MX2012001172A

MX2012001172A - Absorbente específico para la unión de proteínas y péptidos, y método de separación que usa el mismo.

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Publication number: MX2012001172A
Application number: MX2012001172A
Authority: MX
Inventors: Klaus Gottschall; Markus Arendt; Andreas Kirschfeld; Christian Meyer; Markus Weis; Martin Welter; Lothar Ziser
Original assignee: Instraction Gmbh
Priority date: 2009-07-28
Filing date: 2010-07-28
Publication date: 2012-09-07
Also published as: IL217785A; JP6195443B2; KR101866265B1; CA2769040A1; CN102574102A; US9868108B2; WO2011012302A1; CN102574102B; SG178173A1; EP2459308A1; ZA201200724B; JP2013500291A; AU2010278295A1; IL217785A0; KR20120047269A; US20170106349A1; US20140046023A1; EA201290076A1

Abstract

Absorbente que comprende un material de soporte sólido, la superficie del cual comprende primeros residuos que comprenden una estructura heteroarornática binuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, O, S, y segundos residuos que comprenden una estructura heteroaromática mononuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, O, S.

Description

ABSORBENTE ESPECÍFICO PARA LA UNIÓN DE PROTEÍNAS Y PÉPTIDOS, Y MÉTODO DE SEPARACIÓN QUE USA EL MISMO Campo de la Invención La presente solicitud de patente se relaciona al campo de tecnología de separación de biomoléculas, en particular a biocromatografía .

Antecedentes de la Invención Tradicionalmente se ' han categorizado los medios de cromatografía para biomoléculas de acuerdo a uno o más de los siguientes modos posibles de interacción con la muestra: - Interacción hidrófoba ("fase invertida") - Interacción hidrófila ("fase normal") - Intercambio catiónico - Intercambio aniónico - Exclusión de tamaño - Quelación de iones metálicos Las mejoras perdurables en los títulos de procesos de fermentación técnica conducen a una demanda incrementada de tecnologías de purificación de etapa posterior simples, efectivas en el costo y altamente selectivas, capaces de manejar grandes capacidades de proteína sin aumentar en escala los volúmenes requeridos del líquido por el mismo factor. La aplicación tradicional por pasos de las categorías cromatográficas anteriores a un problema dado de separación se reflejó por consiguiente en una mejora estable paso por paso de la pureza del producto pero también en las pérdidas de producto en cada etapa que se acumulan seriamente al final, no mencionando el tiempo de operación y los · costos de los artículos. La introducción de cromatografía de afinidad en una etapa temprana en el proceso de etapa posterior puede ser una respuesta a esta demanda puesto que la reducción de una serie consecutiva de • pasos secuenciales de cromatografía en sólo uno se puede demostrar de esta manera muchas veces. Algunas veces la cromatografía de afinidad se considera como una clase de sí misma aunque, desde un punto de vista químico, se basa en los mismos modos de interacción como antes, pero usualmente en una combinación de dos o más modos. La característica principal de la cromatografía de afinidad es su alta especificidad de un analito pre-determinado que usualmente se basa en un par conocido de reconocimiento molecular de significado biológico tal como antígeno-anticuerpo, carbohidrato-lectina,, hormona-receptor, o entre hebras complementarias de ácido nucleico. Por lo tanto la mayoría de los absorbentes de afinidad se hacen a medida por el usuario final de acuerdo a su tarea particular de separación. Para producir un absorbente completamente funcional, el residuo de afinidad biológica se acopla, inmediatamente o mediante una correa opcional que permite más grado de libertad en el movimiento de traslación y rotación del residuo, por la elección de sólo unas pocas técnicas de bioconjugación normal a un material de soporte que por si mismo puede estar comercialmente disponible. La vida en anaquel de este absorbente normalmente es sólo corta y frecuentemente tiene que ser preparado a demanda.

Adicionalmente, los ligandos de afinidad, sintéticos, tal como péptidos sintéticos lineales o cíclicos, cortos o peptidomiméticos, pero también ciertos tintes reactivos (principalmente tintes de triazina) se han encontrado que interactúan específicamente por grupo con biomoléculas . Estas últimas son residuos de bajo peso molecular, baratos y fáciles de preparar que carecen de las desventajas de las inestabilidades y variabilidades en las estructuras terciarias de biopolímeros . Además, debido a su pequeño tamaño molecular y su química de activación fuerte y ajustable, se pueden inmovilizar eficientemente en una orientación dirigida sobre soportes sólidos aún sin unión larga, en tanto que los biopolímeros bajo las mismas condiciones sufren frecuentemente de carencia de actividad después de inmovilización debido a desplegado, impedimento estérico, u orientación aleatoria. En cualquier caso, el componente del absorbente que está comprendido activamente en el proceso de reconocimiento usualmente está presente sólo en la superficie (frecuentemente como una monocapa unida a superficie) de un sólido de soporte.

Con la excepción de materiales de soporte, sólidos, homogéneos, son bien conocidos del estado de la técnica los absorbentes que consisten de una morfología en sección transversal de dos capas de acuerdo al esquema general de un material de soporte, sólido, a granel, cuya superficie esté cubierta con una película delgada de un polímero reticulado. En el pasado se han usado principalmente polímeros tal como polibutadieno pesadamente reticulado (por radiación) , poliestireno, polisiloxano, poli (met ) acrilato, y poliamidas. Se han empleado principalmente con el propósito de crear una interfaz densa que protege el medio circundante de interacciones indeseadas con la parte subyacente ("portador") del material de soporte, sólido. Estas interacciones pueden conducir a unión no específica o aún irreversible de biomoléculas al absorbente en tanto que, por otra parte, los constituyentes del material de soporte sólido o sus enlaces químicos a los residuos se pueden oxidar por componentes agresivos de ya sea la muestra o el eluyente. Los absorbentes revestidos con polímero se conocen básicamente para aplicaciones en todas las categorías cromatográficas como se listan anteriormente, pero en particular para interacción hidrófoba y exclusión de tamaño. También se conocen revestimientos de polímero que no están internamente reticulados sino injertados al material portador como- cadenas lineales o ramificadas, tal como las llamadas resinas de tentáculo.

La cromatografía de afinidad, por otra parte, se ha llevado a cabo principalmente con resinas de fase en gel a granel. Los materiales pre-eminentes formadores de gel son polisacáridos de reticulación media, poliacrilamidas y poli (óxidos de etileno) . Estos hidrogeles aseguran una interfaz biocompatible que puede acomodar bien tanto el residuo activo como el analito biológico que interactúa con este debido a su blandura (flexibilidad conformacional , módulo elástico) sistemas de poros grandes, alta polaridad y alto contenido de agua, así como la ausencia de grupos químicos reactivos o desnaturalizantes. Son capaces de retener proteínas en su estado nativo, es decir, conservar su estructura tridimensional, correctamente plegada, estado de asociación, e integridad funcional. Esto es en gran parte una consecuencia del hecho que se pueden evitar los toluenos orgánicos que frecuentemente se requieren para eluir proteínas o péptidos de medios hidrófobos, fuertemente adsorbentes ("duros") . La carencia de resistencia intrínseca de adsorción del soporte se compensa de este modo por la introducción de ligandos biológicos, intactos, altamente específicos como compañeros de unión para el objetivo de separación que se acomodan bien dentro del hidrogel. La resistencia mecánica de estos medios es, sin embargo, mucho más débil que aquella de los materiales de soporte, inorgánicos puesto que son compresibles bajo una presión aplicada y no toleran el esfuerzo cortante provocado por la agitación, envasado de columna o altas velocidades de flujo de liquido. Los absorbentes de afinidad que son completamente compatibles con las condiciones fuertes de proceso de HPLC por lo tanto son raros.

Sólo en épocas recientes se ha reconocido que la resistencia mecánica de la fase estacionaria es una propiedad volumétrica del soporte de absorbente en tanto que sólo una capa delgada en la entrecara entre las fases estacionaria y móvil es responsable del intercambio de masa y de la interacción con el analito biológico. Por lo tanto, se ha mencionado el concepto de combinar la función de un núcleo tridimensional, poroso, mecánicamente muy rígido y dimensionalmente estable, y una capa de interfaz, tipo gel, biocompatible que tiene los residuos activos para la unión al analito, y se han solucionado técnicamente los problemas asociados de síntesis. Estos materiales híbridos emplean polímeros reticulados de forma suelta de alta polaridad en una base de ya sea un óxido inorgánico o un polímero densamente reticulado de baja polaridad.

Metodológicamente, se pueden preparar al aplicar el polímero de alta polaridad sobre el material de núcleo o al polimerizar directamente monómeros polares. Precursores de los mismos o un pre-polimero en la presencia del material de núcleo y un reticulador. La mayoría de los materiales preparados de acuerdo a este último método se están describiendo en la literatura como que tienen ya sea una morfología no penetradora de poro o de relleno de poro. En tanto que las películas no penetradoras padecen de áreas superficiales restringidas disponibles para la interacción con el analito y de esta manera de bajas capacidades de unión que sólo dependen del espesor de la película del polímero, las películas de relleno de poro tienen la ventaja de volumen de poro, interior, completo del material de núcleo en la interacción con un analito, que usualmente da por resultado buenas capacidades de unión pero lentas velocidades de transferencia difusional de masa dentro de los poros y sin ética de intercambio con la fase móvil. Una película de polímero que cubre, pero no rellena completamente, las superficies interiores del material de núcleo, sería benéfica a este respecto. El mejor representante conocido de esta clase entera de absorbentes es el sistema que consiste de polietilen-imina ramificada y opcionalmente reticulada de forma adicional, injertada sobre un material de núcleo, de soporte, de sílice, poroso. Se ha demostrado que estos absorbentes se pueden derivatizar adicionalmente pero se han comercializado sólo para intercambio iónico y aquellas aplicaciones de afinidad especificas a grupos que requieren sólo pequeños residuos normales .

Un planteamiento conceptual diferente a la producción de medios sintéticos de afinidad es la llamada técnica de "impresión molecular" que se basa en la complementariedad de forma y grupo funcional entre el sustrato objetivo y las cavidades poliméricas formadas durante una reacción de polimerización que se llevó a cabo en la presencia del sustrato objetivo y un porógeno, que se ha removido de forma subsiguiente. La impresión se ha desarrollado para un gran número de sustratos incluyendo proteínas y péptidos, y se puede dividir en un método covalente y no covalente, en tanto que se relacione la fijación temporal del objetivo. Sin embargo, se restringe a la formación de unos pocos tipos altamente reticulados de polímeros como materiales de soporte sólido y ha encontrado hasta ahora una amplia aceptación una vez que se alcanza la escala de producción, especialmente no para proteínas o péptidos farmacéuticos que están bajo el control de un cuerpo regulador.

Los medios de afinidad, más ampliamente usados para la purificación de inmunoglobulinas G (IgG) son proteínas A o G de unión a soporte, de las cuales se producen de forma natural en las paredes celulares de Staphylococci, así como la proteína L, pero todas requieren más bien alta inversión capital para aplicaciones a gran escala, que básicamente impide su uso como desechables. Se conoce que la proteína^ A se une a un epitopo particular en la parte Fe constante de anticuerpos. Por lo tanto, es de uso limitado en la purificación de fragmentos recombinantes de anticuerpo o productos de fusión que carecen de esta región. El uso repetido de absorbentes derivados de proteina se asocia, por otra parte con las desventajas de inestabilidad de estructura secundaria/terciaria de proteina y/o enlace químico hacia condiciones difíciles de producción, que da por resultado posible inactivación o fugas especialmente durante los tratamientos de desinfección fuertemente alcalinos, obligatorios entre corridas cromatográficas . Además de un intervalo de vida por consiguiente reducido, hay un debate actual de la aplicación de absorbentes de proteína A en la producción farmacéutica puesto que se sospecha que aún pequeñas cantidades de proteína A fugada provocan trastornos inmunológicos en humanos cuando los productos que se van a purificar son para uso farmacéutico in vivo. De esta manera, la aprobación del registro y la autorización esperada del mercado para un producto regulado son otros factores importantes en la decisión de un proceso de purificación técnica, y por lo tanto, tiene que llegar a ser una norma industrial que la cromatografía de proteína A se debe seguir por un paso adicional de cromatografía a fin de remover los tóxicos lixiviados .

Además, de los intentos de crear variantes manejadas de estas proteínas con propiedades técnicas mejoradas, como una consecuencia se produjeron unos pocos absorbentes que tienen ya sea sólo epítopos de péptidos muy cortos (no naturales) o aún residuos completamente sintéticos. Estos medios sintéticos útiles como alternativas de proteína A/G/L que están comercialmente disponibles se han revisado recientemente en la emisión de enero de 2007 de Journal of Chro atography B, volumen 848.

La utilidad de estructuras bi- y mono-nucleares, C, N, O, S-heteroaromáticas , en la siguiente ejemplaridad demostrada para las estructuras prototípicas de indol e imidazol, como residuos de adsorbentes de biocromatografía, se ha reconocido anteriormente, pero independientemente y sin reclamar los beneficios de su uso combinado. Sin embargo, se encuentran ejemplos de estructuras de imidazol más frecuentemente en la literatura científica y de patentes que estructural de indol. Una manera obvia de introducir una estructura de indol den un absorbente es por medio de acoplamiento de enlaces de amida con el aminoácido natural, histidina, una forma protegida de la misma, o con la histamina relacionada, con o sin una porción ligadora adicional. Se puede acoplar histamina al soporte mediante su grupo amino por técnicas de síntesis de fase sólida, dando por resultado una estructura de imidazol que no tiene grupos cargados o disociables adicionales. Con la histidina, son factibles dos opciones: acoplamiento a través de formación de amina . en el grupo amino lo que da por resultado una estructura de imidazol que contiene aún un grupo carboxílico desprotonable, o de manera alternativa a través de la formación de amida en el grupo carboxilo que da por resultado una estructura de imidazol que contiene aún un grupo amino protonable. Todas estas posibilidades diferentes se han logrado ya experimentalmente . De forma análoga, las estructuras de indol se pueden introducir fácilmente como residuos de triptófano o triptamina.

La cromatografía de afinidad en absorbentes de histidina se revisó extensivamente en Molecular Interactions in Bioseparations (Ed: T.T. Ngo) , Plenum Press, Nueva York 1993, Capítulo 18 (pp. 257-275) , y en Biochromatography (ed: M.A. Vij ayalakshmi ) , Taylor & Francis, Londres 2002, Capítulo 9 (pp. 252-271) . Una cuenta de los varios absorbentes que han sido de uso en la purificación de proteínas de plasma humanos se da en estas referencias junto con detalles de parámetros cromatográficos y métodos propuestos de interacción. Los aspectos prácticos de la cromatografía de afinidad de histidinas se resumieron por el mismo autor en Molecular Biotechnology 6 (1996), 347-357.

Algunos ejemplos con pertinencia para purificación de inmunoglobulinas se resaltarán en lo siguiente: Como un ejemplo anticipado, en Journal of Chromatography 376 (1986), 259-267, se acopló histidina a sefarosa mediante enlaces de epiclorohidrina o 1,4-butanodiol-diglicidil-éter y a sílice activada con epoxi. Se investigó el efecto de la preparación del absorbente en los resultados cromatográficos con varios analitos de proteínas y péptidos. El absorbente se empleó finalmente en la purificación a escala semipiloto de IgG placentaria placentaria, humana. La purificación de las subclases IgGi e IgG2 de plasma humano en histidil-aminohexil-sefarosa con un gradiente aplicado de sal se describió en Bioseparation 3 (1992), 47-53. In Journal of Chromatography B 667 (1995), 57-67, y nuevamente en Journal of Chromatography B 674 (1995), 13-21 se inmovilizó histidina en membranas de fibra hueca de poli (etileno-alcohol vinílico) activado con epiclorohidrina o butanodiol-diglicidil-éter para la separación en un paso selectivo de subclase de IgG de suero humano no tratado. El absorbente se empleó de forma reproducible en experimentos cromatográficos y de equilibrio individual bajo diferentes condiciones de amortiguador y de temperatura, que permitieron entendimientos del mecanismo de unión en la parte Fab del anticuerpo. El mecanismo de separación de las isoformas de HSA glicadas en diferentes sistemas amortiguadores en histidil-aminohexil-sefarosa entonces se estudio en Journal of Chromatography B 758 (2001), 163-172. El desempeño de histidina inmovilizada en un gel de sefarosa y en polietileno-alcohol vinilico se comparó adicionalmente a histidina-etilendiamina unida a un soporte de disco monolítico en la purificación de una enzima de restricción modelo de un extracto bacteriano de acuerdo a Chromatographia 65 (2007), 639-648. La mima publicación también reportó la adsorción de IgG pura sobre el medio monolítico y en el aislamiento de un anticuerpo monoclonal de un sobrenadante de cultivo celular.

Un planteamiento conceptualmente diferente para la producción de absorbentes con residuos de imidazol se siguió por los autores de Reactive Polymers 1_3 (1990), 177, y otros. Se preparó una película de polivinilimidazol en un soporte sólido a fin de preparar un absorbente que exhibió carácter de fase invertida.

En Analytical Biochemistry 201 (1992), 170-177, se usó un absorbente de agarosa con residuos de imidazol N-unidos mediante un enlace de divinilsulfona en el fraccionamiento de suero humano y se comparó absorbentes que contienen otros residuos aromáticos o heteroaromáticos bajo una variedad de condiciones de fase móvil. Se encontró que la unión es dependiente de la densidad de los residuos, pero los patrones de unión, se pensó siempre que contienen contribuciones de la porción de sulfona.

En Bioseparation 6 (1996), 165-184, se preparó una serie de absorbentes en donde^ se acopló histidina a través de tres diferentes ligadores a soportes de sefarosa. Los datos. de termodinámica, cinética y estabilidad se presentaron asi como las selectividades medidas en la separación de una mezcla artificial de IgGi murina con BSA y de IgGi murina de un filtrado de cultivo celular. En otro planteamiento reportado en Journal of Membrane Science 207 (2002), 253-264, los discos de membrana de nilón se revistieron covalentemente con capas de dextrano o alcohol polivinilico y se derivatizaron bajo activación de epibromohidrina con un ligador de hexanodiamina y finalmente con histidina. Los absorbentes de membrana se compararon a otras membranas de afinidad en su capacidad para unirse a IgG de humano.

De acuerdo a Reactive & Functional Polymers 3_4 (1997), 103-111, también se observó retención de IgG en un absorbente preparado a partir de un soporte de poli (butadieno-hidroxietilmetacrilato) e histidina después de la activación de soporte con epiclorohidrina o 1,4-butanodiol-diglicidil-éter .

La cromatografía con absorbentes que tienen residuos de histidina se comparó a otras técnicas de separación en Applied Biochemistry and Biotechnology 7_5 (1998), 93-102. Ahora enfocándose en aplicación de la purificación de anticuerpos (IgG, IgM) , se resumen los resultados obtenidos en membranas planas de sefarosa, nilón, nilón-alcohol polivinilico, y sílice, así como membranas de fibra hueca de polietileno-alcohol vinílico con histidina inmovilizada. La recuperación de anticuerpos directamente de sueros se encontró que es superior a captura tradicional en medio de proteína A o proteína G por lo que hasta ahora se puede retener un alto grado de funcionalidad. El absorbente se descubrió que tiene propiedades selectivas de la subclase de IgG.

En Journal of Chromatography A 814^ (1998), 71-81, se acoplaron aminopropilimidazol, histamina, aminometilbencimidazol, mercaptometilimidazol, y 2-mercaptobencilimidazol a cuentas activadas se sefarosa o celulosa. Se probó el comportamiento de retención de varias proteínas modelo en estos absorbentes bajo condiciones de elución que emplean un gradiente de sal o un cambio de pH. En otro ejemplo, se acopló 2-mercapto-l-metilimidazol mediante un ligador de 2-hidroxipropoxi a sefarosa como se describe en Journal of Biotechnology 7_9 (2000), 103-115. Se probó su adecuabilidad en el asilamiento de una proteasa ácida extracelular durante el tratamiento de un cultivo microbiano bajo condiciones de pH cercanas a la pl de la proteína.

También, el grupo amino de la histidina se acopló directamente o mediante un ligador de hexanodiamina a un monolito de copolimero de acrilato, que entonces se usó en la separación de IgG de suero humano, como se reporta en Biotechnology and Bioengineering 80 (2002), 481-489. Este residuo también exhibe un grupo carboxilato disponible para la interacción con el analito.

Separation Science and Technology .37 (2002), 717-731, y Reactive & Functional Polymers 61 (2004), 369-377, describieron la derivatización parcial de poli (2-hidroxietilmetacrilato) con residuos de histidina N-unidos y su uso repetido en la absorción reversible de IgG humana de plasma bajo varias condiciones experimentales. Se preparó un absorbente reticulado similar por copolimerización de metacrilato de 2-hidroxietilo con 2-metacrilamidohistidina de acuerdo a Macromolecular Bioscience 2 (2002), 135-144, y se usó de la misma manera. Se preparó otro copolimero de poli (etilenglicol-dimetacrilato-N-metacriloil-histidina-metiléster) de manera similar por la polimerización de suspensión en partículas magnéticas para el uso en adsorción de IgG sobre una columna de lecho fluidizado magnéticamente estabilizada, como se demuestra en Biotechnology Progress 20 (2004), 1169-1175. Adicionalmente, en Colloids and Surfaces A 301 (2007), 490-497, se describió un producto compuesto no covalente que comprende histidina en bentonita como un material de soporte sólido y se probó de una manera análoga.

El triptofanol y 2-aminobencimidazol fueron, entre otros residuos, acoplados cada uno independientemente a soportes de sefarosa como se describe en Journal of Chromatography A 1016 (2003), 21-33. Se midieron las capacidades de adelanto y las recuperaciones de BSA como un sistema modelo para biomoléculas negativamente cargadas y se compararon entre los diferentes absorbentes.

El ácido 2-mercapto-5-bencimidazol-sulfónico acoplado a cuentas de celulosa se describieron nuevamente en Journal of Chromatography B 808 (2004), 25-33. Los anticuerpos monoclonales de IgGi de fluido ascitico de ratón o sobrenadante de cultivo de células de hibridoma de rata asi como IgG de las fracciones II + III de Cohn de plasma humano se capturaron en el absorbente.

La solicitud de patente internacional WO 96/00735 (Massey University) reivindica un complejo formado entre una resina y una proteina o péptido unido a este, por lo que la resina comprende ligandos ionizables covalentemente unidos a un material de soporte sólido. La parte experimental y el mecanismo señalado de adsorción/desorción fue bastante idéntica con la siguiente patente (ver más adelante) . Como un ejemplo adicional, se monitorizó la unión de una variante de subtilisina de un caldo de fermentación a l-(3-aminopropil) imidazol unido mediante formación de amida sobre celulosa de ácido aminocaproico activado bajo condiciones amortiguadas de poca y bastante sal. La patente Europea relacionada EP 783366 (Massey üniversity) reivindica resinas con una densidad relativamente alta de uno o más residuos ionizables, y opcionalmente residuos no ionizables adicionales, unidos a un soporte mediante brazos separadores. Se adsorben analitos a las resinas bajo condiciones de poca carga electrostática, hidrófobas, y se desorben a un pH de mayor carga electrostática. Se dieron como ejemplos 1- ( 3-aminopropil) imidazol (opcionalmente unido a un separador aminocaproico), 2- (aminometil) bencimidazol, histamina, mercaptobencimidazol, 2-mercapto-l-metilimidazol, y residuos de triptamina. Se usaron ya sea soportes de sefarosa o celulosa después de su activación con epiclorohidrina, éter glicidilico de alilo, bromuro de alilo, o carbonil-diimidazol . Se presentaron datos de titulación ácida de los diferentes residuos absorbentes.

La solicitud de patente internacional WO 2006/066598 (Versamatriz A/S) reivindica absorbentes que tienen residuos covalentemente inmovilizados, cada uno de los residuos que contiene grupos tanto catiónicos como hidrófobos en un intervalo dado de distancias separadas entre ellas. Se inmovilizaron varios péptidos cortos o peptidomiméticos en resinas sintéticas y se probaron para su adecuabilidad en la separación de anticuerpos monoclonales para ilustrar la invención.

La patente europea EP 764048 (Biosepra Inc.), •reivindica absorbentes que contienen residuos heterociclicos de 5 miembros opcionalmente sustituidos que se enlazan a un material de soporte sólido mediante un puente de tioéter. Los ejemplos datos incluyeron absorbentes preparados de 2-amino- y 2-mercaptoimidazol y soportes sólidos activados con epoxi con poros rellenos con hidrogel. El absorbente de 2-mercatoimidazol se usó exitosamente en la purificación de IgG de calostro bovino. La solicitud de patente internacional WO 2004/024318 (Ciphergen Biosystems Inc.), reivindica absorbentes que tienen residuos heteroaromáticos mono- o poli-ciclicos con ciertos sustituyentes aniónicos que se enlazan mediante un grupo mercapto, éter o amino o material de soporte sólido. Como un ejemplo, se inmovilizó ácido 2-mercaptobencimidazol-sulfónico en cuentas de celulosa, cuentas porosas de zirconia, y como un revestimiento basado en dextrano en sílice. Se separaron los anticuerpos de suero bovino y de suero de leche por cromatografía en material modificado por celulosa.

La patente europea EP 921855 (Upfront Chromatography A/S) reivindica un método para el aislamiento de IgG en una solución en un absorbente que consiste de residuos de bajo peso molecular unidos a separador seleccionados de bencimidazoles, benzotiazoles y benzoxazoles, en un material de soporte. Se probó 2-mezcaptobencimidazol en un soporte de agarosa activado con epiclorohidrina para su estabilidad alcalina y luego se usó para aislar anticuerpos monoclonales de un sobrenadante de-cultivo artificial asi como anticuerpos policlonales de varios sueros animales y de yema de huevo, también se describió un absorbente que contiene residuos de 2-mercapto-5-nitrobencimidazol .

Se reportan en forma de ejemplo en la solicitud de patente internacional WO . 01/38227 (Amersham Pharmacia Biotech AB) absorbentes de sefarosa que exhiben ya sea residuos de triptofanol, 2-aminobencimidazol o histidina, que se unieron mediante ligadores cortos al material de soporte sólido, y se midieron sus propiedades de intercambio aniónico contra cuatro proteínas modelo. Se reivindica un método para unir un sustrato negativamente cargado de un líquido acuoso con un absorbente que tiene residuos con propiedades que simultáneamente son de intercambio aniónico e hidrófobas, cada residuo que comprende una estructura de arilamonio, unida a separador, especificada. En la solicitud de patente internacional WO 2005/082483 (Amersham Pharmacia Biotech AB) se reivindica un método para la captura de anticuerpos de un líquido sobre un absorbente en donde el absorbente tiene residuos que comprenden cada uno al menos dos diferentes estructuras: un grupo de intercambio catiónico y un sistema de anillo C, S, O- (hetero) aromático . La cromatografía en un absorbente de 2-aminobencimidazo-sefarosa bajo condiciones de no unión se usó en los ejemplos como un paso de pulido de flujo de paso para IgGi humanizada pre-purificada obtenida de un cultivo de células CHO. En la solicitud de patente internacional WO 2006/043895 (GE Healthcare Bio-Sciences AB) , se reivindica un método para la separación de anticuerpos de un líquido que usa un absorbente que tiene dos diferentes grupos, el primero que es capaz de interactuar con cargas negativas en un analito y el segundo que es capaz de una interacción sin carga respectiva. El absorbente retiene las impurezas de la muestra en tanto que los anticuerpos pasan a través de la misma. Como un ejemplo, se separaron anticuerpos monoclonales de proteína A y proteínas de células hospedadoras por cromatografía en un absorbente que contiene residuos de 2-aminobencimidazol en un soporte de sefarosa activada .

La US 6,071,416 se refiere a composiciones que comprenden uno o más ligandos de hidrocarburos aromáticos N-cíclicos, los compuestos de los cuales contienen al menos dos, y de manera preferente cuatro o más grupos N-cíclicos unidos a través de un separador hidrófilo apropiado que se agrupa a un soporte sólido y al uso de estas composiciones en la remoción o concentración de iones específicos de soluciones .

La O 97/10887 se refiere a ligandos de afinidad, a su separación y unión a matrices que pueden consistir de materiales sólidos, semi-sólidos, en partículas o coloidales, o polímeros solubles, y al uso de los mismos en la purificación de materiales proteinaceos.

Objetos de la Invención Un objeto de la invención es proporcionar un nuevo método de purificación para proteínas y péptidos y un absorbente para realizar este método.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a un absorbente que comprende un material de soporte sólido, la superficie del cual comprende al menos dos diferentes residuos entre los cuales son primeros residuos que comprenden una estructura heteroaromática binuclear que comprenden además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, O, S, y segundos residuos que comprenden una estructura heteroaromática mononuclear que comprenden además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, O, S. opcionalmente, estos al menos dos residuos se portan por una película de un polímero reticulado que cubre esta superficie. Debido al origen completamente sintético, al absorbente se caracteriza por una alta fortaleza física (particularmente térmica) y química, aunque aun permite la separación especifica de biomoléculas bajo condiciones . fisiológicas suaves, aún de matrices de muestra desfavorables. También se proporcionan métodos alternativos • para la preparación de este absorbente.

La invención también se refiere a un método para separar o incrementar la concentración y/o pureza de una .proteína o péptido en una mezcla que contiene el péptido o proteína. El método comprende poner en contacto la mezcla con un absorbente de acuerdo a la invención al cual se . une la proteína o péptido deseado, la elución subsiguiente de la proteína o péptido del absorbente, y opcionalmente un paso intermedio de enjuague.

También se describen varios productos bioquímicos analíticos y preparativos así como aplicaciones médicas en las cuales se puede emplear de forma benéfica el absorbente y/o el método. Los anticuerpos purificados de acuerdo al método se caracterizan por porcentajes de recuperación, pureza, y actividad biológica que son comparables a aquellos obtenidos mediante técnicas convencionales de separación por bioafinidad, sin padecer de las desventajas de estas técnicas .

De acuerdo a un aspecto general, el absorbente de acuerdo a la invención comprende un material de soporte sólido, la superficie del cual comprende primeros residuos que comprenden una estructura heteroaromática binuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los • heteroátomos N, 0, S, y segundos residuos que comprenden una estructura heteroaromática mononuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S.

En una modalidad, la estructura heteroaromática binuclear es una estructura de benzofirrol (indol) , incluyendo todas las posibles estructuras de aza- benzopirrol, oxa-benzopirrol y tia-benzopirrol, o una estructura de benzopiridina (quinolina o isoquinolina) , incluyendo todas las posibles estructuras de aza- benzopiridina, oxa-benzopiridina y tia-benzopiridina.

En una modalidad, la estructura heteroaromática mononuclear comprende un núcleo heteroaromático de cinco miembros.

En una modalidad, la estructura heteroaromática mononuclear es estructura de pirrol, que incluye todas las posibles estructuras de aza-pirrol, oxa-pirrol y tia-pirrol tal como 3-azapirrol (imidazol) .

En una modalidad, la estructura heteroaromática mononuclear no comprende un núcleo heteroaromático de 6 miembros .

En una modalidad, la estructura heteroaromática mononuclear comprende un núcleo heteroaromático de 6 miembros bajo la condición que el núcleo heteroaromático de seis miembros no sea un anillo de triazina o un anillo de pirimidina .

En una . modalidad, los primeros y/o segundos residuos comprenden un ligador.

En una modalidad, los primeros y/o segundos residuos comprenden un ligador covalente, conformacionalmente flexible de una longitud de 1 a 20 átomos .

En una modalidad, el ligador conformacionalmente flexible, covalente no contiene azufre.

En una modalidad, los ligadores comprenden independientemente entre sí de 1 a 300 átomos de carbono, por ejemplo, de 20 a 300 átomos de carbono. En esta modalidad, el ligador consiste de o comprende porciones de polietilenglicol .

En una modalidad, el ligador no comprende una estructura heteroaromática adicional, particularmente no un anillo de triazina o pirimidina.

En una modalidad, los sustituyentes adicionales se une a la estructura heteroaromática binuclear y/o mononuclear gue comprende al menos uno de los heteroátomos N, O, S, respectivamente.

