。洗脱被设置为0.6mL/min，从90％水性流动相开始，接着斜坡上升到95％乙腈，其中两种溶液之间的转变在2min内发生。表面活性剂洗脱在高度有机流动相存在下发生。还用相同的方法测量以范围从0.06mg/mL至0.0005mg/mL的浓度从储备溶液制备的表面活性剂校准曲线，并将其用于定量滤液等分试样中的表面活性剂。从所有样品色谱图中减去超纯水信号。在Chromeleon软件上进行所有分析，接着在Excel和JMP(15版)上进行计算。结果示于图6-图9中。
图6示出了当通过PVDF过滤器时的表面活性剂损失。虽然FM1000峰基本没有变化，但PS80出现了4个峰，其中两个最右边的峰在通过过滤器后立即出现，而在左边的两个峰通过过滤发生了变化(参见图6B)。这证明PS80组成中的一些组分(由两个最右边的峰表示)没有吸附在PVDF过滤器上，而PS80组成中的其他组分(由两个最左边的峰表示)在PVDF过滤器上被吸附并损失。因此，PS80组成和特性在过滤期间发生改变。相比之下，FM1000呈均匀峰通过PVDF过滤器(参见图6A)。这证明FM1000组成和特性在过滤期间未改变。
图7示出了当通过PES过滤器时的表面活性剂损失。虽然FM1000峰基本没有变化，但PS80出现了4个峰，其中两个最右边的峰在通过过滤器后立即出现，而在左边的两个峰通过过滤发生了变化(参见图7B)。这证明PS80组成中的一些组分(由两个最右边的峰表示)没有吸附在PES过滤器上，而PS80组成中的其他组分(由两个最左边的峰表示)在PES过滤器上被吸附并损失。因此，PS80组成和特性在过滤期间发生改变。相比之下，FM1000呈均匀峰通过PES过滤器(参见图7A)。这证明FM1000组成和特性在过滤期间未改变。
图8示出了当通过磺丙基官能化的交联琼脂糖(SP HP)色谱柱时的表面活性剂损失。虽然FM1000峰基本没有变化，但PS80出现了4个峰，其中两个最右边的峰在通过柱后比在左边的两个峰更快出现(参见图8B)。这证明PS80组成中的一些组分(由两个最右边的峰表示)没有吸附在磺丙基官能化的交联琼脂糖柱上，而PS80组成中的其他组分(由两个最左边的峰表示)在磺丙基官能化的交联琼脂糖柱上被吸附并损失。因此，PS80组成和特性在色谱法期间发生改变。相比之下，FM1000呈均匀峰通过磺丙基官能化的交联琼脂糖柱(参见图8A)。这证明FM1000组成和特性在色谱期间未改变。
图9示出了当通过蛋白质A色谱柱时的表面活性剂损失。虽然FM1000峰基本没有变化，但PS80出现了4个峰，其中两个最右边的峰在通过柱后比在左边的两个峰更快出现(参见图9B)。这证明PS80组成中的一些组分(由两个最右边的峰表示)没有吸附在蛋白质A柱上，而PS80组成中的其他组分(由两个最左边的峰表示)在蛋白质A柱上被吸附并损失。因此，PS80组成和特性在色谱法期间发生改变。相比之下，FM1000呈均匀峰通过蛋白质A柱(参见图9A)。这证明FM1000组成和特性在色谱期间未改变。
图10示出了当通过季铵官能化的交联琼脂糖(Q HP)色谱柱的表面活性剂损失。虽然FM1000峰基本没有变化，但PS80出现了4个峰，其中两个最右边的峰在通过柱后比在左边的两个峰更快出现(参见图10B)。这证明PS80组成中的一些组分(由两个最右边的峰表示)没有吸附在季铵官能化的交联琼脂糖柱上，而PS80组成中的其他组分(由两个最左边的峰表示)在季铵官能化的交联琼脂糖柱上被吸附并损失。因此，PS80组成和特性在色谱法期间发生改变。相比之下，FM1000呈均匀峰通过季铵官能化的交联琼脂糖柱(参见图10A)。这证明FM1000组成和特性在色谱期间未改变。
进行分析以找出需要多少体积的表面活性剂溶液来达到表面活性剂量的90wt％。换句话说，对滤液/洗脱液中含有的表面活性剂的累积量进行分析并计算，以找出在哪一点(滤液/洗脱液体积)处表面活性剂(滤液/洗脱液中所含有的)的累积量达到进料至过滤器/柱的表面活性剂(表面活性剂溶液中所含有的)的总量的90wt％。结果总结于表5中。
在表5中，顶行指示表面活性剂的种类，并且左列指示过滤器或色谱柱的种类。表中的量指示在滤液/洗脱液中达到90±1wt％的表面活性剂回收率所需要的滤液/洗脱液的体积(以mL计)。体积越大，表面活性剂在滤液/洗脱液中回收需要的时间越长。在表5中，体积值通过以下方式获得：对滤液/洗脱液等分试样中的每种组分的HPLC-CAD峰进行积分，并且然后使它们除以它们在未过滤或未通过柱的样品中的量(被看作是100％)。记录在每次运行中达到90wt％阈值的第一等分试样的体积值。
表5
FM1000 PS80 10FM1000 18FM1000
PVDF过滤器 1.68 2.16 0.14 1.66
PES过滤器 1.51 1.35 0.24 1.09
SP HP柱 1.07 1.27 1.22 1.61
Q HP柱 1.50 2.34 1.36 1.82
蛋白质A柱 1.73 2.05 1.64 1.93
应注意的是，并不是所有的以上在一般性描述或实例中所描述的活动都是必需的，一部分特定活动可能不是必需的，并且除了所描述的那些以外，还可进行一个或多个其他活动。此外，所列举的活动的顺序不必是它们实施的顺序。
在前述说明书中，已参考具体实施例描述了概念。然而，本领域的普通技术人员理解，在不脱离以下权利要求中所规定的本发明范围的情况下可作出各种修改和改变。因此，本说明书应被认为是说明性的而非限制性的，并且所有此类修改均旨在包括于本发明的范围内。
上面已经关于具体实施例描述了益处、其他优点和问题的解决方案。然而，益处、优点、问题的解决方案、以及可能引起任何益处、优点、或解决方案出现或使其变得更明显的一个或多个任何特征不会被解释为任何或所有权利要求的关键的、必要的或基本的特征。
要理解的是，为清楚起见，本文在单独实施例的上下文中所述的某些特征还可以以组合形式在单个实施例中提供。相反地，为了简洁起见，在单个实施例的背景下所述的各个特征也可以单独地或以任何子组合提供。