En una modalidad estos sustituyentes adicionales no comprenden grupos de intercambio catiónico (es decir, negativamente cargados) , o la estructura heteroaromática binuclear y/o mononuclear no comprende grupos de intercambio catiónico (es decir, negativamente cargados) .

En una modalidad, los sustituyentes adicionales no comprenden grupos de intercambio catiónico que comprenden grupos sulfato, sulfonato, fosfato, o fosfonato; o la estructura heteroaromática binuclear y/o mononuclear no comprende grupos de intercambio catiónico que comprenden grupos sulfato, sulfonato, fosfato, o fosfonato.

En otra modalidad, los sustituyentes adicionales no comprenden grupos de intercambio catiónico seleccionados de grupos sulfato, sulfonato, fosfato, o fosfonato; o la estructura heteroaromática binuclear y/o mononuclear no comprende grupos de intercambio catiónico seleccionados de. grupos sulfato, sulfonato, fosfato, o fosfonato.

En una modalidad los primeros y segundos residuos están presentes en una relación molar de 3:2 a 2:3, de manera preferente en una relación de aproximadamente 1:1.

En una modalidad el primer residuo comprende el segundo residuo.

En una modalidad, la . superficie del material de soporte sólido comprende adicionalmente terceros residuos y opcionalmente también cuartos residuos.

En una modalidad los terceros residuos comprenden una estructura de amina o amida, de manera preferente una estructura de amina primaria.

En una modalidad, los primeros, segundos, y terceros residuos están presentes en una relación molar de aproximadamente 1:1:2.

En una modalidad, la densidad total de residuos da cuenta de 0.1 mol dm"3 a 1.0 mol dm~3, de manera preferente al menos aproximadamente 0.3 mol dm"3.

En una modalidad cada tipo de residuo está distribuido homogéneamente y aleatoriamente/estadísticamente en la estructura del material de soporte sólido.

En una modalidad, el material de soporte sólido consiste de un portador, la superficie del cual se cubre con una película de un polímero que tiene grupos funcionales que tiene los primeros y segundos, y opcionalmente los terceros y cuartos residuos.

En una modalidad, el polímero consiste de cadenas individuales que están covalentemente reticuladas entre sí, pero que no se injertan covalentemente ni se unen a la superficie del portador.

En una modalidad, las cadenas de polímeros se reticulan covalentemente entre sí a un grado de 2 % a 20 % en base al número de grupos funcionales disponibles para reticulación .

En una modalidad, el polímero consiste de cadenas individuales que se injertan covalentemente a la superficie del portador, pero no se reticulan covalentemente entre sí.

En una modalidad, las cadenas de polímero se injertan covalentemente a la superficie del portador mediante sus grupos funcionales, terminales.

En una modalidad, la película de polímero da cuenta de 5 % a 30 %, de manera preferente de 15 % a 20 %, del peso total del absorbente.

En una modalidad, el polímero se puede hinchar en un medio acuoso o mezclado acuoso-orgánico .

En una modalidad, el polímero es un polielectrolito sintético.

En una modalidad, las conexiones de reticulación o de injerto del polímero y/o los enlaces de los residuos se hacen de enlaces de amida, uretano, urea, o amina secundaria/terciaria.

En una modalidad, el polímero es un polímero parcialmente derivatizado seleccionado del grupo que consiste de alcohol polivinílico, polivinilamina, polialilamina, polietilen-imina, ácido poliacrílico, y ácido polimetacrílico, o cualquier mezcla de copolímero o polímero que comprenda al menos uno de estos polímeros.

En una modalidad, el polímero es polivinil-amina .

En una modalidad, el material de soporte sólido o al menos el portador es un material poroso que tiene un tamaño de poro de 10 nm a 400 nm, o un área superficial específica de 1 m2 g_1 a 1, 000 m2 g-1, o una porosidad de 30 % a 80 % en volumen.

En una modalidad, el material de soporte sólido es un material en partículas que tiene un tamaño de partículas de 5 µp? a 500 µ??.

En una modalidad, el material de soporte sólido es un material tipo hoja o fibra tal como una membrana.

En una modalidad, el material del que se hace el portador es diferente del material del que se hace la película de un polímero.

En una modalidad, el material de soporte sólido o al menos el portador se hace de un material seleccionado del grupo que consiste de poliestireno genérico o modificado en superficie, ácido poliestireno-sulfónico, poliacrilatos, polimetacrilatos, alcohol polivinílico, sílice, vidrio, almidón, celulosa, agarosa, sefarosa, y dextrano, o productos compuestos del mismo.

En una modalidad, el absorbente comprende adicionalmente una marca fácilmente detectable tal como una marca ópticamente absorbente, ópticamente emisora, radioactiva, magnética o codificadora en masa o radiofrecuencia .

La invención también se refiere a un método para preparar un absorbente, que comprende: (i) proporcionar un polímero que tiene grupos funcionales ; (ii) adsorber una película de polímero sobre la superficie de un portador; (iii) reticular una porción definida de los grupos funcionales del polímero absorbido con al menos un reactivo reticulador; (iv) derivatizar adicionalmente porciones definidas de los grupos funcionales del polímero reticulado con primeros residuos que comprenden una estructura heteroaromática binuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, O, S, y con segundos residuos que comprenden una estructura heteroaromática mononuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, O, S, y con residuos adicionales, opcionales.

La invención también se refiere a un método para preparar un absorbente, que comprende: (i) proporcionar un polímero que tiene grupos funcionales ; (ii) derivatizar porciones definidas de los grupos funcionales con primeros residuos que comprenden una estructura heteroaromática binuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, O, S, y con segundos residuos que comprenden una estructura heteroaromática mononuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, O, S, y con residuos adicionales, opcionales; (iii) adsorber una película del polímero derivatizado sobre la superficie de un portador; (iv) reticular una porción adicional, definida de los grupos funcionales del polímero absorbido con al menos un reactivo reticulador.

La invención también se refiere a un método para preparar un absorbente, que comprende: (i) proporcionar un polímero que tiene grupos funcionales ; (ii) adsorber una película del polímero sobre la superficie de un portador; (iii) injertar una porción definida de los grupos funcionales del polímero adsorbido al portador; (iv) derivatizar las porciones definidas adicionales de los grupos funcionales del polímero injertado con primeros residuos que comprenden una estructura heteroaromática binuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S, y con segundos residuos que comprende además de átomos de carbono una estructura heteroaromática mononuclear que comprende al menos uno de los heteroátomos N, 0, S, y con residuos adicionales, opcionales.

La invención también se refiere a un método para preparar un absorbente, que comprende: (i) proporcionar un polímero que tiene grupos funcionales ; (ii) derivatizar porciones definidas de los grupos funcionales con primeros residuos que comprende una estructura heteroaromática binuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S, y con segundos residuos que comprende una estructura heteroaromática mononuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S, y con residuos adicionales, opcionales; (iii) adsorbe una película del polímero derivatizado sobre la superficie de un portador; (iv) injertar una porción definida, adicional de los grupos funcionales del polímero adsorbido al portador.

En una modalidad de los métodos para preparar un absorbente, el polímero es soluble en medios acuosos o acuosos-orgánicos mezclados.

En una modalidad, los grupos funcionales del polímero son grupos -NH-, -NH2, -OH, -C00H o -CO0- .

En una modalidad, el polímero tiene un peso molecular de entre 5,000 Daltones y 50,000 Daltones.

En una modalidad, el por lo menos un agente reticulador se selecciona del grupo que consiste de ácidos dicarboxílicos, diaminas, dioles, y bis-epóxidos .

En una modalidad, el por lo menos un reactivo reticulador es una molécula lineal, conformacionalmente flexible de una longitud de entre 1 y 20 átomos.

En una modalidad, el paso de derivatización se llevó a cabo por formación de enlaces de amida entre grupos funcionales y residuos.

En una modalidad, el paso de derivatización se llevó a cabo gradualmente con cada residuo.

La invención también se refiere a un método para separar, o para incrementar la concentración y/o pureza de una proteína o péptido de una mezcla que contiene la proteína o péptido, que comprende: (i) poner en contacto la mezcla que se va a disolver o suspender en un primer líquido con un absorbente de acuerdo a la invención o con un absorbente preparado de acuerdo a un método de la invención, durante un período de tiempo suficiente para permitir que la proteína o péptido se llegue a unir al absorbente; (ii) opcionalmente enjuagar el absorbente con un segundo líquido; (iii) poner en contacto el absorbente con la proteína o péptido unido con un tercer líquido durante un período de tiempo suficiente para permitir que la proteína o péptido se llegue a liberar del absorbente; (iv) opcionalmente lavar y/o regenerar el absorbente con un cuarto y/o un quinto líquido.

En una modalidad, del método para separar, o para incrementar, la concentración y/o pureza de una proteina o péptido, el primer liquido, el segundo liquido, y el tercer liquido son medios acuosos amortiguador, que no contienen adicionalmente modificadores orgánicos.

En una modalidad, el segundo liquido es el mismo como el primer liquido.

En una modalidad, el pH del primero y opcionalmente del segundo liquido está cerca al punto isoeléctrico pl de la proteina o péptido objetivo o diana.

En una modalidad, el pH del tercer liquido es diferente, en particular, menor, que el pH del primer y opcionalmente del segundo liquido.

En una modalidad, el pH del primer liquido está en el intervalo de 5.5 a 8.5 y el pH del tercer liquido está en el intervalo de 3 a 6.5.

En una modalidad, la concentración iónica del tercer liquido es diferente, en particular mayor, que la concentración iónica del primero y opcionalmente del- segundo liquido .

En una modalidad, el método se lleva a cabo como una técnica de filtración con membrana, una técnica de extracción en fase sólida o como una técnica de cromatografía líquida de alta a media presión.

En una modalidad, el método comprende además el aislamiento de la proteina o péptido liberado del tercer liquido subsiguiente al paso (iii) .

En una. modalidad, la proteina o péptido liberado del paso (iii) contiene menos de 10 ppm de absorbente lixiviado u otras sustancias lixiviables del mismo.

En una modalidad, el método se combina con procesos adicionales de separación tal como precipitación, centrifugación, secado, (micro-/ultra-) filtración, diálisis, intercambio . iónico o tratamientos de reducción viral.

En una modalidad, la mezcla que contiene la proteina o péptido es un producto biosintético crudo o parcialmente purificado, obtenido de un organismo o un cultivo celular o de un extracto de cultivo.

En una modalidad, la proteina o péptido tiene un punto isoeléctrico pl de 5.5 a 8.5 y un peso molecular de 100 a 500,000 Da.

En una modalidad, la proteina o péptido es un anticuerpo, o un fragmento del mismo, asociados oligoméricos del mismo, o una proteina de fusión que contiene un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

La invención también se refiere a una columna para cromatografía líquida o extracción en fase sólida que comprende un absorbente de acuerdo a la invención o un absorben preparado de acuerdo a un método de acuerdo a la invención como una fase estacionaria dentro de una contención tubular y opcionalmente componentes adicionales tal como fritas, placas de filtro, distribuidores de flujo, sellos, accesorios, roscas, válvulas u otros elementos de conexión o manejo de fluidos.

En una modalidad, el método se caracteriza adicionalmente por su resistencia física y química contra presiones aplicadas de hasta 20 bar, contra calor aplicado hasta 110 °C, así como contraprotocolos comunes de desinfexión, que permiten de este modo su uso repetitivo de hasta 1,000 veces, de manera preferente hasta 5,000 veces.

La invención también se refiere a una colección de una pluralidad de los mismos o diferentes absorbentes de acuerdo a la invención o de absorbentes preparados de acuerdo a un método de acuerdo a la invención o de columnas de acuerdo a la invención en el formato de un arreglo de microplaca o microcircuito, o un dispositivo multicapilar o microfluídico, capaz de ser procesado en paralelo.

La invención también se refiere a un equipo de purificación de laboratorio de diagnóstico que comprende un absorbente de acuerdo a la invención o un absorbente preparado de acuerdo a un método de acuerdo a la invención o una columna de acuerdo a la invención o una colección de absorbentes o columnas de acuerdo a la invención y con la misma unidad de envasado, reactivos químicos o biológicos adicionales y/o desechables necesarios para llevar a cabo el método de acuerdo a la invención o un diferente método analítico, de diagnóstico de laboratorio diferente del mismo.

La invención también se refiere al uso de un absorbente de acuerdo a la invención o un absorbente preparado de acuerdo a un método de acuerdo a la invención en la elaboración de una composición farmacéutica o nutricional que comprende al menos una proteina o péptido de valor diagnóstico, terapéutico o nutricional.

La invención también se refiere al uso de un absorbente de acuerdo a la invención o un absorbente preparado de un método de acuerdo a la invención en la remoción de al menos una proteína o péptido, y en la prevención médica o tratamientos de enfermedades que se provocan por la presencia de la por lo menos una proteína o péptido .

La invención también se refiere al uso de un absorbente de acuerdo a la invención o un absorbente preparado de acuerdo a un método de acuerdo a la invención en la identificación, caracterización, cuantificación, o purificación en laboratorio de al menos una proteína o péptido .

La invención también se refiere al uso de un absorbente de acuerdo a la invención o un absorbente preparado de acuerdo a un método de acuerdo a la invención para la inmovilización reversible de al menos una proteina o péptido y probar opcionalmente para la unión de estructuras químicas o biológicas adicionales a la proteína o péptido.

De acuerdo a un primer aspecto, la invención se refiere a un absorbente que comprende un material de soporte sólido, la superficie del cual comprende: - un primer residuo que comprende una estructura heteroaromática binuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S; y - un segundo residuo que comprende una estructura heteroaromática mononuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S; caracterizado en que el primero y segundo residuos no están directamente conectados entre sí sino que se unen de forma separada a ya sea un material de soporte sólido a granel en sí mismo o una película de polímero soportada por este como portador .

En una modalidad, la estructura heteroaromática binuclear es una estructura de benzopirrol (indol) , incluyendo todas las estructuras posibles de asa-benzopirrol, oxa-benzopirrol , y tia-benzopirrol , o una estructura de benzopiridina (quinolina o isoquinolina) , incluyendo todas las estructuras asa-benzopiridina, oxa-benzopiridina, y tia-benzopiridina .

En una modalidad, la estructura heteroaromática mononuclear es una estructura de pirrol, incluyendo todas las posibles estructuras de aza-pirrol, oxa-pirrol, y tia-pirrol tal como asa-azapirrol (imidazol) .

En una modalidad, el primero y/o segundo residuo comprende un ligador conformacionalmente flexible, covalente de una longitud de 1 a 20 átomos.

En una modalidad, la superficie del material de soporte sólido comprende adicionalmente un tercer residuo y opcionalmente un cuarto residuo.

En una modalidad, el tercer residuo comprende una estructura de amida o amina o una estructura de amina primaria .

En una modalidad, el primero, segundo, y tercer residuo están presentes en una relación molar de aproximadamente 1:1:2.

En una modalidad, la superficie del material de soporte sólido se cubre con una película de un polímero que comprende un primer y un segundo grupo funcional, que pueden ser los mismos o que pueden ser diferentes entre sí, que a su vez portan un primero y un segundo y opcionalmente un tercer y un cuarto residuo.

En una modalidad, el polímero comprende o consiste de cadenas individuales que se reticulan covalentemente entre sí, pero que no se unen covalentemente o se injertan a la superficie del portador.

En una modalidad, el polímero es una poliamida, o una polivinil-amina, o una mezcla de copolímeros o polímeros que comprende una poliamina.

En una modalidad, una primera porción de los grupos funcionales del polímero adsorbido se retícula con al menos un reactivo reticulador, y en donde una segunda porción de los grupos funcionales del polímero reticulado se une al primero y segundo, y opcionales residuos adicionales.

La invención también se refiere a un método para preparar un absorbente de acuerdo al primer aspecto de la invención, que comprende: (i) proporcionar un polímero que tiene un primer y un segundo grupo funcional; (ii) adsorber una película del polímero sobre la superficie de un portador; (iii) reticular una primera porción de los grupos funcionales del polímero adsorbido con al menos un reactivo reticulador; (iv) unir una segunda porción de los grupos funcionales del polímero reticulado con los primeros, segundos, y opcionales residuos adicionales.

La invención también se refiere a un método para separar, o incrementar la concentración y/o pureza de una proteína o péptido de una mezcla que contiene la proteína o péptido, que comprende: (i) poner en contacto la mezcla que se disuelve o se suspende en un primer líquido con un absorbente de acuerdo al primer aspecto de la invención durante un período de tiempo suficiente para permitir que la proteína o péptido se llegue a unir al absorbente; (ii) enjuagar opcionalmente el absorbente con un segundo líquido; (iii) poner en contacto el absorbente con la proteína o péptido unido con un tercer líquido durante un período de tiempo suficiente para permitir que la proteína o péptido se llegue a liberar del absorbente; (iv) lavar y/o regenerar opcionalmente al absorbente con un cuarto y/o quinto líquido.

En una modalidad, el pH del primero y opcionalmente del segundo líquido está cerca al punto isoeléctrico pl de la proteína o péptido objetivo.

En una modalidad, el pH del primero líquido está en el intervalo de 5.5 a 8.5 y el pH del tercer líquido está en el intervalo de 3 a 6.5.

En una modalidad, la proteína o péptido tiene un punto isoeléctrico pl de 5.5 a 8.5 y un peso molecular de 100 a 500,000 Da.

De acuerdo a un segundo aspecto, la invención se refiere a un absorbente que comprende un material de soporte sólido, la superficie del cual comprende - un primer y un segundo grupo funcional, que pueden ser los mismos o diferentes; - un primer residuo que comprende una estructura heteroaromática binuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S; y - un segundo residuo que comprende una estructura heteroaromática mononuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S; caracterizado en que el primer residuo se une al primer grupo funcional, y el segundo residuo se une al segundo grupo funcional.

De acuerdo a un tercer aspecto, la invención se refiere a un absorbente que comprende a un material de soporte sólido, la superficie del cual comprende - un primero y un segundo grupo funcional, que pueden ser los mismos o diferentes; - un primer residuo que comprende una estructura heteroaromática binuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S; y - un segundo residuo que comprende una estructura heteroaromática mononuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S; caracterizado en que el primero residuo se une al primer grupo funcional, y el segundo residuo se une al segundo grupo funcional; y en donde ninguno de los grupos funcionales se une tanto al primer residuo como al segundo residuo .

De acuerdo a un cuarto aspecto, la invención se refiere a un absorbente que comprende un material de soporte sólido, la superficie del cual comprende - un primer y un segundo grupo funcional, que pueden ser los mismos o diferentes; - un primer residuo que comprende una estructura heteroaromática binuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, O, S; y - un segundo residuo que comprende una estructura heteroaromática mononuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, O, S; caracterizado en que el primero residuo se une al primer grupo funcional, y el segundo residuo se une al segundo grupo funcional; bajo la condición que el material de soporte sólido no comprenda una porción de triazina o una porción de pirimidina.

De acuerdo a un quinto aspecto, la invención se refiere a un absorbente que comprende un material de soporte sólido, la superficie del cual comprende - un primero y un segundo grupo funcional, que pueden ser los mismos o diferentes; - un primer residuo que comprende una estructura heteroaromática binuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S; y - un segundo residuo que comprende una estructura heteroaromática mononuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S; caracterizado en que el primer residuo se une al primer grupo funcional, y el segundo residuo se une al segundo grupo funcional; con la condición que el material de soporte sólido no comprenda una porción de triazina o una porción de pirimidina; y en donde ninguno de los grupos funcionales se une tanto al primer residuo como al segundo residuo.

En una modalidad de acuerdo al segundo, tercero, cuarto o quinto aspecto, la estructura heteroaromática binuclear es una estructura de benzopirrol (indol) , que incluye todas las posibles estructuras de aza-benzopirrol, oxa-benzopirrol , y tia-benzopirrol, o una estructura de benzopiridina (quinolina o isoquinolina) , incluyendo todas las posibles estructuras de aza-benzopiridina, oxa-benzopiridina, y tia-benzopiridina .

En una modalidad, la estructura heteroaromática mononuclear es una estructura de pirrol, incluyendo todas las posibles estructuras de aza-pirrol, oxa-pirrol, y tia-pirrol tal como 3-azapirrol (imidazol) .

En una modalidad, el primero residuo o el segundo residuo o el primero y el segundo residuo se unen al primer y segundo grupo funcional mediante un ligador.

En una modalidad, de 5 a 95 %, o de 15 a 85 %, ó de 25 a 75 %, ó de 35 a 65 %, ó de 40 a 60 % del primer y segundo grupos funcionales se unen al primero como al segundo residuo, y en donde el primer y el segundo residuo están presentes en una relación molar de 3:2 a 2:3.

En una modalidad, el tercer residuo comprende una estructura de amina o amida, o una estructura de amina primaria .

En una modalidad, el primero, segundo, y tercer residuos están presentes en una relación molar de aproximadamente 1:1:2.

En una modalidad, la superficie del material de soporte sólido se cubre con una película de un polímero que comprende el primer y segundo grupos funcionales que a su vez tienen el primer y el segundo; y opcionalmente un tercero y un cuarto residuo.

En una modalidad, el polímero comprende o consiste de cadenas individuales que se reticulan covalentemente entre sí, pero que no injertan covalentemente a la superficie del portador.

En una modalidad, el polímero es una poliamiana parcialmente derivatizada, o una polivinil-amina, o una mezcla de- copolímeros o polímeros que comprenden una poliamina .

. En una modalidad, una primera porción del primer y segundo grupos funcionales se retícula con al menos un reactivo reticulador, y en donde una segunda porción del primero y segundos grupos funcionales se unen al primero y segundo, y opcionales residuos adicionales.

En una modalidad, la invención se refiere a un método para preparar un absorbente de acuerdo al segundo, tercer, cuarto o quinto aspecto, que comprende: (i) proporcionar un polímero que tiene un primer y un segundo grupo funcional; (ii) adsorber una película del polímero sobre la superficie del material de soporte sólido; (iii) reticular una primera función de los grupos funcionales del polímero adsorbido con los menos un reactivo reticulador; (iv) unir una segunda porción de los grupos funcionales del polímero reticulado con el primero, segundo y opcionales residuos adicionales.

En una modalidad, la invención se refiere a un método para separar, o para incrementar, la concentración y/o pureza de una proteína o péptido de una mezcla que comprende la proteína o péptido, que comprende: (i) poner en contacto la mezcla que se disuelve o se suspende en un primer liquido con . un absorbente de acuerdo al segundo, tercero, cuarto o quinto aspecto de la invención, durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la proteina o péptido se llegue a unir al absorbente; (ii) enjuagar opcionalmente el absorbente con un segundo liquido; (iii) poner en contacto el absorbente con la proteina o péptido unido con un tercer liquido durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la proteina o péptido se llegue a liberar del absorbente; (iv) opcionalmente enjuagar y/o regenerar el absorbente con un cuarto y/o quinto liquido.

En una modalidad, el pH del primero y opcionalmente del segundo liquido está cerca al punto isoeléctrico pl de la proteina o péptido.

En una modalidad, la proteina o péptido tiene un punto isoeléctrico pl de 5.5 a 8.5 y un peso molecular de 100 a 500000 Da.

Para el propósito de esta descripción, todas las modalidades como se lista para al absorbente de acuerdo al aspecto general de la invención se pueden combinar con el absorbente de acuerdo al primero, al segundo, al tercero, al cuarto y al quinto aspecto de la invención.

Descripción Detallada de la Invención El problema técnico que fundamente la presente invención se puede señalar como el de proporcionar un nuevo método de purificación para proteínas y péptidos que carece de las desventajas de los métodos anteriormente conocidos como se ha resumido en las secciones anteriores. Esto significa que el método debe permitir aislar la proteína o péptido buscado en un paso individual de la matriz de muestra a alta recuperación sin comprometerse su integridad funcional, en tanto que evita en su mayor parte materiales costosos pero que aún es suficientemente versátil para ser capaz de adherirse a protocolos normales de limpieza y desinfección del equipo en uso y asegurar de este modo la aceptación del método por las respectivas autoridades regulatorias, es decir, proporcionar la proteína o péptido buscado de una manera económicamente factible en calidad farmacéutica .

Este problema técnico ahora se puede solucionar al proporcionar un nuevo tipo de absorbente que se a emplear en un proceso de distribución de equilibrio sólido-líquido de la proteína o péptido que se va a purificar, que se puede distinguir de aquellos conocidos del estado de la técnica principalmente por su derivatización química doble, especifica con residuos, la derivatización que se adapta al problema de separar las proteínas o péptidos buscados de sus productos secundarios, particularmente de varias proteínas o péptidos diferentes, con una selectividad y sensibilidad que puede corresponder a aquella de los medios convencionales de afinidad pero que tiene una composición que está completamente desprovista de material biológico delicado que puede ser costoso de producir y/o que se degrada bajo condiciones difíciles. La alta durabilidad de todos los materiales empleados en la producción del absorbente también asegura la reproducibilidad a largo plazo de cualquier método de separación que use el absorbente, lo que puede llegar a ser obvio por la ausencia de efectos de deriva en los resultados de análisis.

De ayuda asistencial en la solución del problema técnico dado anteriormente es un montaje en capas del absorbente que comprende al menos dos diferentes materiales de los cuales uno es una película de polímero sintético o biosintético que tiene ambos residuos y que cubre el segundo material que sirve como una base sólida. Este montaje particular se caracteriza por una parte por un contenido de peso comparativamente alto y alta estabilidad física de la película de polímero, pero aún un grado más bien alto de flexibilidad de cadena que también da por resultado alta capacidad de captación de solvente y muestra así como su rápido intercambio difusional. La película de esta manera se mantiene en un estado tipo gel, y blando, homogéneo, biocompatible . Esto permite que la proteína o péptidos del analito se sumerjan con sus volúmenes moleculares parciales o completos en la capa que contiene estos elementos activos del absorbente responsable de la unión y migren ya sea a través de este o a lo largo de su superficie en tanto que se impide simultáneamente su desnaturalización. De esta manera se asegura la creación de un espacio de interacción casi tridimensional para los analitos y permite contactos de múltiples puntos entre los epítopos distribuidos sobre la superficie completa de la proteína o péptido y la fase en gel modificada con residuo. Los componentes de la muestra también se protegen de este modo de manera efectiva por la película de polímero de interacciones indeseadas con los constituyentes subyacentes del material de soporte sólido.

Con la intención de valorar el alcance completo de la presente invención y de volverlo más preciso, primero en los párrafos subsiguientes se define el significado de varios términos como se usa dentro del contexto de la presente invención más adelante. Se tiene que entender que todos los ejemplos se dan sólo para propósitos ilustrativos y no se proponen como una lista exhaustiva de modalidades. Las personas expertas en la técnica reconocerán ciertamente maneras adicionales y análogas para llevar a cabo la invención sin desviarse de su espíritu completo. La representación esquemática de la Figura 6 simboliza nuevamente la interrelación entre varios términos diferentes usados en la presente que se relacionan a la composición del absorbente .

El término "absorbente" significa cualquier material sintético o biosintético para el uso como una fase estacionaria en un proceso de distribución de equilibrio sólido <> líquido de una muestra, que exhibe propiedades de unión no covalente selectiva como un receptor para al menos una proteína o péptido objetivo, determinado, contenido en la muestra, o que es capaz de distinguir de sus propiedades de unión no covalente entre al menos dos péptidos o proteínas objetivo, determinadas, de diferente constitución contenidas en la muestra (es decir, alta diferencia constante de unión absoluta o alta diferencia constante de unión) . Por lo tanto, se diseña especialmente para solucionar una tarea de detección, separación, inmovilización o conversión (bio) química, analítica o preparativa, determinada que consiste frecuentemente de una combinación única de al menos una proteína o péptido objetivo, cuya constitución se puede conocer, se conoce parcialmente o se desconoce, y una matriz de muestra, cuya composición puede ser similarmente conocida, parcialmente conocida o desconocida.

Como lo opuesto a fases genéricas (que diferencia en analitos de acuerdo a parámetros acumulativos que se promedian básicamente sobre la molécula de analito completa tal como carga electrostática, momento de dipolo o lipofilicidad) , este absorbente se une, al menos en parte, por el concepto de complementariedad de grupo a al menos un dominio (epitopo) en la superficie molecular tridimensional de al menos una proteina o péptido objetivo. Este nuevo concepto por lo tanto también llega más allá del alcance de los llamados absorbentes de modo mezclado que, en un significado tradicional, se separan de acuerdo a una combinación de dos de los efectos promediados, clásicos. Los absorbentes de la presente invención de esta manera se diseñan al nivel molecular para unirse sólo a un péptido o proteina individual o a un grupo de proteínas o péptidos relacionados, estructuralmente cercanos con alta afinidad y alta selectividad individual o de grupo de entre un ambiente que puede contener un gran espectro de diferentes productos secundarios .

Como un "material de soporte sólido" se pueden usar todos los medios absorbentes no porosos y preferentemente porosos, conocidos por el experto en la técnica tal como todas las clases de óxidos minerales orgánicos tal como sílice, alúmina, magnesia, titania, zirconia, florisil, magnetita, zeolitas, silicatos (celita, tierra de diatomeas) , mica, hidroxiapatita, fluoroapatita, estructuras metal-orgánicas, cerámicas y vidrios tal como vidrio de poro controlado (CPG) , metales tal como aluminio, silicio, hierro, titanio, cobre, plata, oro y también grafito o carbono amorfo, papel, resinas de (bio) polímero tal como polisacáridos, poliacrilamidas, poliestirenos tal como AmberchromMR etc., ya sea de forma esférica o irregular, para acumular el absorbente. Los materiales de soporte sólido preferidos son poli (estireno-co-divinilbenceno) (especialmente poli (estireno-co-divinilbenceno) que está sulfonado en volumen o superficie como se usa en resinas de intercambio catiónico fuerte) , poliacrilatos, poilimetacrilatos, alcohol polivinílico, sílice, vidrio y polisacáridos tal como almidón, celulosa, ásteres de celulosa, amilosa, agarosa, sefarosa, mannao, xantano y dextrano. La introducción de una base sólida de una rigidez y dureza mínima como una función de soporte insoluble proporciona una base para el agrandamiento de la interfaz entre las fases estacionaria y móvil que es el lugar de interacción con la proteína o péptido como la base molecular para el proceso de su división entre estas fases, y para una resistencia mecánica incrementada y abrasividad, especialmente bajo condiciones de flujo y/o presurizadas . Los materiales de soporte sólido de acuerdo a la invención pueden ser de composición homogénea o heterogénea, y por lo tanto también incorporan materiales que son compuestos de uno o más de los materiales mencionados anteriormente, en particular productos compuestos de múltiples capas. En este contexto, las partículas magnéticas se mencionan de forma específica.

En una modalidad importante relacionada a esto, la superficie del material de soporte sólido se puede cubrir por una película de polímero. Esta película opcional se considera como una parte del material de soporte sólido puesto que todos los métodos de preparación y separación desarrollados e introducidos aquí que dependen de grupos funcionales o residuos en la superficie inmediata de un material de soporte sólido, a granel, unitario trabajan igualmente con grupos funcionales respectivos o residuos de esta sobrecapa de polímero. Adicionalmente, una topografía meso- o macro-porosa inherente al material de soporte sólido a granel frecuentemente se conservará en el proceso de revestimiento. Si en este material híbrido resultante la película de polímero de superficie se tiene que distinguir de todos los materiales por abajo del proceso de la invención, esta última se refiere resumidamente a individualmente como un "portador", o en otras palabras, el material de soporte sólido, híbrido comprenderá tanto el portador como la película de polímero. En la práctica, sin embargo, esta distinción frecuentemente es viable sólo si se conoce la historia de la preparación del absorbente. El portador como parte que proporciona la estructura rígida del absorbente es análogamente de condición física sólida y puede consistir de cualquiera de aquellos materiales listados anteriormente como materiales de soporte sólido que igualmente se pueden emplear de acuerdo a la invención como un material de soporte sólido, a granel sin que tenga una película superficial de polímero en la parte superior o como un portador para esta película superficial de polímero. Todas las características, opciones, y restricciones como se han señalado anteriormente excepto por la adecuabilidad para la absorción de un polímero aplican por lo tanto igualmente a ambos términos. Una modalidad central de la invención es por lo tanto un absorbente en donde el material de soporte sólido consiste de un portador, la superficie del cual se cubre con una película de un polímero que tiene grupos funcionales que tienen el primero y el segundo, y opcionalmente el tercero y cuarto residuos.

Si, como se prefiere, se usa un material poroso como el portador, la película de polímero cubrirá normalmente tanto su superficie externa como su superficie interna en su mayor parte más grande, de forma homogénea. Una "superficie" caracteriza de esta manera la interfaz completa de fases sólida-líquida del absorbente durante su preparación y aplicación como un agente de separación, donde se presenta el reconocimiento y unión de analitos por los residuos, y que es accesible a al menos unas proteina o péptido disuelto mediante flujo hidrodinámico (opcionalmente presurizado) , convección, perfusión, difusión, o electro-migración, o combinaciones de cualquiera de estos. Debido a la posible hinchazón de los portadores que comprenden materia blanda y especialmente de películas de polímero de superficie en líquidos apropiados, esto no es un límite bien definido pero puede comprender una capa intermedia de fase de gel. Las propiedades superficiales del absorbente pueden ser diferentes de las propiedades a granel de los materiales empleados. Esto es particularmente cierto si se usan dos diferentes materiales como un portador y una película de polímero, y si se usan métodos de preparación que conduzcan a áreas superficiales específicas extraordinariamente grandes .

La "cobertura" se puede lograr técnicamente por todos los medios de revestimiento conocidos por el experto en la técnica que ya sea puedan presentarse bajo fuerza de impulsión natural o se puedan implementar manualmente tal como adsorción espontánea, depósito en fase vapor, polimerización de la fase líquida, gaseosa o plasma, revestimiento giratorio, condensación en superficie, humectación, remojo, inmersión, cepillado, aspersión estampado, evaporación, aplicación de campos eléctricos o presión, asi como todos los métodos que se basen en automontaje molecular tal como por ejemplo, formación de cristales líquidos, de película de Langmuir-Blodgett o de capa por capa. La película de polímero se puede revestir de este modo directamente como una múltiple capa o como una secuencia gradual de monocapas individuales en la parte superior una de otra. En tanto que están relacionadas las macromoléculas, la "adsorción" en un punto individual o en múltiples puntos, ya sea espontánea o artificialmente acelerada, se considera en cualquier caso como que es el primer paso (incompleto) de cualquier proceso de revestimiento que inicie de una solución de polímero que esté en contacto físico con la superficie de un sólido. Requiere la presencia de algunas fuerzas físicas al menos débilmente atractivas (van der Waals) o, en el caso de funcionalización complementaria presente en el portador y/o polímero, de fuerzas químicas no covalentes más bien específicas entre la superficie sólida y cada hebra de polímero individual y si se absorben capas múltiples, también entre los polímeros dentro de las mismas y diferentes capas verticalmente apiladas a fin de formar al menos un agregado metaestable. Las fuerzas electrostáticas entre cargas de signo opuesto frecuentemente se utilizan para este propósito, la carga superficial del portador que se da de este modo por su potencial zeta. Puede presentarse adsorción inicial de una manera suelta e irregular que puede transformarse más adelante en un grado más grande de orden bi o tri-dimensional y/o densidad. Esto se puede atribuir a alguna . movilidad residual de las hebras de polímero en la superficie como una consecuencia de un equilibrio en estado estable entre los procesos de absorción y desorción en sitios superficiales individuales y por ejemplo se pueden adoptar por fijación. Usualmente es necesario incrementar adicionalmente la estabilidad del agregado adsorbido por la introducción subsiguiente de enlaces covalentes entre grupos funcionales próximos, además de una estabilización estérica básica (entrópica) por enmarañamiento físico de las cadenas. Para lograr estabilidades aún incrementadas, las cadenas de la película de polímero se pueden injertar adicionalmente de forma covalente al material portador subyacente.

La superficie externa del material de soporte sólido de este modo puede ser plana (placas, hojas, hojas delgadas, discos, placas corredizas, filtros, membranas, telas tejidas o no tejidas, papel) o curveada (ya sea cóncava o convexa; esferas, cuentas, granos, fibras (huecas), tubos, capilares, frascos, pozos en una bandeja de muestra) . La estructura de poro de la superficie interna del material de soporte sólido puede consistir, inter alia, de canales capilares continuos, regulares o de cavidades de geometría irregular (fractal) . Microscópicamente, pueden ser lisas o ásperas, dependiendo de la manera de elaboración. El sistema de poro ya. sea puede extenderse continuamente a todo lo largo del material completo de soporte sólido o en extremo en cavidades (ramificadas) . La velocidad del equilibrio interfacial de un péptido o proteina · entre su solvatación en la fase móvil y su retención en la superficie de la fase estacionaria y de esta manera la eficiencia de un sistema de separación de flujo continuo se determina en su mayor parte por la transferencia de masa mediante la difusión a través de los poros del material de soporte sólido y de esta manera por su distribución característica de los tamaños de partícula y poro. Los tamaños de poro pueden mostrarse opcionalmente como distribuciones asimétricas, multimodales, y/o espacialmente no homogéneas (por ejemplo, en sección transversal) . Los tamaños típicos de poro de los sólidos porosos adecuados para el uso en la invención ya sea como materiales de soporte sólido completos o portadores varían desde 10 nm a 400 nm y de esta manera se pueden categorizar como meso- o macro-porosos; los tamaños típicos de partícula de los materiales en partícula varían desde 5 µ?t? a 500 |im. Los sólidos adecuados tiene porosidades aceptables en el intervalo de 30 % a 80 % en volumen y áreas superficiales específicas típicas en el intervalo de 1 m2 g"1 a 1000 m2 g"1.

Los materiales de soporte sólido, alternativos, más recientemente introducidos son los llamados medios de cromatografía, monolíticos que se moldean como una entidad macroscópica individual de la forma deseada (usualmente tipo varilla) como lo opuesto a los envasados en columna, compresibles, clásicos hechos de partículas' microscópicas sueltas. Las columnas monolíticas pueden consistir de materiales poliméricos o sílice tal como por ejemplo, polimetacrilatos, y su microestructura puede contener capilares fibrosos o aglomerados en partículas, sinterizados .

El término "película de un polímero" o "película polimérica" significa una red de polímero sintético o biosintético bidimensional o preferentemente tridimensional de al menos una capa, usualmente entre una y unas pocas decenas de capas moleculares. Esta red de polímero (derivatizada o no derivatizada) se puede preparar por sí misma de acuerdo a procedimientos conocidos por la persona experta en la técnica. La película de un polímero puede ser de una composición químicamente homogénea, o puede estar comprendida de al menos dos clases diferentes de cadenas de polímeros interpenetrantes (por ejemplo, ácido poliacrílico y una poliamina) , ya sea irregularmente enmarañadas, o de una manera ordenada (capa por capa) . El término "cadena" se refiere en general a la hebra principal continua más larga y también a posibles ramificaciones de un polímero, a lo largo de¦ las cuales, se unen los grupos funcionales. El término se usa tanto para indicar la longitud completa de la estructura de un polímero disuelto, absorbido o injertado como se emplea durante la preparación del absorbente, así como para indicar los segmentos de cadena localizados entre los nudos de una malla polimérica reticulada, puesto en este último caso es difícil de identificar la longitud completa de las hebras individuales.

Los "polímeros" que contienen al menos un grupo funcional dentro de su estructura o cadenas laterales son preferibles puesto que permiten una fácil derivatización con residuos en estos grupos funcionales de medios homogéneos o heterogéneos. Adicionalmente, muchas propiedades de un polímero en el estado sólido o disuelto y también su tendencia a adsorberse espontáneamente sobre y adherirse permanentemente a un portador sólido dado se están determinando por sus grupos funcionales. Los polielectrolitos se mencionan específicamente aquí. También a este respecto son factibles copolímeros, ya sea de secuencia alternada, estadística o en bloque, que contienen unidades tanto funcionales como no funcionales. Los grupos funcionales preferidos son grupos amino, hidroxilo, y ácido carboxílico o éster, primarios o secundarios. Dependiendo de la acidez/basicidad del medio circundante, los grupos amino pueden estar presentes como iones de amonio protonado, grupos carboxilo como iones de carboxilato desprotonado. Si también se usa un polímero a granel poroso o no poroso como el portador del material de soporte sólido, se señala que la película del polímero revestido en el mismo, como se describe aquí, tendrá una diferente composición química. Estas diferencias pueden dar por resultado la presencia, clase o densidad de los grupos funcionales listados más adelante, de pesos moleculares menores, o de un grado menor de reticulación. Todos estos parámetros se adicionan a hidrofilicidad incrementada, hinchazón con solvente/difusión, y biocompatibilidad, así como adsorción no específica disminuida en la superficie revestida.

La película de polímero preferida comprende al menos un polímero que contiene grupos amino. Es fuertemente preferida polivinilamina . Otras poliaminas adecuadas pueden comprender polietilen-imina, polialil-amina, etc., así como polímeros funcionales diferentes de aquellos que contienen grupos amino, tal como alcohol polivinílico, acetato de polivinilo, ácido poliacrílico, ácido polimetacrilico, sus polímeros precursores tal como poli (anhídrido maleico) , poliamidas, o polisacáridos (celulosa, dextano, pululano, etc.). Si se emplean co-polímeros, los co-monómeros preferidos son monómeros de alqueno simples o monómeros inertes polares tal como vinil-pirrolidona . Los pesos moleculares preferidos de los polímeros usados varían desde, pero no se limitan a, 5000 Daltones a 50,000 Daltones, que es particularmente cierto para polivinilamina . Los polímeros que tienen un peso molecular cercano al límite inferior del intervalo dado anteriormente han mostrado penetrar poros aún estrechos del portador de modo que los materiales de soporte sólido con altas áreas superficiales y en consecuencia con buena cinética de transferencia de masa, resolución y capacidad de unión se pueden usar en los absorbentes de la presente invención.

El polímero se adsorberá y luego se reticulará o injertará como una capa delgada sobre la superficie de un portador adecuado, ya sea antes o después de la derivatización con los primeros y segundos residuos. El contenido en la película del material híbrido resultante, incluyendo su derivatización con residuos, puede variar desde aproximadamente 5 % a 30 %, de manera preferente de aproximadamente 15 % a 20 %, en base al peso total del adsorbente. El valor exacto del contenido de polímero del adsorbente completamente funcional también será dependiente del grado de derivatización. El peso molecular de los residuos, y el peso específico del portador elegido. Estos valores corresponden a un espesor de película en el intervalo nanométrico inferior. El polímero revestido aún puede retener su capacidad para hincharse o encogerse, el espesor real de película que es fuertemente dependiente del tipo de solvente que se usa.

El grado de reticulación de la película de polímero puede variar de 2 % a 20 % en base al número de grupos funcionales disponibles para reticulación, respectivamente. Son especialmente preferidas las reticulaciones por condensación de grupos funcionales, pero se pueden aplicar todos los otros métodos conocidos en la química de polímeros, incluyendo química de radicales y fotoquímica. Sin embargo, los enlaces de reticulación también se pueden formar directamente entre los grupos funcionales de los polímeros comprendidos sin la adición de reactivos de reticulación. Esto es en particular posible si se empelan copolímeros o polímeros mezclados que proporcionen al menos dos diferentes grupos funcionales que exhiben una reactividad latente entre sí, por ejemplo, grupos amina y grupos de ácido carboxilico que pueden formar enlaces de amida entre sí después de la activación. La reticulación preferida comprende la formación de enlaces C-N covalentes, por ejemplo, enlaces de amida, uretano, urea o amina terciaria/secundaria, y se pueden formar mediante reacción de ya sea ácidos carboxílicos activados o epóxidos con aminas. Las reticulaciones pueden ser de manera alternativa de naturaleza no covalente, haciendo uso de pares de iones entre grupos funcionales opuestamente cargados o con la ayuda de contraiones múltiplemente cargados, etc.

Como se usa en la presente, el "grado de reticulación" se da como el número máximo de reticulaciones que se van a formar en la reacción de reticulación en base al número total de grupos funcionales disponibles para reticulación. Si, como se prefiere, se usan reactivos bifuncionales para reticulación, el grado de reticulación refleja por lo tanto la relación molar entre la cantidad de reactivo de reticulación, que se somete a la reacción de reticulación, y el número de grupos funcionales de polímero disponibles para reticulación (en este caso se requieren dos grupos funcionales por formación de una reticulación) por lo que se asume que la reacción prosigue casi de manera cuantitativa a las relaciones propuestas aquí. En principio, es posible que se estén formando reticulaciones inter-hebra e intra-hebra así como cadenas laterales terminadas en extremo sin reticulación (de reticuladores de reacción parcial) .

Por el contrario, el término "injerto" significa un anclaje covalente de cadenas de polímero individuales a la superficie de un portador sólido, preferiblemente formado con grupos funcionales en el mismo. Será suficiente si cada hebra de polímero se ancla en al menos una posición arbitraria a lo largo de su cadena. Se pueden lograr mejores estabilidades de la película mediante injerto en múltiples puntos de modo que se formen asas salientes de polímero en la superficie. Este último método, sin embargo, reduce la flexibilidad tridimensional de las cadenas de polímero. Las uniones en un punto individual se logran preferentemente a través de un término de cadena de modo que la longitud alargada completa de la cadena a lo largo del cual se pueden unir una pluralidad preferencialmente de grupos funcionales/residuos o sólo uno individual en el término opuesto, pueden apuntar hacia afuera lejos de la superficie. Aunque la conformación real del polímero injertado puede ser una espiral aleatoria, el uso de altas densidades de injerto en la superficie y solventes apropiados puede conducir a hinchazón y al fenómeno de auto-montaje orientado entre cadenas vecinas mediante interacciones dispersas tal como en la formación de cepillos de polímero que se pueden estabilizar adicionalmente por reticulación. De manera preferente, se logra el injerto mediante reacciones de condensación moderadas similares a las reacciones de reticulación, pero también se pueden aplicar métodos que comprenden propagación de radicales libres, iones, o iones de radicales tal como métodos inducidos por radiación u oxidativos. El método elegido dependerá de la facilidad, tipo y grado de funcionalización del portador. Se puede lograr el injerto en principio mediante dos diferentes técnicas: la primer técnica usa monómeros unidos a superficie o iniciadores para constituir cadenas de polímero paralelas por polimerización in situ de la superficie, en tanto que en la segunda técnica primero se sintetiza una cadena de polímero en su longitud completa en un medio homogéneo, es decir, la ausencia de la superficie, a la cual sólo se injerta subsiguientemente en una paso adicional. Esta última técnica se prefiere si se prepara un absorbente de la invención mediante procedimientos de injerto y constituye una modalidad metódica de la invención.

En una modalidad preferida de la presente invención, la película de polímero, también, si se retícula internamente por enlaces covalente, no se injerta, es decir, enlaza covalentemente, al material portador subyacente, es decir, se une en el mismo sólo por adsorción física y/o química. Por consiguiente, el término "unión" abarca adsorción física y/o química. La estabilidad química y mecánica del material compuesto entonces resulta del enmarañamiento físico total del portador por la película de polímero, reticulada. El espesor y densidad de la película de polímero aún son suficientes a fin de proteger grupos muy polares o reactivos en la superficie del portador de soporte, tal como grupos fenilo o sulfonato en el caso de sulfonato de poliestireno sólido, de la accesabilidad que de otro modo se sospecha que se va a escindir por reactivos o a sufrir reacciones indefinidas, irreproducibles o irreversibles con la proteina o péptido objetivo o sus impurezas concomitantes de la mezcla que se va a separar.

En una modalidad adicional, la película de polímero se injerta en el portador pero no se retícula de forma interna. Como una tercera opción, la película de polímero se puede reticular de forma interna así como injertar en el portador. Las tres morfologías de red resultantes diferentes de la película de polímero se representan esquemáticamente en la Figura 2. El caso A de la Figura 2 simboliza el absorbente preferido en donde las cadenas individuales de polímero se reticulan covalentemente entre sí pero no se injertan covalentemente a la superficie del portador. El caso B representa un absorbente en donde las cadenas individuales de polímero se injertan covalentemente a la superficie del portador pero no se reticulan covalentemente entre sí. El caso se representa a un absorbente en donde las cadenas individuales de polímero se injertan ambas covalentemente a la superficie del portador y se reticulan covalentemente entre sí, como resultado de una combinación de las dos técnicas de fijación (que se puede llevar a cabo en cualquier orden) .

El término "grupo funcional" significa cualquier porción química simple, distinta que corresponde a un material de soporte sólido (no derivatizado) o se restringe a una película opcional de polímero en su superficie, o a un polímero durante la preparación de la superficie mediante adsorción de película, que puede servir como un punto de unión química o ancla y que por lo tanto está, al menos en el estado hinchado del material de soporte sólido o una película de polímero que la cubre, tratable para la derivatización en fase sólida o líquida por adición química o reacciones de sustitución y opcionalmente también ha reticulaciones. Por lo tanto los grupos funcionales contendrán típicamente al menos un enlace débil y/o un heteroátomo, preferentemente un grupo que se comporta como nucleófilo o electrófilo. Se puede necesitar que grupos funcionales menos reactivos se activen antes de la drivatización. De esta manera pueden formar tanto el enlace estructural entre las hebras de polímero y los residuos del absorbente así como formar los nudos de una red reticulada. Opuesto a los residuos, 'los grupos funcionales no se diseñan principalmente para interactuar con los analitos (aunque en realidad no se puede excluir rigurosamente que interactúen sin embargo o ayuden en el proceso de separación vía repulsión de componentes laterales) sino más bien proporcionen una cobertura de superficie con puntos de tamaño molecular de reactividad química definida que se pueden convertir en los residuos realmente interactuantes (derivatización) o se usen en la formación de conexiones covalentes (reticulación e injerto de polímero) . Los términos "conexiones" o "enlaces" como se usa en la presente deben incluir tanto enlaces covalentes directamente formados asi como una serie extendida, de enlaces covalentes en una fila mediante una secuencia que comprende múltiples átomos. Otras porciones químicas hacia abajo a fragmentos moleculares diatómicos simples que pueden estar presentes en el absorbente o un analito y que pueden cumplir cualquiera de estas funciones conocidas y especificas, se llaman simplemente "grupos".

Se puede tratar un conjunto de grupos funcionales como una pluralidad de unidades separadas, pero idénticas, y su comportamiento químico se determinará principalmente sólo por las propiedades predecibles y reproducibles del grupo y a un menor grado por los materiales a los cuales se unen, o su posición exacta en estos materiales. Entre estos grupos funcionales están, por mencionar unos pocos, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos tiol, grupos de ácido carboxílico, o grupos de éster carboxílico. Los grupos funcionales representan una parte integral del material de soporte sólido y de esta manera se distribuyen uniformemente sobre grandes área de su superficie. Los grupos funcionales adecuados exhiben frecuentemente débiles propiedades de ácido base y de esta manera dan al polímero formador de película el carácter de un amfolito. Los grupos funcionales en una polímero ya sea se pueden introducir durante la polimerización de los monómeros correspondientes o por conversión subsiguiente de grupos funcionales (reacción análoga a polímero) antes o después de la adsorción sobre el portador. Una película de polímero también puede contener dos o más grupos funcionales diferentes ya sea si se co-polimerizan diferentes monómeros, si la conversión de grupos funcionales se detiene antes del término, o si se estratifican diferentes polímeros uno encima del otro o como redes interpenetrantes. Los grupos funcionales preferidos son grupos amino primarios y secundarios. Se da preferencia particular a grupos amino primarios.

El término "derivatización" significa cualquier reacción química capaz de introducir residuos específicos sobre la superficie de un material de soporte sólido o en un polímero usado para cubrir la superficie durante la preparación del absorbente a fin de producir un absorbente intermedio o completamente funcional, particularmente por la adición a, o sustitución de, sus grupos funcionales con un reactivo adecuado de derivatización que contiene el residuo o un precursor del mismo. La interconexión de un grupo funcional en un diferente grupo funcional pero a un reactivo también se debe cubrir por el término. Un precursor "del residuo" puede incorporar una porción química enmascarada o protegida que se puede desproteger o de otro modo convertir en el residuo final después de o simultáneamente con la formación de un enlace con la superficie o polímero en el paso de derivatización . Por ejemplo, si el polímero contiene grupos funcionales amino, primarios o secundarios y se hace la derivatización a través de la formación de enlaces de amida con estas porciones de amina primaria o secundaria, adicional que van a estar contenidas en el residuo se deben proteger inicialmente como por ejemplo derivados de Boc o Fmoc en el reactivo de derivatización. Adicionalmente, si el enlace que se va a formar durante la reacción de derivatización entre un grupo funcional de polímero o superficie y un centro reactivo en el reactivo de derivatización conduce a la formación de una nueva porción química que juega un papel en el reconocimiento de la proteína o péptido objetivo, del residuo respectivo se desarrollará sólo aparentemente de forma completa después de la derivatización, y sólo una parte o una modificación funcional de este está contenida como un precursor en el reactivo de derivatización. En este caso, parte de la porción precursora (un grupo saliente) también se puede dividir durante la reacción de derivatización (tal como molécula de agua durante una reacción de condensación) .

La derivatización en cada uno de al menos uno u opcionalmente múltiples pasos, siempre se lleva a cabo en una "porción definida" de los grupos funcionales. Esto significa que, tomando en cuenta las reactividades de los diferentes grupos funcionales y reactivos, un porcentaje predeterminado, buscado de cada clase dada de grupos funcionales presentes en el polímero no derivatizado o material de soporte sólido siempre se está convirtiendo en grupos funcionales derivatizados con los respectivos residuos elegidos. A fin de producir absorbentes homogéneamente irreproduciblemente derivatizados, entonces se dejan reaccionar cantidades apropiadas, calculadas de reactivos de derivatización con el polímero. También se puede intentar la derivatización completa (grado de derivatización = 100 %) por lo que el reactivo de derivatización frecuentemente se usa en exceso, pero esto no debe ser indispensable.

Puesto que los materiales residuales del absorbente como tal no deben deteriorarse durante el paso de derivatización, frecuentemente es deseable realizar la derivatización bajo condiciones moderadas. De esta manera, puede ser necesario ya sea activar los grupos funcionales o el reactivo de derivatización antes de o concomitante con el paso de formación de enlace real a fin de mantener reactividad suficiente bajo estas condiciones. De manera preferente, el reactivo de derivatización se activa. Una reacción preferida de derivatización comprenderá un polímero nucleófilo que contiene grupos funcionales de nitrógeno ricos en electrones tal como grupos amino y un reactivo electrófilo que contiene un grupo saliente unido a un carbono pobre en electrones tal como un derivado de carbonilo o carboxilo, o viceversa. Por lo tanto, se puede lograr la activación por técnicas normales de síntesis de péptidos en fase sólida o fase líquida, por ejemplo, mediante ásteres activados. Las reacciones preferidas de derivatización comprenden la formación de enlaces de amida, uretano, urea o amina secundaria/terciaria con los grupos funcionales. Debido a la simetría de los enlaces de amida y uretano con respecto al carbono de carbonilo, se pueden formar en cualquier dirección de polímeros de amino o carboxilo, y de polímeros de amino o hidroxilo, respectivamente .

La afinidad y selectividad del absorbente se determina en su mayor parte por la combinación de dos o más residuos diferentes. El término "residuo" significa cualquier porción química distinta o un arreglo identificable de forma distinta, o usualmente que se presenta de forma repetida, de porciones químicas de la misma o diferente clase capaz de montarse en la escala nanoscópica (por sí misma o como parte de sí misma o dentro de una agrupación de residuos de la misma o diferente clase) en un complejo o un lugar de alta y/o selectiva afinidad hacia al menos una estructura complementaria o región de superficie de al menos una proteína o péptido, en tanto que la afinidad es más fuerte que un sólo contacto de van der Waals con unidades de repetición de CH o CH2 del retículo o cadena de polímero en la superficie del absorbente. Este lugar en la interfaz sólida/líquida, en analogía a la descripción de interacciones específicas que comprenden biomacromoléculas , se llama un "sitio de unión". Un residuo puede ser de este modo un producto completamente sintético o natural o un fragmento o combinación de lo mismo, pero debe ser tratable por síntesis química y/o derivatización. Puede comprender más de una porción química distinta (incluyendo porciones químicamente no reactivas tal como por ejemplo, unidades de alquilo o alquileno que sin embargo son capaces de acoplarse en interacciones hidrófobas o dispersivas) .

Puesto que se introducen dos o más reactivos diferentes en el absorbente a relaciones variables, un sitio de unión comprenderá dos o más residuos idénticos y diferentes. La totalidad de residuos comprendidos en la formación de un sitio particular de unión se localiza en proximidad espacial cercana bio- o tri-dimensional entre sí y puede, pero no necesariamente es, comprender residuos en grupos funcionales de superficie vecina o unidades repetitivas vecinas de una película de polímero. Los residuos individuales de un sitio común de unión pueden corresponder también a diferentes hebras de un polímero reticulado o injertado en superficie (el mismo principio aplica a las contrapartes de la unión expuesta en la superficie respectiva de la proteina o péptido) . Por otra parte, se puede compartir un residuo particular por dos o más sitios de unión adyacentes o de traslape. Debido a la naturaleza aleatoria (estadística) de la distribución de las reticulaciones de residuos sobre los grupos funcionales en la superficie o dentro de una película de polímero, se puede formar una distribución resultante de sitios de unión similares, pero ni estructuralmente ni energéticamente idénticos. Como resultado, los tamaños y afinidades de estos sitios de unión hacia la proteína o péptido objetivo pueden diferir a un grado considerable que sin embargo en la práctica no ha probado ser una desventaja.

La "unión" entre los sitios de unión del absorbente y la proteína o péptido objetivo debe ser reversible y por lo tanto debe tomar lugar mediante cualquier forma de interacción no covalente entre porciones químicas complementarias del absorbente. Entre los modos no covalentes prevalentes de unión están interacciones iónicas, de unión de hidrógeno de transferencia de carga de donador-aceptador p-p, de catión-p, de dipolo, coordinativas, dispersivas e hidrófobas, pero frecuentemente se encuentras formas mezcladas y no estequiométricas que no permiten especificar las contribuciones individuales del modo de unión. De esta manera, pueden presentarse contactos simultáneos individuales, dobles o múltiples entre los compañeros de unión que pueden comprender los mismos o diferentes residuos. Las fuerzas físicas y entrópicas que tiene influencia en la movilidad de un analito en superficies ásperas y en poros microscopios así como interacciones mediadas por solvente pueden adicionarse a los factores responsables de la unión. En ciertos casos, el complejo resultante que comprende el absorbente y al menos una proteína o péptido unido puede ser detectable o un aislable, pero más frecuentemente será sólo de carácter momentáneo. Tampoco hay límite inferior útil impuesto en la concentración de unión puesto que estos valores no sólo serán una propiedad intrínseca de un par dado de absorbente-analito sino también fuertemente dependientes del sorbente. Además, aún entalpias Gibbs diferenciales tan pequeñas como 1 kcal mol"1 pueden aún resolverse por métodos cromatográficos debido a múltiple equilibrios en serie en columnas cuyos números teóricos de placas pueden adoptar valores de aproximadamente 103 a 104 por metro de longitud de lecho cromatográfico . En aplicaciones cromatográficas , la unión también no debe ser demasiado fuerte, debido a que de otro modo la reversabilidad será difícil de lograr bajo condiciones ambiente o biocompatibles .

Con respecto a los absorbentes de la presente invención, se puede conectar un residuo a un grupo funcional en la superficie de un material de soporte sólido, incluyendo una película opcional de polímero que cubre la superficie, y si es así, comprende la estructura parcial completa que apunta lejos de la superficie del punto de unión en el grupo funcional, o al menos esa parte del mismo que se presenta de una manera idéntica en diferentes grupos funcionales. No necesariamente tiene el residuo completo que acoplarse directamente en la unión de la proteína o péptido objetivo. El residuo puede contener también átomos o porciones que sólo tengan el propósito de separar o conectar las estructuras realmente de unión de/con una o a otra o proporcionar una estructura geométricamente adecuada para el sitio de unión a fin de presentar las estructuras de unión al objetivo. De esta manera se van a asignar formalmente unidades ligadoras, separadoras u otras ramificadoras opcionales entre los grupos funcionales en el material de soporte sólido, especialmente en una película opcional de polímero en su superficie y las estructuras realmente de unión como parte de cada residuo al cual hacen al menos una conexión. La conexión usualmente se puede lograr mediante al menos un proceso especial de derivatización de los grupos funcionales, de una manera estocástica (ubicua) o selectiva, antes o subsiguiente a la aplicación de una película opcional de polímero sobre el medio portador, de una manera homogénea o heterogénea. Por consiguiente, se puede hacer reaccionar una solución o película delgada del polímero con reactivos de derivatización pre-sintetizados, que ya contienen los residuos o precursores del mismo.

Sin embargo, si los grupos funcionales, o partes estructurales de los mismos, se convierten por derivatización con residuos precursores de los mismos en porciones de una clase diferente, o entonces están formando una unidad química integral con átomos adicionales del residuo (por ejemplo, el átomo de nitrógeno en la conversión de un grupo funcional -NH2 en un residuo -NHCO-R) , se pueden considerar también como que han perdido básicamente su carácter como grupos funcionales y en cambio se consideran como una porción estructural que corresponde a este residuo.

Si los residuos de la misma o diferente clase se unen individualmente a grupos funcionales del material de soporte sólido ya sea directamente o mediante un ligador covalente, conformacionalmente flexible, se asume que se adaptan a sus contrapartes complementarias en la superficie de la proteína o péptido objetivo, independientemente, la fuerza de activación que es la reducción al mínimo de la entalpia Gibbs total. Por lo tanto, no es necesario para el propósito de la presente invención que los residuos del sitio de unión se organicen en la orientación tridimensional correctas para la unión óptima de un epítopo dado de proteína o péptido (como por ejemplo en un anticuerpo natural); sólo necesitan ser capaces de asumir esta orientación a través de la exploración de su espacio conformacional (ajuste inducido por sustrato) . En muchos :casos, especialmente si se empeña unión diferencial para dos o más, epitopos diferentes o de traslape de la proteina o péptido objetivo se pueden reconocer por el mismo absorbente.

En tanto que el término "residuo", que se refiere a la unidad completa que está apuntando lejos de la superficie del absorbente y repetido muchas veces de forma idéntica o similar en el mismo con la intención de acoplarse en la unión del analito, es como se define funcionalmente, ese residuo puede consistir a nivel molecular-estructural de una o más subunidades contiguas, distinguibles, pero dentro de si mismas, en las cuales se pueden fragmentar, sólo formalmente, las llamadas "estructuras". Este término que se usa a todo lo largo de la invención en su significado más amplio posible. Aunque algo arbitrario, la división de un residuo en diferentes estructuras debe seguir el principio de afinidad química e intuición, por lo que las porciones o fragmentos moleculares se deben agrupar principalmente de forma conjunta de acuerdo a propiedades estructurales y/o físicas comunes. Las funciones asociadas con diferentes estructuras que corresponden al mismo residuo igualmente serán de este modo diferentes: algunas estructuras (C, N, O, S-heteroaromáticas, en particular) se pueden relacionar a la unión del analito en tanto que otras no lo hacen. En vista de la miríada de posibilidades de realizar los absorbentes de acuerdo a la invención debido a pequeños cambios estructurales de los residuos, en base a esto, las partes esenciales de un residuo se pueden separar de las partes no esenciales. Para aquellas estructuras opcionales no comprendidas principalmente en la unión al analito, los "ligadores" van a corresponder que son correas moleculares cortas (frecuentemente simples hidrocarburos), que comprenden opcionalmente funcionalidades o valencias insaturadas en uno o ambos extremos para hacer las conexiones necesarias, y que forman los amarres entre las estructuras realmente de unión y estructuras adyacentes y/o la superficie del absorbente. De esta manera, por ejemplo sería posible emplear varios residuos diferentes en un absorbente de la invención que comprendan todos, una estructura C, N, 0, S-heteroaromática binuclear pero ligadores de diferente clase, longitud o conectividad y estructuras adicionales ausentes u opcionales. Este grupo de residuos entonces se puede distinguir a nivel molecular pero calificarán de una manera funcionalmente conjunta como "primeros residuos" dentro del significado de la invención. El uso de ligadores se analizará en más detalle más adelante en la presente.

Las estructuras de los residuos responsables del reconocimiento objetivo comprenden "estructuras heteroaromáticas", que en el sentido estrecho son aquellas partes estructurales principales de los residuos con los cuales toma lugar el contacto de interacción con un analito de proteina o péptido. La expresión "heteroaromático" dentro de este contexto significa un sistema de anillo o de anillo fusionado que muestra las características aromáticas de un sistema de p-electrones, de circuito cerrado, continuamente deslocalizado (como se indica por ejemplo por una protección magnética anisotropica en el espectro de RMN) y que consiste sólo de carbonos y al menos un heteroátomo endocíclico tomado en el grupo que comprende nitrógeno, oxígeno y azufre. Son posibles combinaciones de heteroátomos de la misma o diferente clase dentro del mismo o diferente anillo, en tanto que resulte una estructura estable en donde no se excedan las valencias usuales de los heteroátomos.

De acuerdo a la nomenclatura común, "binuclear" denota un sistema de anillo bicíclico fusionado que consiste de dos anillos aromáticos de cualquier tamaño cada uno que están compartiendo dos átomos de anillo adyacentes (carbonos en casi todos los casos), el enlace covalente entre ellos (es decir, un [n.m.0] -puente de cero longitud de átomos) y un sistema de p-electrones como un conjugado, en tanto que "mononuclear" denota un anillo monocíclico aislado de cualquier tamaño. Los sistemas de anillo o anillos aromáticos, heteroaromáticos, alifáticos o heteroalifáticos adicionales se pueden unir sin embargo a ambas estructuras heteroaromáticas como sustituyentes mediante conexiones de enlace individual inmediatas a al menos un átomo de anillo, opcionalmente mediante unidades separadoras. Sin embargo, la fusión de anillo extendido (unión de sustituyente de dos puntos) sólo es posible con anillos alifáticos o heteroalifáticos, tal que el sistema de p-electrones heteroaromático no se exceda en la longitud completa de la anillo adicional, y se eviten sistemas de anillo de mayor nuclearidad. El número, combinación, y distribución de heteroátomos asi como su orden de p-enlace formal (que puede ser fraccional) de este modo son irrelevantes con respecto a la clasificación como heteroaromático; el único pre-requisito es que al menos un heteroátomo esté colocado dentro de un anillo y comparta al menos un electrón p del sistema común de anillo conjugado. Debido a las múltiples posibilidades individuales para fragmentar un residuo en estructuras, debe ser suficiente dentro del contexto usado aquí si al menos una fragmentación viable de primer residuo y segundo residuo conduce a una estructura C, N, 0, S-heteroaromática binuclear y mononuclear, respectivamente. Las estructuras heteroaromáticas preferidas comprenden al menos uno, más preferentemente exacto un anillo de cinco miembros .

El término "estructura C, N, 0, S-heteroaromática" como se usa en la presente significa una estructura heteroaromática binuclear respectivamente o mononuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S.

En una modalidad, la estructura heteroaromática comprende al menos un átomo N y al menos un heteroátomo adicional N, 0, o S. En esta modalidad, la estructura heteroaromática comprende dos átomos N. Esta estructura heteroaromática es por ejemplo imidazol.

"Sustituyentes" son radicales orgánicos (excepto hidrógeno) que se consideran como partes opcionales de las estructuras heteroaromáticas y de esta manera se piensa que se acoplan también en la unión al analito. Se asemejan a las partes exociclicas de estas estructuras heteroaromáticas a cuyos núcleos, es decir, los átomos formadores de anillo heteroaromático binuclear o mononuclear, se unen covalentemente mediante al menos un enlace covalente sin comprender átomos formadores de anillo. Excepto para el caso donde se conecten varias estructuras heteroaromáticas entre si mediante enlaces covalentes directos, estos sustituyentes por si mismos exhibirán sólo usualmente interacciones débiles y no selectivas con la proteina o péptido objetivo y más bien se pueden usar para adaptar las propiedades hidrófobas/hidrófilas de- los residuos. No serán capaces de cumplir el objeto de la invención satisfactoriamente si se unieron a la fuente de absorbente en la ausencia de cualquier anillo C, N, 0, S-heteroaromático.

En la técnica anterior, los absorbentes que muestran altas afinidades y selectividades se conocen predominantemente de materiales de soporte sólidos a los cuales se fijan anticuerpos u otros receptores de alto peso molecular de origen biológico. Estos anticuerpos se han formulado primero específicamente contra el antígeno objetivo en un proceso biológico que comprende organismos vivos, o la proteína o péptido objetivo se debe conjugar de manera reversible a un antígeno o a un componente de sólo pocos pares de afinidad natural previamente conocidos. Los absorbentes de la presente invención se pueden distinguir de aquellos por el hecho que sus residuos son accesibles por síntesis química, por un bajo peso molecular y alta estabilidad química. Sin embargo, se pueden implementar también como fases estacionarias en todos los tipos de métodos cromatográficos de afinidad.

Los términos "proteína" y "péptido" representan poli- y oligo-aminoácidos, respectivamente, como entidades químicamente, biosintéticamente o bioanalíticamente identificables de forma distinta que pueden ser de origen sintético o biológico (a pesar de su posible ocurrencia en la naturaleza) , de secuencias homo- o heteroméricas lineales o ramificadas, y en los cuales no se impone ningún limite máximo o mínimo de longitud de secuencia o de peso molecular. Un requisito mínimo es que se deban componer de al menos dos aminoácidos que estén conectados mediante al menos un enlace de amida, que corresponderá por ejemplo, a un dipéptido. La presencia de aminoácidos no proteiogénicos o completamente innaturales, de ß-aminoácidos , de N-alquil-aminoácidos, de unidades peptidomiméticas adicionales, etc., que sean todos aún capaces de formar enlaces peptídicos, no debe ser perjudicial. Frecuentemente se pueden preparar (oligo) péptidos pequeños de forma sintética mediante métodos convergentes o graduales; el término péptido debe abarcar en cada caso adicionalmente estructuras obtenibles formadas mediante conectividades inusuales tal como por ejemplo, depsipéptidoes o peptoides. Las proteínas más grandes poseen típicamente una estructura tridimensional definida que pueda adoptar numerosas formas diferentes tal como por ejemplo, formas globulares, (albúmina) o filamentosas/fibrosas (actina, colágeno) ; pueden ser solubles en citosol estar unidos a membrana, ser parte de la matriz extracelular, o se pueden presentar en la superficie de una célula. Debido a las cantidades diminutas de proteínas que se pueden manejar con los métodos modernos de biología molecular, su secuencia primaria de aminoácidos no necesitar ser conocida a fin de identificarlos;- algunas veces no se conoce aún si están presentes como una composición homogénea. Las proteínas o péptidos unidos a la superficie de una (nano) partícula deportador (coloidalmente) disperso tal como por ejemplo, un virus, un punto cuántico, o una esfera de látex, se requieren usualmente para que se escindan primero a fin de exponer también las partes de otro modo protegidas de su superficie molecular completa para la interacción con el absorbente antes de que se puedan emplear en el método de separación de la invención.

Los términos anteriores incluyen por una parte agregados peptídicos no covalentes así como proteínas homo-y hetero-multiméricas, pero por otra parte también subunidades funcionales o no funcionales de una proteína completa tal como los productos de digestiones enzimáticas o reducciones de enlaces de disulfuro, pero también mini-proteínas diseñadas de-novo tal como "aficuerposMR", "anticalinasMR", "nanocuerposMR", u otros sitios activos artificialmente reconstituidos. Los iones o complejos metálicos pueden estar contenidos en proteínas, usualmente en sus sitios activos. Se pueden modificar proteínas de analito por modificaciones pos-transduccionales in vivo, tal como fosforilación, sulfatización, glicosilación, glucuronidación, o ubiquitinilación. La conjugación con glicósidos y lípidos da por resultado glico- y lipoproteínas, respectivamente, que consisten de unidades estructurales adicionales más allá de sólo aminoácidos. Las modificaciones de proteina cuyo favorecimiento o reducción de expresión pueden servir como marcadores para ciertos estados patológicos del organismo en los cuales se producen en general son de este modo de importancia extrema. De manera similar, las modificaciones bioquímicas in vitro de una superficie así como de un sitio activo alostérico de una proteína incluyen la formación de complejos reversibles o irreversibles con agonistas o antagonistas de substrato así como todas las clases de química de grupos protectores de fusiones amino, carboxilo y cadena lateral. Las proteínas o péptidos se pueden marcar adicionalmente de forma química o bioquímica (por ejemplo, marcas de secuencia de oligohistidina, tintes conjugados o marcas radioactivas) o fusionar con otra proteína (portadora) con la finalidad de expresión, solubilidad, excreción, detección o separación mejoradas de la proteína o péptido, por lo que se puede escindir el punto de conjugación, pero también pueden carecer de parte de su secuencia nativa, tal como por ejemplo, una extremidad de anclaje a membrana.

Si se usa uno de los términos "proteína objetivo", "péptido objetivo" o simplemente "objetivo", la proteína o péptido particular, o la multitud de proteínas o péptidos (usualmente relacionados por estructura, clasificación, síntesis u origen) , se propone para el cual se diseña el absorbente con sus residuos específicos. Esto es normalmente el analito o componente de la mezcla de alimentación que muestra la finalidad más alta para el absorbente. La proteína o péptido objetivo se puede distinguir de sus productos secundarios proteinaceos potenciales no sólo por su secuencia de aminoácidos (abajo de mutaciones o supresiones de secuencia de punto individual e incluye aquellas de empalme alternativo o variantes de SNP durante la transcripción génica) pero por sus elementos de estructura secundaria y terciaria completa que incluyen la presencia de estados diferentemente plegados (nativo, no plegado o mal plegado) . Frecuentemente la proteína o péptido objetivo es, pero no necesariamente necesita ser, el componente principal de la mezcla de alimentación (por peso o molaridad) , no aún el componente peptídico principal. A pesar de su abundancia dentro de la mezcla, el objetivo frecuentemente es, pero no necesariamente es un componente de mezcla valioso o la sustancia particular requerida para ser purificada, esta última posiblemente que está contenida en la fracción de flujo de paso. Puesto que muchas proteínas o péptidos tienen propiedades tóxicas demostrables, en aplicaciones orientadas a la salud o al ambiente predominantemente el objetivo puede ser esta proteína o péptido que exhibe propiedades tóxicas o de otro modo indeseadas en una mezcla de la cual se tiene que agotar. También puede ser que el objetivo no sea el producto principal sino un producto secundario menor de un proceso de producción que se requiera separar o remover del resto de la mezcla, por lo que se incrementa la concentración o pureza de otro componente de mezcla, usualmente el producto principal, que por si mismo puede ser o no una proteina o péptido. Apuntando hacia el proceso de fraccionamiento de plasma sanguíneo de múltiples pasos, pueden ser necesarias muchos fraccionamientos consecutivos para rectificar un montón completo de diferentes proteínas o péptidos que están simultáneamente presentes en la mezcla de alimentación, por lo que el flujo de paso de una etapa particular del fraccionamiento se puede adsorber en la siguiente etapa, o viceversa .

La capacidad de recolección de todos los solutos dentro de la mezcla que se va a separar, incluyendo el objetivo, que son capaces de al menos interacciones mínimas con el absorbente de la invención bajo condiciones adecuadas se llaman "analitos". La mayoría de los analitos serán proteínas o péptidos, debido a que estos son los analitos para los cuales se diseña el absorbente, pero bajo ciertas circunstancias es posible que moléculas no peptídicas pequeñas puedan corresponder a este grupo. Los analitos cercanamente relacionados pueden formar conjuntamente una biblioteca sintética o bio-sintética, por ejemplo una derivada de una digestión triptica, una biblioteca de visualización en fago o un producto de expresión de una biblioteca de ADNc aleatorizada que se ha transcrito apropiadamente in vivo o in vitro. La afinidad del absorbente, sin embargo, cae usualmente de forma rápida para analitos que tienen estructuras que se desvian del grupo objetivo y se aproximan a cero si no están estructuralmente relacionadas al objetivo.

Las proteínas o péptidos preferidos tendrán un punto isoeléctrico pl de 5.5 a 8.5 y su peso molecular puede variar de 100 a 500, 000 Da. Estos valores de pl corresponderán aproximadamente a la acidez pKa de al menos una de las estructuras heteroaromáticas incorporadas en al menos uno del primero y segundos residuos. Las proteínas objetivo particularmente preferidas del absorbente de la invención son "anticuerpos" o mezclas de estos, un término que también debe incluir fragmentos (cadenas ligeras y pesadas, regiones Fab y Fe, regiones variables Se, etc.), de anticuerpos, construcciones moleculares artificiales de estos fragmentos (diacuerpos, triacuerpos) , asociados oligoméricos de anticuerpos, así como proteínas de fusión que contienen anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, u otros tipos de conjugados tal como aquellos que contienen marcas detectables tal como glutationa o GFP que también se pueden enlazar químicamente entre sí. Puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. Entre las inmunoglobulinas (Ig, ?-globulina) en general, el anticuerpo puede corresponder a cualquiera de los isotipos IgA, IgD, IgE, IgG, o Ig , cada uno de los cuales se puede dividir a su vez en varias subclases. El anticuerpo puede ser de origen humano o de otro mamífero típico: murino o roedor (ratón, rata, conejo, hámster, conejo, cobayo) , cabra, oveja, perro, cerdo, bovino, caballo) . Los anticuerpos preferidos son anticuerpos humanos o humanizados (quiméricos) . Sus ideotipos se pueden dirigir contra todos los tipos de antígenos (otros anticuerpos o sustancias biológicas, moléculas pequeñas) .

Una "mezcla que contiene una proteínas o péptido" significa una mezcla que puede ser de origen variado. No hay limitación severa de la presente invención con respecto a la fuente de la cual se ha obtenido la mezcla. El único requisito es que contenga al menos una proteína o péptido que calificaría como un analito para el cual el absorbente de la presente invención exhibe al menos propiedades débiles de receptor. La mezcla puede contener de este modo dos o más proteínas o péptidos diferentes que ya sea se proponen separar colectivamente del resto de la mezcla (es decir, todos son objetivos de separación) o separar uno del otro (es decir, sólo uno o unos pocos de ellos son objetivos de separación) . Los motivos (epitopos) estructurales de las por lo menos dos proteínas o péptidos dentro de la mezcla que se reconocen por los residuos del absorbente pueden ser tanto idénticos, similares o parcialmente idénticos, o diferentes. Se asume que estos últimos casos conducirán en muchos casos a diferentes tipos de interacción con el absorbente, y de esta manera a diferencias más grandes en la fuerza de unión, con la condición que las por lo menos dos proteínas o péptidos sean de peso molecular comparable y contengan aproximadamente el mismo número de epitopos reconocibles.

Si la proteína o péptido es una sustancia que se presenta de forma natural o se produce de manera recombinante, se puede obtener de extractos frescos o secos de material biológico líquido o sólido tal como animales, plantas, microbios, o virus (incluyendo especies cruzadas o transgénicas que producen en exceso el producto, extractos de cultivos celulares o medios de cultivo celular, caldos de fermentación microbiana (bacteriana o fungoidea) o enzimática, materias primas comerciales, o cualquier combinación de estos. De manera alternativa, la mezcla que contiene la proteína o péptido puede ser el producto natural de una síntesis química o síntesis parcial. Esto incluye especialmente métodos normales de síntesis de péptidos en solución o fase sólida, realizados ya sea manualmente o de una manera automatizada.

Como lo típico para cualquier técnica de purificación y especialmente cualquier técnica cromatográfica las condiciones exactas que se van a usar no sólo dependen de la constitución de la proteína o péptido objetivo sino también de aquella de la matriz de muestra. La "matriz" es un término en uso para la colectividad de todos los constituyentes activos y no activos de la mezcla, con la excepción de los objetivos pero que incluye el medio en el cual se disipan. Esto no es debido a que las propiedades físicas o químicas absolutas de la proteína o péptido objetivo se utilizan comúnmente en un proceso de separación sino más bien a las diferencias de las propiedades entre la proteína o péptido objetivo y todos o unos pocos componentes específicos de la matriz. Usualmente, la composición de la matriz se conoce a lo mucho sólo parcialmente (tanto de manera cualitativa como cuantitativamente) puesto que un método de análisis individual frecuentemente no será capaz de detectar todos los constituyentes, al menos no con igual sensibilidad. Los productos intermedios obtenidos en las diferentes etapas de proceso durante el aislamiento y purificación en etapa posterior de un material químico biológico representan diferentes matrices dentro del significado usado en el contexto de la presente invención. La mezcla completa (objetivo y matriz combinados) que se va a probar para su comportamiento de adsorción en el absorbente también se llama frecuentemente la "muestra" en un contexto analítico.

Antes del tratamiento con el absorbente de la invención, la materia prima química o biológica se puede purificar parcialmente mediante pre-procesamiento adicional por cualquier combinación de operaciones unitarias no destructivas adicionales, en particular procesos tradicionales de separación que pueden comprender filtración (incluyendo micro- o ultra-filtración) , diálisis y electrodiálisis, lavado, precipitación, centrifugación, intercambio iónico, filtración en gel, disolución, evaporación, cristalización, secado, molienda, cualquier manera de tratamiento de reducción viral, y también cromatografía convencional (ya sea cromatografía en absorbentes de baja especificidad o cromatografía de afinidad convencional con residuos biológicos) a fin de remover tanto material residual como sea factible (por ejemplo, materia insoluble y la mayoría de proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos, e inorgánicos, en el caso de material biológico, dejando sólo las sustancias valiosas) , sustancias peligrosas o agresivas o aquellas sustancias que se sospecha que deterioran posiblemente el absorbente o disminuyen su capacidad de separación, del material químico o biológico, incrementando de este modo la concentración del objetivo antes de ponerlo en contacto con el absorbente. Dentro de este contexto, se refieren técnicas de acoplamiento LC/LC. Se necesita que las mezclas secas tal como material liofilizado o secado por congelación se tomen en un solvente adecuado de alimentación (antes de que se traten con el absorbente- Es deseable que la mezcla disuelta sea homogénea y esté libre de partículas suspendidas o coloidales. De manera similar, el método de separación de la invención también se puede combinar de manera subsiguiente con uno o más pasos de la clase dada anteriormente.

Se producen ya muchas proteínas o péptidos a escala industrial y han encontrado aplicaciones en medicina, nutrición (por ejemplo, complementos dietéticos) , cosméticos, o agricultura. Una producción a gran escala de la mayoría de estos sólo se puede lograr hasta ahora económicamente y dentro de un marco de tiempo razonable mediante la extracción de biomasa, por ejemplo, material biológico obtenido por ejemplo de plantas medicinales, fermentaciones microbianas usando microorganismos procarióticos o eucarióticos, o cultivos celulares de organismos superiores hasta células de insecto o de mamífero (por ejemplo, las células frecuentemente usadas CHO, NSO, BHK, o las células HeLa inmortalizadas) . En resumen, las fuentes frecuentes de mezclas de acuerdo a la invención por lo tanto son productos biosintéticos, tal como aquellos obtenidos de un microorganismo o un cultivo celular, o de un extracto de cultivo.

Las fermentaciones microbianas incluyen cultivos sumergidos o flotantes de cepas bacterianas o fungoideas (por ejemplo, levaduras) . Los productos se pueden extraer de recolecciones de organismos enteros o de partes separadas tal como el micelio y/o el correspondiente sobrenadante de medio de cultivo en el cual se pueden segregar. Los procedimientos semi-sintéticos incluyen tanto, modificaciones químicas de etapa posterior de productos naturales o compuestos intermedios y la bio-transformación de materias primas de síntesis. En todos los casos, los productos secundarios comprenden frecuentemente isoformas de proteína, formas truncadas y compuestos intermedios acumulados o productos de seguimiento a lo largo de las rutas de biosíntesis que conducen a la proteína o péptido objetivo. Estos se pueden acompañar adicionalmente por antibióticos ubicuamente segregados, endotoxinas, micotoxinas, pirógenos, promotores o inhibidores de proliferación celular, inhibidores de proteasa, agentes desespumantes, residuos de nutrientes incompletamente digeridos, productos de degradación parcial, así como componentes de alto peso molecular y parcialmente insolubles (por ejemplo, desechos celulares) como puedan resultar de lisis celular de etapa final del organismo productor. Los lisados celulares frecuentemente incrementan adicionalmente la complejidad de la mezcla debido a la liberación de- clases adicionales de sustancias tal como ácidos nucleicos y a un vasto número de las llamadas proteínas de células hospedadoras en el medio extraíble.

El término "separación" con pertinencia al método de separación de la invención incluye todas clases de segregación o división de una mezcla en sus partes, particularmente división de uno o más componentes estructuralmente diferentes, que se disuelven molecularmente en un líquido, y extendiéndolos en diferentes fracciones líquidas. Un componente sobresaliente de la mezcla es siempre la proteína o péptido objetivo que debe experimentar una separación ce al menos otro componente de la mezcla. De este modo, no importa si el objetivo se separa en una fracción y la colectividad de productos separados en otra fracción (común) , o si cada componente individual de mezcla se separe en su propia fracción de cualquier otro componente, o si el método de por resultado cualquier cosa localizada entre estos extremos. Es suficiente si en al menos una fracción líquida obtenida después de realizar el método se observa un enriquecimiento de al menos una proteína o péptido disuelto ya presente en la mezcla original (de alimentación) . Los productos secundarios separados no necesitan ser necesariamente recuperados como fracciones líquidas separadas; también pueden estar unidos al absorbente para que se descarten con este, a manera de ejemplo. No será inusual si el proceso de separación permanece incompleto que convertiría las pérdidas de rendimiento en las fracciones que contienen el producto deseado de valor. El fraccionamiento repentino que evita traslapar las bandas de elución incrementará la calidad de la separación (es decir, la pureza) al costo de pérdidas adicionales de rendimiento.

Los términos "concentración" y "pureza" se refieren al contenido fraccional dado o lograble de la sustancia respectiva en la mezcla, por lo que el término concentración se está refiriendo a soluciones con inclusión de la cantidad de solvente en la cantidad total de referencia de la mezcla, en tanto que el término pureza se refiere a mezclas secas (algunas veces hipotéticamente) sin dar consideración a solventes (incluyendo agua residual) . Más frecuentemente se señalan como ya sea fracciones en peso o molares (peso/peso, peso/volumen, moles/moles, moles/volumen) . De esta manera se puede lograr una mayor pureza al costo de una mayor dilución (es decir, menor concentración) o viceversa, dependiendo del extremo más importante que se va a lograr en un sistema particular. La medida para determinar los valores reales de estos indicadores como se usa en la presente es por el área pico de HPLC, por lo que se tiene que señalar que cada método de cuantificación excepto por el peso muestra una cierta desviación para componentes de mezcla bien detectables versus componentes de mezcla malamente detectables, y también puede producir curvas de calibración no lineales. Por ejemplo el material insoluble no es cuantificable por HPLC. Dependiendo de su origen, la manera de su aislamiento y pre-procesamiento, la mezcla puede contener típicamente las proteínas o péptidos objetivo en una pureza (combinada) de 1% a 99%, de manera preferente de al menos 10%, más preferente de al menos 50%, el resto que son productos o compuestos secundarios que no están estructuralmente ni funcionalmente relacionados al objetivo tal como solventes residuales, reactivos, etc. Dependiendo de la tarea real de purificación, el método de separación de la invención por lo tanto se puede usar tanto como un paso inicial de captura o aislamiento de entre mezclas muy diluidas o crudas, o como un paso final de pulido de una mezcla ya pre-purificada que contiene una proteína o péptido objetivo casi puro. El número de productos secundarios u otros constituyentes de la mezcla puede variar desde uno (por ejemplo, una mutación o supresión de secuencia de punto individual) a un número esencialmente infinito (por ejemplo, muestras fisiológicas no tratadas) . La clase de productos secundarios es dependiente también de la fuente de la materia prima y del procesamiento anterior.

El término "contacto" se refiere a cualquier tratamiento apropiado de la mezcla inicial (de alimentación) que está presente en una fase liquida (móvil) con el absorbente como la fase sólida (estacionaria) al establecer contacto físico entre las fases tanto a una escala fenomenológica (humectación) como molecular (difusión en poro o superficie) . Los contactos formados deben ser suficientemente intensos para permitir que posiblemente todos los componentes molecularmente disipados de la mezcla, sino al menos la proteína o péptido objetivo, alcancen todas las superficies internas y externas opcionales del absorbente donde los residuos están localizados y luego interactúen con ellos. La formación del contacto puede presentarse bajo condiciones de flujo (tipo tapón, laminar, turbulento etc.), o estáticas, por ejemplo, sobre lechos fijos o fluidizados (expandidos) de partículas de absorbente. Puesto que la mezcla se disolverá en un primer líquido (líquido de alimentación o líquido de adsorción), esto será un proceso heterogéneo y se puede acelerar macroscópicamente la formación del contacto mediante agitación o sacudida de la suspensión resultante, aunque no hay límite de tiempo para terminar este paso de operación a menos que se aproxime el establecimiento de un equilibrio de unión de estado estable de la proteína o péptido objetivo y opcionalmente de los productos secundarios al absorbente.

Como se usa en la presente, el término "liquido" se refiere a cualquier solvente (incluyendo agua como el más importante) o mezcla de solventes que posee al menos propiedades débiles de solubilización para uno o más componentes de la mezcla que se va a separar. Se pueden emplear líquidos de diferente composición para el tratamiento del absorbente en los diferentes pasos del método, puesto que en cada paso el líquido respectivo empleado en la presente tiene que cumplir una tarea particular que se le debe permitir, tal como adsorción (unión) de objetivo, desorción, (liberación) de objetivo, o limpieza de absorbente. Dentro de un ambiente cromatográfico, un líquido que permite un intercambio de equilibrio dinámico de uno o más compontes de la mezcla con el absorbente frecuentemente se llama también una fase móvil. Puesto que las separaciones cromatográficas en el absorbente de la presente invención son predominantemente dependientes tanto de interacciones fuertemente polares como hidrófobas, se puede usar una amplia variedad de composiciones líquidas que tienen diferentes capacidades de solvatación para componentes individuales de la mezcla, dependiendo de qué tipo de interacción se deba favorecer. Para modular adicionalmente la fuerza de cualquiera o todas estas interacciones durante el transcurso del tiempo de cualquier paso dado del método de separación, algunas veces también puede ser aconsejable cambiar gradualmente la composición de liquido usado dentro de ese paso, por ejemplo, mediante mezclado gradiente. Por lo tanto, la composición de un liquido dedicado a cumplir una tarea especifica no necesita ser constante sobre el transcurso completo de tiempo del paso de proceso en el cual se emplea. La solubilidad especifica de la proteina o péptido objetivo también se tiene que tomar en cuenta cuando se eligen líquidos adecuados de adsorción y elución. Las proteínas, excepto por aquellas que están unidas a membrana, requieren normalmente el uso de líquidos de alto contenido acuoso, si tienen que ser conservadas en sus estados nativos y se tiene que prevenir la agregación. Muchas proteínas o péptidos toleran también bajos a moderados porcentajes de sulfóxido de dimetilo, dimetil-formamida, acetonitrilo, o los alcoholes o glicoles inferiores. Puesto que los absorbentes de la invención son químicamente resistentes a casi todos los solventes orgánicos próticos y apróticos, especialmente si el material de soporte sólido a granel contenido en el portador se protege por una película superficial de polímero que es el único material en contacto directo con los líquidos, se da adicionalmente preferencia a aquellos líquidos predominantemente polares que facilitan la hinchazón del absorbente o al menos la película opcional de polímero localizada en el mismos. La polaridad exacta de una mezcla liquida compatible se puede ajusfar de este modo fácilmente por medio de su composición.

Adicionalmente, a estos líquidos o mezclas líquidas, se deben adicionar favorablemente cantidades pequeñas de sustancias auxiliares tal como, preferentemente ácidos volátiles, bases, o amortiguadores, permitiendo de este modo cambiar entre diferentes capacidades de solvatación mediante el ajuste del pH del líquido aplicado (o, en eluyentes parcialmente orgánicos, el pH aparente) y de este modo el grado de protonación y/o desprotonación de analitos seleccionados o todos y/o de residuos seleccionados o todos del absorbente. Las sustancias útiles a este respecto son, por ejemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético y sus sales. La adición de altas concentraciones de sales inertes, orgánicas o inorgánicas también puede ser útil para modificar la concentración iónica de un líquido y de esta manera para romper selectivamente pares de iones entre analitos y el absorbente mediante interacciones competitivas. Sin embargo, en aplicaciones preparativas estos aditivos no volátiles de sal son difíciles de remover posteriormente del producto eluido recuperado si la proteína o péptido objetivo se propone para purificarse adicionalmente por cristalización.

Puede ser ventajoso bajo ciertas circunstancias usar modificadores orgánicos adicionales conjuntamente con el absorbente en la resolución de mezclas de proteina o péptido, que están actuando por un mecanismo que va más allá de un ajuste puro del pH liquido o concentración iónica. Como "modificadores" se resumen moléculas pequeñas o macromoléculas o mezclas de estas que no son líquidos con propiedades de solvatación por sí mismos pero que se pueden disolver o suspender en pequeñas cantidades en uno o más de los varios líquidos empleados en el método de separación de la invención ya sea para ayudar o prevenir la solubilización/elución de ciertos componentes de la mezcla que se va a separar durante el paso particular del método, o por varias razones secundarias (tecnológicas) tal como por ejemplo, estabilización a largo plazo y almacenamiento de solventes, prevención de vía incrustación de absorbente, preservación de analitos de degradación química o biológica o de coagulación, visibilidad mejorada en solvente, hinchazón de absorbente, detección mejorada de analito, rompimiento de estructura de agua, desplegado o replegado controlado de proteína, etc. , dependiendo del problema individual de separación. Los ejemplos especiales de modificadores orgánicos son reactivos de apareamiento iónico, agentes tensioactivos (detergentes) y reactivos caotrópicos .

"Enjuague", "lavado", y "regeneración" son expresiones diferentes usadas para distinguir mejor el tratamiento gradual del mismo absorbente con diferentes clases de líquidos. Los líquidos se diferencian de este modo más bien por las tareas que realizan que por su composición. El procedimiento real de tratamiento de este modo puede ser muy similar y en algunas veces sólo diferente por la decisión de que se hace si el líquido tiene que ser refinado, fraccionado, recolectado, o descartado adicionalmente en base a las sustancias disueltas en el mismo después del tratamiento. El enjuague se dirige a un tratamiento con un líquido solubiliza idealmente y libera del absorbente cualquier componente de mezcla excepto el objetivo que se pueda haber unido de manera no especifica por el absorbente. El lavado se refiere a un tratamiento que se propone para solubilizar y liberar del absorbente todos los componentes residualmente unidos de la mezcla, aún a aquellos que puedan ser de mayor unión que el objetivo. La regeneración se refiere al uso de líquidos que son capaces de remover trazas del líquido de lavado y restaurar las propiedades físicas y químicas ideales del absorbente limpio para el uso en el paso de adsorción al comienzo de la siguiente corrida del método.

"Inmovilización" significa un proceso para eliminar o retrasar sustancialmente la movilidad lateral y/o vertical de largo alcance de un péptido o proteína en la superficie de un absorbente que de otro modo se puede provocar por ya sea migración difusional estadística (movimiento de Brown) o fuerzas físicas o químicas dirigidas (por ejemplo, presión osmótica, flujo de corte) . La posición bi- o tri-dimensional macroscópica de una proteína o péptido inmovilizado en la. parte adsorbente de una superficie y por lo tanto se puede considerar como que se fija en una escala de tiempo corto. Permanecen aún sin afectar las pequeñas fluctuaciones inevitables en el orden de nanómetros alrededor del centro de inmovilización tal como cambios conformacionales , rotaciones moleculares u oscilaciones, que salta entre sitios adyacentes de unión, o cualquier movimiento de traslación dentro de los radios combinados de la proteína o péptido mismo y el residuo al cual se une así como una correa (opcionalmente polimérica) aplicada para fijación del respectivo residuo de sitio de unión a la superficie. La liberación lenta de la proteína o péptido unido al cruzar la capa de superficie de unión en una escala a largo plazo también puede ser una propiedad deseada.

En una modalidad central que define una composición de materia, la presente invención se refiere al diseño específico al objetivo de un nuevo absorbente. Los materiales de soporte sólido que tienen grupos funcionales se han usado para derivatización subsiguiente a superficie, produciendo un arreglo bi- o tri-dimensional de múltiples residuos adecuado para interacción espacial multivalente y/o multifuncional con la proteina o péptido objetivo incluido en la misma. Después de probar varios residuos, se encontró particularmente que la doble derivatización de porciones de los grupos funcionales del material de soporte sólido tanto con residuos heteroaromáticos binucleares como mononucleares da por resultado un desempeño superior en la separación cromatográfica subsiguiente de proteínas o péptidos uno del otro o de sus productos secundarios sin el absorbente que comprende estos residuos heteroaromáticos se usa como la fase estacionaria.

Por lo tanto, un aspecto general de la invención se puede describir con un absorbente que comprende un material de soporte sólido, la superficie del cual comprende primeros residuos que comprenden una estructura heteroaromática binuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, O, S, y segundos residuos que comprende una estructura heteroaromática mononuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S.

Los aspectos más específicos de la invención se pueden describir con absorbentes de acuerdo al primero, segundo, tercero, cuarto y quinto aspectos como se específica en la sección "Breve Descripción de la Invención" .

El término "en donde ninguno de los grupos funcionales comprende tanto el primer residuo como el segundo residuo" como usa para la descripción de los absorbentes de acuerdo al tercero y quinto aspecto significa que menos de 5% de los grupos funcionales disponibles de la superficie del portador, de manera preferente menos de 1%, más preferido menos de 0.1%, aún más preferido ninguno de los grupos funcionales, tiene tanto un primero como un segundo residuo.

En una modalidad especifica, no es detectable por métodos analíticos comunes tal como métodos espectroscópicos que un grupo funcional tiene un primero y un un segundo residuo.

Este material de soporte sólido del absorbente se puede elegir del grupo que comprende poliestireno, ácido poliestireno-sulfónico, poliacrilatos, polimetacrilatos , alcohol polivinílico, sílice, vidrio, almidón, celulosa, agarosa, sefarosa y dextrano, o cualquier producto compuesto del mismo. El material de soporte sólido puede corresponder a la clase de materiales modificados en superficie a granel, genéricos o adicionales, por ejemplo, para introducir grupos funcionales superficiales o para incrementar la humectabilidad acuosa.

En una modalidad especial, el absorbente también puede comprender una marca fácilmente detectable, tal como una marca ópticamente absorbente, una ópticamente emisora, una radioactiva, o una codificadora en masa o radiofrecuencia. La marca se puede usar para identificar un absorbente particular con su combinación individual de residuos aun en mezclas de absorbentes o para facilitar la detección de la unión de la proteina o péptido. La marca se puede incorporar en el núcleo del material de soporte sólido, o de manera alternativa junto con los residuos sobre su superficie.

A las estructuras C, N, O, S-heteroaromáticas , como se mencionaron anteriormente, especialmente corresponden algunas que se presentan frecuentemente en estructuras químicas de moléculas orgánicas pequeñas, tal como aquellas de la lista representada en las Figuras 3 y 4. Las estructuras heteroaromáticas que contiene al menos un átomo de nitrógeno con al menos un anillo se prefieren en ambos tipos de residuo. Los núcleos de anillo de las estructuras heteroaromáticas típicas se montarán predominantemente de una o más porciones del tipo -NH-, C=N, -O- o -S- además de las porciones C-C o C=C. Los núcleos de anillo de 5 y 6 miembros son estrictamente preferidos. El ajuste fino de la afinidad específica del absorbente para una proteína o péptido particular dado se logra mediante selección cuidadosa de los respectivos núcleos heterocíclicos y sustituyentes, la relación molar de los primeros y segundos residuos, y la introducción de residuos opcionales adicionales. Por lo tanto, llegará a ser claro que la variabilidad completa no se puede tratar de forma exhaustiva; en cambio se dará la estructura conceptual para construir un absorbente de acuerdo a las demandas existentes.

Por simplicidad, sólo se muestra una fórmula mesomérica para cada estructura en las Figuras 3 y 4. Además, para el propósito de la presente invención es suficiente dentro del significado del término "heteroaromático" si al menos una fórmula mesomérica o tautomérica razonable de carácter heteroaromático de esta estructura existe aún si hay fórmulas no heteroaromáticas adicionales, posibles. La conexión entre el sistema de anillo y el resto del residuo, y de esta manera eventualmente el material de soporte sólido, se puede hacer mediante cualquiera de los átomos de anillo, incluyendo valencias libres en los heteroátomos, como puntos de unión.

Algunas de las estructuras heteroaromáticas mostradas, especialmente aquellas que contienen uno o más nitrógenos de anillo, débilmente básicos, son ionogénicas lo que significa que un átomo electrónicamente neutral o cualquier grupo que lo contenga, bajo las condiciones de la separación que se va a realizar (es decir, usualmente condiciones moderadas o ambientes que no afectan la integridad estructural del absorbente o de los analitos) se puede convertir de manera reversible (por ejemplo, por protonacion o desprotonación) en un catión o anión que ya sea es estable bajo condiciones ambientes o en equilibrio con la forma no cargada. De manera más especifica, los residuos C, N, O, S-heteroaromáticos del absorbente serán tratables, al menos en parte a la protonacion y de esta manera, al menos en parte, estarán presentes en su forma protonada. Aunque las formas cargadas no se muestran explícitamente en las figuras, el equilibrio puede residir realmente casi de forma completa en cualquier lado bajo las condiciones dadas, y aún puede haber interconversión mutua medible entre la forma cargada y no cargada. La protonacion depende del pH ambiental pero también es prevalente en la mayoría de los solventes orgánicos apróticos y hace distinguir si ambas formas o sólo una de ellas es responsable de la afinidad exhibida por el absorbente. El grado exacto de protonacion de cada residuo dependerá de la basicidad, de la concentración y de la clase del ácido presente, de la fase móvil usada y de la manera de pre-acondicionar el absorbente.

Dependiendo de la tarea particular de separación, de esta manera puede ser ventajoso ya sea tratar la mezcla que se va a separar con un absorbente que exhiba residuos que se han acondicionado para que estén predominantemente en el estado no cargado o predominantemente en el estado cargado, o que aún puedan cambiar el estado de carga una o más veces durante la separación (por ejemplo, por intercambio de amortiguador como se conoce de los intercambiadores iónicos débiles) . También son posibles condiciones bajo las cuales se ionizan parcialmente a las estructuras heteroaromáticas ionogénicas del absorbente, puesto que se puede concebir fácilmente si se realiza una separación en un ambiente cuyo pH se aproxime al valor pK de la respectiva estructura heteroaromática . También puede ser necesario manufacturar o almacenar el absorbente en un estado no cargado en tanto que se realiza la separación en un estado cargado, o viceversa.

Se prefiere un pre-acondicionamiento del absorbente que comprende un sistema amortiguador acuoso de un pH aproximadamente neutral, especialmente si están presentes (terceros) residuos adicionales que comprende una estructura de amina (ver más adelante) . Este tratamiento establecerá una distribución uniforme de contraiones que corresponden a cada clase de estructura de amonio u otro residuo ionogénico. La fuerza de la unión por hidrógeno exhibida por los residuos hacia un analito también se ve influenciada por la naturaleza de los contraiones que se espera que estén dentro de la cubierta circundante de solvato y formen pares de iones con residuos protonados, su basicidad y/o su comportamiento de capacidad de polarización "dura" versus "blanda".

Se pueden unir sustituyentes adicionales a las estructuras C, N, 0, S-heteroaromáticas binucleares y/o mononucleares, respectivamente, y se pueden elegir para ambas clase de estructuras independientemente. Como se muestra en la Figura 5 para estructuras de ejemplo, en donde los sustituyentes R1, ... , Rn representan independientemente un par de electrones, hidrógeno (H) , un radical orgánico, o un enlace superficial. Sin que se desee que se confine a una geometría particular de anillo o patrón particular de sustitución, los sustituyentes adecuados de las estructuras C, N, 0, S-heteroaromáticas pueden comprender especialmente aquellos que se componente de uno o más de los siguientes radicales orgánicos, simples: alquilo lineal o ramificado de C1-C20 alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, arilalquilo, arilalquenilo, arilalquinilo, alquilooxi, alqueniloxi, alquiniloxi, cicloalquiloxi, ariloxi, arilalquiloxi, alquiltiilo, alqueniltiilo, alquiniltiilo, cicloalquiltiilo, ariltiilo, arilalquiltiilo, halógenoalquilo, halógenoalquenilo, halógenoalquinilo, halógenocicloalquilo, halógenoarilo, halógenoarilalquilo, halógenoalquiloxi, halógenoariloxi, halógenoarilalquiloxi, halógenoalquilotiilo, halógenoariltiilo, o halógenoarilalquiltiilo. En particular, los sustituyentes pueden contener al menos una estructura C, N, 0, S-heteroaromática binuclear o mononuclear adicional o heteroátomos unidos de cualquier otra manera, y especialmente una tomada de la lista representada en las Figuras 3 y 4. También, se pueden conectar dos o más de los sustituyentes R1, ... , Rn entre si por un enlace alifático de cualquier clase y longitud, pero especialmente mediante cualquiera de los radicales orgánicos mencionados anteriormente o una combinación de los mismos, para formar una estructura de anillo policiclica. La condensación en estructuras C, N, 0, S-heteroaromáticas multinucleares (número de anillos aromáticos fusionados > 3) se excluye, sin embargo, puesto que son sustituyentes que comprenden grupos de intercambio catiónico permanente.

Las estructuras binucleares preferidas son estructuras de benzopirrol (indol) , incluyendo todas las posibles estructuras de aza-benzopirrol, oxa-benzopirrol, y tia-benzopirrol, o estructuras de benzopiridina (quinolina o isoquinolina) , incluyendo todas las posibles estructuras de aza-benzopiridina . Las estructuras mononucleares preferidas son estructuras de pirrol, incluyendo todas las posibles estructuras de aza-pirrol, oxa-pirrol, y tia-pirrol. Aquí, se prefieren de manera particular estructuras de 3-azapirrol ( imidazol ) .

Los absorbentes completamente sintéticos de la presente invención se tienen que distinguir adicionalmente de los medios convencionales de afinidad en los cuales los residuos unidos a superficie son por sí mismos frecuentemente proteínas o péptidos o partes de los mismos y que imitan cercanamente las interacciones conocidas de ligando-receptor biológico. En general, estos medios padecen de las desventajas señaladas al comienzo. Puesto que los aminoácidos naturales, triptófano e histidina también contienen estructuras C,» N-heteroaromáticas binucleares o mononucleares en sus cadenas laterales, respectivamente, cualquier residuo de polipéptido o variante protegida en grupo del mismo, que se puedan construir fácilmente por técnicas de síntesis en fase sólida secuencial, calificarían teóricamente como un residuo de acuerdo a la presente invención. De esta manera se tiene que hacer claro que ni triptófano ni histidina, ni sus ésteres ni carbonatos, ni ningún péptido que comprenda cualquiera de ellos como residuos están dentro del alcance de la invención. Sin embargo, esto no es válido para algunas estructuras sintéticas y predominantemente no peptídicas que puedan contener un bloque de construcción relacionado a triptófano o histidina.

Los grados aproximadamente iguales de derivatización con cada residuo se prefieren, es decir, el primero y segundo residuos estarán presentes en una relación molar de aproximadamente 1:1, en un sentido más amplio al menos de 3:2 a 2:3. La suma de los grados de derivatización para el primer y segundo residuos combinados se mantienen preferentemente cerca al menos 50 % (en base al número de grupos funcionales disponibles para derivatización) a fin de promover la formación de sitios de interacción multivalentes de composición mezclada en tanto que aún se mantiene alta la capacidad de unión del absorbente para la proteina o péptido objetivo. Tanto los primeros como los segundos residuos entonces pueden estar presentes, por ejemplo, a grados de derivatización cercanos a 25 % cada uno. Los terceros residuos preferidos (ver más adelante) comprenden amina o amida, de manera preferente estructuras de amina primarias. En este caso, los primeros, segundos y terceros residuos están presentes en una relación molar de aproximadamente 1:1:2, respectivamente. Son tolerables las desviaciones relativas de aproximadamente 10 % alrededor de estos valores .

En una modalidad, se enlazan de 5 a 95 % de los grupos funcionales a estas estructuras heteroaromáticas binucleares y mononucleares, de manera preferente de 15 a 85 %, más preferido de 25 a 75 %, aún más preferido de 35 a 65 %, adicionalmente preferido de 40 a 60 %. Puesto que la relación de primeros y segundos residuos se puede seleccionar libremente, es posible ajustar opcionalmente dentro de estos intervalos dados un absorbente a un problema especifico de separación, por ejemplo, la separación de una proteina o péptido de una mezcla que comprende el péptido o proteina, o ajustar el absorbente al incremento óptimo de la concentración y/o pureza de un péptido o proteina de una mezcla que comprende el péptido o proteina. Esta variabilidad vuelve particularmente útil el absorbente o los absorbentes de acuerdo a la invención para los problemas mencionados de separación o incremento y/o pureza.

Por consiguiente, en una modalidad, se enlazan de 5 a 95 % de los grupos funcionales a las estructuras heteroaromáticas binucleares y mononucleares, de manera preferente de 15 a 85 %, más preferido de 25 a 75 %, aún más preferido de 35 a 65 %, adicionalmente preferido de 40 a 60 %; en donde los primeros y segundos residuos están presentes en una relación molar de 3:2 a 2:3.

El tipo de unión a residuo puede ser cualquier variante de un enlace covalente (orden de enlace variable homo- o heteroatómico) y se puede hacer ya sea directamente con grupos funcionales en la superficie del material de soporte sólido o en una película de polímero opcional que cubre la superficie, ya sea unida a su estructura o a sus cadenas laterales lineales o ramificadas colgantes u opcionalmente acoplado mediante los términos de ligadores bifuncionales . Además de las estructuras heteroaromáticas que son las partes designadas de los primeros y segundos residuos para interactuar selectivamente con la proteina o péptido objetivo, estos residuos de esta manera también pueden comprender ligadores covalentes. Estos ligadores bifuncionales no se muestran intencionalmente en las figuras debido a su gran variabilidad posible en longitud y composición guimica pero.se conocen de métodos normales de bioconjugación o síntesis en fase sólida (por ejemplo, succinilo);- el ligador bufuncional más simple será una cadena de alquileno de un número predeterminado de uno a aproximadamente 20 átomos. Los ligadores más adecuados son los conformacionalmente flexibles. Los enlaces covalentes preferidos que conectan los residuos completos a una película de polímero nuevamente se harán de enlaces de amida, uretano, urea, o amina secundaria/terciaria.

Dentro de este contexto, se tiene que mencionar que especialmente las cadenas largas de alquileno o las porciones de polietilenglicol usadas como ligadores pueden ejercer fuerzas hidrófobas adicionales bastantes inespecíficas en estas proteínas o péptidos en superposición o amplificación del efecto primario de los heteroaromáticos . Sin embargo, los ligadores anteriormente descritos que contienen azufre que se sintetizan fácilmente y se conectan a superficies activadas, no están dentro del enfoque de la presente invención puesto que es bien conocido que los átomos de azufre o los grupos que contienen azufre interactúan bien con los correspondientes grupos de la misma clase en la superficie molecular de un analito, un hecho que puede ser capaz de introducir selectividades especiales en si mismos que pueden interferir posiblemente con el mecanismo de unión de los absorbentes presentados ahi.

Por lo tanto, no se puede excluir que posibles estructuras químicas adicionales formadas entre un ligador opcional y los grupos funcionales del material de soporte sólido y/o las estructuras heteroaromáticas por medio de su unión también son accesibles a varios analitos y de esta manera pueden ayudar en la retención selectiva de la proteína o péptido objetivo. Las únicas limitaciones prácticas con respecto a la composición química de las entidades estructurales adicionales colocadas entre la estructura heteroaromática como parte del residuo respectivo en la superficie del material de soporte sólido se imponen por el requisito de estabilidad y compatibilidad química con las condiciones aplicadas durante la manufactura, almacenamiento y uso del absorbente. Por lo tanto, también es posible que el residuo respectivo se incorpore mediante un punto específico de unión como una subestructura en un núcleo molecular de mayor complejidad (incluyendo polímeros) se pueden comprender residuos adicionales de la misma y/o diferente clase.

Los residuos se pueden acoplar directamente a la superficie de un material de soporte sólido a granel, en particular al formar enlaces covalentes con grupos funcionales en la superficie. Por ejemplo, el método de elección para acoplar residuos a los grupos silanol superficiales de sílice se realiza con la ayuda de ligadores terminados en clorosilano o alcoxisilano en tanto que el acoplamiento a los grupos hidroxilo de soporte de carbohidratos se puede lograr a través de una variedad de métodos tal como la activación clásica con bromuro de cianógeno. Estos métodos se conocen de forma suficiente por el experto en la técnica.

Sin embargo, en una modalidad preferida, el material de soporte sólido a granel representa sólo un portador, la superficie inmediata del cual se cubre con una película de un polímero que tiene grupos funcionales, el polímero que tiene a su vez primeros y segundos y opcionalmente adicionales residuos colgantes. De esta manera se forma una intercapa delgada que mueve las partes que interactúan con el analito y que definen la forma macroscópica del absorbente separándolas una de otra pero no cambiando significativamente la topología superficial subyacente total y por lo tato se considera como una parte de esa superficie. Los residuos se pueden unir a los grupos funcionales de polímero que volverán al polímero más empleado en al menos un copolímero parcialmente derivatizado. Los polímeros adecuados que tienen grupos funcionales son por ejemplo alcohol polivinílico, polivinilamina, polialilamina, polietilen-imina, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, y cualquier mezcla de copolímeros o polímeros que comprenda al menos uno de estos polímeros. Especialmente si el material de soporte sólido consiste de un material polimérico a granel como un portador cuya superficie se cubre adicionalmente con una película de un polímero, pero también si se usan portadores no poliméricos, el material del que se hace el portador puede ser diferente del material del que se hace la película de un polímero. Esta diferencia puede manifestarse por sí misma por ejemplo en una diferente composición monomérica, regio-o estéreo-química de polimerización, estereoregularidad (tacticidad) , distribución de peso molecular, grado de reticulación, o combinaciones de los mismos.

El espesor exacto de la película de polímero y también la cinética de separación y la capacidad del absorbente son de este modo dependientes del estado de hinchazón del polímero, que por sí mismo siempre será una función de la composición de la fase móvil, y de esta manera puede variar bajo diferentes condiciones externas. Para separaciones de proteínas y péptidos llevadas a cabo en medios acuosos o acuosos-orgánicos mezclados, se prefiere si el polímero se pueda hinchar en este medio. Esto se logra más fácilmente si el polímero es un polielectrolito sintético. Como se explica anteriormente, en el carácter de carga de cualquier posible residuo ionogénico también tiene influencia en la capacidad para hincharse de la película de polímero a un cierto grado que nuevamente es dependiente del solvente. El término "acuoso" se usa en la presente para describir líquidos que contienen más de 50 % en volumen de agua, el resto que son otros solventes o aditivos visibles en agua tal como amortiguadores inorgánicos u orgánicos, sales, etc.

Esta morfología se diseña para mantener velocidades de transferencia de masa inusualmente alta entre fases móviles y estacionarias mediante difusión en poros. El polímero lineal o ramificado mismo tiene que ser fijado de forma durable en la superficie del portador rígido y firme a fin de que la película de polímero resista las condiciones del proceso de separación para el cual se hace y está en su posición a todo lo largo de proceso completo. La fijación se puede realizar ya sea por reticulación interna de las hebras individuales de polímero que dan por resultado la formación de una red de polímero continua, o al injertar las células individuales de polímero en una o más posiciones a lo largo de la cadena al sólido portador. La reticulación así como el injerto se pueden lograr fácilmente entre los mismos o diferentes grupos funcionales del polímero, o entre los grupos funcionales presentes en cualquier parte del polímero y aquellos presentes en la superficie el portador no revestido, respectivamente. Las conexiones de reticulación o injerto preferidas del polímero serán de enlaces de amida, uretano, urea o amina secundaria/terciaria. Los grupos funcionales terminales de las hebras individuales del polímero se usan mejor para injerto, lo que dará por resultado una configuración de extremo abierto dada la más alta flexibilidad de cadena.

Aunque será ciertamente factible una combinación de ambas técnicas, usualmente es suficiente una de ellas. La manera preferida de fijación es reticulación (sin injertos) . Las cadenas de polímero se pueden reticular de este modo covalentemente entre sí a un grado de 1 % a 20 % en base al número de grupos funcionales disponibles para reticulación.

Los residuos complementarios adicionales de esta manera pueden resultar en principio de la introducción de reticulaciones en la película de polímero si los reactivos de reticulación contiene estructuras químicas que son adecuadas para interactuar con uno o más analitos. Puesto que el grado de reticulación del polímero se mantiene preferentemente a un porcentaje comparablemente bajo, se cree que sus contribuciones son más bien insignificantes. Los mismo se piensa que es válido para la contribución de grupos adicionales de amida (por ejemplo, formamida) o uretano que pueden estar permaneciendo en una cantidad variable, pero usualmente menos de 1 % como resultado de la síntesis de películas de polímero que contienen grupos aminofuncionales mediante reacciones de hidrólisis incompletas, dando por resultado copolímeros de amina/amida o amina/uretano estadísticos.

Sin embargo es posible derivatizar un material de soporte sólido con dos o más primeros residuos diferentes y/o dos o más segundos residuos diferentes, de acuerdo a la definición de sus estructuras parciales respectivas. Estos entonces pueden diferir entre sí en sus estructuras heteroaromáticas o en sus maneras para enlazar estas estructuras a la superficie del material de soporte sólido, o ambas. En una modalidad preferida, el número total de primeros residuos y el número total de segundos residuos (o su grado de equivalente de derivatización, respectivamente) será aproximadamente igual a fin de realizar el número máximo de sitios de unión de composición mezclada que comprenden todos los primeros y segundos residuos diferentes bajo la provisión de una distribución aleatoria (estadística) espacial de residuos.

Usualmente y en una modalidad preferida, los primeros y segundos residuos no se conectan directamente entre sí sino se unen de forma separada a ya sea un material de soporte sólido a granel, mismo o una película de polímero soportada por este como un portador. Tanto las estructuras C, N, 0, S-heteroaromáticas binucleares como mononucleares son dos entidades distinguibles, cada una que posee su propio ligador a un material de soporte sólido a granel o superficie de polímero, que debe constituir, dentro de esta modalidad, la ruta de conexión más corta entre estos. Esta forma hace al segundo residuo fácilmente separable por estructura del primer residuo. Por consiguiente, la estructura heteroaromática binuclear y la estructura heteroaromática mononuclear no se enlazan a la superficie del material de soporte mediante uno y el mismo grupo funcional.

Por otra parte, también se pueden conectar dos o más residuos de la misma o diferente clase directamente entre sí a través de enlaces covalentes que no comprenden la estructura de una película de polímero o de cualquier otra manera en la superficie del material de soporte sólido. En este caso, los límites entre los residuos individuales empiezan a confundirse y llegan a ser arbitrarios puesto que sólo pueden dejarse significativos si se conoce la historia de derivatización del absorbente (es decir, la secuencia y clase de los pasos de derivatización) . Como se muestra por ejemplo en las representaciones esquemáticas de las Figuras 1A - 1H, se pueden derivatizar dos grupos funcionales colgantes en la superficie del material de soporte y sólido con dos diferentes residuos de muchas maneras diferentes (la linea ondulada horizontal . larga aquí denota una parte de la superficie que por si misma puede contener residuos adicionales) .

Además del caso mencionado anteriormente de una distribución igual en donde cada grupo funcional individual tiene un . residuo (en fórmulas A o B) , también se pueden alinear, por ejemplo secuencialmente en una fila (en fórmula C, D) o en paralelo (en fórmulas E, G) sobre el mismo grupo funcional. Estas configuraciones se pueden lograr de manera experimental, ínter alia, ya que un residuo contiene por si mismo un grupo funcional que es el mismo como el polímero o grupo funcional de superficie o diferente del mismo, y que se puede derivatizar por sí mismo, después de la derivatización del polímero o grupo funcional de superficie con el primer residuo (opcionalmente después de la desprotección y/o activación) con el segundo residuo (caso C) , o en que se derivatiza un grupo funcional al menos dos veces (en un paso individual o en varios pasos consecutivos, tal como un grupo funcional tal común (caso G) , o un ligador que tiene una estructura ramificadas (case E) se comparte por ambos residuos (un ejemplo apropiado sería una alquilación de dos o tres veces de un grupo amino primario para producir una porción amino terciaria o amonio cuaternario) . Las configuraciones C, D, E, F resultantes, también se pueden lograr sin embargo mediante una ruta alternativa en la cual la superficie o el polímero que tiene grupos funcionales se derivatiza con un reactivo individual de derivatización que tenga ya tanto primeros como segundos residuos en el arreglo mutuo correcto. Los arreglos mutuos más complejos de ambos residuos tal como sistemas de anillo macro- o poli-cíclicos (casos F u H) también son imaginables, por supuesto. En todos los casos excepto para A, la primera porción de los grupos funcionales que se derivatiza con el primer residuo siempre es igual a la segunda porción de grupo funcionales que se derivatiza con el segundo residuo.

Todas las situaciones descritas anteriormente pueden ser consideradas también bajo una vista unificada como casos ambiguos de una situación más general en la cual los residuos individuales se arreglan en un orden jerárquico. De acuerdo a esta interpretación y como una modalidad especial de la invención, el primer residuo (más grande) comprende el segundo residuo (más pequeño) (o viceversa) además de su estructura C, N, 0, S-heteroaromática binuclear, por lo que el residuo más grande se elige tal que derivatiza directamente un grupo funcional del material de soporte sólido, como se muestra en la representación general I de la Figura 1. En este caso, todos los átomos y porciones químicas del segundo residuo también están contenidos en el . primer residuo. Esto significa que hay sólo uno, o dos diferentes residuos distinguibles, cada uno de los cuales que comprende todos los elementos estructurales covalentemente conectados incluyendo estructuras C, N, 0, S-heteroaromáticas binucleares y mononucleares . Dentro de este orden jerárquico dado, se puede realizar básicamente cualquier tipo de conexión y geometría (lineal, ramificada, cíclica, etc.) para unir los átomos y entidades estructurales del segundo residuo a aquellos del resto del primer residuo que no se está traslapando con el segundo residuo. Bajo estas circunstancias, la división de la jerarquía estructural en dos diferentes residuos, sería más bien sin embargo una material de formalidad; en el límite las propiedades químicas serían únicas a la suma total de estructuras como una unidad química integral. De este modo son posibles múltiples arreglos con respecto a la orientación múltiple de las subunidades estructurales de los dos residuos, con excepción que tanto los primeros como los segundos residuos no deban compartir un sistema de anillo, heteroaromático, individual, común.

Si uno de los ejemplos dados se vuelve a examinar en vista de esta representación general, esta configuración se puede lograr, ínter alia, ya que las dos estructuras heteroaromáticas diferentes comparten un ligador común o una parte del mismo a través del cual se unen a la superficie del material de soporte sólido mismo. Las dos estructuras heteroaromáticas se pueden arreglar de este modo linealmente en la misma ramificación o en ramificaciones diferentes, si el ligador tiene una estructura ramificada. El residuo completo, es decir, la unidad estructural, uniforme, más grande posible (incluyendo un posible ligador que termina en los grupos funcionales superficiales y todas las otras subestructuras conectadas con este) , entonces se atribuirían, sólo formalmente, al primer residuo, en tanto que el segundo residuo nuevamente de forma formal comprendería en una configuración solamente la respectiva estructura heteroaromática mononuclear y posiblemente sus elementos conectivos inmediatos con el resto del (primero) residuo completo.

Ahora se ha encontrado de forma sorprendente que cualquier absorbente que posea una combinación en las dos características estructurales descritas anteriormente permite la fácil recuperación de varias proteínas o péptidos, en ciertos casos con una pureza mayor de 98 %, o con una concentración final de cada impureza por abajo de 1 % en un paso individual iniciando de sólo mezclas parcialmente purificadas. De esta manera se pueden obtener grados farmacéuticos sin procedimientos laboriosos ni embarazosos. La concentración de proteínas o péptidos en materiales crudos tal como aquellos que resultan, directamente de la producción en una escala industrial, se puede enriquecer a altos niveles en un sólo paso también. Los títulos aplicables pueden variar desde aproximadamente 1 % a aproximadamente 90 % en la mezcla. Los rendimientos recuperados de estos pasos de este modo son al menos tan altos como aquellos de los métodos convencionales de purificación y pueden alcanzar valores de 95 %. El desempeño notablemente bueno de un absorbente que comprende residuos de ambas clases de las dos diferentes estructuras heteroaromáticas para un objeto dado de la invención es aún más sorprendente puesto que se puede mostrar que los absorbentes que comprenden residuos de estructuras cercanamente relacionadas o son una clase de las dos estructuras heteroaromáticas mostraron a lo mucho sólo una eficiencia moderada de, separación.

Sin que se desee que se una a una teoría, el alto desempeño de este absorbente particular en comparación a un absorbente revestido con una película de una amina polimérica, siempre no derivatizada, se puede atribuir a la presencia de sitios de unión multivalente adicionales y estructuralmente nuevos. Las estructuras responsables de la creación de estos nuevos sitios de unión se pueden atribuir predominantemente a modificación estadística parcial del polímero. Entre aquellas estructuras particularmente que se van a señalar está la presencia potencial de sistema p ya sea ricos en electrones o pobres en electrones, extendidos y/o sistemas conjugados de basicidad débil dentro de estos sitios de unión. El modo de interacción subyacente se piensa que comprende tanto interacciones que corresponden al grupo de polares/dipolares tal como fuerzas electrostáticas, transferencia de carga y unión por hidrógeno asi como aquellas que corresponden al grupo de apolares tal como interacción hidrófoba y apilamiento p. Los heteroátomos del sistema p se espera que sean los sitios potenciales de fuerzas de dipolo y unión por hidrógeno, ya sea a través del sistema p electrónico mismo o a través de un par sólo de electrones adicional. Sin embargo, sin que se hayan realizado investigaciones del mecanismo realmente operante en una separación dada y la clase exacta de la contribución parcial de cada residuo a la concentración de unión total, no se puede trazar una conclusión definitiva por adelantado para cualquier estructura, parcialmente debido a que la competición que forma unión por hidrógeno con moléculas de solvente también puede complicar el caso. Los factores histéricos pueden contribuir adicionalmente a la selectividad del absorbente diseñado. Al menos, las contribuciones iónicas puras de los primeros y segundos residuos son improbables o aún se pueden excluir.

Además, después de probar un gran número de absorbentes diferentemente derivatizados, se encontró sorprendentemente que la presencia de un tercer residuo además de la derivatización de las primeras y segundas porciones de grupos opcionales en la superficie del material de soporte sólido con primeros y segundos residuos produjo resultados aún superiores en vista del objeto de separación dado de la invención. El material de soporte sólido de esta manera se puede derivatizar adicionalmente con un tercero, cuarto y quinto residuo complementario, y demás. Un absorbente que comprende un material de soporte sólido, la superficie del cual además de los primeros y segundos residuos, como se describe anteriormente, también comprende un tercer residuo, por lo tanto es una modalidad adicional de la presente invención. Se están excluyendo las estructuras C, N, 0, S-heteroaromáticas binucleares o mononucleares como bloques de construcción estructural del tercero y cada residuo adicional. Aparte de esta exclusión, todas las opciones con respecto a posibles relaciones estructurales entre los residuos, como se expone por ejemplo en la Figura 1 para el primero y segundo residuo, aplican en forma análoga a las relaciones mutuas entre el tercero y el primero, el tercero y el segundo, asi como entre cualquiera de los residuos adicionales. Cada residuo adicional de una clase diferente promueve el potencial del absorbente de crear sitios de unión muy específicos para una proteína de péptido dado y para distinguirlo de productos secundarios cercanamente relacionados. Sin embargo cada categoría de residuos debe estar presente en un grado de derivatización de- al menos aproximadamente 20 % puesto que los grados significativamente menores de derivatización son en la mayoría - de los casos insignificantes por razones estadísticas. Para la mayoría de las aplicaciones, por lo tanto es suficiente mantener el número de categorías de residuo = 5 en aproximadamente grados iguales de derivatización. A pesar del número y relación mutua de diferentes residuos, cada tipo de residuo aún se debe distribuir de manera homogénea y aleatoria (estadísticamente) en la superficie del material de soporte sólido .

En tanto que la primera porción de grupos funcionales puede comprender de este modo la segunda porción de grupos funcionales, o puede ser diferente de esta, el tercer residuo también puede surgir de derivatización incompleta de los grupos funcionales superficiales del material de soporte sólido con porciones de primeros y segundos residuos.. Dependiendo de los reactivos y condiciones sintéticas usadas, las reacciones de derivatización frecuentemente permanecen incompletas. Por lo tanto, un cierto número de grupos funcionales no derivatizados genéricos a la superficie del material de soporte sólido incluyendo el polímero base opcional que lo cubre (es decir, aquellos incorporados en al menos uno de sus monómeros o unidades repetitivas correspondientes) que se va a derivatizar puede sobrevivir intencionalmente o por razones técnicas. Aún pueden ser accesibles a varios analitos, pueden actuar como una parte complementaria de un sitio de unión, y ayudar en la unión a la proteina o péptido objetivo, y de esta manera adicionarse a la capacidad de separación del absorbente. Esto significa que una tercera porción (más a la izquierda) de los grupos funcionales mismos puede representar una clase de los terceros residuos. En la presente invención, se prefiere emplear materiales de soporte sólido cubiertos con una película de poliamina, particularmente una película de polivinilamina . Por consiguiente, los grupos funcionales preferidos son estructuras aminoprimarias y opcionalmente secundarias que por lo tanto se pueden considerar como terceros residuos complementarios. También se puede demostrar que las fracciones de grupos funcionales derivatizados que aparentemente se llevaron muy alto a una disminución en la selectividad para un objeto dado de separación. Este hecho se puede tomar como una indicación que de esta manera se crean nuevos sitios de unión multifuncional dentro del absorbente que comprende tanto primeros como segundos residuos y grupos funcionales no derivatizados en proximidad espacial cercana.

Por medio de esta derivatización terciaria designada o una derivatización primaria y secundaria incompleta, la selectividad para una proteina o péptido dado se puede incrementar además en muchos casos, y como un beneficio práctico acompañante una película de polímero opcional que cubre la superficie del material de soporte sólido frecuentemente se observa para ganar estabilidad química adicional y mejor compatibilidad con solvente o propiedades de hinchamiento dependiendo de las polaridades relativas de los primeros y segundos residuos y los grupos funcionales comprendidos. Sin embargo, se puede señalar que los primeros y segundos residuos son los residuos más esenciales para lograr el objeto de separación subyacente en términos de especificidad puesto que una película de un polímero completamente no derivatizado tal como polivinilamina reticulada, que exhibe sólo grupos funcionales amino primarios de estructura a los analitos, no logra el objeto de separación de la presente invención de forma satisfactoria. Idealmente, la densidad total de residuos (incluyendo grupos funcionales no derivatizados que actúan como residuos complementarios) da cuenta de 0.1 mol / dnf3 a 1.0 mol dm"3, pero de manera preferente al menos aproximadamente 0.3 mol dm"3.

Por otra parte, los grupos funcionales, reactivos, no derivatizados del material de soporte sólido o de una película de polímero opcional en el mismo, más específicamente grupos amino, pueden exhibir aún reactividad reversible o irreversible considerable hacia el objetivo o posibles productos secundarios reactivos de la mezcla que se va a separar que puede conducir a captura firme de esta sustancias, aún si están presentes en bajas concentraciones únicamente y después del uso repetido, aún deterioro lento el absorbente y pérdida de la capacidad de unión. A fin de evitar esta interacciones indeseadas, es práctica común en la preparación de fases estacionarias cromatográficas volver a estos grupos funcionales residuales inactivos mediante "remate de extremo" final de estos grupos. De esta manera se pueden emplear residuos adicionales (terceros o cuartos) aquí mediante al menos conversión parcial de grupos funcionales originalmente libres en grupos funcionales rematados en extremo, estructuralmente diferentes. El remate del extremo de esta manera se puede considerar como un caso especial de una reacción de derivatización que establece una compatibilidad mejorada de la entrecara sólido/líquido con las demandas del analito respectivo, matriz, y fase móvil pero que se puede crear difícilmente una resistencia adicional de unión y de esta manera ninguna selectividad adicional. El remate de extremo parcial o completo de grupos funcionales residuales sin embargo puede eventualmente resultar que es favorable en términos de estabilidad de proceso a largo plazo a pesar del esfuerzo adicional en la preparación de fase estacionaria.

De manera preferente, el remate de extremo de grupos funcionales nucleófilos tal como grupos amino se logra a través de reacciones que reducen la nucleofilicidad de grupos funcionales. Los grupos de remate de extremo se diseñan para que sean de estructura molecular simple para no exhibir interacción o al menos sólo interacciones no covalentes y no especificas de baja resistencia con un amplio intervalo de analitos y no alteren la polaridad total de la fase estacionaria de forma significativa. Sin embargo, es concebible que pueden ayudar a altos grados de derivatización los primeros y segundos residuos en interacciones multivalentes con el substrato. A pesar de la posibilidad de más derivatizaciones terciarias mezcladas de dos veces en el absorbente debido al remate de extremo incompleto o mezclado, ha resultado que es preferible tener como meta ya sea un remate de extremo uniforme (es decir a un grado de > 95 %) , o sin un remate de extremo para nada, a todo lo largo del absorbente. Dependiendo de la estructura de los grupos de remate de extremo, de esta manera pueden actuar o no potencialmente en el papel de residuos terciarios, si se trata formalmente.

En una primera modalidad metódica, la presente • invención se refiere a métodos para preparar absorbentes de la invención que tienen las características como se presenta anteriormente. Darán por resultado esa clase especial de absorbentes en donde el material de soporte sólido consiste de un portador, la superficie del cual se cubre con una película de un polímero que tiene grupos funcionales que tienen los residuos. Las características especiales de esta clase preferida de absorbentes también se ha resumido de forma extensa anteriormente. Ahora, los métodos de preparación comprenden al menos los pasos de: (i) proporcionar un polímero que tiene grupos funcionales; (a) adsorber una película del polímero sobre la superficie de un portador ("paso de adsorción") ; (b-I) reticular una porción definida de los grupos funcionales del polímero adsorbido con los menos un reactivo reticulador ("paso de reticulación") ; o (b-II) injertar una porción definida de los grupos funcionales del polímero adsorbido al portador ("paso de injerto") ; (c) derivatizar porciones definidas de los grupos funcionales del polímero con primeros residuos que comprenden una estructura C, N, 0, S-heteroaromática binuclear y con segundos residuos que comprenden una estructura C, N, 0, S-heteroaromática mononuclear, y con residuos adicionales, opcionales ("paso de derivatización") .

Son concebibles varias variaciones con respecto a la disposición detalla del método de preparación anterior. Primero, los pasos (b-I) y (b-II), reticulación e injerto, respectivamente, se consideran como alternativas, equivalentes, y cualquiera de estos pasos es suficiente para llevar a cabo el método a fin de construir un absorbente de acuerdo a la invención que mostrará las características descritas anteriormente de forma adicional. Ambas alternativas sirven como un medio para cumplir la tarea de una fijación durable del polímero absorbido sobre el portador bajo las condiciones de procesamiento adicional y el uso del absorbente, aún si se trata con solventes fuertemente solubilizables . Esto se logra ya sea al formar una red continua de enlaces covalentes adicionales entre todas las hebra de polímero y de esta manera enmarañar físicamente el portador (reticulación) o al formar enlaces covalentes entre cada hebra individual de polímero y el portador (injerto) . Por supuesto, ambos procesos alternativos para la fijación también se pueden combinar dentro del método, ya sea de manera concurrente en un paso individual o de manera subsiguiente como dos pasos subordinados distinguibles, sin padecer de las desventajas de la estabilidad del absorbente.

Segundo, son posibles variaciones adicionales que se refieren al orden temporal relativo del paso (c) de derivatización con relación al paso (a) de adsorción. De esta manera, es concebible derivatizar primero un polímero en solución homogénea con los residuos y también adsorber una . película del polímero derivatizado que ya contiene los residuos sobre un portador adecuado. Este procedimiento requerirá investigar y optimizar las condiciones experimentales del paso de revestimiento para cada polímero diferentemente derivatizado. La variante preferida por lo tanto es más bien para adsorber primero un polímero no derivatizado sobre el portador puesto que se llevará a cabo dentro del paso (a) de adsorción paralelo o antes del paso (c) de derivatización a fin de obtener una capa homogénea delgada .

El paso (b-I) de reticulación o el paso (b-II) dé injerto, respectivamente, en cada caso seguirán inmediatamente el paso (a) de adsorción puesto que, una vez reticulado, el polímero será difícil de adsorber como una película. Una condición límite adicional es que el paso (i) siempre será el primer paso de la secuencia. Tomado con untamente, las siguientes cuatro combinaciones de dos variaciones independientes de pasos (elección de paso b-I o b-II combinado con el orden relativo de los pasos (a) y (c) ) son posibles: ler Método: Método para preparar un absorbente de acuerdo a la invención, que comprende, en el siguiente orden: (i) proporcionar un polímero que tiene grupos funcionales; (ii) paso (a) de adsorción; (iii) paso (b-I) de reticulación; (iv) paso (c) de derivatización . 2do Método: Método para preparar un absorbente de acuerdo a la invención, que comprende, en el siguiente orden: (i) proporcionar un polímero que tiene grupos funcionales; (ii) paso (c) de derivatización; (iii) paso (a) de adsorción; (iv) paso (b-I) de reticulación. 3er Método: Método para preparar un absorbente de acuerdo a la invención, que comprende, en el siguiente orden : (i) proporcionar un polímero que tiene grupos funcionales; (ii) paso (a) de adsorción; (iii) paso (b-II) de injerto; (iv) paso (c) de derivatización. 4to Método: Método para preparar un absorbente de acuerdo a la invención, que comprende, en el siguiente orden: (i) proporcionar un polímero que tiene grupos funcionales; (ii) paso (c) de derivatización; (iii) paso (a) de adsorción; (iv) paso (b-II) de injerto.

Cada paso de las secuencias se propone que lleve a cabo con el polímero en su estado como resulta de la terminación del paso inmediatamente precedente, es decir, un paso de derivatización después de un paso de reticulación o injerto se llevará a cabo con el polímero ya reticulado o injertado, en tanto que un paso de derivatización que precede un paso de adsorción se llevará a cabo con el polímero no adsorbido, libre. Si una porción definida de los grupos funcionales del polímero se hace reaccionar en un paso particular y una porción similar se ha hecho reaccionar ya en un paso precedente, se quiere decir que la porción definida en ese paso particular se tomará de la totalidad de estos grupos funcionales que son sobrantes de los pasos precedentes y no se han hecho reaccionar previamente (con la excepción de grupos funcionales bi- o multi-valentes) . En tanto que los cuatro métodos producirán en principio resultados comparables, el primer método se prefiere por su simplicidad práctica.

En una variación adicional que no se ha mencionado explícitamente hasta ahora, una primera porción de los grupos funcionales del polímero se puede derivatizar en solución, el polímero parcialmente derivatizado entonces se adsorbe y una segunda porción de los mismos o diferentes grupos funcionales como antes en el polímero adsorbido de esta manera se derivatizan con los mismos o diferentes residuos como antes. O los grupos funcionales del polímero primero se pueden convertir en diferentes grupos funcionales o precursores de residuo por derivatización en solución, que entonces después de la adsorción se convertirán en los residuos finales. El orden más razonable en el cual se introducen residuos individuales por esta combinación mezclada de pasos de preparación dependerá de este modo fuertemente de la clase particular de material portador y de la facilidad de adsorción de un polímero particular, parcialmente derivatizado en el portador.

La reticulación intra- e inter-molecular de la capa formará una red de polímero estable bi- o preferentemente tri-dimensional e impedirá su desorción del medio portador "envuelto". Aunque se puede lograr la reticulación de acuerdo a todos los procedimientos conocidos como estado de la técnica, incorporando también métodos no selectivos en base a la generación de especies radicales en cualquier parte de las cadenas de polímero tal como métodos electroquímicos, inducidos por luz o radiación (ionizante), el paso de reticulación se llevará a cabo preferentemente sólo entre los grupos funcionales del polímero usando reactivos reticuladores que por ejemplo se van a diseñar para sufrir reacciones de condensación con estos grupos funcionales. Las moléculas lineales, conformacionalmente flexibles, tal como reactivos de condensación a,?-bifuncionales, de una longitud de entre 1 y 20 átomos se prefieren para reticulación. También, se pueden emplear dos o más reactivos reticuladores de diferente longitud y/o de diferente reactividad y/o de diferente rigidez de cadena, preferentemente en pasos consecutivos. La reticulación no se llevará a cabo de una manera exhaustiva que conduciría a un material rígido, sino siempre a un grado predeterminado únicamente, es decir, con una porción definida de grupos funcionales de polímero, que se puede controlar fácilmente mediante la fracción estequiométrica de reactivos reticuladores adicionados con relación a grupos funcionales poliméricos disponibles. Los reactivos reticuladores adecuados a este respecto comprenden ácidos dicarboxílicos, diaminas, dioles, y bis-epóxidos, por ejemplo ácido 1,10-decanodicarboxílico o etilenglicol-diglicidil-éter (EGDGE) . El ácido 4 , 4 ' -bifenildicarboxílico es útil como un reticulador rígido.

Los reactivos reticuladores se eligen preferentemente para reaccionar específicamente con los grupos funcionales de polímero pero ni con la plantilla ni con el material portador subyacente tal como para lograr reticulaciones estables dentro de la película de polímero sólo pero no entre la película de polímero y la superficie del portador. De cualquier manera, el establecimiento de reticulaciones adicionales de este último tipo en un número moderado no alteraría ciertamente de forma significativa las propiedades del adsorbente.

Si se desean grupos de remate adicionales, se introducen usualmente al último en el proceso (después de la última derivatización con un residuo específico) si ha sido incompleta la derivatización anterior. El remate de extremo o remate terminal se puede llevar a cabo en principio de forma análoga a los pasos específicos de derivatización descritos anteriormente. Sin embargo, los métodos de activación que conducen a reactivos altamente reactivos son usuales en las reacciones de remate puesto que se requieren para reaccionar con aquellos grupos funcionales que han probado ser los menos reactivos durante los pasos previos de derivatización. Los preferidos son anhídridos de acilo y cloruros de acilo, particularmente aquellos de ácido acético, o isocianatos e isotiocianatos, o epóxidos. También, se pueden emplear dos o más diferentes reactivos de remate de extremo o reactivos que comprende dos o más grupos de remate diferentes tal como por ejemplo, anhídridos mezclados. También se puede imaginar usar otros reactivos típicos de alquilación que tienen buenos grupos salientes, tal como yoduro de metilo, sulfato de dimetilo, o diazometano. Otros métodos adecuados de remate de extremo tanto para fases estacionarias poliméricas como no poliméricas como se conoce de la técnica anterior se pueden usar de forma análoga. Usualmente, un remate de extremo, exhaustivo de muchos grupos funcionales como sea posible se desea aunque el proceso también se puede manejar para detenerse esencialmente en cualquier etapa arbitraria de remate, si se requiere.

También es posible derivatizar temporalmente grupos funcionales de la película de polímero o sustituyentes del residuo con grupos protectores. Estos grupos funcionales o sustituyentes de esta manera se pueden proteger durante la introducción de uno o más conjuntos adicionales de residuos de reacciones algunas veces indeseadas con los respectivos reactivos de derivatización que de otro modo puede conducir a acumulación descontrolable de residuos o patrones de sustitución de mayor orden tal como ramificación. Una vez que se ha puesto en su lugar el conjunto adicional de residuos, nuevamente se remueven usualmente los grupos protectores.

Los grupos funcionales preferidos del polímero que se va a adsorber como una película sobre superficie de un portador son grupos amino primarios o secundarios, grupos hidroxilo, y grupos de ácido carboxilico o éster carboxilico. Estos grupos se pueden derivatizar fácilmente, son biocompatibles e incrementan la solubilidad en agua del polímero. De esta manera también se prefiere emplear polímeros en el método que son solubles en medios acuosos o acuosos-orgánicos mezclados debido a que el paso de adsorción se lleva a cabo preferentemente de estos medios sobre el material portador suspendido en el mismo. Aunque el paso de adsorción por sí mismo se puede llevar a cabo en principio gradualmente usando diferentes polímeros en cada caso, se lleva a cabo preferencialmente con un tipo individual de polímero (es decir, polímeros que tienen el mismo tipo de grupos funcionales, o grupos funcionales que tienen cargas del mismo prefijo) únicamente. Particularmente preferidos son polímeros que tienen un peso molecular de entre 5000 Daltones y 50000 Daltones.

En general, todas las modalidades adicionales preferidas como se resumen anteriormente con respecto a la composición y propiedades del adsorbente de la invención también aplican a los métodos de su preparación y los materiales que se van a emplear en el método de una manera análoga y de esta manera no necesitan ser repetidos dentro de este contexto.

El grupo de ancla, es decir, el sitio de activación el reactivo de derivatización usado en el paso de derivatización puede estar cerca al sitio de unión que se va a formar o en una distancia corta o larga lejos de este, básicamente dependiendo de los requisitos estructurales, funcionales o sintéticos, es decir, puede incorporar un grupo separador entre las estructuras que forman el sitio de unión y el sitio de activación. Este separador puede ser ya sea rígido o flexible y de longitud variable, después de lo cual un grupo separador más largo frecuentemente se transforma en flexibilidad conformacional incrementada que algunas veces se puede requerir por el complejo entre el sitio de unión del adsorbente y la proteína o péptido objetivo a fin de adoptar una geometría favorable. Los separadores se pueden ya sea acoplar primero con las estructuras heteroaromáticas correspondientes en reacciones separadas (posiblemente homogéneas) y los conjugados formados, que se asemejan a los residuos completos, entonces, después de la desprotección opcional, acoplado con el polímero, o se pueden acoplar separadores al polímero primero y los conjugados formados entonces, después de la desprotección opcional, acoplados con las estructuras heteroaromáticas correspondientes para formar los residuos completos. Las dos reacciones de acoplamiento de este modo pueden ser de la misma o diferente clase. En general, si un polímero que contiene grupos funcionales amino primarios se usa como el polímero formador de película, el átomo de nitrógeno del grupo amino funcional se puede incorporar directamente en el residuo.

Los reactivos de derivatización preferidos comprenden aminas, epóxidos, ácidos o ésteres carboxílicos, e iso (tio) cianatos, que da por resultado la formación de enlaces de amida, uretano o urea con los grupos funcionales preferidos de polímero. Por razones estructurales, de estabilidad y conveniencia, es más preferido si el paso de derivatización se lleva a cabo por formación de enlaces de amida entre los grupos funcionales y los residuos, es decir, ya sea entre un polímero que contiene amino y un reactivo de derivatización terminado en carboxilo o entre un polímero que contiene carboxilo y un reactivo de derivatización terminado en amino. En unión con polímeros de amino, los reactivos de derivatización particularmente preferidos son derivados de ácidos carboxílicos activados.

Si la activación química es necesaria antes de la derivatización, se puede llevar a cabo en un paso adicional corriente arriba o en etapa anterior del paso de derivatización o concurrentemente con el paso de derivatización. Se puede activar cualquiera de los grupos funcionales de polímero, o de manera preferente, el reactivo de derivatización. La activación de un grupo carboxilo, por ejemplo, se puede lograr por técnicas normales de síntesis de péptidos de fase sólida, por ejemplo, mediante ésteres activados tal como ésteres de OBt (benzotriazoliloxi) u ONB (norbornendicarboximidiloxi) . De manera análoga se pueden tratar grupos hidroxilo. En una modalidad económica y de esta manera particularmente preferida, la activación se realizará in situ durante el paso de derivatización con la ayuda de métodos conocidos de la química de péptidos, es decir, como una reacción en marmita en la cual se esté produciendo pero no se aisle una concentración en estado estable de la especie activada.

Se pueden introducir ambos residuos en el polímero en un paso individual de derivatización. Opcionalmente, se usa un reactivo individual de derivatización aquí que comprende ya ambos residuos (o precursores del mismo, respectivamente) o que comprende el primer residuo que comprende el segundo residuo (o viceversa) . 0 al menos dos diferentes reactivos de derivatización se emplean como una mezcla, cada uno de los cuales que comprende al menos un residuo pero diferente. El paso de derivatización se puede llevar a cabo de manera alternativa gradualmente con cada residuo. Entonces, el reactivo de derivatización empleado en el primer paso de derivatización comprende el primer residuo y el reactivo de derivatización empelado en el segundo paso de derivatización comprende el segundo residuo, o viceversa.

En una variación del método de preparación, los pasos (iii) y (iv) se pueden llevar a cabo como un paso individual. Esta modalidad toma en cuenta que en una reacción de derivatización de los grupos funcionales del polímero tanto el primero como el segundo residuos se pueden introducir fácilmente de forma simultánea. Esto se puede lograr ya sea de una manera que se use una mezcla de al menos dos reactivos de derivatización, el primero de los cuales que comprende el primer residuo, y el segundo, que comprende el segundo residuo. Aunque entonces resultará una distribución irregular aleatoria de los dos residuos a lo largo de la estructura del polímero, el polímero derivatizado se puede caracterizar por una relación estadística de primeros y segundos residuos que se determinará básicamente por las cantidades relativas y reactividades de los por lo menos reactivos de derivatización. De manera alternativa, es factible usar sólo un reactivo de derivatización si este reactivo de derivatización comprende ya tanto el primero como el segundo residuo (o si el primer residuo comprende el segundo residuo, o viceversa) . Naturalmente, ambos residuos entonces estarán presentes en el polímero derivatizado resultante en una relación 1:1 y en una regio- y estéreo-química mutua pre-definida . En lugar de dos residuos completamente desarrollados también es posible que esté presente al menos un residuo en el reactivo de derivatización como un precursor.

Dentro del alcance de la misma variación del método de preparación de la presente invención, se pueden lograr configuraciones en las cuales se use una mezcla de reactivos de derivatización, cada uno de los cuales que comprende tanto el primero como el segundo residuo. En particular, en esta mezcla se puede variar la estructura parcial del primer residuo (o precursor del mismo) entre los reactivos de derivatización en tanto que el segundo residuo (o precursor del mismo) se puede mantener idéntico, o viceversa. De manera muy particular, los reactivos de derivatización se pueden combinar entre si en busca del método de preparación, una cantidad definida de lo cual contiene tanto el primero como el segundo residuos en tanto que otra cantidad definida puede contener sólo el primero o sólo el segundo residuo. El producto resultante entonces exhibirá un residuo en exceso con respecto al otro si las cantidades de reactivo y reactividades son de otro modo comparables. De esta manera, inter alia se pueden lograr distribuciones hechas a medida, pero son homogéneas y aleatorias (estadística) de los primeros y segundos residuos entre los grupos funcionales del polímero.

Si se van a introducir terceros, cuartos, ... etc., residuos adicionales en el polímero, el paso de derivatización se puede repetir opcionalmente gradualmente múltiples veces empleando residuos adicionales que comprenden un motivo estructural deseado por consiguiente. Económicamente factibles son hasta aproximadamente cuatro pasos de repetición. De manera preferente, cada paso de derivatización se lleva a cabo siempre a aproximadamente el mismo grado de derivatización, el grado para cada residuo que da cuenta de este modo de aproximadamente 25 %.

El absorbente de la presente invención se puede aplicar predominantemente a la purificación de mezclas que contiene proteínas o péptidos. En una segunda modalidad metódica, la presente invención e refiere por lo tanto a un método para separar, para incrementar la concentración y/o pureza de una o más proteínas o péptidos de una mezcla que contiene la proteína o péptido y productos secundarios opcionales usando un absorbente específicamente diseñado al objetivo como se describe anteriormente. El método comprende al menos los pasos de: (i) poner en contacto la mezcla que se va a disolver o suspender en un primer líquido con un absorbente de la invención durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la proteína o péptido se llegue unir al absorbente; (iii) poner en contacto el absorbente con la proteína o péptido unido con un tercer líquido durante un periodo .de tiempo suficiente para permitir que la proteína o péptido se llegue a liberar del absorbente.

En una primera variación del método anterior, un paso de enjuague separado con un segundo liquido (de lavado) que idealmente no interrumpe de forma significativa los enlaces no covalentes de entre los residuos del absorbente y la proteina o péptido que se va a purificar o que de otro modo actúe para liberar la proteina o péptido unido al absorbente, se puede incluir entre el paso (i) y el paso (iii) . Dependiendo de la clase y número de productos secundarios y constituyentes adicionales contenidos en la mezcla, este cambio de líquidos durante el proceso de separación puede incrementar algunas veces la eficiencia de separación. El segundo líquido tendrá principalmente baja concentración de elución y eluirá de forma no específica. El método entonces comprende el paso intermedio opcional de: (ii) enjuagar el absorbente con un segundo líquido; Después de poner en contacto la mezcla de la proteína o péptido objetivo y productos secundarios con el absorbente en el paso (i), el absorbente con la proteína o péptido absorbido en el mismo también se puede preparar nuevamente de la mezcla restante contenida en el primer líquido antes de que se enjuague con el segundo líquido en el paso (ii) . La mezcla restante se puede recolectar por sí misma si contiene productos secundarios valiosos. La última variación también se puede usar como un medio de captura para materias primas muy diluidas y también es una manera factible de remover productos secundarios potenciales en una proceso rápido por lotes que se sospecha que interfieren con una separación cromatográfica, subsiguiente, completas y más sofisticada. Entre estos posibles productos secundarios están aquellos que pueden conducir a un deterioro lento del absorbente por adsorción física o química irreversible de esta manera a durabilidad acortada de la columna.

En un caso especial pero importante en la práctica, el segundo líquido se puede elegir idéntico al primer líquido (de alimentación, adsorción) . Esto significa que el absorbente se enjuaga en el paso (ii) con el mismo líquido como uno del cual se adsorbe la proteína o péptido objetivo cuando se aplica como una mezcla al absorbente en el paso (i) . Esto frecuentemente es posible puesto que el primer líquido se elije usualmente tal que tiene sólo propiedades solubilizadoras medias a pobres para el péptido o proteína objetivo debido a que una absorción eficiente sólo será posible si la entalpia de interacción entre la proteína o péptido objetivo y el líquido es más pequeña que entre la proteína o péptido objetivo y el absorbente. Por otra parte, si este líquido tiene buenas propiedades solubilizadoras para los productos secundarios que se supone que se eluyen del absorbente en el paso (ii) , también se puede aplicar para enjuagar el absorbente en tanto que el péptido o proteina objetivo aún se adicionará a este sin que se libere de forma simultánea.

De manera similar, el segundo liquido se puede elegir idéntico al tercer liquido (de desorción, elución) . Si las propiedades solubilizadoras del tercer liquido para la proteina o péptido objetivo y los productos secundarios son diferentes en un gran grado suficiente en tanto que sus entalpias de adsorción en el absorbente son comparables, se puede usar el mismo liquido para enjuagar el absorbente. Esto significa esencialmente que el paso (ii) y paso (iii) del método se pueden combinar bajo estas circunstancias en un paso. En un sistema de flujo continuo, los productos secundarios mejor solubilizados entonces se enjuagarán primero, seguido por la proteina o péptido objetivo liberado en una fracción eluida posterior del mismo liquido. Por supuesto, esta secuencia nuevamente se puede seguir por fracciones adicionales del tercer liquido que contiene adicionalmente productos secundarios, menos solubilizados y por lo tanto más lentamente eluidos.

Aún los tres líquidos pueden ser idénticos. Sin embargo, aún si se eligen idénticos dos o tres líquidos, aún se pueden aplicar al absorbente a diferentes velocidades de flujo en diferentes pasos del método. Las velocidades de flujo volumétrico en la cromatografía son en general una función del régimen aplicado de presión, las dimensiones de la columna y la viscosidad del liquido. Las velocidades unidimensionales correspondientes de la fase móvil en HPLC están típicamente en el orden de aproximadamente 1-5 mm s-1. La numeración primero, segundo, tercero ... líquido sirve de esta manera para definir la secuencia relativa de aplicación de los líquidos que cumplen diferentes tareas, pero no se propone que definan necesariamente composiciones particulares de los líquidos respectivos. En lugar de intercambiar la clase de líquido o su velocidad de flujo aplicada discretamente o gradualmente (es decir, como un gradiente gradual) , se pueden usar otras formas gradientes continuas, en particular gradientes lineales para cambiar lentamente entre los diferentes líquidos y/o velocidades de flujo. Esto requiere la instalación de un mecanismo para mezclar gradualmente fracciones crecientes de líquido subsiguiente en el líquido precedente, respectivamente.

En una modalidad de la presente invención, el tercer líquido diferirá del primero y opcionalmente también del segundo líquido en su pH. En una modalidad particular, el pH del tercer líquido es menor que el pH del primero y opcionalmente del segundo líquido. Aún más preferido, el pH del primero y opcionalmente del segundo líquido está cerca a (es decir: dentro de ± 1 unidad aproximadamente corresponde) el punto isoeléctrico pl de la proteína o péptido objetivo, en tanto que el tercer liquido tiene un pH que es bastante diferente del mismo, por al menos aproximadamente dos unidades de pH, y en particular menos. El pH del primer liquido puede estar favorablemente en el intervalo de 5.5 a 8.5· en tanto que el pH resultante del tercer liquido estará en el intervalo de 3 a 6.5. Esta modalidad trata con el caso que la entalpia de unión entre el absorbente y la proteina o péptido objetivo se domina a una parte significativa por interacciones electrostáticas u otras polares (fuerzas dipolo, enlaces de hidrógeno) que comprenden uno o más residuos ionizables (por ejemplo, grupos amino o heteroaromáticos que contienen nitrógeno) en cualquier compañero de unión. En particular, se espera que las interacciones hidrófobas y polares sean dominantes cerca de pH neutral, en tanto que se espera que la repulsión iónica reemplace parcialmente las fuerzas polares atrayentes de los mismos residuos, hasta ahora no cargados, cuando se aproxima a su extremo del espectro de pH (por ejemplo, entre nitrógenos protonados a pH bajo) . Este efecto puede debilitar considerablemente la entalpia de unión, y como resultado, liberar la proteina o péptido unido del absorbente. De la manera opuesta, una interacción iónica atractiva también se puede debilitar en la pérdida de una carga puntual de cualquier compañero de unión como resultado del cambio de pH. De importancia particular a este respecto son los heteroaromáticos que contienen nitrógeno como residuos en el absorbente puesto que estos son capaces de exhibir interacciones tanto hidrófobas asi como polares/iónicas. La atracción de estos residuos heteroaromáticos para el uso en el método de separación de la invención resulta del hecho que su comportamiento de unión se puede cambiar a valores de pH que se asemeja cercanamente a las condiciones fisiológicas, por lo que el intervalo exacto de pH para el cambio es dependiente del punto isoeléctrico del residuo especifico y de esta manera se puede ajustar finamente por su estructura y la composición relativa del absorbente que contiene al menos dos residuos diferentes de esta clase. Por otra parte, la dependencia en el pH de la entalpia de unión debe ser menos pronunciada con respecto a las interacciones entre el absorbente y al menos un producto secundario que se va a separar. Esto por ejemplo puede ser debido a diferentes puntos isoeléctricos del objetivo y productos secundarios o a contribuciones relativas cuantitativamente diferentes de interacciones hidrófobas/polares versus electrostáticas.

En una modalidad adicional de la presente invención, el tercer liquido diferirá del primero y opcionalmente también del segundo liquido en su concentración iónica. En una modalidad particular, la concentración iónica del tercer liquido es mayor que la concentración iónica del primero y opcionalmente del segundo liquido. Esta modalidad trata con el caso que la entalpia de unión entre el absorbente y la proteína o péptido objetivo se domine a una parte significativa por interacciones electrostática!|s bajo participación de uno o más residuos iónicos o ionizables, en tanto que esta participación diferente, i particular menos pronunciada, en la interacción ectrostática entre el absorbente y al menos un producto secunpario que se va a separar. Por otra part contribuciones hidrófobas a la entalpia de unión se fortalecerán en un incremento de la concentración iónica, si se mantienen constantes todos los otros parámetros. De manera preferente, el paso (i) de adsorción del método de separación se realiza bajo condiciones de poca sal (cloruro de sodio 0-0.2 M) en el primer líquido, en tanto que el paso (iii) de liberación se puede realizar hasta cloruro de sodio de 1 M en el| tercer líquido. Aunque el absorbente de la invención tolehra muy bien condiciones de alto contenido de sal, bajo la ??3??G?3 de las circunstancias no es necesario ni aconsejable- adicionar altas concentraciones de sal al tercer líquido del paso (iii) a fin de desorber proteínas o péptidos unido 3 al absorbente. En cambio, la afinidad del absorbente para muchas proteínas o péptidos puede ser bastante invar:.able con cambios en la concentración de sal, Por lo tanto, Los gradientes de sal no pueden ser efectivos sólo por sí mismos para libertar proteínas o péptidos absorbidos, pero pueden ser eficientes en combinación con gradientes útiles de pH.

La liberación de la proteína o péptido objetivo del absorbente de esta manera se puede lograr mediante incremento de la fuerza de solvatación del tercer líquido para el objetivo en comparación al primero y segundo líquidos. Se puede lograr de manera alternativa mediante el desplazamiento de la proteína o péptido objetivo de los sitios de unión del absorbente con un reactivo de desplazamiento que se disuelve en el tercer líquido. El efecto del desplazamiento (unión preferible del reactivo de desplazamiento por el absorbente en lugar de aquella del objetivo competente) ya sea se puede lograr si el reactivo de desplazamiento está presente en exceso molar con respecto al péptido o proteína objetivo o si la fuerza de unión del reactivo de desplazamiento hacia el absorbente es aún mayor que aquella de la proteína o péptido objetivo. El reactivo de desplazamiento por sí mismo puede ser una proteína o péptido que tenga propiedades similares como el objetivo, o fragmento del mismo, pero también una molécula sintética pequeña con alta afinidad para residuos C, N, 0, S-heteroaromáticos . También puede ser por sí misma una molécula C, N, 0, S-heteroaromática binuclear o mononuclear; el desplazamiento entonces se presentaría más bien como una consecuencia de la saturación de los grupos que interactúan con el absorbente de la proteina o péptido objetivo con heteroaromáticos solubles en preferencia con respecto a los residuos del absorbente. El reactivo de desplazamiento en exceso se debe remover, sin embargo, posterior del producto eluido a fin de aislar la proteina o péptido objetivo en forma pura.

Otro cambio eluyente, después de que la proteina o péptido objetivo se ha llegado a liberar completamente del absorbente, puede ser útil de manera similar en términos de economía a fin de acelerar un corrida cromatográfica a costa de resolución cromatográfica, o si se eluyen rezagados otros productos valiosos.

En una segunda variación, el método se incrementa por el paso final opcional de: (iv) lavar y/o regenerar el absorbente con un cuarto y/o quinto líquido; que se introduce después del paso (iii) .

Aquí, como un cuarto líquido (de limpieza) se usa un líquido que tendrá principalmente muy alta fuerza de elución, puede contener aditivos de la clase mencionada anteriormente, y eluir de manera no específica. Si al absorbente se usa en la forma de una columna cromatográfica, el cuarto líquido se puede aplicar a altas velocidades de flujo volumétrico en la dirección normal o inversa puesto que su terea: es limpiar el absorbente y remover permanentemente cualquier acumulación de impurezas químicas o biológicas residuales, fuertemente absorbentes o de otro modo interferentes, especialmente materia en partículas, a fin de impedir la incrustación, atasco o reducción de capacidad, gradual de la columna. Para higiene y seguridad médica, también se pueden aplicar protocolos de esterilización o desinfección típicos (por ejemplo, tratamiento alcalino (hidróxido de sodio 1.0 M) , ácido (ácido acético 0.4 M) , oxidativo (hipoclorito) y/o térmico) para eliminar la contaminación microbiana al absorbente en este punto.

El quinto líquido (de re-acondicionamiento) se usa para acondicionar el absorbente, su grado de hinchazón, y la solvatación de sus residuos unidos después del tratamiento anterior con líquidos agresivos o de solvatación fuerte tal que se restaure y sea constante el estado original del absorbente, se instalen condiciones en equilibrio al comienzo de cada corrida de separación. Aparte de la remoción de trazas de líquidos de elución o limpieza, los contraiones de residuos iónicos, si están presentes, también se reemplazarán de este modo a su distribución uniforme original a fin de mantener propiedades ácidas/base constante del absorbente. El quinto líquido puede ser idéntico al primero o segundo líquido, y usualmente se aplicará a la misma velocidad de flujo. También es posible cambiar de un programa de lavado/regeneración rápida y simple después de cada corrida a un procedimiento más sofisticado después de cada quinta, décima, etc., corrida, por ejemplo, dependiendo de la carga real de aquellos contaminantes que son idénticos para alcanzar las especificaciones propuestas de la calidad del producto.

La manera preferida para llevar a cabo el método de separación es como una técnica de cromatografía líquida de alta presión a presión media. Debido a su simplicidad operativa, y por medio de ya sea la variedad de variaciones citadas anteriormente, el método también se puede usar de manera discontinua en la manera de una purificación por lotes como con la filtración por afinidad (en membrana) o técnicas de extracción en fase sólida o continuamente como con la técnica de lecho móvil simulado (SMB) . Todas estas variaciones también se pueden combinar entre sí.

La fuerte estabilidad química así como la capacidad de unión estática dinámica del absorbente (hasta aproximadamente 0.3 1 de carga de alimentación o aproximadamente 20 g de proteína o péptido por litro de absorbente, respectivamente, son posibles) permite grandes grados de libertad en la variabilidad independiente de los cinco líquidos usados en el método. También los sistemas de eluyente fuertemente solvatadores con compatibles con cromatografía convencional por afinidad ahora están accesibles de modo que hay una abundancia de espacio para optimizar los líquidos para propiedades tal como poder de solubilización, bajo costo, baja toxicidad y poca producción de desperdicio. Un sistema de líquidos compatible con la implementación del método comprende básicamente cualquier líquido o mezcla de líquidos que posea al menos propiedades solubilizadoras débiles para el sustrato del método de separación, es decir en particular una proteína o péptido, y de manera preferente también para los productos secundarios, estos últimos de importancia particular para el segundo líquido. Puesto que las separaciones cromatográficas en el absorbente de la presente invención se llevan a cabo usualmente bajo restricciones de biocompatibilidad, se usan más frecuentemente medios acuosos amortiguados como el primero, segundo y tercer líquido. Los modificadores orgánicos diferente de los amortiguadores o sales metálicas que son esenciales para conservar la función de la proteína (por ejemplo, detergentes, aditivos caotrópicos, antioxidantes, antiespuma) también se pueden adicionar de manera hipotética a los líquidos, pero a fin de retener la actividad biológica más alta posible de la proteína o péptido que se va a purificar, estos reactivos se evitan mejor completamente. Se pueden adicionar pequeñas cantidades de ácidos orgánicos volátiles sin embargo antes o subsiguiente al proceso actual de separación por razones de mejorar la detectabilidad de ciertos analitos.

Si se usan sin embargo aditivos adicionales, usualmente tendrán que ser removidos posteriormente, es decir, después del término del método, del liquido que contiene la proteina o péptido objetivo obtenido en el paso (iii) , especialmente si se requiere obtener esta proteina o péptido en forma cristalina. Para lograr este propósito, los expertos en la técnica conocen bien un amplio intervalo de estos pasos potencialmente adicionales. A fin de remover aditivos, el método de la invención por lo tanto se puede combinar bien de manera subsiguiente con cualquier otro tipo de procesos comunes de separación.

Aunque seria factible aplicar virtualmente cualquier liquido orgánico o acuoso o mezcla liquida que incluya fluidos supercriticos al absorbente de la presente invención, se da preferencia a aquellos líquidos polares que facilitan la hinchazón de una película de polímero, si está presente en la superficie del material de soporte sólido. La polaridad exacta de una mezcla líquida se puede ajusfar finamente de forma fácil por medio de su composición.

Puesto que la proteína o péptido objetivo, adsorbido (y también los productos secundarios) frecuentemente no se liberan instantáneamente (un listado activado-desactivado) en el paso (iii) del método sino más bien lentamente y gradualmente, el paso (iii) por si mismo se puede llevar a cabo de forma favorable gradualmente, es decir, como un fraccionamiento, para una resolución incrementada del proceso total de separación. Entonces se recolectan manualmente o automáticamente dos o más fracciones de volumen fijo de ya sea el mismo o diferente tamaño del tercer liquido después de que se ha puesto en contacto el absorbente con este durante un tiempo suficiente. Entonces, se repite el paso (iii) y el absorbente se pone en contacto nuevamente con el tercer liquido fresco (de una composición modificada, si es necesario) hasta que se ha liberado toda la proteina o péptido objetivo, unido. También es posible un suministro continuo del tercer liquido durante la recolección de las fracciones. La pureza y recuperación de la proteina o péptido objetivo liberado en cada fracción se determina de manera subsiguiente, y sólo aquellas fracciones que cumplen con las especificaciones de aceptación preestablecidas en términos de calidad y/o economía se procesan adicionalmente en tanto que todas las otras fracciones ya sea se pueden descartar o reciclar en la materia prima.

Se pueden emplear técnicas de elución frontal así como zonal. El mejor desempeño y productividad frecuentemente se logran con elución gradiente, especialmente con contenido creciente de solventes orgánicos polares (alcoholes inferiores, acetonitrilo, acetona) al segundo y/o tercer líquidos. Sin embargo, sí se usa en la cromatografía de proceso dentro de un ambiente de producción en general, la elusión isocrática o las formas gradientes simples tal como gradientes graduales se pueden preferir por simplicidad operativa y fortaleza técnica. También se pueden implementar exitosamente gradientes de pH y sal. Dependiendo de los residuos particulares del absorbente, son posibles valores de pH en el intervalo entre 1 y 14 para duraciones cortas, y entre 12 y 13 para operaciones continuas, en tanto que se relaciona la estabilidad química del absorbente. Las composiciones líquidas óptimas respectivas también dependerán del grado real de derivatización del absorbente y también se van a determinar experimentalmente de caso a caso.

Lo que hace al método realmente distinguible de absorción de intercambio iónico convencional es que también se puede aplicar en particular a tareas de separación en las cuales la proteína o péptido no contiene ninguna carga iónica neta, es decir, si el pH del medio solubilizador se asemeja cercanamente a su punto isoeléctrico. Aunque las cargas aniónicas pueden adicionarse a la fuerza de unión hacia el absorbente de la presente invención debido a su contenido potencial de residuos protonables que contienen nitrógeno, su presencia no es obligaría para una terminación exitosa del método. Lo mismo se mantiene válido para productos secundarios . y otros componentes de la mezcla. El grado al cual las interacciones cargadas son capaces de afectar la absorción o separación de un compuesto en un absorbente también se determina por el carácter dipolar y concentración de sal del medio circundante. Lo que se ha explicado anteriormente para cargas opuestas del absorbente y analitos también es válido para cargas del mismo prefijo que puede conducir en algunos casos a repelencia y exclusión del absorbente en lugar de una atracción adicional.

El método también puede comprender adicionalmente el aislamiento de la proteina o péptido, subsiguiente al paso (iii) , de al menos una fracción del tercer liquido en el cual se ha liberado. En aplicaciones preparativas, es posible aislar la proteina o péptido en forma concentrada o aún neta de una solución en el tercer liquido para el propósito de caracterización y/o tratamiento subsiguiente. De la manera más fácil, se puede recuperar del liquido del paso (iii) por métodos suaves de evaporación de solvente (incluyendo secado por congelación, liofilización) . Sin embargo, la evaporación de solvente también enriquecerá posiblemente las sustancias contenidas de baja presión de vapor que provienen del tercer liquido. Estas sustancias pueden comprender aditivos tal como sales amortiguadoras o agentes estabilizadores, o contaminantes tal como homólogos de solvente de mayor punto de ebullición y/o productos de degradación que usualmente están contenidos en cantidades traza en solventes de calidades comercialmente disponibles. Debido a la alta estabilidad física y química del absorbente, sin embargo, prácticamente no se presentará lixiviación de la fase estacionaria durante los pasos (ii)- (iv) , de modo que la proteína o péptido liberado del paso (iii) contendrá típicamente menos de 10 ppm de absorbente lixiviado u otras sustancias lixiviables del mismo (es decir, sus constituyentes (polímero, residuos) , o productos de descomposición) .

Un método preferible de aislamiento consiste de un paso de cristalización del tercer líquido que contiene la proteína o péptido purificado o el residuo evaporado, si es necesario, después de la re-disolución. Durante este paso de cristalización, que se puede inducir por ejemplo al cambiar la temperatura y/o la composición del líquido, se pueden lograr aún grados mayores de purificación puesto que los contaminantes de baja presión de vapor usualmente se mantienen en solución y de esta manera se separan fácilmente de los cristales de producto buscado. Después del secado, los cristales frecuentemente están listos para el uso en procesos de combinación y formulación. Si es indeseable o imposible el almacenamiento seco, puede ser alternativamente necesario realizar una transferencia del producto purificado en una solución de diferente composición, es decir, el tercer liquido se intercambiará contra un liquido de almacenamiento por operaciones normales tal como diálisis, intercambio iónico, etc.

Como usual en cromatografía, el método y un aparato asociado en el cual se corre también se pueden complementar de manera favorable por una técnica adecuada de detección que permite la medición cualitativa, semi-cuantitativa o cuantitativa de la concentración de la proteína o péptido objetivo y/o productos secundarios u otros componentes de la mezcla en el producto eluido para fraccionamiento bien definido y fino. Los métodos preferidos de detección comprenden detectores de celda de flujo en línea de propiedades físicas o espectroscópicas tal como refractómetros, polarímetros , conductómetros, espectrofotómetros de absorbancia o fluorescencia ultravioleta/visible, espectrómetros infrarrojos, espectrómetros de masa, y espectrómetros de resonancia magnética nuclear. Una unidad de derivatización de degradación pre- o post-columna en línea también se puede adicionar al sistema a fin de convertir todos los componentes específicos de la mezcla que se va a separar en derivados o fragmentos con detectabilidad mejorara, o para acelerar o retrasar su elución. Un método universal de detección no destructiva para proteínas o péptidos es absorbancia de UV a una longitud de onda de 280 nm.

A gran escala, el absorbente y de esta manera también el método de separación de la presente invención que emplea el absorbente se pueden usar de manera benéfica en la elaboración de una composición farmacéutica o nutricional para uso humano o veterinario (por ejemplo, un antisuero o vacuna) , si esta composición comprende al menos una proteina o péptido de valor diagnóstico, terapéutico o nutricional que se puede unir por el absorbente. El beneficio de la presente invención surge principalmente del hecho que estas aplicaciones requieren frecuentemente purezas del ingrediente activo valioso en el intervalo de > 99 % o aún > 99.9 % que son logrables por métodos convencionales sólo bajo procedimientos tardados y costosos, que aún pueden volver algunas aplicaciones prohibitivas desde un punto de vista económico.

A pequeña escala, se pueden usar de manera alternativa en la identificación, caracterización, cuantificación, o purificación en laboratorio de al menos una proteina o péptido. Para este propósito, que se relaciona a análisis cualitativo y cuantitativo, el método de separación se va a complementar probablemente por un ensayo biológico especifico o por un método espectroscópico, por ejemplo, usando técnicas combinadas, pero también se puede lograr por comparación de volúmenes de retención con muestras auténticas, puras o normas de péptidos. En formatos de microescala, pueden ser interesantes para aplicaciones proteómicas, es decir, la identificación o cuantificación simultánea de los niveles de expresión y modificaciones en la pluralidad de diferentes proteínas en una célula o en un organismo .

Como parte de un dispositivo médico, también se pueden usar en la remoción de al menos una proteína o péptido de un fluido biológico, que incluye la prevención médica o tratamiento de enfermedades que se provocan por la presencia de al menos una proteína o péptido en el fluido biológico. El dispositivo se puede aplicar como una clase de unidad de destoxificación o descontaminación en todos los casos en los cuales un paciente ha tomado ya o está próximo a tomar proteínas o péptidos peligrosos o infecciosos, puesto que se segregan por ejemplo por patógenos, pero también en aquellos casos en los cuales el cuerpo de un paciente en sí mismo ha producido estas proteínas peligrosas o infecciosas, como es frecuentemente el caso en enfermedades autoinmunitarias . Las fuentes potenciales de captación incluyen agua, alimento, aire, contacto con personas infectadas, transfusiones sanguíneas, etc. En una aplicación especializada, el dispositivo médico se puede construir como una unidad de aféresis o plasmaferesis . Este dispositivo se operará predominantemente ex vivo o in vitro, pero la construcción como, un dispositivo implantable, miniaturizado también parece estar dentro de la imaginación. Un fluido biológico del paciente se puede tomar (ya sea de forma continua o por lote) del paciente, agotar el contaminante mediante tratamiento con el absorbente, y luego retornar al paciente. Los fluidos biológicos de fuentes externas (otros humanos, animales) también se pueden tratar con el absorbente para reducir el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas antes de que los fluidos o partes de los mismos o composiciones manufacturadas de los mismos se administren a un paciente en necesidad de los mismos. En este caso, el método de separación de la invención se usará para disminuir la concentración/pureza de la proteina o péptido objetivo en la fracción de "valor" (incrementando de este modo la pureza de las proteínas o péptidos de valor en los mismos) , en tanto que se enriquecerá en la fracción de "desecho" .

Finalmente, se pueden usar para la inmovilización de al menos una proteína o péptido en el absorbente. Debido a la naturaleza no covalente de las interacciones entre el absorbente y la proteína o péptido objetivo, esta inmovilización será reversible. Esto puede ser una ventaja potencial en aplicaciones tal como la preparación de reactivos o catalizadores filtrables, el cultivo unido a superficie de células, en dispositivos de distribución de fármacos (por ejemplo endoprótesis de curación o de elución de fármacos), o en exámenes de descubrimiento de fármacos. En este último caso, el método de separación de la invención se puede completar por un método para probar la unión de estructuras químicas o biológicas adicionales a la proteína o péptido inmovilizado. La detección de esta unión secundaria entonces puede servir como una primera indicación de un posible efecto fisiológico de cualquier compañero de unión. Si se usa un revestimiento de polímero, la proteína o péptido inmovilizado puede llegar a ser atrapado físicamente por el medio circundante formador de gel y de esta manera experimentará adicionalmente un ambiente de alta biocompatibilidad. Expresado en forma diferente, un complejo aislable, no covalente formado entre un absorbente como se describe en la presente y al menos una proteína o péptido de esta manera también se incorpora dentro de la presente invención. Este complejo que contiene un anticuerpo como la proteína preferida de la invención se puede usar en técnicas de inmunosorción.

Un objeto adicional de la presente invención que se puede derivar inmediatamente de las explicaciones dadas anteriormente es una columna pre-empacada, que comprende un absorbente de la presente invención dentro de una contención tubular. Esta columna se puede usar como la fase estacionaria de tamaño deseado, fijo, (longitud x diámetro) en cromatografía líquida o aplicaciones de extracción en fase sólida. Además de la contención tubular, esta columna puede comprender opcionalmente componentes adicionales tal como fritas, placas de filtro, distribuidores de flujo, sellos, accesorios, roscas, válvulas u otros elementos de conexión o manejo de fluidos, que se conocen del estado de la técnica. El absorbente se puede envasar ya sea como una suspensión espesa bajo fuerza gravitacional o centrífuga, bajo fuerza hidrodinámica externamente aplicada, o bajo compresión axial adicional por un pistón en la columna, y se hace comercialmente disponible en este formato pre-envasado. Por la conveniencia adicional del usuario, un envasado más reproducible de esta manera se puede asegurar y se pueden almacenar fácilmente las fases estacionarias sino están en uso y se intercambiar rápidamente dentro de un sistema cromatográfico . El material del que se hace la contención (materiales químicamente y biológicamente inertes tal como acero inoxidable, vidrio de borosilicato, plástico tal como PEEK, etc.) se elige típicamente tal que la alta estabilidad del absorbente mismo no sea sacrificada, lo que significa que la columna completa se debe caracterizar idealmente por una resistencia física y química contra presiones aplicadas de hasta 20 bar o contra calor aplicado de hasta 110°C así como contra protocolos comunes de desinfección que incluyen capacidad de autoclave. Bajo circunstancias favorables, esto permitirá un uso repetitivo de la columna de hasta 1000 veces, de manera preferente hasta 5000 veces y se adiciona a la economía, total del proceso. Sin embargo, también puede ser una unidad desechable o incinerable. Otra opción es diseñar sólo el alojamiento tubular inmediato del absorbente barato y desechable y colocarlo dentro de un segundo alojamiento exterior hecho de materiales durables y de larga vida que también contienen todos los componentes complementarios, reutilizables (diseño de cartucho) .

Una columna puede ser parte de un sistema de cromatografía completo. Aparte del sistema de detección descrito anteriormente, otros componentes pertinentes de un sistema de cromatografía incluyen bombas, reguladores de flujo, depósitos líquidos, desgasificadores, orificios de inyección, válvulas de cambio de columna, medidores de presión y de flujo, cámaras de temperatura controlada, bandejas de recolección de salida (carruseles) , y fraccionadores robóticos.

Un objeto adicional de la presente invención es una colección (o "biblioteca") de una pluralidad de los mismos o diferentes absorbentes de la presente invención ya sea como materiales sueltos (de diseño granular o en bloque (monolítico) ) o como columnas pre-empacadas, cartuchos (ver anteriormente) , o membranas, por lo que los absorbentes individuales pueden ser los mismos o diferentes. Por ejemplo se puede usar una colección de diferentes absorbentes en una campaña inicial de examen para absorbentes adecuados que se planeen usar en un escenario cromatográfico preparativo más sofisticado posteriormente, en vista de una colección de los mismos absorbentes que se puede usar por ejemplo en múltiples pruebas de diagnóstico médico de un gran número de muestras que tienen matrices similares, o en el monitoreo de proceso casi-continuo . La ventaja de esta colección es su capacidad para ser procesada en paralelo, ya sea de una manera manual o automatizada. Este procesamiento paralelo permite, además de ahorrar tiempo debido a un mayor rendimiento de muestra en comparación al procesamiento en serie, comparar diferentes absorbentes u otros parámetros de proceso también bajo condiciones estandarizadas o al menos idénticas (reproducibles) . Esta ventaja se puede aprovechar especialmente si los miembros individuales de la colección se arreglan en un formato estandarizado y dirigible por posición, de manera preferente una rejilla rectangular bidimensional compatible con extracciones de trabajo robóticas, tal como un arreglo de microplaca o un arreglo de microchip, o como un dispositivo multicapilar o multifluidico . En cuanto a lo que se considera la lectura de formatos miniaturizados, nuevamente se hace referencia a tecnologías proteómicas.

Todos los productos intermedios que empiezan con el paso de reticulación/injerto de los métodos de preparación descritos anteriormente son suficientemente estables para ser almacenados para uso futuro. En este producto entonces se puede dividir en varios subconj untos en los cuales se realiza el paso de derivatización con reactivos individuales de derivatización. De esta manera, se puede formar una biblioteca de diferentes absorbentes (es decir, absorbentes derivatizados con diferentes residuos o combinaciones de los mismos a diferentes relaciones de residuo o diferentes grados de derivatización) a petición. Si el paso de derivatización se lleva a cabo en paralelo en la totalidad de subconjuntos, es factible formar una biblioteca en un tiempo muy corto a fin de realizar una búsqueda inicial de examen del mejor absorbente para una aplicación dada que permitiría responder rápidamente a cambiar los objetos de separación. Aparte de las diferentes derivatizaciones también se pueden aplicar diferentes materiales de soporte sólido, incluyendo la posibilidad de diferentes películas de polímero, portadores y/o químicas de activación, en la formación de la biblioteca de absorbentes.

El examen aleatorio o dirigido de la biblioteca es un medio que puede complementar algunas veces o aún reemplazar el diseño racional de absorbentes. Se usa especialmente en aquellos casos donde la importancia relativa de las contribuciones de diferentes residuos en el absorbente y/o sus contrapartes en la proteína o péptido objetivo no son obvias, si es escasa la información estructural, o si aplican límites estrechos adicionales, por ejemplo, con respecto a la elección de fases líquidas compatibles. El examen de esta biblioteca hacia un objeto de separación dado se puede llevar a cabo de una manera tal que se mida uno o más parámetros que caractericen el desempeño de un absorbente particular (afinidad, selectividad, capacidad, recuperación, estabilidad, etc.) ya sea de forma consecutiva o en paralelo con la biblioteca completa o uno o más subconjuntos de estos. Las características más prominentes son parámetros cinéticos y termodinámicos relacionados a afinidad y selectividad con respecto a la formación de complejos entre el absorbente y los objetivos de proteína o péptido. Una pre-selección de absorbentes adecuados para la incorporación en la biblioteca se puede realizar con métodos de cómputo.

Un método de examen viable consistiría por ejemplo del tratamiento de una mezcla que contiene al menos una proteína o péptido así como productos secundarios y/o otros componentes con los absorbentes respectivos de la presente invención bajo condiciones adecuadas de lote y medir las entalpias de Gibbs de equilibrio, individuales de la formación compleja entre los absorbentes y la proteína o péptido que se busca como objetivo. El método alternativo consistiría de medir las entalpias de Gibbs diferenciales entre la formación de los complejos del absorbente con la proteína o péptido que se tiene como objetivo, por una parte y aquellas con productos secundarios apropiadamente elegidos, por otra parte. Las mediciones se pueden llevar a cabo directamente con la ayuda de todos los métodos termodinámicos y/o cinéticos conocidos por la persona experta en la técnica, tal como por ejemplo, calorimetría. Las dimensiones también se pueden hacer indirectamente con la ayuda de corridas cromatográficas bajo las condiciones tipo proceso de la aplicación contemplada en la formación transciente de estos complejos, por lo que los resultados obtenidos pueden necesitar ser corregidos para contribuciones de eluyentes. En un ambiente cromatográfico, los valores k' y a pueden servir en una primera aproximación como indicaciones de la entalpia de Gibbs o entalpia de Gibbs diferencial, respectivamente.

Un objeto adicional de la presente invención es un equipo de purificación de diagnóstico de laboratorio que comprende además de un absorbente de la invención (o una colección de absorbentes o una columna que contiene el absorbente) , dentro de la misma unidad de envasado, un conjunto de reactivos químicos o biológicos adicionales (o aún todos) y/o productos desechables necesarios para llevar a cabo el método de separación de la invención o un diferente método analítico, de diagnóstico de laboratorio en el cual se puede emplear el absorbente. Esta colección pre-envasada de materiales en el número correcto, cantidad correcta o concentración correcta se propone que incremente la conveniencia del usuario si se tienen que seguir protocolos experimentales estandarizados cuando se lleva a cabo el método de separación y especialmente si el absorbente o columna se usa como un dispositivo desechable. Este protocolo se puede incorporar conjuntamente con hojas de datos de seguridad, etc., en las instrucciones de uso que se pueden acompañar opcionalmente el equipo.

Breve Descripción de las Figuras Figuras 1A, IB, 1C, ID, 1E 1F, 1G Y 1H.-Diferentes configuraciones individuales 1A - 1H y una representación general I que resulta de la derivatización de dos grupos funcionales (FG) superficiales, adyacentes con un primero y un segundo residuo.

Figuras 2A, 2B y 2C- Diferentes morfologías esquemáticas Figuras 2A a 2C de un material de soporte sólido que consiste de un portador, la superficie del cual se cubre con una película de un polímero (ejemplificado aquí para un portador en partículas, no poroso representado como una esfera gris; no trazada a escala) .

Figura 3.- Elección de posibles primeros residuos que comprende una estructura C, N, 0, S-heteroaromática binuclear compuesta de los anillos fusionados de 5 y 6 miembros y uno o dos heteroátomos contenidos en las mismas.

Figura 4.- Elección de posibles segundos residuos que comprenden una estructura C, N, O, S-heteroaromática mononuclear compuesta de anillos de 5 y 6 miembros y uno o dos heteroátomos contenidos en la misma.

Figura 5.- Representación general de primeros y segundos residuos de. ejemplo compuestos de anillos de 5 y 6 miembros. R1... R8 = par de electrones, H, radical orgánico o enlace superficial; X1... X6 = C o N; Y1... Y2 = N, O, S.

Figura 6.- Representación simbólica (no trazada a escala) de términos usados para caracterizar la superficie del absorbente que interactúa con el analito. No todos los términos representados son necesarios para llevar a cabo la invención.

Figura 7.- Estructuras de los primeros y segundos residuos usados en este estudio (se imprimen en negrita los grupos funcionales proporcionados por una película superficial de polímero) .

Figura 8.- Elución de pH gradual de inmunoglobulina G de absorbente no. ND 10003 para la determinación de capacidad de carga del Ejemplo 4.

Figura 9.- Cromatogramas analíticos de una mezcla de prueba de proteína que contiene catalasa y de sus componentes individuales en el absorbente no. ND 08037 del Ejemplo 5.

Figura 10.- Cromatogramas analíticos de una mezcla de prueba de proteína que contiene catalasa y de sus componentes individuales en el absorbente no. ND 070002 del Ejemplo 5.

Figura 11.- Cromatogramas analíticos de una mezcla de prueba de proteina que contiene catalasa y de sus componentes individuales en el absorbente no. ND 06380 del Ejemplo 5.

Figura 12.- Cromatografía analítica de una mezcla de prueba de proteína que contiene con albúmina y de sus componentes individuales bajo la influencia de altas concentraciones de sal en el absorbente no. ND 08236 del Ejemplo 6.

Figura 13.- Cromatografía analítica de una mezcla de prueba de proteína que contiene con albúmina y de sus componentes individuales bajo la influencia de altas concentraciones de sal en el absorbente no. ND 07200 del Ejemplo 6.

Figura 14.- Cromatografía analítica de una mezcla de prueba de proteína que contiene con albúmina y de sus componentes individuales bajo la influencia de altas concentraciones de sal en el absorbente no. ND 07122 del Ejemplo 6.

Figura 15.- Cromatografía analítica de una mezcla de prueba de proteína que contiene con albúmina y de sus componentes individuales bajo la influencia de altas concentraciones de sal en el absorbente no. ND 06386 del Ejemplo 6.

Figuras 16a y 16b.- Cromatogramas de UV del aislamiento semi-preparativo de conalbúmina de una mezcla de proteínas adicionales en los absorbentes no. ND 07200 (Fig. a) y PRC 10014 (Fig. b) de acuerdo al Ejemplo 7 (las líneas punteadas simbolizan el curso de los gradientes de pH aplicados; secciones I - VII: ventanas de tiempo de fracciones recolectadas) .

Ejemplos Aspecto General Los sistemas de HPLC de Dionex (anteriormente Gynkotek) consisten de una bomba de gradiente de baja presión de cuatro canales (LPG 580, LPG 680 o LPG 3400), automuestreador (Gina 50, ASI-100 o WPS-300) , válvulas de cambio de columna de seis canales (Besta) , horno de columna y un detector de UV de arreglo de diodos (UVD 170U, UVD 340S o VWD 3400) .

Todos los absorbentes empleados se basaron en el mismo portador esférico poroso de copolímero de poliestireno-divinilbenceno sulfonado (diámetro medio de partícula de 35 µp?, diámetro medio de poro de 1000 Á) cubierto con una película de polivinilamina reticulada que se derivatiza de una manera aleatoriamente distribuida con residuos como se da en la descripción experimental respectiva. Las estructuras heteroaromáticas binucleares y mononucleares empleadas como primeros y segundos residuos se muestran en la fórmula de la Figura 7. Se representan en la presente anillos heteroaromáticos tanto de cinco como de seis miembros que contienen uno o dos átomos de nitrógeno. Para todos los experimentos cromatográficos, los absorbentes se usaron en columnas normales de HPLC de acero inoxidable de tamaño de lecho real de 33.5 x 4 mm, si no se señala de otro modo. Las columnas se envasaron por sedimentación de flujo de suspensiones de agua-metanol (1:1) bajo una presión de 20 bar.

La siguiente Tabla 1 lista las proteínas que se emplearon en los varios experimentos. La elección dada abarca una amplia variedad que varía desde péptidos de tamaño medio a complejos de proteínas, multiméricos, grandes, con diferentes funciones tal como catálisis, transporte, respuesta inmunitaria y señalización/regulación que se representa, también. Se tomaron datos del punto isoeléctrico de la literatura y se reprodujeron por enfoque isoeléctrico. Las purezas de las proteínas se verificaron adicionalmente por cromatografía de permeacion en gel. Todos los otros reactivos usados fueron de calidad normal grado de laboratorio.

Tabla 1: Lista de roteínas usadas en este estudio Ejemplo 1: Síntesis de Absorbentes Específicos que tienen Residuos que Contienen Indol e Imidazol en Diferentes Relaciones Primero cuentas esféricas de resina de copolímero de poliestireno-divinilbenceno, comerciales (Rohm & Haas Company: AmberchromMR) se sulfonaron excesivamente en ácido sulfúrico concentrado, luego se adsorbió solución comercial de copolímero de polivinilamina-polivinilformamida (BASF: LupaminMR) sobre las cuentas porosas y se retículo químicamente de forma ligera con un bis-epóxido. A este compuesto intermedio no derivatizado, que contuvo aproximadamente 0.35 - 0.45 mmol/ml de grupos amino libres y se pre-hinchó en dimetil-formamida, se acoplaron sucesivamente y de forma independiente ácido 3-indolpropiónico activado in situ y ácido 4-imidazolilacrílico a los grupos amino mediante un protocolo normal de acoplamiento de amida de fase sólida en un exceso ligero sobre la cantidad predeterminada que corresponde a los grados buscados de derivatización. Los absorbentes se lavaron libre de reactivos en exceso y se secaron hasta que se logró peso constante. Se determinaron los grados de derivatización después de cada paso de derivatización mediante titulación en fase sólida con ácido toluenosulfónico acuoso como diferencias de las capacidades de unión a protón de los grupos amino residuales. De acuerdo a este procedimiento general, se prepararon los absorbentes listados en la Tabla 2.

Tabla 2: Composiciones de absorbentes seleccionados de ejemplo preparados (exactitud aproximada + 2 %; si está presente acetilo como el tercer residuo, la diferencia entre los grados combinados de sustitución y 100 % usualmente es igual el contenido de grupos acetilo; sin o está presente el tercer ligando, la diferencia entre los grados combinados de sustitución y 100 % es igual al contenido de grupos amino residuales) Ejemplo 2: Examen de una Colección de Absorbente de la Invención para sus Propiedades de Unión hacia Diferentes Proteínas Parte Experimental: Se prepararon soluciones de las proteínas puras, con albúmina, hemoglobina, catalasa (de hígado murino) y piruvato-cinasa, todas que tienen puntos isoeléctricos entre 6 y 8, en amortiguador de fosfato 25 mM pH 7.4 en concentraciones de aproximadamente 15 - 18 mg/ml (piruvato-cinasa: 5 mg/ml) . Las cantidades analíticas de 30 µ? (hemoglobina: 125 µ?) de estas soluciones se inyectaron independientemente sobre diferentes columnas de HPLC que contienen los absorbentes que se han derivatizado con uno o más residuos individuales que comprenden estructuras heteroaromáticas en los grados respectivos como se lista en las tablas posteriores. Se empleó un gradiente gradual iniciando con un paso de unión de amortiguador de fosfato 25 mM pH 7.4 durante 40 min a 0.25 ml/min, seguido por un paso de elución con amortiguador de acetato 50 mM, pH 3.5 durante 20 min a 0.5 ml/min y una purga ácida final con ácido acético acuoso 1 M (pH 2.25) durante otros 20 min a la misma velocidad de flujo. El reacondicionamiento con el amortiguador de unión durante 20 min a un flujo de 1 ml/min restauró las condiciones originales del absorbente para la siguiente corrida. Se determinaron los rendimientos de proteína eluida independientemente para cada paso de elución mediante la integración de la señal de absorbancia de UV a una longitud de onda de 230 nm, 280 nm, o 500 nm. Se determinaron las recuperaciones totales de proteína a través de la comparación cuantitativa con corridas adicionales de derivación (sin columna instalada) .

Resultados: Los resultados de examen se listan en las Tablas 3 - 6 (la suma de los rendimientos absolutos de los tres pasos de elución es igual de este modo la recuperación total) que permite la comparación directa de diferentes primeros y segundos residuos asi como el efecto de cualquier residuo ausente. En tanto que la derivatización con segundos residuos sólo da por resultado usualmente una capacidad disminuida de unión del absorbente (mayor avance) , la derivatización con primeros residuos sólo dio por resultado la unión que frecuentemente se prueba que es demasiado fuerte para propósitos prácticos (cromatográficos) . La unión reversible reproducible sólo se puede asegurar si la proteina objetivo se recupera durante un paso de elución, amortiguada moderadamente ácida (aquí: pH 3.5). Si, por otra parte, la proteina objetivo sólo se puede liberar del absorbente en un paso de purga fuertemente ácido, puede sufrir de desnaturalización, haciendo de este modo al absorbente inútil para propósitos preparativos. La unión irreversible algunas veces también se indico por las bajas recuperaciones totales que pueden implicar que aún el ácido acuoso usado en el paso de purga no tiene suficiente fuerza eulotrópica para liberar la cantidad total de proteina del absorbente. Como una tendencia general, de esta manera se logró el desempeño máximo total sólo si ambos ligandos estuvieron presentes en el absorbente. La composición óptima del absorbente, sin embargo, también fue dependiente en cierto grado de la proteina objetivo. Dependiendo de las capacidades sintéticas individuales, se pueden variar los grados de derivatización con tanto primeros como segundos residuos sobre un intervalo amplio. Además, se puede observar una respuesta medible de desempeño aún en variaciones menores de los grados de derivatización si permaneció sin cambio la clase de residuos. No se observó retención reversible en los absorbentes de referencia incluidos en el estudio que no contuvieron ni un primero ni un segundo residuo. La derivatización con grupos acetilo o de ácido succinico como terceros ligandos distribuyó más bien propiedades adversas. Bajo las mismas condiciones como se aplica aquí, las proteínas básicas tal como proteinasa K, citocromo C, o lisozima así como proteínas ácidas tal como pepsina o insulina se muestra que a traviesan a pH 7.4 en un alto porcentaje en la mayoría de las fases estacionarias para eluir (parcialmente) a pH 3.5. Se dio una excepción por la proteína hexocinasa que se encontró en las tres fracciones incluyendo el paso de purga ácida. Las recuperaciones totales frecuentemente fueron inaceptablemente bajas con estas proteínas (datos no mostrados) . Un experimento paralelo realizado con hemoglobina bajo la adición de cloruro de sodio 150 mM a amortiguadores tanto de unión como de elución no altera significativamente los datos al natural. Un paso adicional de elución con alto contenido de sal (NaCl 1 M) y a un pH de unión de 7.4 antes de disminuir el pH del eluyente condujo a elución adicional (12 %) sólo del absorbente derivatizado con 30 % de residuos que comprenden una estructura de indol (es decir, que carecen del segundo residuo) .

Tabla 3: Examen de fase con la proteína objetivo, con albúmina Tabla 4: Examen de fases con la protelna objetivo, hemoglobina Tabla 5: Examen de fase con la proteína objetivo catalasa de Tabla 6: Examen de fase con la proteína objetivo piruvato- cinasa (n.d. = no determinado) Ejemplo 3: Determinación de Capacidades de Carga de Absorbentes que Tienen Residuos que Contienen Indol e Imidazol para Proteínas Neutrales y Débilmente ácidas Parte Experimental: Las tres proteínas, hemoglobina, conalbúmina y catalasa (de hígado bovino) se disolvieron cada a una concentración de 32 mg/ml en amortiguador de fosfato 25 mM, pH 7.4. Se inyectaron gradualmente volúmenes crecientes (15...250 µ?) de estas soluciones concentradas que corresponden a cantidades absolutas de 0.5...8 mg de proteína, o cargas de 1.2...19.0 mg de proteína por mi de fase estacionaria (igual 0.2...3.6 % en peso/peso), respectivamente, sobre columnas de HPLC que contienen los absorbentes que se han derivatizado a grados variables con residuos de 3-indolilpropionilo y 4-imidazolilacrilo como se muestra a continuación.

ND 08240: 25 % de residuos de 3-indolilpropionilo + 20 % de residuos de 4-imidazolilacrilo ND 08236: 14 % de residuos de 3-indolilpropionilo + 29 % de residuos de 4-imidazolilacrilo ND 08037: 26 % de residuos de 3-indolilpropionilo + 26 % de residuos de 4-imidazolilacrilo Se empleó un gradiente gradual con un paso de unión con amortiguador de fosfato 25 mM, pH 7.4 durante 40 min a 0.25 ml/min, seguido por un paso de elución con amortiguador de acetato 50 mM, pH 3.5 durante 20 minutos a 0.5 ml/min y una purga ácida final con ácido acético acuoso 1 (pH 2.25) durante otros 20 minutos a la misma velocidad de flujo. Los rendimientos de la proteina eluida se determinaron independientemente para cada paso mediante integración de la señal de absorbancia UV a una longitud de onda de .280 nm o 450 nm. Las recuperaciones totales de proteina se verificaron a través de comparación cuantitativa con corridas adicionales de derivación (sin columna instalada) .

Resultados: Los comportamientos de elución de las tres proteínas a cargas incrementadas en los diferentes absorbentes se resumen en la Tabla 7. ND 08240: avance a pH 7.4 varió desde 4.3 % a 52 % sobre el intervalo medido de carga de 4.8 - 19.0 mg/ml para la proteína neutral, hemoglobina. La capacidad máxima de carga se determinó que es de 4.8 mg/ml. La mayor carga condujo a un aumento rápido de la porción de avance. El resto de la proteína se eluyó a pH 3.5 sobre el intervalo completo de carga. ND 08236: avance a pH 7.4 varió desde 0.32 % a 47 % sobre el intervalo medido de 1.2-19.0 mg/ml de carga para la proteína neutral conalbúmina . La capacidad máxima de carga se determinó que es de 7.13 mg/ml. Una mayor carga condujo a un aumento rápido de la porción de avance. El resto de la proteína se eluyó a pH 3.5 sobre el intervalo completo de carga. ND 08037: Avance a pH 7.4 varió desde 2.1 % a 10.4 % sobre el intervalo medido de carga de 1.2 - 19 mg/ml para la proteína débilmente ácida, catalasa. La capacidad máxima de carga se determinó que es de 11.88 mg/ml. Una mayor carga condujo sólo a un aumento lento de la porción de avance; el resto de la proteína, sin embargo, se dividió entre ambos pasos de elución ácida, con la porción a pH 2.25 que disminuye de 56 % a una carga de 1.19 mg/ml a 16 % a una carga de 19.0 mg/ml .

Tabla 7: Rendimientos después de adsorción y desorción gradual para tres combinaciones de absorbente-proteína a sus respectivas capacidades de carga máxima.

Ejemplo 4: Determinación de la Capacidad de Carga de Inmunoglobulina G en un Absorbente que Tiene Residuos que contienen Indol e Imidazol Parte Experimental: Se preparó una solución de 10 mg/ml de inmunoglobulina G (IgG) al diluir 303 µ? de producto farmacéutico comercial GammanormMR con amortiguador de fosfato 100 mM pH 7.4 en un matraz volumétrico de 5 mi. Se inyectaron 842 µ? de estas solución concentrada que corresponde a una cantidad soluta de 8.58 mg de IgG, o una carga de 20.4 mg de IgG por mi de fase estacionaria, sobre una columna de HPLC que contiene absorbente no. ND 10003 que se ha puesto en equilibrio previamente con aproximadamente 70 volúmenes de columna de amortiguador de fosfato 100 mM, pH 7.4. Este absorbente se ha derivatizado con 22 % de residuos de 3-indolilpropionilo y 30 % de residuos de 4-imidazolilacrilo . Durante la inyección, se aplicó un amortiguador de unión a fosfato 100 mM, pH 7.4 a una velocidad de flujo de 0.1 ml/min que se mantuvo durante 90 minutos, seguido por un cambio gradual a amortiguador de acetato 100 mM, pH 4.3 + amortiguador de elución de cloruro de sodio 50 mM durante 20 minutos a 0.5 ml/min, una purga ácida pH 2.6 con ácido acético acuoso 0.5 M durante otros 20 minutos al mismo flujo, una dilución intermedia con amortiguador de fosfato 100 mM, pH 7.4 durante 10 minutos a 1 ml/min, y una limpieza final con solución acuosa de hidróxido de sodio 1 M durante 12 min al mismo flujo. La Figura 8 se muestra un cromatograma correspondiente. Se recolectaron tres fracciones que se asemejan a los eluyentes de diferente pH (pH 7.4, pH 4.3, pH 2.6) y se analizaron fuera de linea para su contenido de IgG de forma fotométrica a 280 nm. Para la valoración del valor de referencia de 100 %, se realizó una corrida de derivación con la columna que se reemplaza con una pieza de tubería vacía pero bajo condiciones de otro modo idénticas.

Resultados: Se puede encontrar IgG en todas las fracciones, con la mayoría que se une de forma reversible a pH 7.4 y se desorbe o libera a pH 4.3. Los rendimientos de IgG en las tres fracciones analizables se midieron como 9 % (avance pH 7.4), 81 % (elución pH 4.3), y 12 % (purga pH 2.6). La recuperación total de proteínas sobre las tres fracciones da por lo tanto cuenta de una suma de aproximadamente 102 %. La capacidad de carga reversible (fracción de pH 4.3) del absorbente no. ND 10003 de esta manera se puede determinar como 16.5 mg de IgG por mi de fase estacionaria, la capacidad de carga total (cantidad inyectadas menos avance de pH 7.4) como 18.5 mg de IgG por mi de fase estacionaria. Puesto que el absorbente se usó de forma repetida bajo el mismo protocolo experimental, también fue notable la estabilidad del absorbente contra limpieza/desinfección con NaOH 1 M.

Ejemplo 5: Separación Analítica de Catalasa en Diferentes Absorbentes de la Invención Parte Experimental: Una mezcla de las cinco proteínas catalasa (de hígado bovino) , hexocinasa, pepsina, citocromo C, y a-quimotripsinógeno A (cada una en una cantidad de 0.48 mg disuelta en amortiguador de fosfato 25 mM, pH 7.4) se inyectó sobre diferentes columnas de HPLC que contiene los absorbentes que se han derivatizado con los primeros y/o segundos residuos como se lista a continuación.

ND 08037: 26 % de residuos 3-indolilpropionilo + 26 % de residuos 4-imidazolilacrilo ND 070002: 50 % de residuos de bencimidazol-5-carbonilo + 30 % de residuos de 4-imidazolilacrilo ND 06380: 32 % de residuos de bencimidazol-5-carbonilo El eluyente se aplicó como un gradiente iniciando desde amortiguador de fosfato 25 mM, pH 7.4 durante 10 minutos a 0.25 ml/min, seguido por un primer cambio de pH lineal a ácido acético acuoso 0.1 M (pH 2.86) en el espacio de 50 minutos a 0.5 ml/min y un segundo cambio de pH lineal a ácido acético acuoso 1 M (pH 2.25) dentro de 50 minutos adicionales al mismo nivel de flujo que se mantuvo finalmente durante 20 minutos. La composición del producto eluido se monitorizó a longitudes de onda de absorbancia de 225 nm, 280 nm, y 290 nm. Por comparación, cada proteina individual se inyectó también como una solución pura. En las Figuras 9-11 se representan corridas cromatográficas de los diferentes absorbentes.

Resultados: El cromatograma de la mezcla corresponde a la superposición de las corridas individuales de proteina. La elución de la cantidad inyectada completa de la proteina objetivo, catalasa, se retrasó en los tres absorbentes. Como se espera, las proteínas ácidas, hexocinasa y pepsina también se unieron de forma electrostática al absorbente pero con bajas capacidades (avance de 5 - 25 % para hexocinasa; avance de 35 - 50 % para pepsina) . Las recuperaciones totales consistentemente bajas de la pepsina sugieren que la fracción unida de esta proteína no se puede liberar del absorbente nuevamente aún a los valores de pH más bajos aplicados. Entre las proteínas básicas, el citocromo C se encontró completamente en la fracción de avance en tanto que oí-quimiotripsinógeno A a aproximadamente 25 - 35 % estuvo atravesando y el resto se retuvo. El orden relativo de elución a lo largo del gradiente de pH se encontró en todos los casos como (1) a-quimiotripsinógeno A - (2) catalasa - (3) hexocinasa con diferencias de pico a pico que varían de 3 y 9 minutos. Aunque los picos eluidos siempre se traslaparon, para propósitos analíticos cualitativos la catalasa se resolvió de forma suficiente de ambas proteínas durante el gradiente aplicado en tanto que fue realmente completa la separación de citocromo C y pepsina. De este modo se puede detectar catalasa en presencia simultánea con proteínas tanto ácidas como básicas con la ayuda de un absorbente de la invención. Cuando se compara el absorbente no. ND 070002 con ND 06380, llega a ser evidente también que el sustituyente heterocíclico mononuclear adicional presente en ND 070002 efectúa un incremento general en la retención así como un traslape reducido de los picos de catalasa y -quimiotripsinógeno A.

Tabla 8: Tiempos de retención [min] de tres proteínas en tres absorbentes en el gradiente de elución del Ejemplo 5 Ejemplo 6: Efecto de Sal Adicionada en la Retención de Proteínas en Diferentes Absorbentes de la Invención Parte Experimental: Una mezcla de las cinco proteínas, conalbúmina, hexocinasa, pepsina, citocromo C, y a-quimiotripsinógeno A (cada uno en una cantidad de 0.48 mg disuelta en amortiguador de fosfato 25 mM, pH 7.4) se inyectó en diferentes columnas de HPLC que contienen los absorbentes que se han derivatizado con residuos como se indica en las tablas correspondientes posteriores. El eluyente se aplicó como un gradiente iniciando desde amortiguador de fosfato 25 mM, pH 7.4 durante 10 minutos a 0.25 ml/min, seguido por un incremento lineal de sal de cloruro de sodio de 0 a 1 M a pH constante en el espacio de 50 minutos a 0.5 ml/min nivel que entonces se mantuvo durante 20 minutos a flujo constante. Un paso final de purga con ácido acético acuoso 1 M durante 10 minutos a 0.5 ml/min concluyó la secuencia de elución. La composición del producto eluido se monitorizó a longitudes de onda de absorbancia de 225 nm, 280 nm, y 290 nm. Los rendimientos dados se basaron en estas señales para integración. Las recuperaciones de las proteínas se calcularon aquí al sumar los rendimientos de cada paso de elución. Por comparación, cada proteína se inyectó también como una solución pura (ver Figuras 12 - 15) .

Resultados: Los datos de retención de las cinco proteínas se listan en las Tablas 9 - 12. Los absorbentes nos. ND 08236 y ND 06386 ni muestran ninguna influenza notable en la fuerza de unión hacia la conalbúmina objetivo ni hacia las proteínas más ácidas, hexocinasa y pepsina. De acuerdo con el protocolo propuesto, estas proteínas sólo se pueden eluir de los absorbentes después de un salto hacia abajo del pH con un eluyente ácido. Sólo un pequeño porcentaje de la proteína básica, -quimiotripsinógeno A (que no se supone que se una de forma electrostática) se eluyó a una concentración incrementada de sal. Por otra parte, los absorbentes que contienen quinolil-4-carbonilo nos. ND 07200 y ND 07122 exhibieron un efecto moderado de sal en la retención tanto de conalbúmina como de a-quimiotripsinógeno A. Este efecto fue más pronunciado en ND 07122 que en ND 07200 en términos de pérdidas de rendimiento durante la aplicación de sal, confirmando de este modo el efecto benéfico del ligando heteroaromático, mononuclear, adicional en la fuerza de unión en ND 07200. Estos hallazgos combinados se pueden considerar como una indicación que el mecanismo de unión del absorbente difiere de un intercambio iónico simple. Como consecuencia, las proteínas también se pueden capturar en los absorbentes de soluciones de alimentación (no clarificadas) que contienen altas concentraciones de sales de pH neutral. Por el contrario, la concentración de sal del eluyente se puede usar como un parámetro adicional para ajustar la selectividad de la proteína en separaciones de mezclas más complejas.

Tabla 9: Datos de retención con sal adicionada en el absorbente no. ND 08236 (14 % de residuos de 3-indolilpropionilo + 29 % de residuos de 4-imidazolilacrilo) Tabla 10: Datos de retención con sal adicionada en absorbente no. ND 07200 (19 % de residuos de quinolina-4-carbonilo + 30 % de residuos de 4-imidazolilacrilo) Tabla 11: Datos de retención con sal adicionada en absorbente no. ND 07122 (19 % de residuos de quinolina-4- carbonilo) Tabla 12: Datos de retención con sal adicionada en absorbente no. ND 06386 (13 % de residuos de bencimidazolil-2-tioacetilo) Ejemplo 7: Separación Semi-Preparativa de Conalbúmina de una Mezcla de Proteínas en Absorbentes que Tienen Residuos que Contienen Imidazol y ya sea Indol o Quinolina Parte Experimental: Una mezcla de las cinco proteínas con conalbúmina, hexocinasa, pepsina, citocromo C, y a-quimiotripsinógeno A (cada una en una cantidad de 0.48 mg disuelto en amortiguador de fosfato 25 mM, pH 7.4) se inyectó en dos diferentes columnas de HPLC que contienen el absorbente no. ND 07200 (33.5 x 4 mm) o PRC 10014 (250 x 4 mm; 0.96 mg cargado). Los absorbentes ya se han derivatizado con 19 % de residuos de quinolina-4-carbonilo y 30 % de residuos de 4-imidazolilacrilo (ND 07200) o con 22 % de residuos de 3-indolilpropionilo y 28 % de residuos de 4-imidazolilacrilo (PRC 10014). El eluyente se aplicó como un gradiente iniciando de amortiguador de fosfato 25 mM, pH 7.4 durante 10 minutos (PRC 10014: 40 min) a 0.25 ml/min, seguido por -cambio de amortiguador lineal a amortiguador de acetato 50 mM, pH 3.5 en espacio de 50 minutos a 0.5 ml/min nivel que finalmente se mantuvo durante 20 min (PRC 10014: 50 min) a una velocidad constante de flujo. La composición del producto eluido se monitorizó a una longitud de onda de absorbancia de 225 nm (Figuras 16 a/b) y se recolectó en siete fracciones. Después de la concentración a un volumen de 0.2 mi a través de filtración centrifuga en membrana, el contenido de proteina de cada fracción se analizó cualitativamente por SDS-PAGE (mostrada por ejemplo en la Figura 17 que corresponde al fraccionamiento en ND 07200) . Para propósitos de comparación, las corridas analíticas de las cinco proteínas individuales en el absorbente no. ND 07200 se representan en la Figura 18.

Resultados: ND 07200: Fracción IV (31:30 - 40:00 min; 4.25 mi) contuvo la mayoría de la conalbúmina conjuntamente con algo de -quimiotripsinógeno A residual pero no contaminado por ninguna proteína adicional. Se encontró citocromo C en la fracción I, a-quimiotripsinógeno A en las fracciones II y III, y hexocinasa en las fracciones V y VI. También se detectaron cantidades menores de conalbúmina en las fracciones II, III, y V. Aunque aún incompleta, la capacidad de la purificación de la combinación elegida de fases estacionarias y móviles fue aceptable cuando se consideró la dimensión corta de columna y el fraccionamiento grueso. PRC 10014: Fracción V (98:00 -109:00 min; 5.50 mi) contuvo la mayoría de la conalbúmina conjuntamente con a-quimiotripsinógeno A residual y hexocinasa del cual se ha separado parcialmente. Se encontró citocromo C en la fracción I, a-quimiotripsinógeno A en las fracciones IV y VI, y hexocinasa en las fracciones V - VII. También se detectaron cantidades menores de conalbúmina en las fracciones IV y VI.

Ejemplo 8: Separación Analítica y Semi-Preparativa de Hemoglobina de una Mezcla de Proteínas en un Absorbente que Tiene Residuos que Contienen Bencimidazol e Imidazol Parte Experimental: Una mezcla de las cinco proteínas, hemoglobina, hexocinasa, pepsina, citocromo C, y a-quimiotripsinógeno A (cada una en una cantidad de 0.48 mg disuelta en amortiguador de fosfato 25 mM, pH 7.4) se inyectó en una columna de HPLC que contiene el absorbente no. ND 07003 que se ha derivatizado con 13 % de residuos de Bencimidazolil-2-tioacetilo y 10 % de 4-imidazolilacrilo . El eluyente se aplicó como un gradiente iniciando desde amortiguador de fosfato 25 mM, pH 7.4 durante 10 min a 0.25 ml/min, seguido por un cambio de amortiguador lineal a amortiguador de acetato 50 mM, pH 3.5 en el espacio de 50 minutos a .0.5 ml/min nivel que finalmente se mantuvo durante 20 min a velocidad constante de flujo. La composición del producto eluido se monitorizó a longitudes de onda de absorbancia de 225 nm (Figura 19) , 280 nm, 290 nm, y 500 nm y se recolectó en siete fracciones. Después de la concentración a un volumen de 0.2 mi a través de filtración centrifuga en membrana, el contenido de proteina de cada fracción se analizó cualitativamente por SDS-PAGE (Figura 20a y Figura 20b) . Para propósitos de comparación, corridas analíticas paralelas de las cinco proteínas individuales (hemoglobina: 1.92 mg de cantidad inyectada) en el absorbente no. ND 07003 se grafican en la Figura 21 junto con los valores medidos de pH del eluyente recolectado al final de la columna. Corridas analíticas en el absorbente análogo de referencia no. ND 06386, que estuvo carente del residuo de imidazolilacrilo, se adicionan en la Figura 22.

Resultados: Algunos datos claves de este experimento se resumen en la Tabla 13. El traslape de los cromatogramas analíticos obtenidos con el absorbente no. ND 07003 demuestra una razonablemente buena eficiencia de separación de la fase estacionaria. La hemoglobina de esta manera se puede detectar en la presencia simultánea de proteínas tanto ácidas como básicas con una diferencia mínima de tiempo de retención de 7.5 min y recuperadas con 100 % (absorbente de referencia ND 06386: 86 %) . Adicionalmente, el cromatograma de la mezcla corresponde a la superposición de las corridas individuales de proteína. Como se espera, las proteínas ácidas, hexocinasa y pepsina, también se unieron electrostáticamente al absorbente pero con bajas capacidades (es decir, avance parcial) . El problema más difícil que se va a solucionar resulta ser la separación de hemoglobina de hexocinasa debido a un amplio comportamiento de elución de esta última. Las recuperaciones totales consistentemente bajas de la pepsina sugieren que la fracción unida de esta proteína no se puede liberar del absorbente nuevamente aún a los valores de pH más bajo aplicados. En contraste, a-quimiotripsinógeno A y hemoglobina no se pueden separar en el absorbente no. ND 06386 (tiempos de retención de 35.1 y 35.7 min) si se usa el mismo gradiente. De acuerdo con las corridas analíticas, la fracción IV de la corrida preparativa (31:30 - 40:00 min; 4.25 mi) contuvo la mayoría de la hemoglobina conjuntamente con algo de a-quimiotripsinógeno A pero no contaminado por ninguna proteína adicional. Las otras proteínas de la mezcla inicial se encontraron en la fracción I (citocromo C) y las fracciones V y VI (hexocinasa, a-quimiotripsinógeno A) . Las trazas de hemoglobina también se llevaron en estas últimas fracciones .

Tabla 13: Datos de retención de la mezcla de prueba del Ejemplo 8 en el absorbente no. ND 07003.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un absorbente que comprende un material de soporte sólido, la superficie del cual comprende: un primer residuo que comprende una estructura heteroaromática binuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S; y un segundo residuo que comprende una estructura heteroaromática mononuclear que comprende además de átomos de carbono al menos uno de los heteroátomos N, 0, S; caracterizado en que el primero y segundo residuos no están directamente conectados entre si sino que se unen de forma separada a ya sea el material de soporte sólido a granel en si mismo o una película de polímero soportada por este como portador.

2. El absorbente según la reivindicación 1, en donde la estructura heteroaromática binucleares una estructura de benzopirrol (indol), incluyendo todas las posibles estructuras de aza-benzopirrol, oxa-benzopirrol, y tia-benzopirrol, o una estructura de benzopiridina (quinolina o isoquinolina ) , incluyendo todas las posibles estructuras de aza-benzopiridina, oxa-benzopiridina, y tia-benzopiridina .

3. El absorbente según la reivindicación 1 ó 2, en donde la estructura heteroaromática mononuclear es una estructura de pirrol, incluyendo todas las posibles estructuras de aza-pirrol, oxa-pirrol, y tia-pirrol tal como 3-azapirrol (imidazol) .

4. El absorbente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el primero y/o segundo residuo comprenden un ligador covalente, conformacionalmente flexible de una longitud de 1 a 20 átomos.

5. El absorbente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la superficie del material de soporte sólido comprende adicionalmente un tercer residuo y opcionalmente un cuarto residuo.

6. El absorbente según la reivindicación 5, en donde el tercer residuo comprende una estructura de amina o amida o una estructura de amida primaria.

7. El absorbente según la reivindicación 6, en donde el primero, segundo, y tercer residuo están presentes en una relación molar de aproximadamente 1:1:2.

8. El absorbente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la superficie del material de soporte sólido se cubre con una película de un polímero que comprende un primero y un segundo grupo funcional, que pueden ser los mismos o que pueden ser diferentes entre sí, que a su vez tienen un primer y un segundo, y opcionalmente un tercero y un cuarto residuo.

9. El absorbente según la reivindicación 8, en donde el polímero comprende o consiste de cadenas individuales que se reticulan covalentemente entre sí, pero que no se unen covalentemente a la superficie del portador.

10. El absorbente según la reivindicación 8 ó 9, en donde el polímero es una poliamina, o una polivinil-amina, o una mezcla de copolímero o copolímeros que comprenden una poliamina.

11. El absorbente según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde una primera porción de los grupos funcionales de la película de un polímero se retícula con al menos un reactivo reticulador, y en donde una segunda porción de los grupos funcionales del polímero reticulado se une al primero y segundo, y opcionales residuos adicionales.

12. Un método para preparar un absorbente según la reivindicación 11, que comprende: (i) proporcionar un polímero que tiene un primero y un segundo grupo funcional; (ii) adsorber una película del polímero sobre la superficie de un portador; (iii) reticular una primera porción de los grupos funcionales del polímero adsorbido con al menos un agente reticulador; (iv) unir una segunda porción de los grupos funcionales del polímero reticulado con un primero, un segundo y opcionales residuos adicionales.

13. Un método para separar, o incrementar la concentración y/o pureza de una proteína o péptido de una mezcla que contiene la proteína o péptido, que comprende: (i) poner en contacto la mezcla que se va a disolver o suspender en un primer líquido con un absorbente como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o con una absorbente preparado de acuerdo a la reivindicación 12 durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la proteina o péptido se llegue a unir al absorbente; (ii) enjuagar opcionalmente el absorbente con un segundo liquido; (iii) poner en contacto el absorbente con la proteina o péptido unido con un tercer liquido durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la proteina o péptido se llegue a liberar del absorbente; (iv) opcionalmente lavar y/o regenerar al absorbente con un cuarto y/o químico líquido.

14. Un método según la reivindicación 13, donde el pH del primero y opcionalmente el segundo líquido está cercano al punto isoeléctrico pl de la proteína o péptido.

15. Un método según la reivindicación 13 ó 14, donde el pH del primer líquido está en el intervalo de 5.5 a 8.5 y el pH del tercer líquido estás en el intervalo de 3 a 6.5.

16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde la proteína o péptido tiene un punto isoeléctrico pl de 5.5 a 8.5 y un peso molecular de 100 a 500,000 Da.