Claims (15)

1.一种方法，其包括：
(a)提供包含蛋白质和具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的水溶液
Figure FDA0004048072640000011
其中R1-C(＝O)是脂肪酰基，R2是H或取代或未取代的烃基，X1是O或NH，X2是O或NH，n是0或1-5的整数，R3是包含具有式II和III的聚合单元的聚合物基团
Figure FDA0004048072640000012
(b)使所述水溶液经受生物工艺。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂选自由以下组成的组：12FM1000、FM1000、16FM1000、18FM1000、及其混合物。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂是FM1000。
4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)包括过滤所述水溶液。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂选自由以下组成的组：FM1000、16FM1000、18FM1000、及其混合物。
6.如权利要求4所述的方法，其中，过滤器选自由以下组成的组：PVDF过滤器、PES过滤器、聚丙烯过滤器、纤维素过滤器、尼龙过滤器、及其组合。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述过滤器是PVDF过滤器或PES过滤器。
8.如权利要求4所述的方法，其中，当通过所述过滤器时，所述水溶液中的所述具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的组成基本上保持不变。
9.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)包括使所述水溶液通过色谱柱。
10.如权利要求9所述的方法，其中，色谱树脂选自由以下组成的组：磺丙基官能化的交联琼脂糖、蛋白质A、季铵官能化的交联琼脂糖、疏水相互作用色谱树脂、及其组合。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述色谱树脂是磺丙基官能化的交联琼脂糖、蛋白质A、或季铵官能化的交联琼脂糖。
12.如权利要求9所述的方法，其中，当通过所述色谱柱时，所述水溶液中的所述具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的组成基本上保持不变。
13.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)包括输送所述水溶液。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂选自由以下组成的组：12FM1000、FM1000、及其混合物。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述具有式I的聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂是FM1000。
CN202180049435.3A 2020-07-15 2021-07-14 表面上结垢减少的生物工艺 Pending CN116348475A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063052048P 2020-07-15 2020-07-15
US63/052048 2020-07-15
PCT/US2021/041508 WO2022015779A1 (en) 2020-07-15 2021-07-14 Bioprocess with reduced fouling on surfaces

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116348475A true CN116348475A (zh) 2023-06-27

Family

ID=77466035

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180049435.3A Pending CN116348475A (zh) 2020-07-15 2021-07-14 表面上结垢减少的生物工艺

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230242580A1 (zh)
EP (1) EP4182329A1 (zh)
JP (1) JP2023535561A (zh)
KR (1) KR20230043132A (zh)
CN (1) CN116348475A (zh)
BR (1) BR112023000584A2 (zh)
CA (1) CA3185567A1 (zh)
IL (1) IL299852A (zh)
WO (1) WO2022015779A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024122802A1 (ko) 2022-12-09 2024-06-13 주식회사 엘지에너지솔루션 배터리 셀 및 이를 포함하는 배터리 팩 및 차량

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG193564A1 (en) * 2011-03-25 2013-10-30 Genentech Inc Novel protein purification methods
US10301428B2 (en) 2015-09-11 2019-05-28 Dow Global Technologies Llc Polyalkoxy fatty compound
KR20180051543A (ko) * 2015-09-11 2018-05-16 다우 글로벌 테크놀로지스 엘엘씨 단백질 및 폴리알콕시 지방 화합물을 포함하는 조성물
US20200061542A1 (en) * 2017-02-24 2020-02-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for improving filterability of polysaccharide-protein conjugate reactions
CN112672734B (zh) * 2018-09-10 2023-04-11 陶氏环球技术有限责任公司 包含蛋白质和聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的组合物
JP2023506173A (ja) * 2019-12-12 2023-02-15 ニュートリション アンド バイオサイエンシス ユーエスエー １，エルエルシー タンパク質のバイオプロセス

Also Published As

Publication number Publication date
EP4182329A1 (en) 2023-05-24
BR112023000584A2 (pt) 2023-03-28
IL299852A (en) 2023-03-01
WO2022015779A1 (en) 2022-01-20
KR20230043132A (ko) 2023-03-30
JP2023535561A (ja) 2023-08-18
CA3185567A1 (en) 2022-01-20
US20230242580A1 (en) 2023-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8728828B2 (en) Purification of immunoglobulins
JP5787461B2 (ja) 免疫グロブリンの精製方法
EP3130384B1 (en) Purification of biological molecules
US7662930B2 (en) Polishing steps used in multi-step protein purification processes
EP2513142B1 (en) Membranes and associated methods for purification of antibodies
US8932715B2 (en) Precipitation stabilising compositions comprising bioactive molecule and at least one cationic and one anionic precipitation stabilizing additives
AU2007272494B2 (en) Adsorptive membranes for trapping viruses
US20140251911A1 (en) Method and apparatus for chromatographic purification
EP2889617B1 (en) Antibody purification method by means of temperature-responsive chromatography
CN116348475A (zh) 表面上结垢减少的生物工艺
EP3762121B1 (en) Composite material for bioseparations
CA1262121A (en) High performance liquid chromatography mobile phase
JP2009508132A (ja) ポロキサマーの定量方法
ES2961186T3 (es) Purificación de glicoformas
CN112672734A (zh) 包含蛋白质和聚烷氧基脂肪酰基表面活性剂的组合物
Schick III et al. Understanding loss of soluble high molecular weight species during filtration of low concentration therapeutic monoclonal antibodies
CN115279780A (zh) 蛋白质生物工艺
CN113692420B (zh) 用于纯化含蛋白质的溶液的聚酰胺介质及其制造方法
US7728145B2 (en) Industrial method for separation and purification of fentanyl by reverse phase preparative chromatography
CN116124936B (zh) 一种他氟前列素的有关物质检测方法
US20220348608A1 (en) Purification of proteins and viral inactivation
US20230182041A1 (en) Purification of antibodies
WO2023126903A2 (en) A process for separation and quantification of non-ionic surfactant
AU2022361768A1 (en) Separation of pre-peak and post-peak in fusion protein sample by using size exclusion high performance liquid chromatography

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination