KR20120047269A - 단백질 및 펩타이드 결합용 특정 흡착제, 및 이를 사용하는 분리방법 - Google Patents

단백질 및 펩타이드 결합용 특정 흡착제, 및 이를 사용하는 분리방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고체 지지체를 포함하는 흡착제에 관한 것으로, 이의 표면에 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로 원자 N, O, S를 포함하는 이핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기, 및 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로 원자 N, O, S를 포함하는 단핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기를 포함한다.

Description

단백질 및 펩타이드 결합용 특정 흡착제, 및 이를 사용하는 분리방법{SPECIFIC SORBENT FOR BINDING PROTEINS AND PEPTIDES, AND SEPARATION METHOD USING THE SAME}
본 특허 출원은 생체 분자, 특히 바이오크로마토그래피의 분리 기술 분야에 관한 것이다.
생체 분자용 크로마토그래피 매질은 샘플과 하나 이상의 다음의 가능한 모드의 상호작용에 따라 전형적으로 분류되어 왔다:
- 소수성 작용 (<<역상>>)
- 친수성 작용 (<<정상>>)
- 양이온 교환
- 음이온 교환
- 크기 배제
- 금속 이온 킬레이션
기술적 발효 과정의 적정 농도에서의 끊임없이 계속되는 개선은 동일한 요소에 의해 필요한 용량의 액체를 증가시키지 않고 큰 단백질 크기를 처리할 수 있는 간단하고, 비용면에서 효율적이며, 고도의 선택적인 다운스트림 정제 기술에 대한 요구를 증가시켰다. 주어진 분리 문제에 대한 상기 크로마토그래피의 분류의 전형적으로 단계적 출원은 제품의 작동 시간 및 비용을 언급하지 않고, 이에 따른 제품 순도의 단계적, 지속적인 개선, 뿐만 아니라 최종적으로 심각하게 축적된 모든 단계에서의 제품 손실을 반영했다. 연속적인 일련의 순차적인 크로마토그래피 단계를 단지 하나로 감소시키는 것은 수차례 입증되었기 때문에, 모든 단계에서 다운스트림 과정으로 친화성 크로마토그래피의 도입은 상기 요구에 대한 대답이 될 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 화학적 관점으로부터 상기와 같은 동일한 상호작용 모드를 기초로 하지만, 일반적으로 2개 이상의 모드의 조합을 기초로 할 지라도 가끔 자체의 종류로서 간주된다. 친화성 크로마토그래피의 원칙적 특징은 일반적으로 항원-항체, 탄수화물-렉틴, 호르몬-수용체, 또는 상보 핵산 가닥 사이와 같은 생물학적 중요성의 공지된 분자 인식 쌍을 기초로 하는 예비-결정된 분석물의 높은 특이성이다. 따라서 대부분의 친화성 흡착제는 특정 분리 작업에 따라 최종 사용자에 의해 맞추어진다. 작용성 흡착제를 완전히 수득하기 위해서, 생물학적 친화성 잔기는 단지 몇 가지 표준 생체접합(bionconjugation) 기술의 선택으로 즉시 또는 잔기의 병진 또는 회전식 모션에서 더 많은 정도의 자유를 허용하는 임의의 사슬을 통해 그 자체가 상업적으로 이용가능할 수 있는 지지 물질로 결합된다. 이러한 흡착제의 수명은 정상적으로 단지 짧으며, 종종 요구가 있는 대로 제조되어야 한다.
또한, 짧은 선형 또는 순환형 합성 펩타이드 또는 펩타이드 유사체와 같은 합성 친화성 리간드, 및 특정 반응성 염료(주로 트리아진 염료)는 생체분자와 그룹-특이적으로 상호작용하는 것이 발견되어 왔다. 후자는 저렴하며, 생체 중합체의 3차 구조에서 불안정성 및 가변성의 단점이 없는 저분자량 잔기를 제조하는데 용이하다. 또한, 저 분자량 크기 및 조화가능하고 활발한 활성 화학적 성질로 인해, 이들은 심지어 긴 사슬 없이도 고체 지지체 위로 지시된 배향에서 효과적으로 고정될 수 있는 반면, 동일한 조건 하에 생체 분자는 종종 디폴딩(defolding), 입체 장애(steric hindrance) 또는 임의 배향(random orientation)으로 인해 고정 후 활성이 결여되고 있다. 어느 경우든, 인식 과정에 활성적으로 포함되는 흡착제의 성분은 일반적으로 지지 고체의 표면(종종 표면-결합된 단층)에만 존재한다.
균질 고체 지지 물질과는 달리, 표면이 가교 결합된 중합체의 박막으로 둘러쌓인 벌크 고체 지지 물질의 일반적인 방식에 따라 2층 단면 구조로 이루어진 흡착제는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 심하게(방사-) 가교결합된 폴리부타디엔, 폴리스티렌, 폴리실록산, 폴리(메트)아크릴레이트, 및 폴리아미드와 같은 중합체는 과거에 주로 사용되어 왔다. 이들은 고체 지지 물질의 기초적인 부분("담체")과 원하지 않는 상호작용으로부터 둘러싸는 매질을 보호하는 밀집형 인터페이스를 창출하려는 의도를 가지고 주로 사용되어 왔다. 이러한 상호작용은 흡착제에 대한 비특이적 또는 심지어 변경할 수 없는 생체분자의 결합을 유도할 수 있는 반면, 잔기에 대한 고체 지지 물질 또는 이의 화학적 연결의 구성성분이 샘플 또는 용출제 중의 하나의 공격적인 성분으로 부식될 수 있다. 중합체-피복된 흡착제는 위에 나열된 것처럼 모든 크로마토그래피 분류 내의 출원에 대해 기본적으로 공지되지만, 특히 소수성 상호작용 및 크기 배제에 대해서 공지된다. 또한, 선형 또는 분지형 사슬, 예를 들면, 소위 섬모 수지(tentacle resin)로서 담체 물질에 내적으로 가교결합되지 않지만 접목(grafting)되는 중합체 피복이 공지되어 있다.
반면, 친화성 크로마토그래피는 대부분 벌크 겔-상 수지로 수행되어 왔다. 현저한 겔-형성 물질은 매질-가교결합된 다당체, 폴리아크릴아미드 및 폴리(에틸렌 옥사이드)이다. 이러한 하이드로겔은 이들의 연성(구조적 유연성, 탄성 계수), 큰 공극 시스템, 높은 극성 및 높은 물 함량, 뿐만 아니라 반응성 또는 변성 화학적 그룹의 부재로 인해 하이드로겔과 상호작용하는 생물학적 분석물 및 활성적 잔기 둘 다를 잘 수용할 수 있는 생체적합성 상호작용을 확보한다. 이들은 자연 상태로 단백질을 유지할 수 있는데, 즉, 이들의 정확한 중첩식, 3차원 구조, 결합 상태, 및 기능적 통합성을 보존할 수 있다. 이는 종종 소수성 (<<경질>>) 매질을 강하게 흡착하는 것으로부터 단백질 또는 펩타이드를 용출시키는데 필요한 유기 용매를 피할 수 있는 사실의 대부분의 결과이다. 이로써 지지체의 내인성 흡착 강도의 결여는 하이드로겔 내에 잘 수용되어 있는 분리 표적에 대해 결합 파트너로서 고도로 특이적이고, 완전한 생물학적 리간드를 도입시킴으로써 상쇄된다.
그러나, 이들 매질의 기계적 저항은 무기 지지체의 저항보다 훨씬 더 약한데, 그 이유는 적용된 저압하에 압축될 수 있으며, 교반에 의해 발생되는 전단 응력, 칼럼 충전 또는 높은 액체 유동율을 견디지 못하기 때문이다. 따라서 로버스트 HPLC 공정 조건에 완전히 부합하는 친화성 흡착제는 흔하지 않다.
최근에 고정상의 기계적 저항이 흡착제 지지의 벌크 특성으로 인식되었지만 고정상과 이동상 사이의 인터페이스에서의 박층만이 물질 교환 및 생물학적 분석물과의 상호작용에 대한 책임이 있다. 따라서, 기계학적으로 매우 엄밀하고 차원적으로 안정한 다공성 3차원 코어의 기능, 및 분석물을 결합하기 위한 활성 잔기를 수반하는 젤형 인터페이스 층을 결합하는 개념이 제기되어 왔으며, 관련된 합성 문제들이 기술적으로 해결되어 왔다. 이러한 하이브리드 물질은 무기 산화물 또는 낮은 극성의 고밀도 가교결합된 중합체의 염기 상에 높은 극성의 저밀도 가교결합된 중합체를 사용한다.
방법론적으로, 이들은 코어 물질 위로 고 극성의 중합체를 도포시키거나 코어 물질 및 가교결합제의 존재하에 직접적으로 극성 단량체, 이의 전구체를 중합시킴으로써 제조할 수 있다. 후자의 방법에 따라 제조된 대다수의 물질은 비-기공-침투성 또는 기공-충진 방법 중의 하나를 가지는 것으로 문헌에 기재되어 있다. 비-침투성 필름은 분석물과 상호작용하는데 이용가능한 표면적이 제한됨에 따라 단지 중합체 필름, 기공 충진 필름의 두께에 좌우되는 낮은 결합 능력은 일반적으로 양호한 결합 능력을 나타내지만 이동 상과 함께 기공 및 교환 운동 내의 확산 물질 이동률은 느리다. 완전히 충진되지는 않지만 코어 물질의 내부 표면을 감싸는 중합체 필름은 이러한 측면에서 이로울 것이다. 이러한 모든 종류의 흡착제 중에 가장 잘 공지된 대표적 흡착제는 다공성 실리카 지지 코어 물질 위로 접목(grafting)된, 분지형이고 임의적으로 추가의 가교결합된 폴리에틸렌 이민으로 이루어진 시스템이다. 이러한 흡착제는 추가로 유도될 수 있는 것으로 입증되어 왔지만, 이들은 이온 교환 및 단지 작은 표준 잔기를 필요로 하는 이들 그룹-특이적 친화성 적용에만 상업화되어 왔다.
합성적 친화성 매질의 생산에 대해 개념적으로 상이한 접근은 표적 물질과, 표적 물질과 가공 형성제의 존재하에 수행되는 중합체 반응 동안에 형성되고 순차적으로 제거되어야만 하는 중합체성 캐비티 사이에 모양과 기능기 상보성을 기준으로 하는 일명 <<분자 각인>> 기술이다. 각인기술은 단백질과 펩타이드를 포함하는 다수의 물질에 대해 개발되어 왔으며, 표적의 일시적 고정을 고려하여 공유 방법 및 비-공유 방법으로 나눌 수 있다. 그러나, 이 기술은 고체 지지체로서 몇몇의 고도로 가교결합된 유형의 중합체의 형성에 제한적이며, 일단 생산 규모에 도달한 후의 광범위한 허용, 특히 규제 기관의 통제하에 있는 약제학적 단백질 또는 펩타이드에 대해서는 발견된 바가 없다.
면역글로불린 G (IgG)의 정제에 대해 가장 광범위하게 사용되는 매질은 지지-결합된 단백질 A 또는 G이고, 이들 둘 다와 단백질 L은 스타필로코커스의 세포 벽에 자연적으로 생산되지만, 대규모 적용에 대해 높은 설비 투자가 필요하여 기본적으로 이들의 일회적인 사용은 중지되어 있다. 단백질 A는 항체의 고정 Fc 파트에 대한 특정 에피토프에 결합하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 이 영역이 결핍되어 있는 재조합 항체 단편 또는 융합 생성물의 정제에는 사용이 제한된다. 반면, 단백질-유도된 흡착제의 반복적 사용은 엄격한 제조 조건에 대한 단백질 2차/3차 구조 및/또는 화학적 결합 불안정성의 단점과 관련되며, 크로마토그래피 작동 중에 특히 의무적인 강 알칼리성 위생처리 동안 가능한 불활성화 또는 누설을 야기시킨다. 이에 따라 감소된 수명에 추가하여 약제학적 생산에 있어서 단백질 A 흡착제의 적용에 대해 논쟁이 진행중이며, 매 분 누설된 단백질 A의 양이 정제하고자 하는 생성물이 생체 내 약제학적 사용을 위한 경우 사람에게 면역학적 질환을 유발하는 것으로 추측되기 때문이다. 따라서, 규제 생성물에 대해 승인 허가 및 예측되는 시판 허가는 기술적 정제 과정을 결정하는데 기타의 중요한 요소들이며, 따라서, 단백질 A 크로마토그래피는 여과된 독성물질을 제거하기 위해서 추가의 크로마토그래피 단계를 거쳐야만 한다.
향상된 기술적 특성을 갖는 이들 단백질의 가공된 변이를 생성하려는 시도 외에 결과적으로 매우 짧은(비자연적) 펩타이드 에피토프 만을 또는 심지어 완전히 합성적인 잔기를 갖는 몇몇의 흡착제들이 제조되었다. 시판적으로 이용가능한 단백질 A/G/L 대체물로서 유용한 이들 합성적 매질은 2007년 1월에 발행된 문헌[Journal of Chromatography B, volume 848]에서 최근 검토되어 왔다.
배경 기술
바이오크로마토그래피 흡착제의 잔기로서 기본형 인돌 및 이미다졸 구조에 대해 다음의 예시적으로 입증된 이핵 및 단핵 C, N, O, S-헤테로방향족 구조의 유용성은 일찍 인식되어 왔지만 별개로 이들의 혼합된 사용의 장점은 청구되지 않았다. 그러나, 이미다졸 구조의 예는 인돌 구조 보다는 과학 및 특허 문헌에서 더욱 종종 발견된다. 이미다졸 구조를 흡착제로 도입하는 분명한 방식은 추가적 링커 잔기 또는 추가적 링커 잔기 없이, 천연 아미노산 히스티딘, 이의 보호된 형태, 또는 관련된 히스타민과 커플링하여 아미드 결합하는 방식이다. 히스타민은 고체상 합성 기술에 의해 아미노 기를 통해 지지체와 커플링될 수 있어서 추가적 전하되거나 분리가능한 그룹 없이 이미다졸 구조를 야기시킨다. 히스티딘과 커플링하여 2개의 선택이 실현가능하다: 탈양성자화 가능한 카복실 그룹을 여전히 함유하는 이미다졸 구조를 생성하는 아미노 기에서 아미드 형성을 통한 커플링, 또는 양성자화가능한 아미노 기를 여전히 함유하는 이미다졸 구조를 생성하는 카복실 기에서 아미드 형성을 통한 커플링, 모든 이들 상이한 가능성은 이미 실험적으로 실현되어 왔다. 유사하게는, 인돌 구조는 트립토판 또는 트립타민 잔기로서 쉽게 도입될 수 있다.
히스티딘 흡착제에 대한 친화성 크로마토그래피는 문헌[Molecular lnteractions in Bioseparations (Ed.: T.T. Ngo), Plenum Press, New York 1993, Chapter 18 (pp. 257-275)], 및 문헌[Biochromatography (Ed.: M.A. Vijayalakshmi), Taylor & Francis, London 2002, Chapter 9 (pp. 252- 271)]에 광범위하게 검토되었다. 사람 혈장 단백질의 정제에 사용되어 왔던 다양한 흡착제는 이들 문헌에서 크로마토그래피 매개변수 및 제안된 상호작용 메카니즘에 대한 상세한 내용과 함께 제공된다. 히스티딘 친화성 크로마토그래피의 실용적인 측면은 문헌 [Molecular Biotechnology 6 (1996), 347-357]에서 동일한 저자에 의해 요약되어 있다. 면역글로불린 정제와 관련된 일부 예는 다음에서 강조될 것이다:
초기 예로서, 문헌[Journal of Chromatography 376 (1986), 259 - 267]에서, 히스티딘은 에피클로로히드린 또는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 결합을 통해 세파로스 및 에폭시-활성화된 실리카에 커플링되었다. 일부 단백질 및 펩타이드 분석물과의 크로마토그래피 결과에 대해 흡착제 제조의 효과가 조사되었다. 흡착제는 사람 태반 IgG의 반-조종 규모 정제에 최종적으로 사용되었다. 적용된 염 성분을 갖는 히스티딜-아미노헥실-세파로스로부터 IgG1 및 IgG2 소분류의 정제는 문헌[Bioseparation 3 (1992), 47-53. ln Journal of Chromatography B 667 (1995), 57 - 67], 및 문헌[Journal of Chromatography B 674 (1995), 13-21]에 기재되어 있으며, 히스티딘을 처리되지 않은 사람 혈청으로부터 IgG의 소분류-선택적인 원스텝 분리에 대해 에피클로로히드린 또는 부탄디올 디글리시딜에테르-활성화된 폴리(에틸렌 비닐알콜) 중공 섬유막 위로 고정시켰다. 흡착제는 상이한 완충제 및 온도 조건하에 크로마토그래피 및 단일 평형 실험에 재생가능하게 사용되었고, 이는 항체의 Fab 파트에서 결합 메카니즘에 대한 인식을 가능하게 하였다. 이후에, 히스티딜아미노헥실세파로스 상에서 상이한 완충 시스템에서 HSA 동종의 분리 메카니즘은 문헌[Journal of Chromatography B 758 (2001), 163- 172]에서 연구되었다. 세파로스 겔 상 및 폴리에틸렌-비닐알콜 상에 고정된 히스티딘의 성능을 추가로 문헌[Chromatographia 65 (2007), 639- 648]에 다른 세균 추출물로부터 모델 제한 효소의 정제에 모놀리식 디스크 지지에 결합된 히스티딘-에틸렌디아민과 비교하였다. 또한 동일한 공개문헌은 모놀리식 매질 상으로 순수한 IgG의 흡수 및 세포 배양 상청액으로부터 단일클론 항체의 분리에 대해 보고하였다.
이미다졸 잔기를 갖는 흡착제의 생산을 위한 개념적으로 상이한 접근은 문헌[Reactive Polymers 13 (1990), 177]의 저자 및 그 외 문헌을 따라하였다. 폴리비닐이미다졸 필름은 역상 특징을 나타내는 흡착제를 제조하기 위해서 고체 담체에 제조되었다.
문헌[Analytica / Biochemistry 201 (1992), 170 - 177]에서, 디비닐설폰 결합을 통해 N-결합된 이미다졸 잔기를 갖는 아가로스 흡착제가 사람 혈청의 분획에 사용되었고 다양한 이동 상 조건 하에 기타 방향성 또는 헤테로방향성 잔기를 함유하는 흡착제와 비교하였다. 상기 결합은 잔기의 밀도에 좌우되는 것으로 밝혀졌지만, 결합 패턴은 설폰 잔기에 기여되는 것으로 항상 생각되었다.
문헌[Bioseparation § 6 (1996), 165 - 184]에서, 일련의 흡착제는, 히스티딘이 3개의 상이한 링커를 통해 세파로스 지지체에 커플링되어 제조되었다. 열역학, 운동학, 및 안정성 데이타가 제안되었고, 세포 배양 여과액으로부터 BSA와 생쥐 IgG1의 인공적 혼합물 및 생쥐 IgG1의 분리에서 선택성이 측정되었다. 문헌[Journal of Membrane Science 207 (2002), 253 - 264]에서 보고된 다른 접근에서, 나일론 막 디스크는 덱스트란 또는 폴리비닐알콜 층과 공유적으로 피복되고, 헥산디아민 링커 및 최종적으로 히스티딘과 함께 에피브로모하이드린 활성 하에 유도된다. 막 흡착제는 이의 능력에서 기타 친화성 막과 비교하여 사람 IgG와 결합한다.
문헌[Reactive & Functional Polymers 34 (1997), 103- 111]에 따라, IgG의 보유는 또한 지지체와 에피클로로하이드린 또는 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르와 활성화 이후 폴리(부타디엔하이드록시에틸메트아크릴레이트) 지지체 및 히스티딘으로부터 제조된 흡착제 상에서 발견되었다.
히스티딘 잔기를 갖는 흡착제를 크로마토그래피하여 문헌[Applied Biochemistry and Biotechnology 75 (1998), 93 - 102]에 기재된 기타 분리 기술과 비교하였다. 항체 (IgG, IgM) 정제의 적용에 초점을 맞추어, 세파로스, 나일론, 나일론-폴리비닐 알콜, 및 실리카 평막 및 폴리에틸렌 비닐 알콜 중공 섬유 막과 고정된 히스티딘과의 수득한 결과가 요약되어 있다. 혈청으로부터 직접적으로 항체를 수득하는 것은 높은 상관성이 보유될 수 있는 한, 단백질 A 또는 단백질 G 매질 상에서 전형적인 캡처에 우수한 것으로 밝혀졌다. 상기 흡착제는 IgG 소분류 선택적 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
문헌[Journal of Chromatography A 814 (1998), 71 - 81]에서, 아미노프로필이미다졸, 히스타민, 아미노메틸벤즈이미다졸, 머캅토메틸이미다졸, 및 2-머캅토벤즈이미다졸을 활성화된 세파로스 또는 셀룰로스 비드에 커플링시켰다. 염 구배 또는 pH 변화를 사용하는 용출 조건 하에 이들 흡착제 상의 몇몇 모델 단백질의 보유 특성을 시험하였다. 다른 예에서, 2-머캅토-1-메틸이미다졸을 2-하이드록시프로폭시 링커를 통해 문헌[Journal of Biotechnology 79 (2000), 103 - 115]에 기재된 바와 같이 세파로스에 커플링시켰다. 단백질의 pI에 근접한 pH 조건 하에 미생물 배양을 처리하는 동안 세포외 산 프로테아제의 분리에서 이의 적합성을 시험하였다.
또한, 히스티딘의 아미노 그룹을, 직접적으로 또는 헥산디아민 링커를 통해 아크릴레이트 공중합체 모놀리식에 커플링시킨 다음, 문헌[Biotechnology and Bioengineering 80 (2002), 481-489]에 보고된 바와 같이 사람 혈청으로부터 IgG의 분리에 사용하였다. 이 잔기 또한 분석물과 상호작용하는데 이용가능한 카복실레이트 그룹을 나타낸다.
문헌[Separation Science and Technology 37 (2002), 717 - 731, and Reactive & Functional Polymers 61 (2004), 369-377]은 N-결합된 히스티딘 잔기를 갖는 폴리(2-하이드록시에틸메트아크릴레이트)의 부분적 유도 및 다양한 실험 조건 하에 혈장으로부터 사람 IgG의 역 흡수에서 이의 반복적 사용을 기재하였다. 문헌[Macromolecular Bioscience 2 (2002), 135-144]에 따라 2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트와 2-메트아크릴아미도히스티딘과의 공중합으로 유사한 가교결합된 흡착제를 제조하고 동일한 방식으로 사용하였다. 다른 폴리(에틸렌글리콜디메트아크릴레이트-N-메트아크릴오일-히스티딘 메틸에스테르)공중합체는 문헌[Biotechnology Progress 20 (2004), 1169-1175]에 입증된 것처럼 자화적으로 안정화된 유체화된 베드 칼럼 위로 IgG 흡수에 사용하기 위한 자석 입자 위의 현탁액 중합으로 유사하게 제조하였다. 또한, 문헌[Colloids andzz Surfaces A 301 (2007), 490-497]에서, 고체 지지체로서 벤토나이트 상에 히스티딘을 포함하는 비-공유 조성물을 기재하고 있고, 유사한 방식으로 시험하였다.
문헌[Journal of Chromatography A 1016 (2003), 21-33]에 기재된 바와 같이 트립토파놀 및 2-아미노벤즈이미다졸을, 기타 잔기 사이에서, 각각이 독립적으로 세파로스에 커플링시켰다. 음성적으로 전하된 생체 분자에 대한 모델 시스템으로서 BSA의 회수 및 획기적인 성능을 측정하였고 상이한 흡착제와 비교하였다.
셀룰로스 비드에 커플링된 2-머캅토-5-벤즈이미다졸 설폰산이 문헌[Journal of Chromatography B 808 (2004), 25 - 33]에 기재되어 있다. 생쥐 복수액으로부터의 IgG1 단일클론 항체 및 사람 혈장 Cohn 분획 II + III으로부터의 IgG를 흡착제 상에 캡처하였다.
국제 특허 출원 WO 96/00735(Massey University)는 수지 및 여기에 결합된 단백질 또는 펩타이드 사이에 형성된 착물을 청구함으로써 고체 지지 물질에 공유 결합된 이온화가능한 리간드를 포함한다. 실험적 부분 및 전술된 흡착/탈착 메카니즘은 다음 특허(아래 참조)와 상당히 동일하다. 추가의 예로서, 발효액에서부터 활성화된 아미노카프로산 셀룰로스 위로 아미드 형성을 통해 부착된 1-(3-아미노프로필)이미다졸까지 서브틸리신 변이의 결합을 완충된 저 염 조건 및 고 염 조건 하에 모니터링하였다. 관련된 유럽 특허 EP 783366(Massey University)은 상대적으로 높은 밀도의 하나 이상의 이온화가능한 잔기, 임의적으로 스페이서 암을 통해 지지체에 부착되는 추가적 비-이온화가능한 잔기를 갖는 수지를 청구하고 있다. 분석물은 소수성의 낮은 정전기적 전하 조건 하에 수지에 흡착되며, pH의 높은 정전기적 전하에서 탈착된다. 1-(3-아미노프로필)이미다졸(임의적으로 아미노카프로산 스페이서에 부착됨), 2-(아미노메틸)벤즈이미다졸, 히스타민, 머캅토벤즈이미다졸, 2-머캅토-1-메틸이미다졸, 및 트립트아민 잔기는 이러한 예이다. 에피클로로히드린, 알릴 글리시딜 에테르, 알릴브로마이드, 또는 카보닐 디이미다졸과 이들의 활성화 이후에, 세파로스 또는 셀룰로스 지지체 중의 하나를 사용하였다. 상이한 흡착제 잔기의 산 적정 데이타를 제시하였다.
국제 특허 출원 WO 2006/066598(Versamatrix A/S)는 공유결합으로 고정된 잔기를 갖는 흡착제를 청구하고 있고, 여기서 각각의 상기 잔기는 서로가 주어진 범위의 거리에서 이격된 양이온 기 및 소수성 기 둘 다를 함유한다. 본 발명을 설명하기 위해서 다수의 짧은 펩타이드 또는 펩타이드 유사체를 합성 수지에 고정시킨 다음 단일클론 항체 분리에서 이의 적합성에 대해 시험하였다.
유럽 특허 EP 764048(Biosepra Inc.)은 티오에테르 브릿지를 통해 고체 지지 물질에 연결되는 치환된 5원 헤테로사이클릭 잔기를 임의로 함유하는 흡착제를 청구하고 있다. 이에 대한 예로 하이드로겔-충진된 기공을 갖는 2-아미노- 및 2-머캅토이미다졸 및 에폭시-활성화된 고체 지지체로부터 제조된 흡착제를 포함한다. 2-머캅토이미다졸 흡착제는 소 초유로부터 IgG의 정제에 성공적으로 사용되었다. 국제 특허 출원 WO 2004/024318(Ciphergen Biosystems Inc.)는 고체 지지 물질에 머캅토-, 에테르, 또는 아미노 그룹을 통해 연결되는 특정 음이온 치환체와 함께 모노- 또는 폴리사이클릭 헤테로방향족 잔기를 갖는 흡착제를 청구하고 있다. 하나의 예로서, 2-머캅토벤즈이미다졸 설폰산은 셀룰로스 비드, 다공성 지르코니아 비드 상, 및 실리카 상에서 덱스트란계 피복으로서 고정되었다. 항체를 소 혈청 및 우유로부터 분리하여서 개질된 셀룰로스 물질 상에 크로마토그래피하였다.
유럽 특허 EP 921855(Upfront Chromatography A/S)는 지지 물질 상에 벤즈이미다졸, 벤즈오티아졸, 및 벤즈옥사졸로부터 선택된 스페이서-결합된, 저분자량 잔기로 이루어진 흡착제 상에서 하나의 용액으로부터 IgG의 분리에 대한 방법을 청구하고 있다. 에피클로로하이드린-활성화된 아가로스 지지체 상에서 2-머캅토벤즈이미다졸을 알카린 안정성에 대해 시험한 다음, 인공 배양 상청액으로부터의 모노클론 항체 및 각종 동물 형철 및 노른자로부터의 폴리클로날 항체를 분리하는데 사용하였다. 2-머캅토-5-니트로벤즈이미다졸 잔기를 함유하는 흡착제가 또한 기재되었다.
트립토파놀, 2-아미노벤즈이미다졸, 또는 히스티딘 잔기를 나타내는 세라로스 흡착제는 고체 지지 물질에 짧은 링커를 통해 부착되고, 국제 특허 출원 WO 01/38227(Amersham Pharmacia Biotech AB)에 예시적으로 보고되어 있으며 4개의 모델 단백질에 대한 이들의 음이온 교환 특성이 측정되었다. 음이온-교환 및 소수성 특성을 동시에 갖는 잔기를 갖는 흡착제를 갖는 수성액으로부터 음으로 전하된 물질을 결합하는 방법이 청구되어 있으며, 여기서 각각의 잔기는 특이적, 스페이서-결합된 아릴암모늄 구조를 포함한다. 국제 특허 출원 WO 2005/082483(Amersham Biosciences AB)에서, 액체로부터 흡착제 위로 항체를 캡처하기 위한 방법이 청구되어 있으며, 여기서 상기 흡착제는 각각이 적어도 2개의 상이한 구조: 하나는 양이온 교환 기 및 하나는 C,S,O-(헤테로)방향족 환 시스템인 구조를 포함하는 잔기를 수반한다. 비-결합 조건 하에 2-아미노벤즈이미다조-세파로스 흡착제 상에서 크로마토그래피가, CHO 세포 배양으로부터 수득한 예비정제된 사람화된 IgG1에 대한 유체-관통 연마 단계로서 사용되었다. 국제 특허 출원 WO 2006/043895(GE Healthcare Bio-Sciences AB)에서, 액체로부터 항체를 분리하기 위한 방법은 2개의 상이한 그룹을 갖는 흡착제를 사용하여 청구되어 있는데, 제1 그룹은 분석물에서 음전하와 상호작용할 수 있고, 제2 그룹은 각각의 비-전하로 상호작용할 수 있다. 흡착제는 항체가 관통하는 동안 샘플의 불순도를 보유한다. 하나의 예로서, 활성화된 세파로스 지지체 상에서 2-아미노벤즈이미다졸 잔기를 함유하는 흡착제 상에 크로마토그래피하여 단백질 A 및 숙주 세포 단백질로부터 모노클로날 항체를 분리하였다.
US 6,071,416은 하나 이상의 N-사이클릭 방향족 탄화수소 리간드를 포함하는 조성물, 및 용액으로부터 특정 이온의 제거 또는 농도에서 이러한 조성물의 사용에 관한 것으로, 상기 조성물은 적절한 친수성 스페이서를 통해 고체 지지체에 결합된 적어도 2개, 및 바람직하게는 4개 또는 이상의 N-사이클릭 그룹을 함유한다.
WO 97/10887은 친화성 리간드, 이의 제조 및 고체, 반-고체, 미립자 또는 콜로이드성 물질, 또는 가용성 중합체로 이루어질 수 있는 매트릭스에 부착, 및 단백질성 물질의 정제에서 이의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 목적
본 발명의 하나의 목적은 단백질 및 펩타이드에 대한 신규한 정제 방법 및 상기 방법을 수행하기 위한 흡착제를 제공하는 것이다.
본 발명의 요약
본 발명은 고체 지지 물질을 포함하는 흡착제에 관한 것으로, 이의 표면은, 제1 잔기가 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵 헤테로방향족 구조를 포함하고, 제2 잔기가 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 단핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 적어도 2개의 상이한 잔기를 포함한다. 임의적으로, 이들 적어도 2개의 잔기는 상기 표면을 커버(cover)하는 가교결합된 중합체의 필름에 의해 수행된다. 이의 완전히 합성적인 기원으로 인해, 상기 흡착제는 심지어 양호하지 않은 샘플 매트릭스로부터 온화한 생리학적 조건 하에 생체분자의 특정 분리를 여전히 허용하면서도, 높은 물리적(특히 열적) 및 화학적 강성(rigidity)을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 이러한 흡착제의 제조를 위한 대안적인 방법이 제공되어 있다.
본 발명은 또한 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 혼합물로부터 단백질 또는 펩타이드의 농도 및/또는 순도를 분리시키거나, 또는 증가시키는 방법을 제공하고 있다. 상기 방법은 본 발명에 따른 흡착제를 상기 혼합물과 접촉시켜 목적하는 단백질 또는 펩타이드가 결합되는 방법, 상기 흡착제로부터 상기 단백질 또는 펩타이드의 이후 용출, 및 임의적으로 중간 세척 단계를 포함한다.
또한, 흡착제 및/또는 상기 방법이 유리하게 사용할 수 있는 다양한 분석적 및 제조적 생화학적 및 의학적 적용을 기재하고 있다. 본 발명에 따라 정제된 항체는 회수, 순도, 및 생물학적 활성의 퍼센트로 특징지어지며, 이는 통상적인 생친화성 분리 기술의 단점을 갖지 않고 이러한 기술을 통해 수득한 것과 견줄 만하다.
일반적인 측면에 따라, 본 발명에 따른 흡착제는 고체 지지 물질을 포함하고, 이의 표면은 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기, 및 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 단핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 이핵 헤테로방향족 구조는 모든 가능한 아자-벤조피롤, 옥사-벤조피롤, 및 티아-벤조피롤 구조를 포함하는 벤조피롤(인돌) 구조, 또는 모든 가능한 아자-벤조피리딘, 옥사-벤조피리딘, 및 티아-벤조피리딘 구조를 포함하는 벤조피리딘(퀴놀린 또는 이소퀴놀린) 구조이다.
하나의 양태에서, 단핵 헤테로방향족 구조는 5원 헤테로방향족 코어를 포함한다.
하나의 양태에서, 단핵 헤테로방향족 구조는 모든 가능한 아자-피롤, 옥사-피롤, 및 티아-피롤 구조를 포함하는 피롤 구조, 예를 들면, 3-아자피롤 (이미다졸)이다.
하나의 양태에서, 단핵 헤테로방향족 구조는 6원 헤테로방향족 코어를 포함하지 않는다.
하나의 양태에서, 단핵 헤테로방향족 구조는 6원 헤테로방향족 코어가 트리아진 환 또는 피리미딘 환이 아닌 경우 6원 헤테로방향족 코어를 포함한다.
하나의 양태에서, 제1 및/또는 제2 잔기는 링커를 포함한다.
하나의 양태에서, 제1 및/또는 제2 잔기는 1 내지 20개의 원자의 길이의 공유결합된, 구조적으로 유연한 링커를 포함한다.
하나의 양태에서, 공유결합된, 구조적으로 유연한 링커는 황을 함유하지 않는다.
하나의 양태에서, 링커는 서로 독립적으로 1개 내지 300개의 탄소 원자, 예를 들면, 20개 내지 300개의 탄소 원자를 포함한다. 상기 양태에서, 상기 링커는 폴리에틸렌 글리콜 잔기로 이루어지거나 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 링커는 특히 트리아진 또는 피리미딘 환이 아닌 추가의 헤테로방향족 구조를 포함하지 않는다.
하나의 양태에서, 추가의 치환체는 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵 및/또는 단핵 헤테로방향족 구조에 각각 결합된다.
하나의 양태에서, 상기 추가의 치환체는 양이온 교환(음으로 전하된) 그룹을 포함하지 않으며, 상기 이핵 및/또는 단핵 헤테로방향족 구조는 양이온-교환(음으로 전하된) 그룹을 포함하지 않는다.
하나의 양태에서, 상기 추가의 치환체는 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 또는 포스포네이트 그룹을 포함하는 양이온-교환 그룹을 포함하지 않거나; 또는 상기 이핵 및/또는 단핵 헤테로방향족 구조는 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 또는 포스포네이트 그룹을 포함하는 양이온-교환 그룹을 포함하지 않는다.
다른 양태에서, 상기 추가의 치환체는 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 또는 포스포네이트 그룹으로부터 선택된 양이온-교환 그룹을 포함하지 않거나; 또는 상기 이핵 및/또는 단핵 헤테로방향족 구조는 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 또는 포스포네이트 그룹으로부터 선택된 양이온-교환 그룹을 포함하지 않는다.
하나의 양태에서, 상기 제1 및 제2 잔기는 3:2 내지 2:3, 바람직하게는 약 1:1의 몰 비로 존재한다.
하나의 양태에서, 제1 잔기는 제2 잔기를 포함한다.
하나의 양태에서, 고체 지지 물질의 표면은 제3 잔기 및 임의로 또한 제4 잔기를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 제3 잔기는 아민 또는 아미드 구조, 바람직하게는 1차 아민 구조를 포함한다.
하나의 양태에서, 제1, 제2, 및 제3 잔기는 약 1:1:2의 몰 비로 존재한다.
하나의 양태에서, 잔기의 총 밀도는 0.1 mol dm-3 내지 1.0 mol dm-3, 바람직하게는 적어도 약 0.3 mol dm-3의 양으로 존재한다.
하나의 양태에서, 각 유형의 잔기는 고체 지지 물질의 표면 상에 균질적으로 및 임의로/ 통계적으로 분포된다.
하나의 양태에서, 고체 지지 물질은 표면이 제1 및 제2 잔기, 및 임의로 제3 및 제4 잔기를 수반하는 기능기를 갖는 중합체의 필름으로 커버하는 담체로 이루어진다.
하나의 양태에서, 중합체는 서로 공유적으로 가교결합되지만, 담체의 표면에 공유로 접목(grafting)되거나 결합되지 않는 개별 쇄로 이루어진다.
하나의 양태에서, 중합체는 가교결합이 가능한 기능기의 수를 기준으로 2% 내지 20%의 양으로 서로 공유 가교결합된다.
하나의 양태에서, 중합체는 담체의 표면으로 공유적으로 접목(grafting)되지만, 서로 공유적으로 가교결합 되지않는 각각의 쇄로 이루어진다.
하나의 양태에서, 중합체는 이의 말단 기능기를 통해 담체의 표면에 공유적으로 접목(grafting)된다.
하나의 양태에서, 중합체의 필름은 흡착제의 총량의 5% 내지 30%, 바람직하게는 15% 내지 20%로 존재한다.
하나의 양태에서, 중합체는 수성 또는 혼합된 수성 유기 매질 중에 팽창가능해진다.
하나의 양태에서, 중합체는 합성 고분자 전해질이다.
하나의 양태에서, 중합체의 가교결합 또는 접목(grafting) 연결 및/또는 잔기의 연쇄는 아미드, 우레탄, 요소, 또는 2차/3차 아민 결합으로 제조된다.
하나의 양태에서, 중합체는 폴리비닐 알콜, 폴리비닐아민, 폴리알릴아민, 폴리에틸렌 이민, 폴리아크릴산, 및 폴리메트아크릴산, 또는 적어도 하나의 이들 중합체를 포함하는 임의의 공중합체 또는 중합체 혼합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 부분 유도된 중합체이다.
하나의 양태에서, 중합체는 폴리비닐 아민이다.
하나의 양태에서, 고체 지지 물질 또는 적어도 하나의 담체는 10nm 내지 400nm의 기공 크기, 또는 1 m2g-1 내지 1,000 m2g-1의 표면적, 또는 30% 내지 80% 용적의 다공성을 갖는 다공성 물질이다.
하나의 양태에서, 고체 지지 물질은 5㎛ 내지 500㎛의 입자 크기를 갖는 미립자 물질이다.
하나의 양태에서, 고체 지지 물질은 시트-형 또는 섬유-형 물질, 예를 들면 막이다.
하나의 양태에서, 담체를 제조하는 물질은 중합체의 막을 제조하는 물질과 상이하다.
하나의 양태에서, 고체 지지 물질 또는 적어도 하나의 담체는 일반 또는 표면-개질된 폴리스티렌, 폴리스티렌 설폰산, 폴리아크릴레이트, 폴리메트아크릴레이트, 폴리비닐알콜, 실리카, 글라스, 전분, 셀룰로스, 아가로스, 세파로스, 및 덱스트란, 또는 이의 조성물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 물질로 제조된다.
하나의 양태에서, 흡착제는 임의의 흡착, 임의의 발광, 방사선, 자석 또는 질량- 또는 무선주파수-인코딩 태그와 같은 쉽게 검출가능한 태그를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한
(i) 기능기를 갖는 중합체를 제공함;
(ii) 상기 중합체의 필름을 담체의 표면 위로 흡착시킴;
(iii) 흡착된 중합체의 상기 기능기의 한정된 부분을 적어도 하나의 가교시약으로 가교결합시킴; 및
(iv) 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기, 및 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 단핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기, 및 임의로 추가의 잔기를 갖는 가교결합된 중합체의 상기 기능기의 추가의 한정된 부분을 유도함을 포함하여 흡착제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한
(i) 기능기를 갖는 중합체를 제공함;
(ii) 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기, 및 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 단핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기, 및 임의로 추가의 잔기를 갖는 상기 기능기의 한정된 부분을 유도함;
(iii) 유도화된 중합체의 필름을 담체의 표면 위로 흡착시킴; 및
(iv) 흡착된 중합체의 상기 기능기의 추가의 한정된 부분을 적어도 하나의 가교결합 시약으로 가교결합시킴을 포함하여 흡착제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한
(i) 기능기를 갖는 중합체를 제공함;
(ii) 상기 중합체의 막을 담체의 표면 위로 흡착시킴;
(iii) 흡착된 중합체의 상기 기능기의 한정된 부분을 상기 담체로 접목(grafting)함; 및
(iv) 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기, 및 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 단핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기, 및 임의로 추가의 잔기를 갖는 접목(grafting)된 중합체의 상기 기능기의 추가의 한정된 부분을 유도함을 포함하여 흡착제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
(i) 기능기를 갖는 중합체를 제공함;
(ii) 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기, 및 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 단핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기, 및 임의로 추가의 잔기를 갖는 상기 기능기의 한정된 부분을 유도함;
(iii) 유도된 중합체의 필름을 담체의 표면 위로 흡착시킴; 및
(iv) 흡착된 중합체의 상기 기능기의 추가 한정된 부분을 상기 담체로 접목(grafting)시킴을 포함하여 흡착제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
흡착제를 제조하는 방법들 중의 하나의 양태에서, 중합체는 수성 또는 혼합된 수성-유기 매질에 가용적이다.
하나의 양태에서, 중합체의 기능기는 -NH-, -NH2, -OH, -COOH 또는 -COO- 기이다.
하나의 양태에서, 상기 중합체는 5,000 달톤 내지 50,000 달톤의 분자량을 갖는다.
하나의 양태에서, 적어도 하나의 가교결합 시약은 디카복실산, 디아민, 디올, 및 비스-에폭시드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 적어도 하나의 가교결합 시약은 1 내지 20개의 원자 사이의 길이의 선형, 구조적으로 유연한 분자이다.
하나의 양태에서, 유도 단계는 상기 기능기과 상기 잔기 사이에 아미드 결합의 형성으로 수행된다.
하나의 양태에서, 유도 단계는 각각의 잔기로 점차적으로 수행된다.
본 발명은 또한
(i) 단백질 또는 펩타이드를 흡착제에 결합할 수 있는데 충분한 시간 동안, 제1 용액 중에 용해되거나 현탁되는 상기 혼합물을, 본 발명에 따른 흡착제 또는 본 발명의 방법에 따라 제조된 흡착제와 접촉시킴;
(ii) 상기 흡착제를 제2 용액으로 임의로 세척시킴;
(iii) 단백질 또는 펩타이드를 상기 흡착제로부터 방출시키는데 충분한 시간 동안, 상기 결합된 단백질 또는 펩타이드를 갖는 상기 흡착제를, 제3 용액과 접촉시킴;
(iv) 상기 흡착제를 제4 및/또는 제5 용액과 임의로 세척 및/또는 재생성시킴을 포함하여, 상기 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 혼합물로부터 단백질 또는 펩타이드의 농도 및/또는 순도를 분리시키거나, 증가시키는 방법에 관한 것이다.
단백질 또는 펩타이드, 제1 용액, 제2 용액, 및 제3 용액의 농도 및/또는 순도를 분리, 또는 증가시키는 방법의 하나의 양태는 추가의 유기 개질제를 함유하지 않는 완충된 수성 매질을 포함한다.
하나의 양태에서, 제2 용액은 제1 용액과 동일하다.
하나의 양태에서, 제1 및 임의로 제2 용액의 pH는 표적 단백질 또는 펩타이드의 등전점 pI와 근접하다.
하나의 양태에서, 제3 용액의 pH는 상이하고, 특히, 제1 및 임의로 제2 용액의 pH 보다 낮다.
하나의 양태에서, 제1 용액의 pH는 5.5 내지 8.5의 범위이고, 제3 용액의 pH는 3 내지 6.5의 범위에 있다.
하나의 양태에서, 제3 액체의 이온성 강도는 상이하고, 특히 제1 및 임의로 제2 용액의 이온성 강도보다 크다.
하나의 양태에서, 상기 방법은 막-여과 기술, 고체 상 추출 기술 또는 중압 내지 고압 액체 크로마토그래피 기술로서 수행된다.
하나의 양태에서, 상기 방법은 단계 (iii) 이후 제3 액체로부터 방출된 단백질 또는 펩타이드의 분리를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 단계 (iii)의 방출된 단백질 또는 펩타이드는 이로부터 여과된 흡착제 또는 기타 여과가능한 물질을 10ppm 미만 함유한다.
하나의 양태에서, 상기 방법은 침전, 원심분리, 건조, (마이크로-/울트라-) 여과, 투석, 이온 교환, 또는 바이러스 리덕션 치료와 같은 추가의 분리 과정과 혼합된다.
하나의 양태에서, 상기 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 상기 혼합물은 미생물 또는 세포 배양, 또는 순 추출물로부터 수득한 미정제 또는 부분 정제된 생합성 제품이다.
하나의 양태에서, 상기 단백질 또는 펩타이드는 5.5 내지 8.5의 등전점 pI 및 100 내지 500,000 Da의 분자량을 갖는다.
하나의 양태에서, 상기 단백질 또는 펩타이드는 항체, 이의 단편, 이의 올리고머성 관련 물질, 또는 항체- 또는 항체 단편-함유 융합 단백질이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 흡착제, 또는 관형 구조 내에 고정상으로서 본 발명에 따른 방법에 따라 제조된 흡착제, 및 임의로 프릿(frit), 필터 플레이트, 유동 분배기, 씰(seal), 피팅(fitting), 나사결합, 밸브, 또는 기타 유체 핸들링 또는 연결 요소와 같은 추가의 성분을 포함하는 액체 크로마토그래피 또는 고체 상 추출용 칼럼에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 상기 방법은 추가로 20 바까지 적용된 압력, 110℃까지 적용된 열, 및 일반적인 위생 프로토콜에 대한 물리적이고 화학적인 저항을 특징으로 함에 따라 1,000배까지, 바람직하게는 5,000배까지 반복적으로 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 다수의 동일하거나 상이한 흡착제 또는 본 발명에 따른 방법에 따라 제조된 흡착제 또는 병렬로 처리될 수 있는 마이크로플레이트 또는 마이크로칩 어레이, 또는 다중-모세관 또는 미세유체 장치의 형식으로 본 발명에 따른 칼럼의 집합에 관한 것이다.
본 발명은 또한 동일한 포장 단위 내에, 본 발명에 따른 흡착제 또는 본 발명에 따른 방법에 따라 제조된 흡착제 또는 본 발명에 따른 칼럼 또는 본 발명에 따른 흡착제 또는 칼럼의 집합, 및 추가로 화학적 또는 생물학적 시약 및/또는 본 발명에 따른 방법을 수행하는데 필요한 일회용품 또는 이로부터 상이한 분석, 진단, 또는 실험적 방법을 포함하는 진단적 또는 실험적 정제 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 진단적, 치료학적, 또는 영양학적 가치의 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드를 포함하여 약제학적 또는 영양학적 조성물을 제조에 있어서 본 발명에 따른 흡착제 또는 본 발명에 따른 방법에 따라 제조된 흡착제의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드의 존재로 야기된 질환의 의학적 예방 또는 치료, 및 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드의 제거에 있어서 본 발명에 따른 흡착제 또는 본 발명에 따른 방법에 따라 제조된 흡착제의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드의 검증, 특성화, 정량화 또는 실험적 정제에 있어서 본 발명에 따른 흡착제 또는 본 발명에 따른 방법에 따라 제조된 흡착제의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드의 가역성 고정 및 임의로 단백질 또는 펩타이드에 추가의 화학적 또는 생물학적 구조를 결합하기 위해 시험하기 위한, 본 발명에 따른 흡착제 또는 본 발명에 따른 방법에 따라 제조된 흡착제의 사용에 관한 것이다.
제1 측면에 따라, 본 발명은 고체 지지 물질을 포함하는 흡착제에 관한 것으로, 이의 표면은
- 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기; 및
- 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 단핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기;를 포함하고, 상기 제1 및 제2 잔기는 서로 직접적으로 연결되지 않지만 자체로서 벌크 고체 지지 물질 또는 담체로서 이에 지지된 중합체 필름에 별개로 부착되는 것을 특징으로 한다.
하나의 양태에서, 이핵 헤테로방향족 구조는 모든 가능한 아자-벤조피롤, 옥사-벤조피롤, 및 티아-벤조피롤 구조를 포함하는 벤조피롤(인돌) 구조, 또는 모든 가능한 아자-벤조피리딘, 옥사-벤조피리딘,, 및 티아-벤조피리딘 구조를 포함하는 벤조피리딘(퀴놀린 또는 이소퀴놀린) 구조이다.
하나의 양태에서, 단핵 헤테로방향족 구조는 모든 가능한 아자-피롤, 옥사-피롤, 및 티아-피롤 구조를 포함하는 피롤 구조, 예를 들면, 3-아자피롤(이미다졸)이다.
하나의 양태에서, 제1 및/또는 제2 잔기는 1 내지 20개의 원자의 길이의 공유, 구조적으로 유연한 링커를 포함한다.
하나의 양태에서, 고체 지지 물질의 표면은 추가로 제3 잔기 및 임의로 제4 잔기를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 제3 잔기는 아민 또는 아미드 구조 또는 1차 아민 구조를 포함한다.
하나의 양태에서, 제1, 제2, 및 제3 잔기는 약 1:1:2의 몰 비로 존재한다.
하나의 양태에서, 고체 지지 물질의 표면은 서로 동일하거나 상이할 수 있고, 순서대로 상기 제1 및 제2, 임의로 제3 및 제4 잔기를 수반하는 제1 기능기 및 제2 기능기를 포함하는 중합체의 필름으로 커버되어 있다.
하나의 양태에서, 중합체는 서로 공유적으로 가교결합되지만 담체의 표면에 공유 결합되거나 접목(grafting)되지 않은 개별 쇄를 포함하거나 이루어진다.
하나의 양태에서, 중합체는 폴리아민, 또는 폴리비닐 아민, 또는 폴리아민을 포함하는 공중합체 또는 중합체 혼합물이다.
하나의 양태에서, 흡착된 중합체의 상기 기능기의 제1 부분은 적어도 하나의 가교결합 시약과 가교결합되고, 여기서 가교결합된 중합체의 상기 기능기의 제2 부분은 상기 제1 및 제2, 및 임의로 추가의 잔기에 결합된다.
본 발명은 또한
(i) 제1 및 제2 기능기를 갖는 중합체를 제공함;
(ii) 상기 중합체의 막을 담체의 표면 위로 부착함;
(iii) 상기 흡착된 중합체의 상기 기능기의 제1 부분과 적어도 하나의 가교결합 시약을 가교결합시킴;
(iv) 가교결합된 중합체의 상기 기능기의 제2 부분과 상기 제1, 제2, 및 임의의 추가의 잔기와 결합시킴을 포함하여, 본 발명의 제1 측면에 따른 흡착제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한
(i) 단백질 또는 펩타이드를 상기 흡착제에 결합하는데 충분한 시간 동안, 제1 용액에 용해되거나 현탁되는 상기 혼합물을, 본 발명의 제1 측면에 따른 흡착제와 접촉시킴;
(ii) 임의로 상기 흡착제를 제2 용액과 세척함;
(iii) 단백질 또는 펩타이드를 상기 흡착제로부터 방출시키는데 충분한 시간 동안, 상기 결합된 단백질 또는 펩타이드를 갖는 상기 흡착제를, 제3 용액과 접촉시킴;
(iv) 상기 흡착제를 제4 및/또는 제5 용액과 임의로 세척 및/또는 재생성시킴을 포함하여, 상기 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 혼합물로부터 단백질 또는 펩타이드의 농도 및/또는 순도를 분리시키거나, 증가시키는 방법에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 제1 및 임의로 제2 액체의 pH는 표적 단백질 또는 펩타이드의 등전점 pI에 근접하다.
하나의 양태에서, 제1 액체의 pH는 5.5 내지 8.5의 범위이고, 제3 액체의 pH는 3 내지 6.5의 범위이다.
하나의 양태에서, 상기 단백질 또는 펩타이드는 5.5 내지 8.5의 등전점 pI 및 100 내지 500,000 Da의 분자량을 갖는다.
제2 측면에 따라, 본 발명은 고체 지지 물질을 포함하는 흡착제에 관한 것으로, 이의 표면은
- 동일하거나 상이할 수 있는 제1 및 제2 기능기;
- 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기; 및
- 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 단핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기를 포함하고, 상기 제1 잔기는 제1 기능기과 결합하고, 제2 잔기는 제2 기능기과 결합하는 것을 특징으로 한다.
제3 측면에 따라, 본 발명은 고체 지지 물질을 포함하는 흡착제에 관한 것으로, 이의 표면은
- 동일하거나 상이할 수 있는 제1 및 제2 기능기;
- 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기; 및
- 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 단핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기를 포함하고, 상기 제1 잔기는 제1 기능기과 결합하고, 제2 잔기는 제2 기능기과 결합하며, 여기서 상기 기능기는 상기 제1 잔기 및 상기 제2 잔기 둘 다에 결합되지 않는 것을 특징으로 한다.
제4 측면에 따라, 본 발명은 고체 지지 물질을 포함하는 흡착제에 관한 것으로, 이의 표면은
- 동일하거나 상이할 수 있는 제1 및 제2 기능기;
- 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기; 및
- 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 단핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기를 포함하고, 상기 제1 잔기는 제1 기능기에 결합되고, 제2 잔기는 제2 기능기에 결합되며; 단, 고체 지지 물질은 트리아진 모이어티 또는 피리미딘 모이어티를 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
제5 측면에 따라, 본 발명은 고체 지지 물질을 포함하는 흡착제에 관한 것으로, 이의 표면은
- 동일하거나 상이할 수 있는 제1 및 제2 기능기;
- 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기; 및
- 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 단핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기를 포함하고, 단, 고체 지지 물질은 트리아진 모이어티 또는 피리미딘 모이어티를 포함하지 않고; 여기서 상기 기능기는 상기 제1 잔기 및 제2 잔기 둘 다에 결합되지 않는다.
제2, 제3, 제4 또는 제5 측면에 따른 하나의 측면에서, 이핵 헤테로방향족 구조는 모든 가능한 아자-벤조피롤, 옥사-벤조피롤, 및 티아-벤조피롤 구조를 포함하는 벤조피롤(인돌) 구조, 또는 모든 가능한 아자-벤조피리딘, 옥사-벤조피리딘, 및 티아-벤조피리딘 구조를 포함하는 벤조피리딘(퀴놀린 또는 이소퀴놀린) 구조이다.
하나의 측면에서, 단핵 헤테로방향족 구조는 모든 가능한 아자-피롤, 옥사-피롤, 및 티아-피롤 구조를 포함하는 피롤 구조, 예를 들면, 3-아자피롤(이미다졸)이다.
하나의 측면에서, 제1 잔기 또는 제2 잔기 또는 제1 및 제2 잔기는 링커를 통해 상기 제1 및 제2 기능기에 결합된다.
하나의 측면에서, 상기 제1 및 제2 기능기의 5 내지 95%, 또는 15 내지 85%, 또는 25 내지 75%, 또는 35 내지 65%, 또는 40 내지 60%는 상기 제1 및 제2 잔기에 결합되고, 여기서 상기 제1 및 제2 잔기는 3:2 내지 2:3의 몰 비로 존재한다.
하나의 측면에서, 고체 지지 물질의 표면은 추가로 제3 잔기 및 임의로 제4 잔기를 포함한다.
하나의 측면에서, 제3 잔기는 아민 또는 아미드 구조, 또는 1차 아민 구조를 포함한다.
하나의 측면에서, 제1, 제2, 및 제3 잔기는 약 1:1:2의 몰 비로 존재한다.
하나의 양태에서, 고체 지지 물질의 표면은 순서대로 상기 제1 및 제2, 임의로 제3 및 제4 잔기를 수반하는 제1 기능기 및 제2 기능기를 포함하는 중합체의 필름으로 커버되어 있다.
하나의 양태에서, 중합체는 서로 공유적으로 가교결합되지만 담체의 표면에 공유적으로 접목(grafting)되지 않은 개별 쇄를 포함하거나 이루어진다.
하나의 양태에서, 중합체는 부분적으로 유도된 폴리아민, 또는 폴리비닐 아민, 또는 폴리아민을 포함하는 공중합체 또는 중합체 혼합물이다.
하나의 양태에서, 상기 제1 및 제2 기능기의 제1 부분은 적어도 하나의 가교결합 시약과 가교결합되고, 여기서 상기 제1 및 제2 기능기의 제2 부분은 상기 제1 및 제2, 및 임의로 추가의 잔기에 결합된다.
하나의 양태에서, 본 발명은
(i) 제1 및 제2 기능기를 갖는 중합체를 제공함;
(ii) 상기 중합체의 필름을 고체 지지 물질의 표면 위로 흡착시킴;
(iii) 상기 흡착된 중합체의 상기 기능기의 제1 부분을 적어도 하나의 가교결합 시약과 가교결합시킴;
(iv) 가교결합된 중합체의 상기 기능기의 제2 부분을 상기 제1, 제2, 및 임의의 추가의 잔기와 결합시킴을 포함하여, 제2, 제3, 제4 또는 제5 측면에 따른 흡착제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명은
(i) 단백질 또는 펩타이드를 상기 흡착제에 결합하는데 충분한 시간 동안, 제1 용액에 용해되거나 현탁되는 상기 혼합물을 본 발명의 제2, 제3, 제4, 또는 제5 측면에 따른 흡착제와 접촉시킴;
(ii) 임의로 상기 흡착제를 제2 용액과 세척함;
(iii) 단백질 또는 펩타이드를 상기 흡착제로부터 방출시키는데 충분한 시간 동안, 상기 결합된 단백질 또는 펩타이드를 갖는 상기 흡착제를, 제3 용액과 접촉시킴;
(iv) 상기 흡착제를 제4 및/또는 제5 용액과 임의로 세척 및/또는 재생성시킴을 포함하여, 상기 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 혼합물로부터 단백질 또는 펩타이드의 농도 및/또는 순도를 분리시키거나, 증가시키는 방법에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 제1 및 임의로 제2 액체의 pH는 표적 단백질 또는 펩타이드의 등전점 pI에 근접하다.
하나의 양태에서, 제1 액체의 pH는 5.5 내지 8.5의 범위이고, 제3 액체의 pH는 3 내지 6.5의 범위이다.
하나의 양태에서, 상기 단백질 또는 펩타이드는 5.5 내지 8.5의 등전점 pI 및 100 내지 500,000 Da의 분자량을 갖는다.
이러한 기재를 목적으로, 본 발명의 일반적인 측면에 따라 흡착제에 대해 나열된 것처럼 모든 양태들은 본 발명의 제1, 제2, 제3, 제4, 및 제5 측면에 따른 흡착제 혼합될 수 있다.
도 1은 하나의 제1 잔기 및 하나의 제2 잔기를 갖는 2개의 인접한 표면 기능기(FG)의 유도로 야기되는 상이한 각각의 구성 A 내지 H 및 하나의 일반적인 대표도 I를 나타낸다.
도 2는 중합체(여기서, 회색 구로서 나타낸 비-다공성, 미립자 담체로 예시됨; 일정한 크기로 도시되지는 않았음)의 필름으로 커버되는 표면을 갖는 담체로 이루어진 고체 지지 물질의 상이한 개략적인 구조 A 내지 C를 나타낸다.
도 3은 융합된 5원 및 6원 환 및 1 또는 2개의 헤테로원자로 이루어진 이핵 C, N, O, S-헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기의 가능한 선별을 나타낸다.
도 4는 5원 및 6원 환 및 1 또는 2개의 헤테로원자로 이루어진 단핵 C, N, O, S-헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기의 가능한 선별을 나타낸다.
도 5는 5원 및 6원 환으로 이루어진 예시적 제1 및 제2 잔기의 일반적인 대표도를 나타내고, 여기서, R1 내지 R8은 전자쌍, H, 유기 라디칼 또는 표면 결합이고; X1 내지 X6은 C 또는 N이며; Y1 내지 Y2는 N, O, S이다.
도 6은 흡착제의 분석물-상호작용하는 표면을 특징으로 하는데 사용된 용어의 상징적인 대표도(일정한 크기로 도시되지는 않았음)를 나타내는 것으로, 나타낸 모든 용어는 본 발명을 수행하는데 필요하다.
도 7은 조사에 사용된 제1 및 제2 잔기의 구조(표면 중합체 필름으로 제공된 기능기는 볼드체로 인쇄된다)를 나타낸다.
도 8은 실시예 4의 부하 성능을 측정하기 위한 흡착제 번호 ND 10003으로부터 면역글로불린 G의 단계적 pH-용출을 나타낸다.
도 9는 실시예 5의 흡착제 번호 ND 08037 상에서 카탈라아제 및 개별적 성분을 함유하는 단백질 시험 혼합물의 분석적 크로마토그램을 나타낸다.
도 10은 실시예 5의 흡착제 번호 ND 070002 상에서 카탈라아제 및 개별적 성분을 함유하는 단백질 시험 혼합물의 분석적 크로마토그램을 나타낸다.
도 11은 실시예 5의 흡착제 번호 ND 06380 상에서 카탈라아제 및 개별적 성분을 함유하는 단백질 시험 혼합물의 분석적 크로마토그램을 나타낸다.
도 12는 실시예 6의 흡착제 번호 ND 08236 상에서 고염 농도의 영향 하에 콘알부민 및 개별적 성분을 함유하는 단백질 시험 혼합물의 분석적 크로마토그램을 나타낸다.
도 13은 실시예 6의 흡착제 번호 ND 07200 상에서 고염 농도의 영향 하에 콘알부민 및 개별적 성분을 함유하는 단백질 시험 혼합물의 분석적 크로마토그램을 나타낸다.
도 14는 실시예 6의 흡착제 번호 ND 07122 상에서 고염 농도의 영향 하에 콘알부민 및 개별적 성분을 함유하는 단백질 시험 혼합물의 분석적 크로마토그램을 나타낸다.
도 15는 실시예 6의 흡착제 번호 ND 06386 상에서 고염 농도의 영향 하에 콘알부민 및 개별적 성분을 함유하는 단백질 시험 혼합물 분석적 크로마토그램을 나타낸다.
도 16은 실시예 7에 따른 흡착제 번호 ND 07200 (a) 및 PRC 10014 (b) 상에서 추가의 단백질의 혼합물로부터 콘알부민을 반-제조 분리하는 UV-크로마토그램을 나타낸다.(점선은 수집된 분획의 적용된 pH 구배; 섹션 I-VII; 시간의 코스를 상징화한다).
본 발명이 직면한 기술적 문제는 앞서 기술한 단락에 요약된 바와 같이 이전 공지된 방법의 단점이 없는 단백질 및 펩타이드에 대한 신규한 정제 방법을 제공하여 해결될 수 있다. 이는 상기 방법이 이의 작용적 통합성을 초래하지 않고 샘플 매트릭스로부터 높은 회수로 단일 단계 중에 표적된 단백질 또는 펩타이드를 분리하는 동시에, 고가의 물질을 피하면서도 여전히 사용되는 장치의 위생 프로토콜 및 정규 세척에 부착할 수 있는데 충분히 자유자재일 수 있으며, 이에 따라 각각의 규제 기관에 의해 상기 방법이 허용됨이 확실하고, 즉, 경제학적으로 실현가능한 방식으로 약제학적 품질로 표적 단백질 또는 펩타이드를 제공하는 것을 의미한다.
현재 이러한 기술적 문제는 정제하고자 하는 단백질 또는 펩타이드의 고체-액체 평형 분포 과정에 사용되는 신규한 형태의 흡착제를 제공함으로써 해결할 수 있으며, 이는 주로 잔기를 갖는, 특정 2배 화학적 유도에 의해 당업자로부터 구별될 수 있고, 상기 유도는 부 생성물, 특히 각종 기타 단백질 또는 펩타이드로부터 표적 단백질 또는 펩타이드를 분리하는 문제에 적합하고, 통상적인 친화성 매질의 선택성 및 민감성에 부합하지만 엄격한 조건하에 제조에 고가일 수 있고/있거나 저하될 수 있는 손상되기 쉬운 생물학적 물질이 전혀 없는 조성물을 갖는다. 흡착제의 생산에 사용된 모든 물질의 높은 내구성은 또한 흡착제를 사용하는 임의의 분리 방법의 장기간 재생산성을 보증하고, 분석 결과에서 일반적 영향의 부재로 명백해질 수 있다.
상기 주어진 기술적 문제의 해결을 돕는 보조는 적어도 2개의 상이한 물질을 포함하는 흡착제의 조립된 층으로, 하나의 물질은 2개의 잔기를 수반하는 합성적 또는 생합성적 중합체 필름이고, 제2 물질이 고체 염기로서 역할을 한다.
이러한 특정 조립은 한편으로는 중합체 필름의 상당한 고분자량 함량 및 고 물리적 안정성을 가지지만, 여전히 높은 정도의 쇄 유연성을 가져서 고 용매 및 샘플 흡수 능력 및 이의 빠른 확산적 교환을 생성하는 것을 특징으로 한다. 이에 따라 상기 필름은 균질하고, 생물학적으로 적합하며, 연성의 겔-형 상태로 유지된다. 이는 분석물 단백질 또는 펩타이드를, 부분적 또는 완전한 분자적 용적과 함께 결합해야하는 흡착제의 활성 요소들을 함유하는 층 내로 침지시키고, 층을 통해 또는 층의 표면을 따라 이동시키는 동시에 이의 변성을 방지하도록 한다. 따라서, 분석물에 대해 준-3-차원 상호작용 공간의 생성을 보증하고, 전체 단백질 또는 펩타이드 표면에 걸쳐 분포된 에피토프와 잔기-개질된 겔 상 사이에 멀티-포인트 접촉을 허용한다. 이에 따라 샘플 성분은 또한 중합체 필름에 의해 고체 지지 물질의 근본적 구성 성분과의 원하지 않은 상호작용으로부터 효율적으로 보호된다.
본 발명의 전체 범위를 평가하고 보다 명확하게 하는 의도를 가지고, 이후 본 발명의 내용 이내에 사용된 다수의 용어의 의미는 이후 단락에서 먼저 정의된다. 모든 예는 단지 예시적인 목적으로 주어지며 양태의 배제 목록을 의미하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 전체 취지에 벗어나지 않고 본 발명을 수행하는 추가적 유사한 방식으로 분명히 인식할 것이다. 도 6의 개략적인 대표도는 흡착 조성물과 관련된 본원에 사용된 다수의 상이한 용어들 사이의 상호관계를 상징한다.
용어 "흡착제"는 샘플의 고체 액체 평형 분포 과정에서 고정 상으로서 사용하기 위한 임의의 합성 또는 생합성 물질을 의미하는 것으로, 샘플에 함유된 적어도 하나의 주어진 표적 단백질 또는 펩타이드에 대한 수용체로서 선택적 비-공유 결합 특성을 나타내거나, 또는 상기 샘플(즉, 높은 절대 결합 상수 또는 높은 결합 상수 차)에 함유된 상이한 조성의 적어도 2개의 주어진 표적 펩타이드 또는 단백질 사이에서 비-공유 결합 특성으로 구별할 수 있다. 따라서, 주어진 분석 또는 제조 검출, 분리, 고정, 또는 (생)화학적 전환 작업을 해결하는 것으로 특별히 고안되는 것으로 종종 적어도 하나의 표적 단백질 또는 펩타이드의 고유 조합으로 이루어지고, 이의 구성은 공지된, 부분적으로 공지된, 또는 비공지된 샘플 매트릭스 일 수 있으며, 이의 조성은 공지된, 부분적으로 공지된, 또는 비공지된 것과 유사할 수 있다.
일반적인 상(전체 분석 분자에 대해 기본적으로 평균인 누적 매개 변수, 예를 들면, 정전기적 전하, 쌍극자 모멘트 또는 친유성에 따라 분석물을 차별화시킴)에 반대하여, 이러한 흡착제는 그룹 상보성의 개념에 의해 적어도 하나의 표적 단백질 또는 펩타이드의 3-차원 분자 표면 위에 적어도 하나의 도메인(에피토프)에 적어도 부분적으로 결합한다. 따라서 이러한 신규한 개념은 또한 전형적인 의미에서 2개의 전형적인 평균 효과의 조합에 따라 분리하는 혼합형-모드 흡착제라고 부르는 개념을 넘어 도달한다. 따라서 본 발명의 흡착제는 분자 수준에서 고안되어, 상이한 부생성물의 큰 스펙트럼을 함유할 수 있는 환경에서 벗어나 높은 친화성 및 높은 개별적 또는 그룹적 선택성과 함께 단순한 단일 단백질 또는 펩타이드 또는 구조적으로 근접하게 관련된 단백질 또는 펩타이드의 그룹에 결합한다.
"고체 지지 물질"로서 당업자에게 공지된 모든 비-다공성 또는 바람직하게는 다공성, 흡착성 매질로, 예를 들면, 실리카, 알루미나, 마그네시아, 티타니아, 지르코니아, 플로리실, 자철광, 제올라이트, 실리케이트(셀라이트, 규조토), 운모, 수산화인회석, 플루오로아파타이트, 금속-유기 구조물, 조절 기공 글라스(CPG)와 같은 세라믹 및 글라스, 알루미늄, 실리콘, 철, 티타늄, 구리, 은, 금과 같은 금속 및 흑연 또는 무정형 탄소, 페이퍼, (생)중합체 수지, 예를 들면, AmberchromTM 등의 폴리사카라이드, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌과 같은 모든 종류의 무기 산화물이며, 구형 또는 불규칙한 형태로, 흡착제를 강화시키기 위해 사용될 수 있다. 폴리(스티렌-공중합-디비닐벤젠)(특히 폴리(스티렌-공중합-디비닐벤젠)은 강 양이온 교환 수지에 사용되는 것으로 벌크- 또는 표면-설폰화된다), 폴리아크릴레이트, 폴리메트아크릴레이트, 폴리비닐 알콜, 실리카, 글라스, 및 폴리사카라이드, 예를 들면, 전분, 셀룰로스, 셀롤로스 에스테르, 아밀로스, 아가로스, 세파로스, 만난, 잔탄 및 덱스트란은 바람직한 고체 지지 물질이다. 가용성 지지 기능으로서 최소의 강성(rigidity) 및 강도를 갖는 고체 염기를 도입하여, 특히 유동 및/또는 가압 조건하에서, 상기 상들 사이에 분할하는 과정, 및 증가된 기계적 강도 및 마멸에 대한 분자적 기초로서 단백질 또는 펩타이드와의 상호작용의 위치인 고정상과 이동상 사이의 인터페이스의 확장에 대한 기초를 제공한다. 본 발명에 따른 고체 지지 물질은 균질 또는 불균질 조성물일 수 있으며, 이에 따라 위의 언급한 하나 이상의 물질, 특히 다층 조성물인 물질을 삽입할 수 있다. 본 내용에서, 자성 입자는 구체적으로 언급된다.
본원과 관련된 하나의 중요한 양태에서, 고체 지지 물질의 표면은 중합체 필름으로 극복될 수 있다. 이러한 임의의 필름은 고체 지지 물질의 일부로서 고려되는데, 그 이유는 본원에 개발되고 도입된 모든 제조 및 분리 방법이 이러한 중합체 겹층의 각각의 기능기 또는 잔기와의 작업과 같이 단일 벌크 고체 지지 물질의 직면한 표면 상에서 기능기 또는 잔기에 의존하기 때문이다. 추가로, 벌크 고체 지지 물질에 삽입된 메조- 또는 매크로다공성 토포그래피는 종종 피복 과정에서 보존될 것이다. 이렇게 생성된 하이브리드 물질에서, 표면 중합체 필름은 본 발명의 목적에 놓인 모든 물질(들)과 구별되어야 하는 경우, 후자는 요약하면 "담체"로서 개별적으로 언급되거나, 또는, 달리 말하면, 하이브리드 고체 지지 물질은 담체 및 중합체 필름 둘 다를 포함할 것이다. 그러나, 실제로, 이러한 구별은 종종 흡착제의 제조 이력이 공지된 경우에만 실현 가능하다. 흡착제의 강성(rigidity) 뼈대를 제공하는 부분으로서 담체는 고체 물리적 조건과 유사하며, 고체 지지 물질로서 상기 나열된 임의의 물질로 구성될 수 있으며, 이는 마찬가지로 상부 위에 표면 중합체 필름을 가지지 않고 벌크 고체 지지 물질로서 또는 이러한 표면 중합체 필름용 담체로서 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 따라서 중합체의 흡착에 대한 적합성을 배제하고 상기 언급된 바와 같은 모든 특성, 선택, 및 제한을 두 용어에 동등하게 적용한다. 따라서 본 발명의 중심적 양태는 흡착제이며, 여기서 고체 지지 물질은 제1 및 제2, 및 임의로 제3 및 제4 잔기를 수반하는 기능기를 갖는 중합체의 필름으로 커버되는 표면을 갖는 담체로 이루어진다.
바람직하게는, 다공성 물질이 담체로서 사용되는 경우, 중합체 필름은 일반적으로 이의 외부 및 대부분 넓은 내면 표면 둘 다를 균질적으로 커버할 것이다. 따라서, "표면"은 분리제로서 흡착제를 제조하고 적용하는 동안 흡착제의 전체 고체-액체 상 인터페이스를 특징으로 하고, 여기서 잔기에 의한 분석물의 인식 및 결합이 발생하고, (임의로 가압된) 유체역학적 유동, 대류, 살포, 확산, 또는 전자이동(electromigration), 또는 이들의 조합을 통해 적어도 하나의 용해된 단백질 또는 펩타이드에 접근가능하다. 연성 물질을 포함하는 담체 및 특히 적절한 액체 내 표면 중합체 필름의 팽창 가능성으로 인해, 뚜렷한 경계는 아니지만, 중간체 겔-상 층을 포함할 수 있다. 흡착제의 표면 특성은 사용된 물질의 벌크 특성과 상이할 수 있다. 이는 특히 2개의 상이한 물질이 담체 및 중합체 필름으로서 사용하는 경우, 및 제조 방법이 특별히 넓은 특정 표면적으로 유도되어 사용되는 경우 해당된다.
"커버링(covering)"은 천연 구동력하에 발생할 수 있거나 또는 자연 흡착, 기상 증착, 액체, 가스 또는 플라즈마 상으로부터의 중합, 스핀 코팅, 표면 응축, 웨팅(wetting), 침지(soaking), 침액(dipping), 브러싱(brushing), 스프레이, 스탬핑, 증발, 전기장 또는 압력의 적용과 같은 인력으로 강화할 수 있는 당업자에게 공지된 모든 피복 수단 및 액체 결정, 랑뮤어-블로젯(Langmuir-Blodgett-) 또는 층간 필름 형성과 같이 분자 자체-조립을 기초로 하는 모든 방법으로 기술적으로 달성될 수 있다. 이로써 중합체 필름은 다층으로서 직접적으로 또는 개별 단층의 서로의 상부 위로 순서적으로 피복될 수 있다. 거대분자를 고려하는 한, 단- 또는 다-점-"흡착"은 자연적으로 또는 인공적으로 촉진되든 간에 고체 표면과 물리적 접촉에 있는 중합체 용액으로부터 출발하는 임의의 피복 과정의 제1 (불완전) 단계로서 어떠한 경우라도 고려된다. 일부 적어도 약하게 흡착하는 물리력(반 데르 발스) 또는 -담체 및/또는 중합체에 존재하는 상보성 기능화의 경우- 오히려 고체 표면과 각각의 단일 중합체 가닥 사이에 특정, 비-공유 화학적 힘을 요구하며, 다층이 또한 적어도 준안정성의 응집체를 형성하기 위해서 동일하고 상이하게 수직으로 적층된 중합체들 사이에서 흡착된다. 상반되는 전하들 사이의 정전기적 힘은 종종 이러한 목적으로 사용되며, 이로써 담체의 표면 전하는 제타 전위로 주어진다. 초기 흡착은 느슨하고 불규칙한 방식으로 발생할 수 있고, 이후 큰 규모의 2차원 또는 3차원 순서 및/또는 밀도로 변화시킬 수 있다. 이는 개별 표면 영역에서 흡착과 탈착 과정 사이의 지속 상태 평형의 결과로서 표면 상에 중합체 가닥의 일부 잔기 이동성이 원인이 될 수 있으며, 예를 들면, 어닐링(annealing)으로 촉진될 수 있다. 일반적으로 쇄의 물리적 응집에 의한 기초 입체(엔트로피) 안정화에 추가하여, 근접한 기능기들 간의 공유 결합의 도입으로 인해 흡수된 응집체의 안정성을 추가로 증가시킬 필요가 있다. 안정성의 증가를 달성하기 위해서, 중합체 필름의 쇄는 추가로 당해 담체 물질에 공유적으로 접목(grafting)될 것이다.
이와 관련된 고체 지지 물질의 외부 표면은 편평(판, 시트, 호일, 디스크, 슬라이드, 필터, 막, 직조 또는 비직조 섬유, 종이)하거나 또는 만곡(오목 또는 볼록: 구, 비드, 입자, (공동) 섬유, 튜브, 모세관, 바이알, 샘플 접시의 웰(well))될 수 있다. 고체 지지 물질의 내부 표면의 기공 구조는 무엇보다도 규칙적이고 연속적인 모세관 채널 또는 불규칙한(프랙탈) 기하학의 캐비티로 이루어질 수 있다. 이를 현미경으로 보면, 제조 방식에 따라 매끄럽거나 거칠 수 있다. 기공 시스템은 전반적인 고체 지지 물질에 걸쳐서 연장될 수 있거나 또는 (분지된) 캐비티로 종료될 수 있다. 이동 상의 용매화와 정지 상의 표면의 보유력 사이의 단백질 또는 펩타이드의 상호 평형의 비율 및 이에 따른 연속 유동 분리 시스템의 효율은 주로 고체 지지 물질의 기공을 통한 확산에 의한 물질 전달로 측정되며 이에 따라 입자 및 기공 크기의 특징적 분포로 측정된다. 기공 크기는 임의적으로 비대칭, 다모드 및/또는 공간적으로 (예를 들면, 단면적으로) 불균질한 분포로 나타날 수 있다. 전체 고체 지지 물질 또는 담체 중의 하나로서 본 발명에서 사용하는데 적합한 다공성 고체의 전형적인 기공 크기는 10nm 내지 400nm의 범위이고, 이에 따라 메조- 또는 매크로다공성으로 분류할 수 있으며, 미립자 물질의 전형적인 입자 크기는 5㎛ 내지 500㎛의 범위이다. 적합한 고체는 용적의 30% 내지 80%의 범위에서 허용가능한 유공성을 가지며, 전형적인 특정 표면적은 1m2g-1 내지 1,000m2g-1의 범위이다.
또는, 보다 최근 도입된 고체 지지 물질은 느슨한 미립자로 이루어진 전형적 압축가능한 칼럼 패킹에 상반된 목적하는(일반적으로 로드(rod)형) 형태의 육안으로 보이는 단일 실재물로서 주조하는 일명 모놀리식 크로마토그래피 매질이다. 모놀리식 칼럼은 예를 들면, 폴리메트아크릴레이트와 같은 실리카 또는 중합체성 물질로 이루어질 수 있으며, 이의 미세구조는 섬유 모세관 또는 소결된 입자 응집체를 함유할 수 있다.
용어 "중합체의 필름" 또는 "중합체 필름"은 일반적으로 몇 개 내지 몇 십개 분자 층 사이에서 적어도 하나의 층의 2차원 또는 바람직하게는 3차원 합성 또는 생합성 중합체 네트워크를 의미한다. 이러한 (유도화된 또는 비유도화된) 중합체 네트워크는 당업자에게 공지된 과정에 따라 그 자체로 제조될 수 있다. 중합체의 필름은 화학적으로 균질한 조성물일 수 있거나, 또는 불규칙하게 얽혀지거나 또는 정돈된 방식(층간) 중의 하나로, 서로 관통하는 중합체 쇄(예를 들면, 폴리아크릴산 및 폴리아민)의 적어도 2개의 상이한 종류로 이루어질 수 있다. 용어 "쇄"는 일반적으로 가장 긴 연속성의 주 가닥 및 또한 기능기가 부착된 중합체의 가능한 분쇄로 언급된다. 상기 용어는 흡착제 제조 동안 사용된, 전체 주쇄 길이의 용해된, 흡착된, 또는 접목(grafting)된 중합체를 나타내며, 가교 결합된 중합체성 메시(mesh)의 매듭들 사이에 위치된 쇄 단편을 나타내는 것으로, 후자의 경우 개별 가닥의 총 길이를 식별하기 어렵다.
중합체의 주쇄 또는 측쇄 내 적어도 하나의 기능기를 함유하는 "중합체"가 바람직한데, 그 이유는 이들이 균질 또는 불균질 매질 중의 기능기과 같은 잔기와 쉽게 유도작용하기 때문이다. 또한, 고체 또는 용해된 상태의 중합체의 많은 특성과 주어진 고체 담체 위로 자발적으로 흡착되고 영구적으로 부착되는 경향은 중합체의 기능기에 의해 결정된다. 고분자 전해질은 본원에 구체적으로 언급된다. 공-중합체는, 작용성 및 비-작용성 단위 둘 다를 함유하여 교대, 통계, 또는 블록 서열이든지 간에, 이러한 측면에서 실현가능하다. 바람직한 기능기는 제1차 및 제2차 아미노산, 수산, 및 카복실산 또는 에스테르 기이다. 주위 매질의 산성/염기성에 좌우하여, 아미노 그룹은 카복실화된 양성자화된 암모늄 이온, 카복실 그룹으로서 탈양성자화된 카복실레이트 이온으로서 존재할 수 있다. 다공성 또는 비-다공성 벌크 중합체는 또한 고체 지지 물질의 담체로서 사용하는 경우, 위에 피복된 중합체의 필름이 본원에 기재한 것처럼 상이한 화학적 조성물을 갖는 경향을 보인다. 이들 차이점은 아래 나열된 기능기의 존재, 종류, 또는 밀도, 및 낮은 분자량, 낮은 정도의 가교결합에 기인할 수 있다. 모든 이러한 매개 변수는 증가된 친수성, 용매 팽창성/확산, 및 생체 적합성, 및 피복된 표면 상의 감소된 비특정 흡착에 영향을 미친다.
바람직한 중합체 필름은 아미노 그룹을 함유하는 적어도 하나의 중합체를 포함한다. 폴리비닐아민은 매우 바람직하다. 기타 적합한 폴리아민은 폴리에틸렌 이민, 폴리알릴아민 등, 및 아미노 그룹을 함유하는 중합체 이외의 작용성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 아세테이트, 폴리아크릴산, 폴리메트아크릴산, 이의 전구체 중합체, 예를 들면, 폴리(무수 말레인산), 폴리아미드, 또는 폴리사카라이드(셀룰로스, 덱스트란, 풀루란 등)을 포함할 수 있다. 공-중합체가 사용되는 경우, 바람직한 공-단량체는 단순한 알켄 단량체 또는 비닐 피롤리돈과 같은 극성, 불활성 단량체이다. 바람직한 중합체의 분자량 사용 범위는 5,000 달톤 내지 50,000달톤으로 특히 폴리비닐아민에 적용되며, 범위는 이에 제한되지 않는다. 상기한 범위의 최저에 근접한 분자량을 갖는 중합체는 담체의 좁은 기공을 관통해서 높은 표면적, 결과적으로 양호한 물질 이동 운동성, 분해능, 및 결합 능력을 갖는 고체 상태 물질이 본 발명의 흡착제에 사용될 수 있는 것으로 나타났다.
중합체는 흡착될 것이고 이후 제1 및 제2 잔기와의 유도작용하기 이전 또는 이후에 적합한 담체의 표면 위로 박층으로서 가교결합되거나 또는 접목(grafting)될 것이다. 잔기와의 유도작용을 포함하여, 생성된 하이브리드 물질의 필름 함량은 흡착제의 총량을 기준으로 중량의 약 5% 내지 30%, 바람직하게는 약 15% 내지 20%의 범위일 수 있다. 완전히 작용적인 흡착제의 중합체 함량의 정확한 값은 유도작용의 정도, 잔기의 분자량, 및 선택된 담체의 특정 중량에 좌우될 것이다. 이들 값은 낮은 나노미터 범위의 필름 두께에 상응한다. 피복된 중합체는 여전히 팽창 또는 수축하는 능력을 보유할 수 있으며, 이에 따른 실제 필름 두께는 사용하는 용매의 유형에 강하게 좌우된다.
중합체 필름의 가교 결합의 정도는 각각 가교결합이 가능한 기능기의 수를 기준으로 하여 2% 내지 20%의 범위일 수 있다. 특히 바람직한 것은 기능기 축합으로 인한 가교결합이지만, 라디칼 및 광화학을 포함하여 중합체 화학에 공지된 기타의 모든 방법들이 적용될 수 있다. 그러나, 가교결합은 또한 가교결합 시약을 추가하지 않고 포함된 중합체(들)의 기능기들 사이에 직접적으로 형성될 수 있다. 이는 특히, 공-중합체 또는 혼합된 중합체를, 서로를 향해 잠재된 반응성을 나타내는 적어도 2개의 상이한 기능기, 예를 들면, 활성화 후 서로 아미드 결합을 형성할 수 있는 아민 기과 카복실산 그룹을 제공하는데 사용하는 경우, 가능하다. 바람직한 가교결합은 공유 C-N 결합, 예를 들면, 아미드, 우레탄, 요소 또는 2차/3차 아민 결합을 포함하며, 활성화된 카복실산 또는 에폭시드와 아민의 반응을 통해 형성할 수 있다. 가교결합은 다중-전하된 반대 이온 등의 도움으로 또는 반대 전하된 기능기들 사이에 이온 페어링을 사용하여 비-공유결합할 수 있다.
본원에 사용된 것처럼, "가교결합 정도"는 가교결합이 가능한 총 수의 기능기를 기초로 가교결합 작용에 형성되는 가교결합의 최대 수로 나타낸다. 바람직한 경우, 이기능성 시약(bifunctional reagent)을 가교결합에 사용하는 경우, 이에 따른 가교결합의 정도는 가교결합 반응에 사용되는 시약의 양과 가교결합에 이용가능한 중합체 기능기의 수(이러한 경우, 하나의 가교 형성마다 2개의 기능기가 필요하다) 사이에 몰 비를 반영하는 것으로 반응이 본원에 시도된 비율에 근접하게 정량적으로 진행되는 것으로 간주된다. 원칙적으로, 인터-가닥 및 인트라-가닥 가교결합 둘 다 및 비-가교결합 말단-종결된 측쇄(부분적으로 반응한 가교결합제로부터)가 형성되는 것이 가능하다.
역으로, 용어 "접목(grafting)접목(grafting)능기가 형성된 고체 담체의 표면에 단일 중합체 쇄의 공유적 앵커(anchor)를 의미한다. 각각의 중합체 가닥은 쇄를 따라 적어도 하나의 임의의 위치에 앵커된 경우이면 충분하다. 상기 필름의 더 나은 안정성은 돌출된 중합체 루프가 표면에 형성되도록 다중-지점 접목(grafting)을 통해서 달성될 수 있다. 그러나, 후자의 방법에서 중합체 쇄의 3-차원 유연성은 감소된다. 단일-지점 부착은 바람직하게는 쇄 말단을 통해 실현되어서 바람직하게는 반대 말단에서 다수의 기능기/잔기 또는 단지 하나의 단일 기능기/잔기가 부착될 수 있는 쇄의 완전히 연장된 길이가 표면으로부터 외부를 향할 수 있다. 접목(grafting)된 중합체의 실제 구조가 임의의 코일일지라도, 표면 상의 높은 접목(grafting) 밀도와 적절한 용매를 사용하여, 가교결합으로 추가로 안정화될 수 있는 중합체 브러쉬의 형성과 같은 분산적 상호작용을 통해 이웃하는 쇄들 사이에서 팽창 및 자가-조립 지향된 현상으로 유도할 수 있다. 바람직하게는, 접목(grafting)은 가교결합 반응과 유사한 중 축합 반응을 통해 달성되지만, 자유 라디칼, 이온, 또는 라디칼 이온을 보급함을 포함하는 방법, 예를 들면, 산화 또는 방사선-유도된 방법들이 또한 적용될 수 있다. 선택된 방법은 담체의 작용화의 용이성, 유형, 및 정도에 좌우될 것이다. 접목(grafting)은 2개의 상이한 기술을 통해 원칙적으로 달성될 수 있는데, 제1 기술은 표면으로부터 표면-부착 단량체 또는 개시제를 사용하여 표면으로부터 적소 중합에 의해 평행중합체 쇄를 제조하는 것인 반면, 제2 기술은 표면의 부재에서 균질한 매질 내 완전한 길이로 중합체 쇄를 먼저 합성하고 추가의 단계로 이후에는 단지 접목(grafting)만 하는 기술이다. 후자의 기술은 본 발명의 흡착제가 접목(grafting) 과정을 통해 제조되고 본 발명의 방법적 양태를 구성하는 경우 바람직하다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 중합체 필름, 또한 공유 결합으로 내부에 가교결합, 즉, 공유 결합된 필름은 아래의 담체 물질에 접목(grafting)되지 않고 물리적 및/또는 화학적 흡착으로 위에 부착된다. 따라서, 용어 "결합"은 물리적 및/또는 화학적 흡착을 포함한다. 이후 조성 물질의 화학적 기계적 안정성은 가교결합된 중합체 필름에 의한 담체의 총 물리적 결합으로 야기된다. 중합체 필름의 두께와 밀도는 시약에 의해 점착되도록 하거나 또는 표적 단백질 또는 펩타이드 또는 분리하고자 하는 혼합물의 부수 불순물과 한정되지 않은, 재생불가능 하거나 변경할 수 없도록 상호작용할 가능성으로부터, 고체 폴리스티렌 설포네이트의 경우 페닐 또는 설포네이트 기과 같이 지지 담체 표면에서 매우 극성 또는 반응기를 보호하는데 여전히 충분하다.
추가의 양태에서, 중합체 필름은 담체 위로 접목(grafting)되지만, 내부로 가교결합되지 않는다. 제3의 선택으로서, 중합체 필름은 내부로 가교결합될 수 있고 담체 위로 접목(grafting)될 수 있다. 중합체 필름의 모든 3개의 상이하게 생성된 네트워크 형태는 도 2에 개략적으로 도시된다. 도 2의 A 경우는 바람직한 흡착제를 상징하는 것으로, 각각의 중합체 쇄는 서로 공유적으로 가교결합 되지만, 담체의 표면에 공유적으로 접목(grafting)되지 않는다. B 경우는 담체의 표면에 공유적으로 접목(grafting)되지만 서로 공유 가교결합 되지 않는다. C 경우는 2개의 고정 기술의 조합(임의의 순서로 수행될 수 있음)의 결과로서 각각의 중합체 쇄가 담체의 표면에 공유 접목(grafting)되고 서로 공유 가교결합된 흡착제를 나타낸다.
용어 "기능기"는 이의 표면 위에 (비유도된) 고체 지지 물질에 속하거나 임의의 중합체 필름, 또는 필름 흡착을 통해 상기 표면의 제조 동안 중합체에 제한되는 간단한, 별개의 화학적 모이어티를 의미하는 것으로, 화학적 부착 지점 또는 앵커로 작용할 수 있고, 이에 따라 고체 지지 물질 또는 이를 둘러싸는 중합체 필름의 팽창된 상태 중에 적어도 존재하여 화학적 추가 또는 치환 반응으로 액체 또는 고체 상 유도 및 임의로 가교결합으로 수정가능하다. 따라서 기능기는 전형적으로 적어도 1개의 약한 결합 및/또는 하나의 헤테로원자, 바람직하게는 친핵 또는 친전자를 갖는 그룹을 함유한다. 적게 반응하는 기능기는 유도작용 이전에 활성화되는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 이들은 중합체 가닥과 흡착제의 잔기 사이의 구조적 결합을 형성하고 가교결합된 네트워크의 매듭을 형성할 수 있다. 잔기와 반대로, 기능기는 초기에 분석물과 상호작용하도록 고안되지 않지만(실제로 이들이 결국 부속 성분의 척력을 통해 분리 과정에 작용하거나 돕는 것을 엄격하게 배제할 수는 없지만) 공유 연결(중합체 가교결합 및 접목(grafting))의 형성에 사용되거나 실제로 상호작용하는 잔기(유도작용)로 전환될 수 있는 한정된 화학적 반응의 분자-크기의 지점으로 커버되는 표면을 제공하도록 고안된다. 본원에 사용된 용어 "연결" 또는 "결합"은 직접적으로 형성된 공유 결합 및 다중 원자를 포함하는 서열을 통해 연속적으로 연장된 일련의 공유 결합 둘 다를 포함할 것이다. 흡착제 또는 분석물에 존재할 수 있는 단순한 2가 분자 단편 이하의 이들의 공지된 기능 및 구체적인 기능을 수행하지 않는 기타 화학적 모이어티는 단순히 "기"으로 명명한다.
한 세트의 기능기는 다수의 분리로 처리될 수 있지만, 동일 단위, 및 이의 화학적 특성은 단지 예측가능하고 재생산가능한 기 특성에 의해서 주로 결정될 것이고 이들이 부착되는 물질, 또는 이들 물질의 정확한 위치에 의해서는 훨씬 적은 정도로 결정될 것이다. 이러한 기능기들 중에는, 일부 아미노 기, 하이드록실 기, 티올 기, 카복실산 기, 또는 카복실 에스테르 기이 있다. 기능기는 고체 지지 물질의 통합 일부를 나타내고 이에 따라 이의 표면의 큰 면적에 걸쳐 균일하게 분포한다. 적합한 기능기는 종종 약산 또는 약염기 특성을 나타내고 이에 따라 필름-형성 중합체에 양성체의 특성을 제공한다. 중합체 내 기능기는 상응하는 단량체로부터 중합하는 과정 동안 또는 이후 담체 위로 흡착하기 전 또는 후에 기능기 전환에 의해 도입될 수 있다. 중합체 필름은 또한 상이한 단량체가 공-중합하는 경우, 기능기 전환은 완료 전에 정지하는 경우, 또는 상이한 중합체가 서로 또는 침투성 네트워크로서 상부에 적층되는 경우 2개의 상이한 기능기를 함유할 수 있다. 바람직한 기능기는 1차 및 2차 아미노 기이다. 특히 바람직한 것은 1차 아미노 기이다.
용어 "유도"는 기능기의 잔기 또는 전구체를 함유하는 적합한 유도 시약을 갖는 기능기의 추가 또는 치환에 의해 중간체 또는 전체 작용성 흡착제를 제조하기 위해 흡착제 제조 동안 상기 표면을 커버하는데 사용된 고체 지지 물질의 표면 위로 또는 중합체 내로 특정 잔기를 도입할 수 있는 임의의 화학적 반응을 의미한다. 상이하지만 여전히 반응성 기능기로 기능기를 상호전환시키는 것 또한 상기 용어에 포함될 것이다. 잔기의 "전구체"는 숨겨지거나 보호된 화학적 모이어티를 삽입해서 유도 단계에서 중합체 또는 표면을 갖는 결합의 형성과 동시에 또는 후에 최종 잔기로 탈보호될 수 있거나 전환될 수 있다. 예를 들면, 중합체가 1차 또는 2차 아미노 기능기를 함유하고 이들과 함께 아미드 결합 형성을 통해 유도가 수행되는 경우, 잔기 내 포함되는 추가적 1차 또는 2차 아민 잔기들은 예를 들면, 유도 시약 내 Boc- 또는 Fmoc-유도체로서 초기에 보호되어야 한다. 또한, 표면 또는 중합체 기능기과 유도 시약의 반응성 중심 사이에 유도 작용 동안에 형성되는 결합이 표적 단백질 또는 펩타이드의 인식에 역할을 수행하는 신규 화학적 모이어티의 형성을 유도하는 경우, 각각의 잔기는 명백하게는 유도 후 완전히 개발되고, 유도 시약에 함유된 전구체의 부분 또는 기능적으로 변화될 것이다. 이러한 경우, 전구체 모이어티(이탈기)의 일부는 유도 반응 동안 분배될 것이다(예를 들면, 축합 반응 동안의 물 분자).
유도는 항상 기능기의 "한정된 부분"에 수행되는 각각의 적어도 하나의 단계 또는 임의로 다중 단계들로 이루어진다. 이는 -상이한 기능기 및 시약의 반응성을 고려하여- 비유도화된 중합체 또는 고체 지지 물질에 존재하는 각각의 주어진 종류의 기능기의 표적된, 예비측정된 퍼센트가 항상 선택된 각각의 잔기로 유도된 기능기로 전환되는 것을 의미한다. 균질하고 재생산가능하게 유도된 흡착제를 수득하기 위해서, 적절한 양의 유도 시약을 중합체와 반응시키도록 한다. 전체 유도(유도 정도= 100%)가 시도될 수 있고, 여기서 유도 시약은 과량으로 사용하지만, 반드시 그런 것은 아니다.
상기와 같은 흡착제의 잔류 물질이 유도 단계 동안 손상될 것이기 때문에, 온화한 조건 하에 유도를 수행하는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 조건 하에 충분한 반응성을 유지하기 위해서 실제 결합 형성 단계 전에 또는 이와 동일하게 유도 시약 또는 기능기를 활성화시키는 것이 필요할 수 있다. 바람직하게는, 유도 시약이 활성화된다. 바람직한 유도 시약은 전자-풍부 질소 기능기, 예를 들면, 아미노 그룹을 함유하는 친핵성 중합체 및 전자-부족 탄소에 부착되는 이탈기, 예를 들면, 카보닐 또는 카복실 유도체를 함유하는 친전자 시약을 포함하거나, 또는 그 반대일 것이다. 따라서, 활성은 고체 상 또는 액체 상 펩타이드 합성의 표준 기술, 예를 들면, 활성화된 에스테르에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 유도 반응은 기능기과 아미드, 우레탄, 요소 또는 2차/3차 아민 결합의 형성을 포함한다. 카보닐 탄소에 대한 아미드 및 우레탄 결합의 비대칭성으로 인해, 이들은 아미드 또는 카보닐 중합체로부터 및 아미노 또는 하이드록실 중합체 중의 하나의 방향으로 각각 형성될 수 있다.
흡착제의 친화성 및 선택성은 2개 이상의 상이한 잔기의 조합으로 대부분 결정된다. 용어 "잔기"는 친화성이 흡착제 표면 상의 격자 또는 중합체 쇄의 CH 또는 CH2 반복 단위와 약한 반 데르 발스-접촉보다 더 강한 경우, 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드의 적어도 하나의 상보성 구조 또는 표면 영역을 향해 높은 및/또는 선택적인 친화성의 위치 또는 착물 내로 나노크기(자체적으로 또는 자체의 부분 또는 동일하거나 상이한 종류의 잔기의 클러스터 내로)로 조립할 수 있는 동일하거나 상이한 종류의 임의의 별개의 화학적 모이어티, 또는 별개로 식별가능한, 일반적으로 반복적으로 발생하는 화학적 모이어티의 정렬을 의미한다. 이러한 고체/액체 인터페이스의 부위는 생거대분자를 포함하여 특정 상호작용의 기술과 유사하게 "결합 부위"로 명명된다. 이로써 잔기는 전체적으로 합성 또는 천연 제품 또는 이의 단편 또는 조합일 수 있지만, 화학적 합성 및/또는 유도로 수정가능할 수 있어야 한다. 이는 하나 이상의 별개의 화학적 모이어티를 포함할 수 있다(소수성 또는 분산 상호작용에 관여할 수 있는 예를 들면, 알킬 또는 알킬렌 단위와 같은 화학적으로 비반응적 잔기를 포함함).
2개 이상의 상이한 잔기가 가변성 비율로 흡착제 내로 도입되기 때문에, 결합 부위는 2개 이상의 동일하고 상이한 잔기를 포함할 것이다. 특정 결합 부위의 형성에 포함된 총 잔기는 서로의 2차원 또는 3차원 공간적 접근성에 근접하여 위치하고, 중합체 필름의 이웃하는 표면 기능기 또는 이웃하는 반복 단위 상의 잔기를 포함할 수 있지만, 반드시 이럴 필요는 없다. 일반적인 결합 부위의 각각의 잔기는 가교결합된 또는 표면-접목(grafting)된 중합체의 상이한 가닥에 속할 수 있다(동일한 법칙이 각각의 단백질 또는 펩타이드 표면에 노출된 결합에 상응하여 적용된다). 반대로, 특정 잔기는 2개 이상의 인접하거나 중첩된 결합 부위로 분배될 수 있다. 중합체 필름 내 또는 표면 상의 기능기 위로 가교 결합 및 잔기의 분포의 임의적(통계학적) 특성으로 인해, 이 결과 유사하지만 구조적 또는 효과적으로 동일하지 않은 결합 부위의 분포가 형성될 수 있다. 결과적으로, 표적 단백질 또는 펩타이드를 향한 이들 결합 부위의 크기 및 친화성은 상당한 부분 상이할 수 있지만 실제로는 단점으로서는 입증되지 않았다.
흡착제의 결합 부위와 표적 단백질 또는 펩타이드의 결합 부위 사이의 “결합”은 가역적이고 이에 따라 흡착제의 상보성 화학적 모이어티들 사이의 비-공유 상호작용의 임의의 형태를 통해 발생할 것이다. 빈번히 발생하는 비-공유 모드의 결합은 이온 결합, 수소 결합, 공여체-수용체 전하 전달, π-π, 양이온-π, 쌍극자, 배위, 분산, 및 소수성 상호작용이지만, 종종 혼합된 및 비-화학량론적 형태로 개별 결합 모드 분포를 특정화하지 않도록 나타난다. 따라서, 단일, 이중 또는 다중의 동시 접촉은 동일하거나 상이한 잔기를 포함할 수 있는 결합 파트너 사이에서 발생할 수 있다. 거친 표면 상 및 미세한 기공 내 분석물의 이동성 및 용매-매개된 상호작용에 영향을 미치는 물리적 및 엔트로피 힘을 결합하는 요소에 가할 수 있다. 특정 예에서, 흡착제 및 적어도 하나의 결합 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 생성된 착물은 검출가능하거나 심지어 분리가능할 수 있지만, 보다 흔하게는 단지 일시적인 특성일 것이다. 또한 이러한 값들이 주어진 흡착제-분석물 쌍의 내인성 특성 및 강한 용매-독립적이기 때문에 결합 강도에 부과된 유용한 최저 제한이 존재하지 않는다. 또한, 1kcal-1 몰만큼 작은 차별적 깁스 엔탈피는, 이론상 플레이트 넘버가 크로마토그래피 베드 길이의 미터 당 약 103 내지 104의 값을 채택할 수 있는 칼럼 내 다중 일련 평형으로 인하여 크로마토그래피 방법으로 여전히 해결될 수 있다. 크로마토그래피 적용에 있어서, 결합은 너무 강하지 않아야 하는데, 그 이유는 주위 또는 생체적합한 조건하에 가역성이 달성되기 어렵기 때문이다.
본 발명의 흡착제와 관련하여, 잔기는 상기 표면을 커버하는 임의의 중합체 필름을 포함하여 고체 지지 물질의 표면 위에서 기능기에 연결될 수 있고, 상기의 경우, 기능기에서 부착 지점으로부터 표면에서 벗어난 전체 부분적 구조를 포함하거나, 또는 이의 적어도 부분은 상이한 기능기 위의 동일한 방식으로 발생한다. 표적 단백질 또는 펩타이드의 결합에 직접적으로 관여하는 것에 있어서 반드시 전체 잔기를 가질 필요는 없다. 잔기는 이러한 원자 또는 잔기를 함유할 수 있어서 서로 실제로 결합 구조를 분리하거나 연결하는 목적만을 가지거나 표적에 결합 구조를 제공하기 위해서 결합 부위에 대해 적합한 뼈대를 기하학적으로 제공한다. 고체 지지 물질 상, 특히 이의 표면 상의 임의의 중합체 필름의 기능기들 사이에 임의의 공간, 분지되거나 기타의 링커 단위들, 및 이에 따른 실제 결합 구조는 적어도 하나의 연결을 만드는 각각의 잔기의 일부가 되도록 형식적으로 배정된다. 이러한 연결은 확률적(편재적) 또는 선택적 방식으로 기능기의 적어도 하나의 특정 유도 과정을 통해, 균질한 또는 비균질한 방식으로 담체 매질 위로 임의의 중합체 필름의 적용 전 또는 후에, 일반적으로 달성될 수 있다. 이에 따라, 중합체의 용액 또는 박막은 이미 중합체의 잔기 또는 전구체를 함유하는 예비-합성된 유도 시약과 반응시킬 수 있다.
그러나, 이들의 기능기, 또는 구조적 부분들이 이의 잔기 또는 전구체와의 유도를 통해 상이한 종류의 잔기로 전환되는 경우, 또는 이후 상기 잔기의 추가적 원자(예를 들면, -NH2 기능기가 -NHCO-R 잔기로 전환되는 질소 원자)를 갖는 통합적 화학적 단위를 형성하는 경우, 기능기는 이들의 기능그룹으로서의 특성을 기본적으로 상실하고 대신에 상기 잔기에 속하는 구조적 잔기로서 간주될 수 있다.
동일하거나 상이한 종류의 잔기는 개별적으로 고체 지지 물질의 기능기에 직접적으로 또는 공유, 구조적으로 유연한 링커를 통해 부착되는 경우, 이들은 표적 단백질 또는 펩타이드 표면에 독립적으로 상보적 상응성에 적합하다고 간주되며, 구동력은 전체 깁스 엔탈피의 최소가 된다. 따라서, 본 발명의 목적에 대해, 결합 부위의 잔기가 주어진 단백질 또는 펩타이드 에피토프(한 예로서, 천연 항체 내)의 최적 결합에 대한 3차원 배위를 수정하도록 조직될 필요가 없고; 단지 이들은 이들의 구조적 공간(물질-유도된 핏(fit))의 탐구를 통해 이러한 배위를 가정할 수 있을 필요가 있다. 다수의 경우에서, 특히 차별화되는 결합을 시도하는 경우, 표적 단백질 또는 펩타이드의 2개 이상의 상이하거나 중첩되는 에피토프는 동일한 흡착제에 의해 인식될 수 있다.
용어 "잔기"는, 흡착제 표면으로부터 벗어난 전체 단위를 나타내고, 분석물 결합에 관련되어 동등하게 또는 유사하게 수회 반복되고, 기능적으로 한정되며, 이러한 장사는 하나 이상의 식별할 수 있지만 이들 자체로 연속적인 소단위 내의 분자-구조적 수준으로 존재할 수 있으며, 내부로 -단지 형식적으로- 단편화되어, 일명" 구조"가 될 수 있다. 상기 용어는 가능한 광범위한 의미로 본 발명의 전반에 걸쳐 사용된다. 일부 전제적이지만, 상이한 구조로의 잔기의 분할은 화학적 유사성과 직관력의 원칙에 따라야 함으로써 분자의 잔기 또는 단편이 일반적인 구조 및/또는 물리적 특성에 따라 함께 공간은되어야 한다. 동일한 잔기에 속하는 상이한 구조와 관련된 기능은 이와 마찬가지로 상이할 수 있다: 일부 구조(특히, C, N, O, S-헤테로방향족)는 분석물 결합과 관련될 수 있지만 기타는 그렇지 않다. 잔기의 작은 구조적 변화로 인해 본 발명에 따른 흡착제를 부분으로부터 분리될 수 있다. 실현하는 무수한 가능성의 관점에서, 이를 기초로 하는 잔기의 본질적 부분은 비-본질적 부분과 분리될 수 있다. 이들의 임의의 구조를 분석물 결합에 주로 포함하지 않기 위해서, "링커"는 짧은 분자 (종종 단순한 탄화수소) 사슬에 속하며, 임의로는 필요한 결합을 만들기 위해 하나 또는 2개의 말단에 작용성 또는 비포화된 결합가를 포함하고, 실제의 결합 구조 및 인적합 구조 및/또는 흡착제 표면 사이에 매듭을 형성한다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 흡착제에 몇몇 상이한 잔기를 사용하는 것이 가능할 것이고, 모두 이핵 C, N, O, S-헤테로방향족 구조를 포함하지만, 상이한 종류, 길이, 또는 연결성 및 선택적 또는 결실된 추가적 구조의 링커를 포함한다. 잔기의 이러한 그룹은 분자 수준으로 구별할 수 있지만, 본 발명의 의미 내에서 "제1 잔기"로서 기능적으로 평가될 것이다. 링커의 용도는 아래에서 추가로 상세하게 기재될 것이다.
표적 인식에 책임이 있는 잔기의 구조는 "헤테로방향족 구조"를 포함하며, 좁은 의미에서 단백질 또는 펩타이드 분석물과의 상호 접촉이 발생하는 잔기의 주요 구조적 일부이다. 본원 내 표현 "헤테로방향족"은 연속적으로 비국지화된, 폐쇄-루프 π-전자 시스템(NMR 스펙트럼 중에 이방성 자석 보호에 의한 예로 인식됨)의 방향족 특성을 나타내는 환 또는 융합된 환 시스템을 의미하고, 탄소와 질소, 산소, 및 황을 포함하는 그룹으로부터 취해진 적어도 하나의 환내 헤테로원자로만 이루어진다. 헤테로원자의 일반적인 결합가가 초과되지 않는 안정한 구조를 생성하는 한, 동일하거나 상이한 환 내 동일하거나 상이한 종류의 헤테로원자의 조합이 가능하다.
일반적인 학술용어에 따라, "이핵"은 2개의 인접한 환 원자(거의 모든 경우에서 탄소)를 공유하는 각각의 임의의 크기의 2개의 방향족 환, 이들 사이의 공유 결합(즉, 제로 원자 길이의 [n.m.0]-브릿지) 및 일반적인 콘쥬게이트된 π-전자 시스템으로 이루어진 융합된 비사이클릭 환 시스템을 나타내는 것으로, "단핵"은 임의의 크기의 분리된 모노사이클릭 환을 나타낸다. 추가의 방향족, 헤테로방향족, 지환족 또는 헤테로지환족 환 또는 환 시스템은 결국 적어도 하나의 환 원자에 대한 중간체 단일 결합 연결, 선택적으로 공간 단위를 통해 치환체로서 헤테로 방향족 구조 둘 다에 부착될 수 있다. 그러나, 연장된 환 융합(2-지점 치환체 부착)은 지환족 또는 헤테로지환족 환으로만 가능해서, 헤테로방향족 π-전자 시스템이 완전한 길이의 추가적 환으로 연장되지 않고 더 높은 핵성(nuclearity)의 분포 시스템을 방지하게 된다. 헤테로원자의 수, 조합, 및 분포 및 이의 형식적인 π-결합 순서(부분적일 수 있음)는 헤테로방향족으로서의 분류와 관련되고; 단지 전제조건은 적어도 하나의 헤테로원자가 환 내에 위치하고, 일반적인 콘쥬게이트된 환 시스템의 적어도 하나의 π 전자를 공유한다는 것이다. 이는 구조 내로 잔기의 단편화되는 다수의 각 가능성으로 인해, 적어도 하나의 가시적인 제1 잔기와 제2 잔기 단편이 각각 이핵 및 단핵 C, N, O, S-헤테로방향족 구조로 유도하는 경우 본원에 사용된 문맥 내에서 충분해야 한다. 바람직한 헤테로방향족 구조는 적어도 하나의, 보다 바람직하게는 정확히 하나의 5원 환을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "C, N, O, S-헤테로방향족 구조"는 각각의 단핵 헤테로방향족 구조가 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵을 의미한다.
하나의 양태에서, 헤테로방향족 구조는 적어도 하나의 N 원자 및 적어도 하나의 추가 헤테로원자 N, O, 또는 S를 포함한다. 하나의 이러한 양태에서, 헤테로방향족 구조는 2개의 N 원자를 포함한다. 이러한 헤테로방향족 구조는 예를 들면, 이미다졸이다.
"치환체"는 헤테로방향족 구조의 선택적 일부로 고려되고 이에 따라 또한 분석물 결합에 관여하는 것으로 생각되는 유기 라디칼(수소를 제외함)이다. 이들은 이의 코어, 즉, 이핵 또는 단핵 헤테로방향족 환-형성 원자에 이들 헤테로방향족 구조의 고리외 부분과 유사하며, 상기 환-형성 원자를 포함하지 않고 적어도 하나의 공유 결합을 통해 공유적으로 결합된다. 일부 헤테로방향족 구조가 직접적인 공유 결합을 통해 서로 연결되는 경우를 제외하고, 이들 치환체는 자체적으로 표적 단백질 또는 펩타이드와의 약하고 비선택적 상호작용만을 일반적으로 나타내며, 잔기의 소수성/친수성 특성을 조절하는데 사용될 수 있다. 이들은 임의의 C, N, O, S-헤테로방향족 환 없이 흡착제 표면에 결합하는 경우 본 발명의 목적을 완전히 충족시킬 수는 없다.
선행 기술에서, 높은 친화성 및 선택성을 나타내는 흡착제는 생물학적 기원의 항체 또는 기타 고분자량 수용체가 고정되는 고체 지지 물질로부터 우월하게 공지된다. 이러한 항체는 먼저 생물 유기체를 포함하는 생물학적 과정에서 표적 항원에 대해 특이적으로 증가 되어야 하거나, 또는 표적 단백질 또는 펩타이드는 단지 몇몇의 이전 공지된 천연 친화성 쌍의 하나의 항원 또는 하나의 성분에 가역적으로 콘쥬게이트되어야 한다. 본 발명의 흡착제는 이의 잔기가 화학적 합성으로 낮은 분자량과 높은 화학적 안정성에 의해 접근가능하다는 사실로 차별화될 수 있다. 그러나, 이들은 모든 종류의 친화성 크로마토그래피 방법에서 고정상으로서 수행될 수 있다.
용어 "단백질" 및 "펩타이드"는 각각 폴리- 및 올리고아미노산을 나타내며, 화학적, 생합성적 또는 생분석적으로 별개의 식별가능한 전체로서, 합성 또는 생물학적 기원(자연에서 이의 가능한 발생에 관계없이), 선형 또는 분지형, 동종 또는 이종 서열일 수 있고, 최소 또는 최대 서열 길이 또는 분자량 제한이 부과되지 않는다. 최소 요건은 적어도 하나의 아미드 결합을 통해 연결되는 적어도 2개의 아미노산으로 이루어져야 하고, 예를 들면, 디펩타이드에 상응한다. 비-단백질성 또는 완전한 비자연적 아미노산, β-아미노산, N-알킬 아미노산, 추가 펩타이드 유사체 단위 등 모두 여전히 펩타이드 결합을 형성할 수 있는 존재는 해가 되어서는 안된다. 작은 (올리고)펩타이드는 종종 단계적 또는 집중적 방법을 통해 합성적으로 제조될 수 있고; 용어 펩타이드는 이러한 경우에 뎁시펩타이드 또는 펩토이드와 같이 비일반적인 연결성을 통해 형성된 수득 가능한 구조를 추가로 포함할 것이다. 더 큰 단백질은 전형적으로 예를 들면, 구형(알부민) 또는 섬유모양/섬유(액틴, 콜라겐) 모양과 같은 다수의 상이한 모양을 채택할 수 있는 한정된 3차원 구조를 함유하고; 이들은 시토졸, 막-결합, 세포외 매트릭스의 일부에 가용적일 수 있거나, 세포의 표면에 존재할 수 있다. 현대의 분자 생물학적 방법으로 처리할 수 있는 소량의 단백질로 인해, 이의 1차 아미노산 서열은 이들을 동정하기 위해 공지될 필요가 없고, 때때로 이들이 상동 구성(homologous composition)으로서 존재하는 여부도 공지되어 있지 않아도 된다. 예를 들어, 바이러스, 양자점, 또는 라텍스 구와 같은 (콜로이드성) 분산된 담체 (나노) 입자의 표면에 결합된 단백질 또는 펩타이드는 이들이 본 발명의 분리 방법에 사용할 수 있도록 흡착제와 상호작용하기 위해 전체 분자 표면의 보호된 부분을 노출시키기는 분할이 일반적으로 먼저 필요하다.
상기 용어들은 한편으로는 비-공유 펩타이드 응집체 및 호모- 및 헤테로다량체 단백질을 포함하지만, 다른 한편으로는 또한 효소 소화 또는 디설파이드 결합 환원의 생성물과 같은 전체 단백질의 작용성 또는 비-작용성 소단위, 뿐만 아니라 <<affibodiesTM>>, <<anticalinsTM>>, <<nanobodiesTM>>, 또는 기타 인공적으로 재구성된 활성 부위와 같은 새로 고안된 미니 단백질을 포함한다. 금속 이온 또는 착물은 단백질, 일반적으로 이의 활성 부위에 포함될 수 있다. 분석물 단백질은 생체내 후해독 개질, 예를 들면, 인산화, 설페이트화, 글리코실화, 글루쿠로나이드화, 또는 유비퀴틴화로 개질될 수 있다. 글리코사이드 및 지방과의 접합은 각각 아미노산만을 넘어 추가의 구조적 단위로 이루어진 당단백질 및 지방단백질을 생성한다. 상향 또는 하향조절이 유기체의 특정 병리학적 상태에 대해 마커로서 작용할 수 있는 단백질 개질은 일반적으로 가장 중요하다. 유사하게는, 표면의 생체외 생화학적 개질 및 단백질의 활성 또는 알로스테릭 부위는 물질 효능제, 또는 길항제 및 아미노, 카복실, 및 측쇄 기능의 모든 종류의 보호성 그룹 화학과의 가역성 또는 비가역성 착물을 형성함을 포함한다. 단백질 또는 펩타이드는 단백질 또는 펩타이드의 향상된 발현, 가용성, 배출, 검출 또는 분리를 목적으로 하여 다른 (담체) 단백질과 화학적 또는 생화학적으로 태그(예를 들면, 올리고히스티딘 서열-태그, 콘쥬게이트된 염료 또는 방사성 라벨) 또는 융합될 수 있고, 이로써 콘쥬게이션 지점이 분할될 수 있지만, 또한 예를 들면, 막 앵커링 태일(membrane anchoring tail)과 같은 자연 서열의 일부를 결손할 수 있다.
용어 "표적 단백질", "표적 펩타이드", 또는 단순히 "표적" 중의 하나가 사용되는 경우, 특정 단백질 또는 펩타이드, 또는 다수의 단백질 또는 펩타이드(일반적으로 구조, 종류, 합성, 또는 기원과 관련됨)는 특정 잔기를 갖는 흡착제가 고안되는 것을 의미한다. 이는 일반적으로 흡착제에 대한 최고의 친화성을 나타내는 공급 혼합물의 분석물 또는 성분이다. 표적 단백질 또는 펩타이드는 아미노산 서열(유전자 전사 동안 대안적으로 접합 또는 SNP 변이체를 야기하는 것을 포함하는 단일점 서열 변이 또는 결실에 도달함) 및 상이하게 접힌(순수, 접히지 않은 또는 잘못 접힌) 상태의 존재를 포함하는 전체 2차 및 3차 구조 요소에 의해 잠재적인 단백질성 부 생산물과 차별화될 수 있다. 표적 단백질 또는 펩타이드는 종종 공급 혼합물(중량 또는 몰)의 주 성분이지만, 반드시 될 필요는 없고, 심지어 주요 펩타이드 성분이 될 필요는 없다. 혼합물 내에 풍부함에 관계없이, 표적은 종종 정제하는데 필요한 가치있는 혼합물 성분 또는 특정 성분이지만, 반드시 그럴 필요는 없으며, 후자의 경우 유동-관통 단편에 함유되는 것이 가능하다. 다수의 단백질 또는 펩타이드는 건강- 또는 환경-기원의 적용에 있어서 빈번하게 독성 특성을 입증했기 때문에, 상기 표적은 또한 이러한 독성이 될 수 있거나, 그렇지 않으면 감소되어야 하는, 혼합물 내 원하지 않는 단백질 또는 펩타이드 특성을 나타낸다. 또한, 표적은 주요 생성물이 아니지만 혼합물의 잔류와 분리되거나 제거하는데 필요한 제조 공정의 소수의 부생성물이 될 수 있어서, 이로써 그 자체가 단백질 또는 펩타이드가 될 수 있거나 되지 않을 수 있는 다른 혼합 성분-일반적으로 주요 생산물-의 농도 또는 순도는 증가한다. 다-단계 혈장 분배 과정에 대해, 공급 혼합물에 동시에 존재하는 상이한 전체 무리의 단백질 또는 펩타이드를 정류하는데 다수의 연속적 분배가 필요할 수 있고, 이에 따라 분배의 특정 단계의 유동-관통이 다음 단계에서 흡수될 것이며, 또는 그 반대도 가능하다.
-표적을 포함하여- 적합한 조건하에 본 발명의 흡착제와 적어도 약한 상호작용할 수 있는 분리하고자 하는 혼합물 내에 모든 용질의 집합은 "분석물"이라고 명명된다. 대부분의 분석물은 단백질 또는 펩타이드로, 그 이유는 이들이 상기 흡착제가 고안된 분석물이기 때문이며, 그러나 특정 환경 하에 작은, 비-펩타이드성 분자가 이들 그룹에 속할 수 있다. 근접하게 관련된 분석물은 합성 또는 생합성 라이브러리를 함께 형성할 수 있으며, 예를 들면, 트립신 소화, 파지 디스플레이 라이브러리 또는 생체 내 생체 외에서 적절히 전사되는 임의의 cDNA 라이브러리의 발현 생성물로부터 기원한다. 그러나, 흡착제의 친화성은 일반적으로 표적 그룹으로부터 벗어난 구조를 갖는 분석물에 빠르게 감소하며, 이들이 표적(물)에 구조적으로 관련되지 않은 경우 0에 근접한다.
바람직한 단백질 또는 펩타이드는 5.5 내지 8.5의 등전점 pI를 가지고 이의 분자량은 100 내지 500,000Da의 범위일 수 있다. 이들 pI 값은 적어도 하나의 제1 및 제2 잔기에 삽입된 적어도 하나의 헤테로방향족 구조의 산성 pKa에 대략적으로 부합될 것이다. 본 발명의 흡착제의 특히 바람직한 표적 단백질은 "항체" 또는 이의 혼합물이고, 용어는 또한 항체의 단편(경쇄 및 중쇄, Fab 및 Fc 영역, Sc 가변 영역 등), 이러한 단편(2가 항체, 3가항체)으로부터의 인공적 분자 작제물, 항체의 올리고머 관련물, 및 항체- 또는 항체 단편-함유 융합 단백질, 또는 서로 화학적으로 결합할 수 있는 글루타티온 또는 GFP와 같은 검출가능한 태그를 함유하는 것과 같은 기타 유형의 접합체를 포함할 것이다. 이는 다중클론 또는 단일클론 항체일 수 있다. 일반적으로 면역글로불린(Ig, γ-글로불린) 중에서, 항체는 임의의 동종형 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM에 속할 수 있고, 여기서 각각은 몇몇의 하부 종류로 분할될 수 있다. 항체는 사람 또는 기타 포유류(전형적으로 생쥐류 또는 설치류(마우스, 랫트, 래빗, 햄스터, 기니피그), 염소, 양, 개, 돼지, 소, 말) 기원일 수 있다. 바람직한 항체는 사람 또는 사람화된 (키메라) 항체이다. 이의 유전형은 모든 종류의 항원(기타 항체 또는 생물학적 물질, 소분자)에 대해 유도될 수 있다.
"단백질 또는 펩타이드를 함유하는 혼합물"은 각종 기원일 수 있는 혼합물을 의미한다. 혼합물이 수득되는 공급원에 대해 본 발명에서 엄격한 제한은 존재하지 않는다. 단지 요건은 본 발명의 흡착제가 적어도 약한 수용체 특성을 나타내는 분석물로서 평가되는 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 것이다. 혼합물은 이로써 혼합물의 잔류로부터 공통적으로 분리하고자하는(즉, 모두가 분리 표적임) 또는 서로 분리하고자 하는(즉, 하나 또는 일부가 분리 표적임)2개 이상의 상이한 단백질 또는 펩타이드를 함유할 수 있다. 흡착제의 잔기에 의해 인식되는 혼합물 내에 적어도 2개의 단백질 또는 펩타이드의 구조적 주요소(에피토프)는 동일하고, 유사하거나 또는 부분적으로 동일하거나, 또는 상이할 수 있다. 후자의 경우 다수의 예에서 흡착제와 상이한 종류의 상호작용을 유도하고, 이에 따라 결합 강도에 더 큰 차이를 나타내는데, 단, 적어도 2개의 단백질 또는 펩타이드가 비교가능한 분자량이며 대략 동일한 수의 인식가능한 에피토프를 함유한다.
단백질 또는 펩타이드가 자연 발생 또는 재조합으로 발생된 물질인 경우, 액체 또는 고체 생물학적 물질, 예를 들면, 동물, 식물, 미생물, 또는 바이러스(생성물을 과잉생산하는 개량되거나 형질전환된 종을 포함함)의 신선한 또는 건조 추출물, 세포 배양 또는 세포 배양 배지로부터의 추출물, 미생물(박테리아 또는 곰팡이) 또는 효소성 발효액, 시판용 공급제품, 또는 이의 임의의 조합으로부터 수득할 수 있다. 또는, 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 혼합물은 화학적 합성 또는 부분 합성의 미가공 제품일 수 있다. 이는 특히 표준 용액 및 수동적 또는 자동화된 방식으로 수행되는 고체-상 펩타이드 합성 방법을 포함한다.
전형적인 임의의 정제 기술 및 특히 임의의 크로마토그래피 기술로서, 사용되는 정확한 조건은 표적 단백질 또는 펩타이드의 구성 및 샘플 매트릭스의 구성에 좌우된다. "매트릭스"는 혼합물의 모든 활성 및 비-활성 성분의 집합체에 대해 사용되는 용어로, 표적(들)을 제외하지만, 이들이 소멸되는 매질을 포함한다. 그 이유는 표적 단백질 또는 펩타이드의 절대적 물리적 또는 화학적 특성이 분리 과정에 일반적으로 이용되기 때문이 아니라 오히려 표적 단백질 또는 펩타이드와 모든 또는 일부 특정 매트릭스 성분 사이의 상기 특성의 차이점 때문이다. 일반적으로, 매트릭스의 조성물은 단일 분석 방법이 종종 모든 구성, 적어도 동등한 민감성을 가지고 검출할 수 없기 때문에, 기껏해야 단지 부분적으로 공지되어 있다(질적 및 양적 둘 다). 하류 분리 및 화학적 또는 생물학적 물질의 정제 동안 상이한 과정 단계에서 수득된 중간체 생성물은 본 발명의 문맥에서 사용된 의미 내의 상이한 매트릭스를 나타낸다. 흡착제 상의 흡착 특성에 대해 시험하고자 하는 전체 혼합물(혼합된 표적 및 매트릭스)은 또한 "샘플"로 명명되는 분석적 문맥에 있다.
본 발명의 흡착제와 처리하기 전에, 미가공 화학적 또는 생물학적 물질은 추가의 예비-처리를 통해 추가의 비-파괴적 단위 작업에 의해 부분적으로 정제될 수 있고, 특히 전형적인 분리 과정은 여과(마이크로- 또는 울트라여과를 포함함), 투석, 전기투석, 세척, 침전, 원심분리, 이온 교환, 겔 여과, 용해, 증발, 결정화, 건조, 연마, 임의의 방식의 바이러스 리덕션 치료, 및 또한 통상적인 크로마토그래피(저 특이성의 흡착제 상의 크로마토그래피 또는 생물학적 잔기와의 통상적인 친화성 크로마토그래피 중의 하나)를 포함해서 실현가능한 만큼 많은 폐 물질(예를 들면, 생물학적 물질의 경우에 중요한 물질만을 남기면서 가용성 물질 및 단백질, 핵산, 탄수화물, 지방, 및 무기물의 다수), 해롭거나 공격적인 물질 또는 화학적 또는 생물학적 물질로부터 흡착제를 악화시키거나 이의 분리 능력을 감소시킬 가능성이 있는 이들 물질을 제거함으로써 이들이 흡착제와 접촉하기 전에 표적의 농도를 증가시킨다. 이 문맥 내에서, LC/LC-커플링 기술을 참조한다. 건조 혼합물, 예를 들면, 냉동-건조되거나 동결건조된 물질은 이들이 흡착제와 처리되기 전에 적합한 공급 흡착제 중에 처리될 필요가 있다. 용해된 혼합물은 균질되고, 현탁되거나 콜로이드성 입자가 없는 것이 바람직하다. 유사하게는, 본 발명의 분리 방법은 또한 상기 주어진 종류의 하나 이상의 단계로 순서대로 혼합될 수 있다.
많은 단백질 또는 펩타이드는 산업용 크기로 이미 제조되고 약품, 영양(예를 들면, 식품 보조물), 미용, 또는 농업에서 적용되어 왔다. 대부분의 큰-규모 생산품은 현재 경제적으로 합리적인 시간 내에만 생물량, 즉, 예를 들면, 약용 식물, 원핵 또는 진핵 미생물을 사용하는 미생물 발효, 또는 곤충 또는 포유동물 세포까지의 고등 유기체의 세포 배양(예를 들면, CHO, NSO, BHK, 또는 고정된 HeLa 세포가 빈번히 사용됨)으로부터 수득된 생물학적 물질의 추출로 달성될 수 있다. 요약하면, 본 발명에 따른 혼합물의 빈번한 공급원은 따라서 생합성적 생성물, 예를 들면, 미생물 또는 세포 배양, 또는 작물 추출물로부터 수득한 것들이다.
미생물 발효는 박테리아 또는 곰팡이(예를 들면, 효모) 균주의 침수되거나 부유한 배양을 포함한다. 생성물은 전체 유기 수확물 또는 분리 부분, 예를 들면, 균사체 및/또는 이들이 배출될 수 있는 상응하는 배양 배지 상청액으로부터 추출할 수 있다. 반-합성 과정은 천연 제품 또는 중간체의 하류 화학적 개질 및 합성 공급재료의 생전환을 포함한다. 모든 경우에서, 부 생성물은 종종 단백질 동종형, 불완전한 형태 및 축적된 중간체 또는 표적된 단백질 또는 펩타이드를 유도하는 생합성 경로를 따른 후처리 제품을 포함한다. 이들은 추가로, 편재하여 배출된 항체, 내독성, 마이코톡신, 발열원, 세포 증식의 촉진자 또는 억제제, 프로테아제 억제제, 소포제, 불완전히 소화된 영양물의 잔류, 부분 분해의 제품, 및 고분자량 및 부분적으로 불용성 성분(예를 들면, 세포 잔해)과 함께 있어 생성한 유기체의 세포 용해의 최종-단계를 야기할 수 있다. 세포 용해물은 종종 핵산과 같은 추가의 물질 종류 및 많은 수의 추출가능한 매질 내 일명 소위 숙주 세포 단백질의 방출로 인해 혼합물의 복잡성을 추가로 증가시킨다.
본 발명의 분리 방법과 관련된 용어 "분리"는 혼합물의 부분으로 분리 또는 분할하는 모든 종류를 포함하는 것으로, 특히 하나 이상의 구조적으로 상이한 성분을 나누며, 액체에 분자적으로 용해되고, 이들을 상이한 액체 분획 내에 확산시킨다. 혼합물의 하나의 현저한 성분은 적어도 하나의 기타 혼합물 성분으로부터의 분리를 경험해야 하는 표적 단백질 또는 펩타이드이다. 따라서, 표적이 하나의 분획에 분리되고 부 생성물의 집합이 하나의 기타(공통의) 분획으로 분리되든지, 또는 각각의 개별 혼합물 성분이 임의의 기타 성분으로부터 자체 분획으로 분리되거나, 또는 상기 방법이 이들 극단 사이에 위치된 임의를 생성하는 경우이든 간에 문제가 되지 않는다. 상기 방법을 수행한 후 수득한 적어도 하나의 액체 분획 중에 있는 경우 원래(공급) 혼합물 중에 이미 존재하는 적어도 하나의 용해된 단백질 또는 펩타이드의 강화가 관찰되는데 충분하다. 분리된 부 생성물은 별개의 액체 분획으로서 반드시 회수될 필요가 없고; 이들은 또한 예를 들면 버려진 흡착제에 결합한 채로 유지될 수 있다. 분리 과정이 바람직한 생성물의 값을 함유하는 분획 내 수율 손실을 야기하는 불완전한 과정으로 남는 경우는 흔하지 않을 것이다. 용출 밴드와 중첩되는 것을 피하는 선명한 분획은 추가의 수율 손실의 비용면에서 분리의 질(즉, 순도)을 증가시킨다.
용어 "농도" 및 "순도"는 혼합물에서 각각의 물질의 주어지거나 달성가능한 분획 함량에 관한 것으로 용어 농도는 총 관련된 양의 혼합물 중의 용매의 양을 포함하는 용액을 언급하는 반면, 용어 순도는 용매(잔류 물을 포함함)를 고려하지 않고 (때때로 가설에 근거한) 건조 혼합물을 언급한다. 보다 빈번하게는 분자 또는 몰 분획(량/량, 량/용적, 몰/몰, 몰/용적)으로 나타낸다. 이에 따라 높은 순도는, 특정 시스템에 달성되도록 보다 중요한 목적에 좌우하여 더 높은 희석액(즉, 낮은 농도)의 비용에서 달성될 수 있거나 또는 그 반대도 가능하다. 본원에 사용된 이들 지시기의 실제 값을 결정하기 위한 측정은 HPLC 피크 면적으로, 중량을 제외하는 모든 정량 방법은 검출이 잘 되는 혼합물 성분 대 검출이 안 되는 혼합물 성분에 대한 특정 성향을 나타내는 것으로 알려져 있고, 또한 비-선형 교정 커브를 산출할 수 있다. 예를 들면, 불용성 물질은 HPLC로 정량화할 수 없다. 이를 근거로, 분리 및 예비-처리하는 방식으로, 혼합물은 전형적으로 1% 내지 99%, 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 50%의 (혼합된) 순도로 표적된 단백질(들) 또는 펩타이드(들)를 함유할 수 있고, 부 생성물 또는 성분인 잔류는 잔류 용매, 시약 등과 같은 표적에 구조적으로 기능적으로 관련되지 않는다. 실제 정제 작업에 좌우하여, 본 발명의 분리 방법은 이에 따라 희석되거나 미정제 혼합물 외에 초기 포획 또는 분리 단계로서, 또는 대부분 순수한 표적 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 이미 예비-정제된 혼합물의 최종 연마 단계로서 둘 다 사용될 수 있다. 부 생성물의 수 및 혼합물의 기타 성분은 하나(예를 들면, 단일-지점 서열 변이 또는 결손) 내지 본질적으로 무수한 수(예를 들면, 비처리된 생리학적 샘플)의 범위일 수 있다. 부 생성물의 종류는 미가공 물질의 공급원 및 전 처리에 좌우된다.
용어 "접촉"은 현상적(웨팅) 규모 및 분자적(표면 또는 기공 확산) 규모 둘 다로 상들 사이에 물리적 접촉함으로써 고체(정지)상으로서 흡착제를 갖는 액체(이동)상으로 존재하는 초기(공급) 혼합물의 임의의 적절한 처리를 의미한다. 형성된 접촉은 혼합물의 모든 분자적 성분, 적어도 표적 단백질 또는 펩타이드를 가능하게 분산할 수 있도록 충분히 강해서 잔류가 위치한 모든 외부 및 임의의 내부 흡착제 표면에 도달해야 하며 이들과 상호작용해야한다. 접촉 형성은 정지 또는 (플러그, 적층, 거친 등)의 유동 조건, 예를 들면, 흡착제 입자의 고정되거나 유체화된(확장된) 베드 위에 발생할 수 있다. 혼합물이 제1 용액(공급 용액 또는 흡수 용액) 중에 용해되기 때문에, 이는 불균일한 과정일 것이고, 접촉 형성은 생성 현탁액의 교반 또는 진동을 통해 육안으로 보이도록 가속화될 수 있으며, 비록 표적 단백질 또는 펩타이드 및 임의로 부 생성물의 흡착제로의 정상-상태 결합 평형이 도달하지 않는 한, 이들 작동적 단계를 종결하기 위해서 시간적 제한은 없다.
본원에 사용된 것처럼, 용어 "액체"는 분리하고자 하는 혼합물의 하나 이상의 성분에 대해 적어도 약한 가용 특성을 갖는 용매의 임의의 용제(가장 중요한 것으로서 물을 포함함) 또는 혼합물에 관한 것이다. 상이한 조성물의 액체는 상이한 단계의 방법에서 흡착제의 처리에 사용할 수 있는데 그 이유는 각 단계에서 이에 사용된 각각의 액체가 예를 들면, 표적 흡착(결합), 표적 탈착(방출), 또는 흡착제 세척을 할 수 있어야 하는 특정 작업을 충족시켜야 하기 때문이다. 크로마토그래피의 환경에서, 흡착제를 갖는 하나 이상의 혼합물의 성분의 역학적 평형 교환을 가능하도록 하는 액체를 종종 이동 상으로 명명한다. 본 발명의 흡착제 상에 크로마토그래피 분리는 강한 극성 및 소수성 상호작용 둘 다에 우세하게 좌우되며, 각각의 혼합물 구성성분에 대해 차별화하는 용매화 성능을 갖는 광범위하게 다양한 액체 조성물이 우호적인 상호작용의 종류에 좌우되어 사용될 수 있다. 시간이 지나면서 분리 방법의 임의의 주어진 단계의 임의의 또는 모든 이들 상호작용의 강도를 추가로 조절하기 위해서, 상기 단계, 예를 들면, 구배 혼합(gradient mixing)을 통해 사용된 액체의 조성물을 점차적으로 변화시키는데 참고할 수 있다. 따라서, 특정 작업을 충족하는데 사용된 액체의 조성물은 사용된 과정 단계의 전체 시간을 벗어나 일정할 필요가 없다. 표적 단백질 또는 펩타이드의 특정 용해도는 또한 적절한 흡착 및 용출 액체가 선택되는 경우 고려되어야 한다. 막-결합된 단백질을 제외하고, 단백질은 이들이 자연 상태에서 보존되고 응집이 방지되어야 하는 경우, 정상적으로 높은 수용액 함량의 사용을 필요로 한다. 많은 단백질 또는 펩타이드는 중간 내지 높은 퍼센트의 디메틸 설폭사이드, 디메틸 포름아미드, 아세토니트릴. 또는 낮은 알콜 및 글리콜을 함유한다. 본 발명의 흡착제는 모든 양성자성 및 비양성자성 유기 용매에 화학적으로 저항적이기 때문에, 특히 담체에 포함된 벌크 고체 지지 물질이 액체와 직접적으로 접촉하는 물질인 표면 중합체 필름으로 보호되는 경우, 흡착제 또는 위에 위치한 적어도 상기 임의의 중합체 필름의 팽창을 용이하게 하는 우세하게 극성인 액체가 추가로 바람직하다. 이로써 상호가능한 액체 혼합물의 정확한 극성은 조성물에 대해 쉽게 미세-전환될 수 있다.
또한, 이러한 액체 또는 액체 혼합물에, 소량의 -바람직하게는 휘발성- 산, 염기, 또는 완충제와 같은 보조 물질을 가하는 것이 바람직할 수 있으며, 이에 따라 적용된 액체(또는, 부분적으로 유기 용출제, 명백한 pH)의 pH의 조절을 통해 상이한 용매화 능력과 이에 따른 흡착제의 선택되거나 모든 분석물 및/또는 선택되거나 모든 잔기의 양성화 및/또는 탈양자화의 정도 사이에서 변화시킬 수 있다. 이러한 측면에서 유용한 물질은, 예를 들면, 포름산, 아세트산, 트리풀루오로아세트산, 및 이의 염이다. 높은 농도의 불활성, 유기 또는 무기 염의 첨가는 또한 액체의 이온성 강도를 변화시키는데 사용될 수 있고, 이에 따라 분석물과 흡착물 사이에서 경쟁적 상호작용을 통해 이온 쌍을 선택적으로 절단한다. 그러나, 제조 적용에 있어서, 이러한 비-휘발성 염 첨가물은, 표적 단백질 또는 펩타이드가 결정화로 추가로 정제하고자 하는 경우 회수된 용출제로부터 후에 제거하는데 어렵다.
특정 환경 하에 단백질 또는 펩타이드 혼합물의 분해에서 흡착제와 함께 추가의 유기적 개질제를 사용하는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 액체 pH 또는 이온성 강도의 순수한 조절을 넘어 도달하는 메카니즘에 의해 작용한다. "개질제"로서, 소분자 또는 거대분자 또는 이의 혼합물을 합한 것으로, 자체의 용매화 특성을 갖는 액체는 아니지만, 본 발명의 분리 방법에 사용된 하나 이상의 각종 액체 중에 소량으로 용해되거나 현탁될 수 있어서 혼합물의 특정 성분의 용해/용출을 돕거나 방지하여 상기 방법의 특정 단계 동안, 또는 다수의 2차(기술적) 이유에 대해, 예를 들면, 장기간 안정화 및 용매의 저장, 흡착제 생물 부착 방지, 화학적 또는 생물학적 분해 또는 응집으로부터 분석물의 보존, 향상된 용매 혼화성, 흡착제 팽창, 향상된 분석물 검출, 물 구조의 분해, 제어된 단백질 언폴딩 또는 리폴딩 등에 대해 각각의 분리 문제에 좌우하여 분리된다. 유기 개질제의 특정 예는 이온 결합 시약, 계면활성제(표면활성제) 및 카오트로픽 시약이다.
"세정", "세척" 및 재생성"은 상이한 종류의 액체를 갖는 동일한 흡착제의 단계적 처리를 더욱 구별하는데 사용하는 상이한 표현이다. 이로써 상기 액체는 이의 조성물 보다 이들이 수행하는 작업에 의해 구별된다. 실제적 과정의 처리는 매우 유사할 수 있고, 단지 때때로 처리한 후 용해된 물질을 기초로 액체가 추가적으로 정제, 분별, 재수집, 또는 폐기되어야 하는 지에 대한 결정에 의해 상이할 수 있다. 세척은 흡착제로부터 이상적으로 가용화되고 방출되는 액체로 처리하는 것으로 표적을 제외한 임의의 혼합 성분은 흡착제에 비특이적으로 결합할 수 있다. 세척은 흡착제로부터 가용화되고 방출되도록 의도된 처리에 관한 것으로 모든 잔류 결합 혼합 성분은 심지어 표적 보다 더 강하게 결합할 수 있다. 재생성은 액체를 세척하는 흔적을 제거하고, 다음 수행 방법의 시작에서 흡착 단계에 사용하기 위해 깨끗한 흡착제의 이상적인 물리적 화학적 특성을 회수할 수 있는 액체의 사용에 관한 것이다.
"고정"은 흡착제의 표면 위에 단백질 또는 펩타이드의 긴-범위 측 및/또는 수직 이동을 제거 또는 실질적으로 방해하는 방법을 의미하는 것으로, 통계, 확산 이동(브라운 운동) 또는 직접적인 물리적 또는 화학적 힘(예를 들면, 삼투압, 전단 유동) 중의 하나에 의해 야기될 수 있다. 표면의 흡착 부분 상의 고정화된 단백질 또는 펩타이드의 육안으로 보이는 2차원 또는 3차원 위치는 단시간 규모에 고정되는 것으로 간주될 수 있다. 고정화의 중심 주위의 나노미터의 순서로 된 필연적 작은 변동, 예를 들면, 구조적 변화, 분자적 회전 또는 진동, 인접한 결합 부위 사이의 호핑(hopping), 또는 단백질 또는 펩타이드 자체 및 결합되는 잔기 뿐만 아니라 표면에 각각의 결합 부위 잔기의 고정에 적용된 (선택적으로 중합체성) 매듭의 혼합된 반경 내 임의의 변형 운동은 여전히 영향을 미치지 않는다. 결합 표면 층을 많은 시간 동안 횡단하여 결합 단백질 또는 펩타이드의 서방출 또한 목적하는 특성이 될 수 있다.
조성물을 한정하는 주요 양태에서, 본 발명은 신규한 흡착제의 표적-특이적 설계를 향하고 있다. 기능기를 갖는 고체 지지 물질은 이후 표면 유도화에 사용되어 왔으며, 내부에 포함된 표적 단백질 또는 펩타이드와 다가 및/또는 다기능으로 공간적 상호작용하는데 적합한 다중 잔기의 2차원 또는 3차원 배열을 수득하였다. 각종 잔기를 시험한 후, 이핵 및 단핵 헤테로방향족 잔기 둘 다를 갖는 고체 지지 물질의 기능기의 부분의 2배 유도가, 헤테로방향족 잔기를 포함하는 흡착제가 고정상으로 사용되는 경우 서로 또는 이의 부 생성물로부터 단백질 또는 펩타이드의 이후 크로마토그래피 분리에서 우수한 성능을 생성하는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 일반적인 측면은 고체 지지 물질을 포함하는 흡착제를 기재할 수 있고, 이의 표면은 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기, 및 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 단핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기를 포함한다.
본 발명의 보다 특정한 특면은 "본 발명의 요약"에 명시된 것처럼 제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 국면에 따른 흡착제와 기재될 수 있다.
제3 국면 및 제5 국면에 따른 흡착제의 기재에 사용된 용어 "여기서, 상기 기능기는 상기 제1 잔기 및 제2 잔기 둘 다를 포함하지 않는다"는 담체의 표면의 이용가능한 기능기의 5% 미만, 바람직하게는 1% 미만, 보다 바람직하게는 0.1% 미만을 의미하고, 여전히 보다 바람직하게는 기능기가 제1 잔기와 제2 잔기 둘 다를 수반하지 않는 것을 의미한다.
특정 양태에서, 기능기가 제1 및 제2 잔기를 수반하는 것은 일반적인 분석 방법, 예를 들면, 분광기 방법으로 검출가능하지 않다.
흡착제의 상기 고체 지지 물질은 폴리스티렌, 폴리스티렌 설폰산, 폴리아크릴레이트, 폴리메트아크릴레이트, 폴리비닐 알콜, 실리카, 글라스, 전분, 셀룰로스, 아가로스, 세파로스, 및 덱스트란, 또는 이의 임의의 조성을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 고체 지지 물질은 일반 벌크 또는 추가의 표면-개질된 물질의 종류에 포함되어서 예를 들면 표면 기능기를 도입하거나 수성 습윤성을 증가시킬 수 있다.
특정 양태에서, 흡착제는 쉽게 검출가능한 태그, 예를 들면, 임의의 흡착, 임의의 방출, 방사능, 또는 질량- 또는 무선주파수-암호 태그를 포함할 수 있다. 태그를 사용하여 흡착제 혼합물 중에 잔기의 각각의 조합을 가진 특정 흡착제를 식별하거나 또는 단백질 또는 펩타이드 결합의 검출을 용이하게 할 수 있다. 상기 태그는 고체 지지 물질의 코어 내로, 또는 이의 표면 위로 잔기와 함께 삽입될 수 있다.
C, N, O, S-헤테로방향족 구조에서, 이들이 상기 언급된 바와 같이, 특히 일부는 소 유기 분자, 예를 들면, 도 3 및 도 4에 나열된 목록과 같이, 소 유기 분자의 화학적 구조에서 빈번히 발생한다. 적어도 하나의 환 내에 적어도 하나의 질소 원자를 함유하는 헤테로방향족 구조는 2개의 잔기 유형에서 바람직하다. 전형적인 헤테로방향족 구조의 환 코어는 -NH-, C=N, -O- 또는 -S- 유형의 하나 이상의 잔기 내지 C-C 또는 C=C 잔기에 주로 집합될 것이다. 5원 및 6원 환 코어는 엄격하게 바람직하다. 주어진 특정 단백질 또는 펩타이드에 대한 흡착제의 특정 친화성의 미세-조정은 각각의 헤테로사이클릭 코어 및 치환체의 주의 깊은 선택, 제1 및 제2 잔기의 몰 비, 및 임의의 추가 잔기의 도입을 통해 달성된다. 따라서, 전체 가변성은 철저하게 처리될 수 없는 것이 분명해질 것이고; 대신에 존재하는 요구에 따라 흡착제를 제조하는 개념적 구조가 주어질 것이다.
간단성을 위해서, 단지 하나의 메조머 형식이 도 3 및 도 4에서 각각의 구조에 대해 도시한다. 또한 본 발명의 목적에 대해, 추가적 비-헤테로방향족 화학식이 가능할지라도 이러한 구조의 헤테로방향족 특성의 적어도 하나의 합리적인 메조머 또는 토토머(tautomer) 식이 존재하는 경우, 용어 "헤테로방향족"의 의미와 충분하다. 환 시스템과 잔기의 잔류 사이의 연결, 및 이에 따른 고체 지지 물질은 부착점으로서 헤테로원자에서 자유 결합가를 포함하여 임의의 환 원자를 통해 달성될 수 있다.
특히, 하나 이상의 약한 기초 환 질소를 함유하는 것으로 나타나는 일부 헤테로방향족 구조는 이온 발생으로, 전자적으로 중성 원자 또는 이를 함유하는 임의의 그룹이 분리 조건 하에 수행되어서(즉, 흡착제 또는 분석물의 구조적 통일성에 영향을 미치지 않는 일반적으로 저 또는 주변 조건) 역으로 양이온 또는 음이온으로 전환될 수 있고(예를 들면, 양성자화 또는 비양성자화에 의함) 비변화된 형태로 주변 조건 또는 평형에서 안정하다. 보다 구체적으로, 흡착제의 C, N, O, S-헤테로방향족 잔기는 적어도 부분적으로 양성자화할 수 있고, 이에 따라, 적어도 부분적으로 이의 양성자화된 형태로 존재할 수 있다. 전하된 형태가 도면에서 명백하게 도시되지만, 평형은 주어진 상태하에 거의 전체적으로 실제로 존재할 수 있지만, 전하 및 비전하된 형태 사이에서 측정가능한 상호 전환이 될 수 있다. 양성자화는 환경적 pH에 좌우되지만, 또한 대다수의 비양성자성 유기 용매에서 일반적으로, 이는 2개의 형태 또는 이중 하나가 흡착제에 의해 나타난 친화성에 책임이 있는 지에 대해 구별하는 것을 어렵게 한다. 각각의 잔기의 양성자화의 정확한 정도는 사용된 이동상과 흡착제의 예비-조건의 방식으로, 존재하는 염기성, 산의 농도와 종류에 좌우될 것이다.
특정 분리 작업에 따라, 흡착제와 분리되는 혼합물을 처리하여, 비전하된 상태에서 우세하게 또는 전하된 상태에서 우세하게 되도록 조건화되는 잔기를 나타내거나, 또는 분리(예를 들면, 약한 이온 교환으로부터 공지된 완충 교환에 의함) 동안 1회 이상 전하 상태를 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 흡착제의 이온성 헤테로방향족 구조가 부분적으로 이온화가능한 조건이 또한 가능하며, 각각의 헤테로방향족 구조의 pK 값을 도달하는 pH의 환경에서 분리가 수행되는 경우 쉽게 예측할 수 있다. 또한, 전하된 상태에서 흡착제를 제조 또는 저장하면서 전하된 상태에서 분리를 수행하는 것이 필요할 수 있으며, 또는 그 반대도 가능하다.
대략 중성 pH의 수성 완충 시스템을 포함하는 흡착제의 예비-조건이 바람직한데, 특히, 아민 구조(아래 참조)를 포함하는 추가의(제3) 잔기가 존재하는 경우 바람직하다. 이러한 처리는 각 부분의 암모늄 구조 또는 기타 이온성 잔기에 속하는 반대이온의 균일한 분포를 성립할 것이다. 분석물을 향하는 잔기로 나타낸 수소 결합의 강도는 또한 주위 용매화물 쉘 내 유지되고 양성자화된 잔기를 갖는 이온 쌍을 형성하도록 예측되는 반대이온의 특성, 이의 염기성 및/또는 이의 <<강>> 대 <<연>> 편광성 특성에 영향을 미친다.
추가의 치환체는 이핵 및/또는 단핵 C, N, O, S-헤테로방향족 구조, 각각에 결합할 수 있고, 독립적으로 2 종류의 구조에 대해 선택될 수 있다. 도 5에서 예시적 구조가 나타나며, 여기서 치환체 R1,,,,, Rn은 전자 쌍, 수소 (H), 유기 라디칼 또는 표면 결합을 나타낸다. 특정 환 기하학 또는 치환 패턴에 한정되지 않고, C, N, O, S-헤테로방향족 구조의 적합한 치환체는 특히 하나 이상의 다음 단순한 유기 라디칼로 이루진 것을 포함할 수 있다: C1-C20 선형 또는 분지형 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 사이클로알킬옥시, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 알킬티일, 알케닐티일, 알키닐티일, 사이클로알킬티일, 아릴티일, 아릴알킬티일, 할로겐알킬, 할로겐알케닐, 할로겐알키닐, 할로겐사이클로알킬, 할로겐아릴, 할로겐아릴알킬, 할로겐알킬옥시, 할로겐아릴옥시, 할로겐알킬티일, 할로겐아릴티일, 또는 할로겐아릴알킬티일. 특히, 치환체는 적어도 하나의 추가 이핵 또는 단핵 C, N, O, S-헤테로방향족 구조 또는 임의의 방식으로 결합된 헤테로원자를 함유할 수 있고, 특히 도 3 및 도 4에 나타난 목록으로부터 취해진다. 또한, 둘 이상이 치환체, R1, ,,,,, Rn은 임의의 종류 및 길이의 지방족 결합으로 서로 연결될 수 있지만, 특히 임의의 앞서 언급된 유기 라디칼 또는 이의 조합을 통해서 다환식 환 구조를 형성할 수 있다. 그러나 다핵 C, N, O, S-헤테로방향족 구조(융합된 방향족 환의 수 ≥ 3)으로의 축합은 배제되는데 치환체가 영구적인 양이온-교환 그룹을 포함하기 때문이다.
바람직한 이핵 구조는 벤조피롤(인돌) 구조로, 모든 가능한 아자-벤조피롤, 옥사-벤조피롤, 및 티아-벤조피롤 구조, 또는 벤조피리딘(퀴놀린 또는 이소퀴놀린) 구조를 포함하고, 모든 가능한 아자-벤조피리딘 구조를 포함한다. 바람직한 단핵 구조는 피롤 구조이고, 모든 가능한 아자-피롤, 옥사-피롤, 및 티아-피롤 구조를 포함한다. 여기서, 3-아자피롤(이미다졸) 구조는 특히 바람직하다.
본 발명의 완전히 합성적인 흡착제는, 표면-결합된 잔기가 자체로 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 부분이고 공지된 생물학적 리간드-수용체 상호작용과 근접하게 비슷한 통상적인 친화성 매질로부터 추가로 구별되어야 한다. 일반적으로, 이러한 매질은 초기에 언급된 단점이 있다. 천연 아미노산인 트립토판 및 히스티딘은 또한 각각 이의 측쇄에서 이핵 또는 단핵 C, N-헤테로방향족 구조를 함유하기 때문에, 임의의 폴리펩타이드 잔기 또는 이의 그룹-보호된 변이체는 순차적으로 고체-상 합성 기술로 쉽게 제조될 수 있고, 본 발명에 따른 잔기로서 이론적으로 수행할 것이다. 따라서, 잔기로서 트립토판 또는 히스티딘, 이의 에스테르 또는 카바메이트, 또는 이들 중의 하나를 포함하는 임의의 펩타이드가 본 발명의 범위 내에 없음을 분명히 하도록 해야 한다. 그러나, 이는 트립토판- 또는 히스티딘- 관련된 제조 블록을 함유할 수 있는 임의의 합성적 및 우세하게 비-펩타이드성 구조에 대한 것은 사실이 아니다.
각각의 잔기와의 대략 동등한 정도의 유도작용은 바람직하고, 즉, 제1 및 제2 잔기는 약 1:1의 몰 비, 광범위한 범위에서 적어도 3:2 내지 2:3의 몰 비로 존재할 것이다. 혼합된 제1 및 제2 잔기에 대한 유도의 정도의 합은 바람직하게는 적어도 50%(유도에 이용가능한 기능기의 수를 기초로 함)에 근접하게 유지해서 혼합된 조성물의 다원자의 상호작용 부위를 형성하는 것을 촉진하면서도 여전히 표적 단백질 또는 펩타이드에 대한 흡착체의 결합 능력을 높게 유지하는 것이 바람직하다. 제1 및 제2 잔기 둘 다는 예를 들면, 각각 25%에 근접한 유도의 정도에서 존재할 수 있다. 바람직한 제3 잔기(아래 참조)는 아민 또는 아미드, 보다 바람직하게는 1차 아민 구조를 포함한다. 이러한 경우, 제1, 제2 및 제3 잔기는 각각 약 1:1:2의 몰 비로 존재한다. 이들 계산 값의 10%의 관련 유도는 용인될 수 있다.
하나의 양태에서, 기능기의 5 내지 95%는 상기 이핵 및 단핵 헤테로방향족 구조에 결합되며, 바람직하게는 15 내지 85%, 보다 바람직하게는 25 내지 75%, 여전히 보다 바람직하게는 35 내지 65%, 추가로 바람직하게는 40 내지 60%가 연결된다. 제1 및 제2 잔기의 비는 자유롭게 선택할 수 있기 때문에, 주어진 범위 내에서 흡착제를 특정 분리 문제, 예를 들면, 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 혼합물로부터 단백질 또는 펩타이드의 분리에 대해 최적으로 조절하거나, 또는 흡착제를 조절하여 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 혼합물로부터 펩타이드 또는 단백질의 농도 및/또는 순도를 최적으로 증가시키는 것이 가능하다. 이러한 가변성은 언급된 분리 또는 증가 및/또는 순도 문제에 대해 본 발명에 따른 흡착제 또는 흡착제들을 특히 유용하게 한다.
따라서, 하나의 양태에서, 기능기의 5 내지 95%는 상기 이핵 및 단핵 헤테로방향족 구조에 결합되며, 바람직하게는 15 내지 85%, 보다 바람직하게는 25 내지 75%, 여전히 보다 바람직하게는 35 내지 65%, 추가로 바람직하게는 40 내지 60%로 결합되며, 여기서, 제1 및 제2 잔기는 3:2 내지 2:3의 몰비로 존재한다.
잔기 부착의 유형은 임의의 변이체의 공유 결합(호모- 또는 헤테로 원자성, 가변성 결합 순서)일 수 있고, 고체 지지 물질의 표면 또는 상기 표면을 커버하는 임의의 중합체 필름 상의 중합체 그룹과 직접적으로 이루어질 수 있으며, 주요요소 또는 부속 선형 또는 분지형 측쇄에 부착되거나 또는 임의로 이작용성 링커의 말단을 통해 결합된다. 표적 단백질 또는 펩타이드와 선택적으로 상호작용하여 지정된 부분의 제1 및 제2 잔기인 헤테로방향족 구조에 추가하여, 이들 잔기는 이에 따른 공유 링커를 포함할 수 있다. 이러한 이작용성 링커는 길이에서 길이 및 화학적 조성물에서 가변성이 크게 가능하기 때문에 도면에서 의도적으로 도시되지는 않았지만, 표준 고체 상 합성 또는 생체 접합(예를 들면, 석시닐)로부터 공지되고; 가장 단순한 이작용성 링커는 1 내지 약 20개의 원자의 예정된 수의 알킬렌 쇄일 것이다. 가장 적합한 링커는 구조적으로 유연한 링커이다. 중합체에 전체 잔기를 연결하는 바람직한 공유 결합은 아미드, 우레탄, 요소, 또는 2차/3차 아민 결합으로 이루어질 수 있다.
이러한 문맥에서, 링커로서 사용된 특히 긴 알킬렌 쇄 또는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 헤테로방향족의 주된 효과의 중합 또는 확장에서 단백질 또는 펩타이드 상에서 추가의 크게 비특정한 소수성을 발휘하는 것으로 언급되어야 한다. 앞서 기술된 황을 함유하는 링커는, 그러나, 쉽게 합성되고 활성화된 표면에 연결되며, 본 발명의 요점 내에 있지 않는데, 그 이유는 황 원자 또는 황-함유 그룹이 분석물의 분자 표면 상에서 동일한 종류의 상응하는 그룹과 잘 상호작용하는 것이 잘 공지되어 있고, 여기 제시된 흡착제의 결합 메카니즘과 충돌할 가능성이 있는 자체적으로 특정 선택성을 도입할 수 있기 때문이다.
따라서, 이러한 선택적 링커와 고체 지지 물질 및/또는 헤테로방향족 구조의 기능기 사이에 형성된 가능한 추가적 화학적 구조가 각종 분석물에 접근가능하고, 이에 따라 표적 단백질 또는 펩타이드의 선택적 유지력에 일조할 수 있음을 배제할 수는 없다. 각각의 잔기의 일부로서 헤테로방향족 구조와 고체 지지 물질의 표면 사이에 위치된 추가적 구조적 실체의 화학적 조성물에 관한 단지 실제적인 제한은 흡착제의 제조, 저장, 및 사용 동안 적용된 조건과의 화학적 안정성 및 호환성의 조건에 부과된다. 따라서, 각각의 잔기는 특정 부착 지점을 통해 하부-구조로서 스캐폴드 또는 더 높은 착물(중합체를 포함함)에 삽입되어 동일하고;하거나 상이한 종류의 추가의 잔기를 포함할 수 있는 것이 가능해진다.
상기 잔기를, 벌크 고체 지지 물질의 표면에 기능기과 공유 결합을 형성함으로써 직접적으로 커플링할 수 있다. 예를 들면, 실리카의 표면 실라놀 그룹에 대한 커플링 잔기를 선택하는 방법은 클로로실란- 또는 알콕시실란- 종결된 링커를 사용하여 수행되는 반면, 탄수화물 지지체의 하이드록실 그룹에 커플링되는 것은 전형적인 시아노겐 브로마이드 활성과 같은 다수의 방법을 통해 달성 될 수 있다. 이들 방법은 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
그러나, 바람직한 양태에서, 벌크 고체 지지 물질은 표면이 기능기를 갖는 중합체 필름으로 커버되는 담체 만을 나타내는 것으로 상기 중합체는 제1 및 제2 잔기 및 임의로 추가의 잔기를 수반한다. 따라서 얇은 내층이 형성되어 서로로부터 이격된 흡착제의 육안상 형태-한정 및 분석물-상호작용 부분을 이동시키지만, 전체 기초적인 표면 위상 기하학을 상당히 변화시키지 않고, 이에 따른 표면의 일부로서 고려된다. 잔기는 상기 중합체 기능기에 부착될 수 있어서, 사용된 기초 중합체는 적어도 부분적으로 유도화된 공-중합체로 전환될 것이다. 기능기를 갖는 적합한 중합체는 예를 들면, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐아민, 폴리알릴아민, 폴리에틸렌 이민, 폴리아크릴산, 폴리메트아크릴산, 및 적어도 하나의 이들 중합체를 포함하는 임의의 공중합체 또는 중합체 혼합이다. 특히, 고체 지지 물질이 표면이 중합체의 필름으로 추가로 커버되는 담체로서 벌크 중합체성 물질로 이루어지는 경우, 또는 비-중합체성 담체가 사용되는 경우, 담체가 이루어진 물질은 중합체의 필름이 이루어진 물질과 상이할 수 있다. 이러한 차이점은 예를 들면, 상이한 단량체 조성물, 중합체 위치- 또는 입체화학, 입체균일성(배열성), 분자량 분포, 가교결합 정도, 또는 이의 조합으로 나타날 수 있다.
중합체 필름의 정확한 두께 및 흡착제의 분리 역학 및 성능은 중합체의 팽창 상태에 의존하고, 자체는 항상 이동상 조성물의 기능이며, 이에 따라 상이한 외부 조건 하에서 변화할 수 있다. 수성 또는 혼합된 수성-유기 매질 중에 수행된 단백질 및 펩타이드의 분리에 대해, 중합체가 이러한 매질 중에 팽창가능한 경우 바람직하다. 중합체가 합성 폴리전해질인 경우 대부분 쉽게 달성된다. 위에서 설명된 것처럼, 임의의 가능한 이온성 잔기의 전하 특성은 또한 특정 정도로 중합체 필름의 팽창성에 영향을 미치고, 이는 다시 용매-의존적이다. 용어 "수성"은 50%를 초과하는 물의 용적을 함유하고, 나머지는 기타 물-혼화성 용매 또는 추가제, 예를 들면, 무기 또는 유기 완충제, 염 등인 액체를 설명하는데 사용된다.
이러한 형태는 기공 확산을 통해 이동상과 고정상 사이에서 일반적으로 높은 물질 이동률을 유지하도록 고안된다. 선형 또는 분지형 중합체 자체는, 중합체 필름이 수행되는 분리 과정의 조건을 견디고 전체 과정에 걸친 위치에서 유지되도록 하기 위해서 고정되고 단단한 담체의 표면에 견고하게 고정되어야 한다. 상기 고정은 연속적인 중합체 네트워크의 형성을 생성하는 각각의 중합체 가닥을 내부 가교결합함으로써, 또는 쇄를 따라 하나 이상의 위치에서 각각의 중합체 가닥을 담체 고체로 접목(grafting)함으로써 수행될 수 있다. 가교결합 및 접목(grafting)은 중합체의 동일하거나 상이한 기능기들 사이, 또는 중합체에서 임의로 존재하는 기능기과 피복되지 않은 담체의 표면에 존재하는 기능기 사이에서 쉽게 달성될 수 있다. 중합체의 바람직한 가교결합 또는 접목(grafting) 연결은 아미드, 우레탄, 요소, 또는 2차/3차 아민 결합으로 이루어질 것이다. 각각의 중합체 가닥의 말단 기능기는 접목(grafting)에 사용하는데 가장 좋으며, 가장 높은 쇄 유연성을 주는 엔드-온 구조를 생성할 것이다.
2개의 기술을 조합하는 것이 확실히 실현 가능하겠지만, 일반적으로는 이들 중 하나로 충분하다. 고정의 가장 바람직한 방법은 가교결합(접목(grafting)이 아님)이다. 중합체 쇄는 이에 따라 가교결합에 이용가능한 기능기의 수를 기준으로 1% 내지 20%의 정도로 서로 공유적으로 가교결합될 수 있다.
따라서, 추가적인 보충 잔기는 원칙적으로, 가교결합 시약이 하나 이상의 분석물과 상호작용하는데 적합한 화학적 구조를 함유하는 경우, 가교결합을 중합체 필름으로 도입시켜 야기될 수 있다. 중합체의 가교결합의 정도는 바람직하게는 비교가능하게 낮은 퍼센트에서 수행되기 때문에, 이의 분포는 오히려 무시할 수 있는 것으로 여겨진다. 통계적인 아민/아미드 또는 아민/우레탄 공중합체를 생성하는 불완전한 가수분해 반응을 통해 아미노 기능기를 함유하는 중합체 필름의 합성으로부터의 결과로서, 가변량, 일반적으로 1% 미만으로, 잔류할 수 있는 추가적 아미드(예를 들면, 포름아미드) 또는 우레탄 그룹의 분포에 대해 사실인 것으로 동일하게 생각된다.
결국 각각의 부분 구조의 정의에 따라 2개 이상의 상이한 제1 잔기 및/또는 2개 이상의 상이한 제2 잔기를 갖는 고체 지지 물질을 유도화하는 것이 가능하다. 이후에 이들은 헤테로방향족 구조로 또는 고체 지지 물질의 표면에 이들 구조를 연결하는 방식으로, 또는 둘 다로 서로 상이할 수 있다. 바람직한 양태에서, 제1 잔기의 총 수와 제2 잔기의 총 수(또는 각각 이들의 유도 당량의 정도)는 대략 동등해서 임의의(통계학적) 공간적 잔기 분포의 조건하에 모든 상이한 제1 및 제2 잔기를 포함하는 혼합된-조성물 결합 부위의 최대 수를 실현시킬 것이다.
일반적으로 바람직한 양태에서, 제1 및 제2 잔기는 서로 직접적으로 연결되지 않지만, 담체로서 벌크 고체 지지 물질 자체에 또는 지지되는 중합체 필름에 별개로 부착된다. 이핵 및 단핵 C, N, O, S-헤테로방향족 구조 둘 다는 2개의 구별가능한 실체이며, 각각은 벌크 고체 지지 물질 또는 중합체 표면에 자체 링커를 함유하고 -본 양태 내에서- 이들 사이의 가장 짧은 연결 경로를 구성할 것이다. 이러한 형태는 제1 잔기로부터 구조에 의해 쉽게 분리될 수 있는 제2 잔기를 만든다. 이에 따라, 이핵 헤테로방향족 구조 및 단핵 헤테로방향족 구조는 하나의 동일한 기능기를 통해 지지 물질의 표면에 연결되지 않는다.
반면, 동일하거나 상이한 종류의 2개 이상의 잔기는 중합체 필름의 주요소를 포함하지 않는 공유 결합을 통해 서로 직접적으로 또는 임의의 방식으로 또는 고체 지지 물질의 표면에서 연결될 수 있다. 이러한 경우에, 각각의 잔기들 사이의 경계는 흐려지기 시작하고 자유자재가 되는데, 흡착제의 유도 이력(즉, 유도 단계의 서열 및 종류)이 공지되는 경우에만 의미를 가질 수 있다. 도 1의 개략적인 대표도 A-H에서 예시적으로 도시된 것처럼, 고체 지지 물질의 표면 상에서 2개의 펜던트 기능기는 다수의 상이한 방식으로 2개의 상이한 잔기로 유도될 수 있다(수평의 긴 물결선은 추가의 잔기를 포함할 수 있는 표면의 일부를 나타낸다).
각각의 개별 기능기가 하나의 잔기를 함유(화학식 A 또는 B에서)하는 동등한 분포의 상기 언급된 경우에 추가하여, 이들은 또한, 예를 들면, 동일한 기능기 위로 연속하여 일렬(화학식 C, D) 또는 평행(화학식 E, G)으로 정렬될 수 있다. 이러한 구성은 무엇보다도 잔기가 중합체 또는 표면 기능기과 상이하거나 이와 상이한 기능기를 함유한다는 점에서 실험적으로 달성될 수 있고, 상기 제1 잔기를 갖는 중합체 또는 표면 기능기의 유도화 후, 제2 잔기(C 경우)로 자체로 유도(임의로 탈보호 및/또는 활성화 후)될 수 있거나, 또는 하나의 기능기가 적어도 2배(단일 단계 또는 다수의 연속 단계로)로 유지되는 점에서 달성되어서 일반적인 기능기(G 경우) 또는 분지형 구조(E 경우)를 갖는 링커가 두 개의 잔기(하나의 적절한 예는 1차 아미노 그룹의 2배 또는 3배 알킬화로 3차 아미노 또는 4차 암모늄 잔기를 수득할 것이다)로 분배되도록 한다. 그러나, 생성한 구성 C, D, E, F는 또한 교차 경로를 통해 달성할 수 있는데 여기서, 기능기를 갖는 표면 또는 중합체는 정확한 상호 배열 내 제1 및 제2 잔기 둘 다를 이미 수반하는 단일 유도 시약으로 유도된다. 2개의 잔기, 예를 들면, 대환 또는 다환형 환 시스템(F 및 H의 경우)의 보다 복잡한 상호 배열이 물론 예측가능하다. A를 제외하고 모든 경우에서, 제1 잔기로 유도화되는 기능기의 제1 부분은 제2 잔기로 유도화되는 기능기의 제2 부분과 항상 동일하다.
상기 기술된 모든 상황은 통합된 관점하에 각각의 잔기가 조직적인 순서로 배열되는 보다 일반적인 상황의 경계선 경우로서 간주될 수 있다. 본 발명의 이러한 해석과 특정 양태에 따라, 제1 (큰) 잔기는 이핵 C, N, O, S-헤테로방향족 구조에 추가하여 제2 (작은) 잔기를 포함하고, 여기서 큰 잔기를 선택하여 도 1의 일반적인 대표 I에서 나타난 것처럼 고체 지지 물질의 기능기를 직접적으로 유도하도록 한다. 이러한 경우에, 제2 잔기의 모든 원자 및 화학적 모이어티는 또한 제1 잔기에 함유된다. 이는 단지 하나, 또는 2개의 상이한, 구별가능한 잔기가 존재하는 것을 의미하고, 각각의 잔기는 이핵 및 단핵 C, N, O, S-헤테로방향족 구조 둘 다를 포함하는 모든 공유적으로 연결된 구조적 요소를 포함한다. 이렇게 주어진 계급적 순서 내에서, 기초적으로 임의의 유형의 연결 및 기하학(선형, 분지형, 환형 등)을 실현하여 제2 잔기의 원자와 구조전 실물을 제2 잔기와 중첩되지 않는 제1 잔기의 나머지에 부착할 수 있다. 이러한 환경하에, 구조적 계급을 2개의 잔기로 분리하는 것은 그러나, 형식상의 문제일 수 있고; 경계선에서, 화학적 특성은 통합적인 화학적 단위로서 전 구조의 합과 동일할 것이다. 다중 배열은 제1 및 제2 잔기 둘 다가 일반적인 단일 헤테로방향족 환 시스템을 분배하지 않는다는 것을 배제하고, 구조적 소단위의 2개의 잔기의 상호 배위에 대해 가능하다.
주어진 예들 중에서 하나는 일반적인 대표의 관점에서 재설명되는 경우, 무엇보다도 이러한 구성이, 2개의 상이한 헤테로방향족 구조가 이들이 자체의 고체 지지 물질의 표면에 부착되는 것을 통해서 일반적인 링커 또는 이의 부분을 공유한다는 점에서 실현될 수 있다. 2개의 헤테로방향족 구조는 링커가 분지형 구조를 갖는 경우, 동일한 분지 또는 상이한 분지 상에서 선형으로 배열될 수 있다. 전체 잔기, 즉, 최고 가능한, 균일한 구조적 단위(표면 기능기로 종결되는 가능한 링커 및 이와 연결된 모든 기타 하부구조를 포함함)는 이후에 -단지 형식적으로- 제1 잔기에 기인하지만, 제2 잔기는 -다시 형식적으로- 이러한 구성에서만 각각의 단핵 헤테로방향족 구조 및 전체(제1) 잔기의 나머지를 갖는 이의 즉각적인 연결 요소를 포함할 것이다.
상기한 2개의 구조적 특징의 조합을 포함하는 임의의 흡착제는 다수의 단백질 또는 펩타이드의 용이한 회수, 특정 예에서, 임의의 부분적으로 정제된 혼합물로 출발하는 단일 단계에서 98%를 초과하는 순도, 또는 1% 미만의 각 불순도의 최종 농도로 회수되는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 이에 따라 약제학적 등급은 고된 또는 번거로운 과정 없이 수득할 수 있다. 예를 들면, 산업 규모로 제조되어 생성된 미정제 물질 중에 단백질 또는 펩타이드의 농도는 또한 단일 단계에서 높은 수준으로 강화될 수 있다. 적용가능한 적정 농도는 혼합물 중에 약 1% 내지 약 90%의 범위일 수 있다. 상기 단계중의 회수된 수율은 적어도 통상적인 정제 방법만큼 높으며 95%의 값에 도달할 수 있다. 본 발명의 주어진 목적에 대한 2개의 상이한 헤테로방향족 구조의 2가지 종류의 잔기를 포함하는 흡착제의 현저히 양호한 성능은 훨씬 더 놀라운데 그 이유는 매우 관련있는 구조 또는 2개의 헤테로방향족 구조의 한 종류의 잔기를 포함하는 흡착제가 기껏해야 알맞은 분리 효능을 보여주었다고 나타낼 수 있기 때문이다.
이론에 얽매이지 않고, 단순한, 비유도화된 중합체성 아민의 필름으로 피복된 흡착제와 비교하여 특정 흡착제의 높은 성능은 추가적이고 구조적으로 신규한 다가 결합 부위의 존재에 기인할 수 있다. 이러한 신규 결합 부위의 생성에 관여하는 구조는 중합체의 부분적 통계적 전환에 우세하게 기여할 수 있다. 구조 중에서 특히 주목해야 하는 것은 연장된, 전자-풍부 또는 전자-부족 π-시스템 및/또는 상기 결합 부위 내 약한 염기도의 콘쥬게이트된 시스템의 전위 존재이다. 놓여 있는 상호작용 모드는 정전기력, 전하 이동 및 수소 결합과 같은 극성/비극성의 그룹, 및 소수성 상호작용 및 π-스택킹과 같은 무극성의 그룹을 포함하는 것으로 생각된다. π 시스템의 헤테로원자는 전자성 π 시스템 자체를 통하거나 또는 과잉 전자 고립 쌍을 통하든지 간에 쌍극자력 및 수소 결합의 전위 부위가 되는 것이 기대된다. 그러나, 주어진 분리에서 실제로 작동하는 메카니즘 및 전체 결합 강도로 각각의 잔기의 정확한 종류의 부분적 분포로 조사를 수행하지 않고는, 앞선 임의의 이러한 구조에서 정확한 결론을 도출할 수 없는데, 부분적으로 용매 분자와 경쟁하여 형성한 수소 결합이 상기 경우를 복잡하게 할 수 있기 때문이다. 입체 요소들은 추가적으로 고안된 흡착제의 선택성에 기여할 수 있다. 적어도 제1 및 제2 잔기로부터의 순수한 이온 분포는 존재하지 않거나 또는 심지어 배제될 수 있다.
또한, 많은 수의 상이하게 유도된 흡착제를 시험한 후, 제3 잔기의 존재가 제1 및 제2 잔기를 갖는 고체 지지 물질의 표면에서 기능기의 제1 및 제2 부분의 유도에 추가하여 본 발명의 주어진 분리 목적의 관점에서 우수한 결과를 나타냈다는 사실이 현저하게 밝혀졌다. 따라서, 고체 지지 물질은 제3, 제4, 및 제5 잔기 등으로 추가로 유도될 수 있다. 고체 지지 물질을 포함하는 흡착제는 이의 표면에 제1 및 제2 잔기에 추가하여, 상기한 것처럼, 또한 제3 잔기를 포함하고, 따라서 이는 본 발명의 추가의 양태가 된다. 이핵 또는 단핵 C, N, O, S-헤테로방향족 구조는 제3 및 각각의 추가 잔기의 구조적 제조 블록으로서 배제된다. 이러한 배제에서 벗어나, 2개의 잔기 사이에 가능한 구조적 관계에 관한 모든 선택은, 제1 및 제2 잔기에 대해 도 1에서 예시적으로 나타낸 것처럼, 제3 및 제1, 제 3 및 제2, 및 임의의 추가 잔기 사이의 상호 관계에 유사하게 적용된다. 상이한 종류의 각각의 추가적 잔기는 주어진 단백질 또는 펩타이드에 대해 매우 특이적인 결합 부위를 생성하는 흡착제의 전위를 촉진시켜 매우 관련있는 부 생성물과 구별하도록 한다. 그러나, 각각의 잔기의 종류는 적어도 약 20%의 유도의 정도로 존재해야 하는데 그 이유는 현저히 낮은 정도의 유도가 통계적 이유로 대부분의 경우 소홀히 할 수 있기 때문이다. 대부분의 적용에 있어서, 따라서, 동등한 정도의 유도에서 잔기의 수가 5 이하로 분류되도록 유지하는데 충분하다. 상이한 잔기의 수와 상호 비율에 관계없이, 각각의 유형의 잔기는 고체 지지 물질의 표면 상에서 여전히 균질하고 임의적으로(통계적으로) 분포되어야 한다.
기능기의 상기 제1 부분은 기능기의 제2 부분을 포함할 수 있는 반면, 서로 상이할 수 있으며, 제3 잔기는 제1 및 제2 잔기의 부분을 갖는 고체 지지 물질의 표면 기능기의 불완전한 유도로부터 발생할 수 있다. 사용된 시약과 합성 조건에 따라, 유도 반응은 불완전한 것으로 남는다. 따라서, 유도하고자 하는 물질을 커버하는 임의의 기초 중합체를 포함하는 고체 지지 물질의 표면에 일반적인 비유도화된 기능기의 특정 수는 의도적으로 또는 기술적인 이유로 생존할 수 있다. 이들은 여전히 각종 분석물에 접근가능할 수 있고, 결합 부위의 충분한 부분으로서 작용할 수 있으며, 표적 단백질 또는 펩타이드를 결합하는데 일조함으로써 흡착제의 분리 능력에 가해진다. 이는 상기 제3 기능기 자체의 제3(나머지) 부분이 한 종류의 상기 제3 잔기를 나타낼 수 있음을 의미한다. 본 발명에서, 폴리아민 필름, 특히 폴리비닐아민 필름으로 커버되는 고체 지지 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 바람직한 기능기는 1차 및 임의로 2차 아미노 구조이고, 보충적인 3차 잔기로서 간주될 수 있다. 또한, 명백히 아주 높은 유도화된 기능기의 분획은 주어진 분리 목적에 대한 선택성에서 감소를 유도하는 것으로 나타날 수 있다. 이러한 사실은 신규한 다기능 결합 부위가 제1 및 제2 잔기 둘 다 및 공간적으로 가까운 근접성으로 비유도화된 기능기를 포함하는 흡착제 내에 생성되는 것을 나타낼 수 있다,
이렇게 고안된 3차 유도 또는 불완전한 1차 및 2차 유도화의 방식으로, 주어진 단백질 또는 펩타이드에 대한 선택성은 다수의 경우에 추가로 증가할 수 있고, 수반된 실제적인 장점으로서, 고체 지지 물질의 표면을 커버하는 임의의 중합체 필름은, 포함된 제1 및 제2 잔기 및 기능기의 상대적 극성에 좌우하여, 추가의 화학적 안정성 및 더 나은 용매 혼화성, 또는 팽창 특성을 수득하는 것으로 나타난다. 결국, 제1 및 제2 잔기는 특이성에서 분리 목적을 달성하기 위해 가장 본질적인 잔기인 것으로 언급될 수 있으며, 그 이유는 분석물에 대해 단지 주요 1차 아미노 기능기를 나타내는, 가교결합된 폴리비닐아민과 같은 완전히 비유도화된 중합체의 필름이 본 발명의 분리 목적을 만족스럽게 달성하지 않기 때문이다. 이상적으로는, 총 밀도의 잔기(보충 잔기로서 작용하는 비유도화된 기능기를 포함함)는 0.1 mol dm-3 내지 1.0 mol dm-3의 양으로, 바람직하게는 적어도 약 0.3mol dm-3이다.
반면, 고체 지지 물질 또는 이의 임의의 중합체 필름의 비유도화된 반응적 기능기는 보다 특이적으로 아미노 그룹은 여전히 혼합물의 표적 또는 가능한 반응성 부 생성물을 향하는 고려가능한 가역성 또는 비가역성 반응성을 나타내어 분리되고, 이들 물질의 견고한 캡처를 유도할 수 있으며 -낮은 농도로만 존재하는 경우- 반복적으로 사용한 후, 흡착제의 느린 저하 및 결합 성능을 손실시킨다. 이러한 원하지 않는 상호작용을 피하기 위해서, 크로마토그래피 고정상의 제조에서 잔류 기능기가 상기 그룹의 최종 <<말단-캡핑>>을 통해 불활성으로 되는 것이 실제로 일반적이다. 따라서, 추가의(제3 또는 제4) 잔기는 기본적으로 유리 기능기가 구조적으로 상이한 말단-캡핑된 기능기로 적어도 부분적으로 전환되는 것을 통해서 생성될 수 있다. 말단-캡핑은 이러한 방식에서 각각의 분석물, 매트릭스, 및 이동상의 요구와 상호관련되는 고체/액체의 향상된 호환성을 성립하는 유도 반응의 특정 경우로 간주될 수 있지만, 추가의 결합강도를 거의 생성할 수 없고 이에 따라 추가적 선택성을 갖지 않는다. 결국 잔류하는 기능기의 부분 또는 전체 말단-캡핑은, 고정상 제조에 있어서 추가적 시도에도 불구하고 장기간 과정 안정성에 의해 유리한 것으로 실질적으로 밝혀질 수 있다.
바람직하게는, 친핵성 기능기, 예를 들면, 아미노 그룹의 말단-캡핑은 기능기의 친핵성을 감소시키는 반응을 통해 달성된다. 말단-캡핑 그룹은 단순한 분자형 구조로 고안되어서 상호작용이 드러나지 않거나 또는 광범위한 분석물과 낮은 강도의 적어도 단지 비-공유적 및 비-특이적 상호작용을 나타내며 전체 극성의 고정상을 현저하게 변화시키지 않는다. 그러나, 이들은 물질과 다원자 상호작용하는 제1 및 제2 잔기의 높은 정도의 유도에 일조하는 것으로 생각될 수 있다. 불완전한 또는 혼합된 말단캡핑으로 인해 흡착제 상에 2배 이상의 혼합된 3차 유도의 가능성에도 불구하고, 흡착제 전반에 걸쳐 균일한 말단캡핑(즉, 95%를 초과하는 정도로), 또는 말단 캡핑이 전혀 없는 것을 목표로 하는 것이 바람직한 것으로 밝혀졌다. 말단-캡핑 그룹의 구조에 좌우하여, 이들은 정상적으로 처리되는 경우, 3차 잔기의 역할을 잠재적으로 수행할 수 있거나 또는 수행할 수 없다.
제1 양태에서, 본 발명은 상기에 나타낸 특성을 갖는 본 발명의 흡착제를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 이들은 고체 지지 물질이, 표면이 잔기를 수반하는 기능기를 갖는 중합체의 필름으로 커버되는 담체로 이루어지는 특정 종류의 흡착제를 생성할 것이다. 흡착제의 바람직한 종류의 특정한 특성은 위에 광범위하게 개략되어 왔다. 이제, 상기 제조 방법은 적어도 다음의 단계를 포함한다:
(i) 기능기를 갖는 중합체를 제공함;
(a) 중합체의 필름을 담체의 표면 위로 흡착시킴("흡착 단계");
(b-I) 흡착된 중합체의 기능기의 한정된 부분을 적어도 하나의 가교결합 시약으로 가교결합시킴("가교결합 단계"); 또는
(b-II) 흡착된 중합체의 기능기의 한정된 부분을 담체로 접목(grafting)시킴("접목(grafting) 단계");
(c) 중합체의 기능기의 한정된 부분을 이핵 C, N, O, S-헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기 및 단핵 C, N, O, S-헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기, 및 임의의 추가의 잔기로 유도시킴("유도 단계").
상기 제조 방법의 상세한 설명에 관한 몇몇 변화가 가능하다. 먼저, 단계 (b-I) 및(b-II), 각각 가교결합 및 접목(grafting)은 동등한 대안으로서 고려되고, 이들 단계들 중의 하나는 상기 추가로 기재된 특성을 나타낼 본 발명에 따른 흡착제를 제조하기 위해서 방법을 수행하는데 충분하다. 강하게 가용화하는 용매로 처리하는 경우일지라도, 2개의 대안이 추가의 가공 조건 및 흡착제의 사용 하에 담체 위로 흡착된 중합체의 견고한 고정의 작업을 수행하는 수단으로서 역할을 한다. 이는 모든 중합체 가닥들 사이에 추가적 공유 결합의 지속적인 네트워크를 형성함으로써 담체를 물리적으로 결합시킴(가교결합)으로써 또는 각각의 단일 중합체 가닥과 담체 사이에 공유 결합(접목(grafting))을 형성함으로써 달성된다. 물론, 고정을 위한 대안적 처리 둘 다를 흡착제의 안정성에 대한 단점 없이 단일 단계로 동시에 또는 2개의 별개의 하부 단계로서 연속적인 방법 내에서 혼합할 수 있다.
두번째로, 흡착 단계 (a)와 관련하여 유도 단계 (c)의 상대적으로 일시적인 수서를 고려하여 추가의 변화가 가능하다. 따라서, 균질한 용액 중의 중합체를 잔기와 먼저 유도시킨 다음, 잔기를 이미 혼합한 유도된 중합체의 필름을 적합한 담체 위로 흡착시키는 것이 가능하다. 이러한 과정은 각각의 상이하게 유도화된 중합체에 대해 피복 단계의 실험적 조건을 조사하고 최적화하는데 필요할 것이다. 바람직한 변화는 따라서 얇은 균질한 층을 수득하기 위해서, 흡착 단계 (a) 와 유도 단계 (c)가 동일하게 또는 이전에 담체 위로 비유도화된 중합체를 먼저 흡착하도록 하는 것이다.
가교결합 단계 (b-I) 또는 접목(grafting) 단계 (b-II) 각각은 일단 가교결합되면, 중합체가 필름으로서 흡착되기 어렵기 때문에 어떠한 경우라도 흡착 단계(a) 직후 수행된다. 추가의 한계 조건은 단계 (i)는 항상 제1 단계의 순서로 수행될 것이다. 상기 2개의 독립적인 변화 단계(단계 (a) 및 (c)의 관계순으로 합해진 단계 (b-I) 또는 (b-II)의 선택)의 다음 4개의 조합이 가능하다:
제1 방법: 다음 순서를 포함하는 본 발명에 따른 흡착제의 제조방법:
(i) 기능기를 갖는 중합체를 제공함;
(ii) 흡착 단계 (a);
(iii) 가교결합 단계 (b-I);
(iv) 유도 단계 (c).
제2 방법: 다음 순서를 포함하는 본 발명에 따른 흡착제의 제조방법:
(i) 기능기를 갖는 중합체를 제공함;
(ii) 유도 단계 (c);
(iii) 흡착 단계 (a);
(iv) 가교결합 단계 (b-I).
제3 방법: 다음 순서를 포함하는 본 발명에 따른 흡착제의 제조방법:
(i) 기능기를 갖는 중합체를 제공함;
(ii) 흡착 단계 (a);
(iii) 접목(grafting) 단계 (b-II);
(iv) 유도 단계 (c).
제4 방법: 다음 순서를 포함하는 본 발명에 따른 흡착제의 제조방법:
(i) 기능기를 갖는 중합체를 제공함;
(ii) 유도 단계 (c);
(iii) 흡착 단계 (a);
(iv) 접목(grafting) 단계 (b-II).
각각의 단계의 순서는 즉시 진행되는 단계의 완료로 생성되는 상태의 중합체로 수행되는 것을 의미하는데, 즉, 가교결합 또는 접목(grafting) 단계 후 유도 단계는 이미 가교결합되거나 또는 접목(grafting)된 중합체로 수행되는 반면, 흡착 단계 전에 유도 단계는 자유, 비-흡착된 중합체로 수행될 것이다. 중합체의 기능기의 한정된 부분을 특정 단계에서 반응시키고 유사 부분이 진행하는 단계에서 이미 반응된 경우, 특정 단계에서 이전 단계로부터 남고 이전(이가- 또는 다가 기능기를 배제함)에 반응되지 않은 총 기능그룹으로부터 취해지는 한정된 부분을 의미한다. 모든 4개의 방법은 원칙적으로 비교가능한 결과를 수득하겠지만, 제1 방법이 실험적 간결성을 위해 바람직하다.
지금까지 명확하게 기재되지 않은 추가의 변화에서, 중합체의 기능기의 제1 부분은 용액에 유도될 수 있고, 이후에 부분적으로 유도된 중합체는 흡착되고, 전과 동일하거나 상이한 잔기로 유도된 중합체에 전과 동일하거나 상이한 기능기의 제2 부분이 흡착된다. 또는 중합체의 기능기는 용액 유도화에 의해 상이한 기능기 또는 잔기 전구체로 먼저 전환된 다음, 흡착 후 최종 잔기로 전환될 것이다. 각각의 잔기가 혼합된 조합의 제조 단계로 도입되는 가장 합리적인 순서는 특정 종류의 담체 물질 및 담체 상의 특정, 부분적으로 유도된 중합체의 흡착의 용이성에 좌우될 것이다.
층의 분자속 및 분자간 가교결합은 안정한 2차 또는 바람직하게는 3차 중합체 네트워크를 형성하고 <<인랩핑된(enwrapped) 담체 매질로부터의 탈착을 방지할 것이다. 가교결합이 당해 기술로서 공지된 모든 과정에 따라, 또한 전자화학, 광- 또는 (이온화) 방사선-유도된 방법과 같은 임의의 중합체 쇄 상에 라디칼 종의 생성을 기초로 하는 비선택적 방법을 사용하여 달성될지라도, 가교결합 단계는 예를 들면, 상기 기능기과 축합 반응을 수행하도록 고안되는 가교결합 시약을 사용하여 중합체의 기능기들 사이에서만 수행되는 것이 바람직할 것이다. 선형, 구조적으로 유연한 분자, 예를 들면, 1개 내지 20개 원자의 길이의 α,ω-이작용성 축합 시약은 가교결합에 바람직하다. 또한, 상이한 길이 및/또는 상이한 반응성 및/또는 상이한 쇄 강성(rigidity)의 2개 이상의 가교결합 시약을 연속 단계에 바람직하게 사용할 수 있다. 가교결합은 강성(rigidity) 물질을 유도하는 완전한 방식으로 수행하지 않지만, 항상 예비결정된 정도로만, 즉, 한정된 일부의 중합체 기능기로 수행하고, 이용가능한 중합체 기능기과 관련하여 가해진 가교결합 시약(들)의 화학량론적 분획을 통해 쉽게 조절가능하다. 이러한 측면에서 적합한 가교결합 시약은 디카복실산, 디아민, 디올, 및 비스-에폭시드, 예를 들면, 1,10-데칸디카복실산 또는 에틸렌글리콜 디글시딜에테르(EGDGE)를 포함한다. 4,4'-비페닐디카복실산은 경성 가교결합제로서 유용하다.
가교결합 시약은 중합체의 기능기과 특정적으로 반응하도록 선택되지만 템플레이트 또는 당해의 담체 물질와 반응하지 않으며, 중합체 필름과 담체 표면 사이가 아닌 중합체 필름 내에 안정한 가교결합을 달성한다. 후자의 방식으로 적당한 수로 추가적 가교결합을 달성하는 것은 흡착제의 특성을 현저하게 변경시키지 않는 것은 분명하다.
추가의 캡핑 그룹을 목적하는 경우, 이전 유도가 불완전한 경우, 과정의 마지막(특이적 잔기로 마지막 유도한 후)에 일반적으로 도입된다. 말단-캡핑을 원칙적으로 상기한 특정 유도 단계에 유사하게 수행할 수 있다. 그러나, 고도의 반응성 시약을 유도하는 활성 방법은 캡핑 반응에 일반적이며, 그 이유는 이들이 유도 단계 직전에 적어도 반응적으로 입증된 기능기과 반응하는데 필요하기 때문이다. 바람직한 것은 무수아실, 아실 클로라이드, 특히 아세트산, 또는 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트, 또는 에폭시드의 것들이다. 또한, 2개 이상의 상이한 말단-캡핑 시약, 또는 2개 이상의 상이한 캡핑 그룹을 포함하는 시약, 예를 들면, 혼합된 무수물을 사용할 수 있다. 또한 양호한 이탈 그룹, 예를 들면, 요오드화메틸, 디메틸 설페이트, 또는 디아조메탄을 갖는 기타 전형적인 알킬화 시약을 사용하는 것이 예측될 수 있다. 선행기술로부터 공지된 중합체성 및 비-중합체성 고정상 둘 다에 대한 기타 적합한 말단-캡핑 방법이 유사하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 과정이 본질적으로 임의의 정도의 캡핑에서 정지하도록 관리될 수 있을지라도 필요한 경우, 가능한 많은 잔류 기능기의 말단이 바람직하다.
또한, 중합체 필름의 기능기 또는 잔기의 치환체를 보호 그룹으로 임시적으로 유도하는 것이 가능하다. 이에 따라 상기 기능기 또는 치환체는 각각의 유도화 시약과의 때때로 바람직하지 않은 반응으로부터 하나 이상의 추가의 세트의 잔기를 도입하는 동안 보호될 수 있고, 그렇지 않으면 분기(branching)와 같은 잔기의 비조절가능한 축적 또는 높은-순서 치환체 패턴을 유도할 수 있다. 추가적 세트의 잔기가 적소에 있는 경우, 보호 그룹은 일반적으로 다시 제거된다.
담체의 표면 위로 필름으로서 흡착되는 중합체의 바람직한 기능기는 1차 또는 2차 아미노 그룹, 하이드록실 그룹, 및 카복실산 또는 카복실 에스테르 그룹이다. 이들 그룹은 쉽게 유도가능하고, 생체적합하고, 중합체의 수용성을 증가시킨다. 또한, 수성 또는 혼합된 수성-유기 매질 중에 가용적인 방법으로 중합체를 사용하는 것이 바람직한데, 그 이유는 흡착 단계가 내부에 현탁된 담체 물질 위로 이러한 매질로부터 수행되는 바람직하기 때문이다. 흡착 단계 자체는 원칙적으로 각각의 단계에서 상이한 중합체를 사용하여 단계적으로 수행될 수 있지만, 바람직하게는 단일 종류의 중합체(즉, 동일한 종류의 기능기, 또는 동일한 전치의 전하를 갖는 기능기를 갖는 중합체)만으로 수행된다. 특히 바람직한 것은 5,000 달톤(Dalton) 내지 50,000 달톤 사이의 분자량을 갖는 중합체이다.
일반적으로, 본 발명의 조성물 및 흡착제의 특성과 관련된 상기 요약된 모든 추가의 바람직한 양태는 제조 방법 및 유사한 방식으로 상기 방법에 사용된 물질에 적용되므로 본 문맥에서 반복될 필요는 없다.
앵커 그룹(anchor group), 즉, 유도 단계에서 사용된 유도 시약의 활성 부위는 결합 부위에 근접해서 이로부터 단거리 또는 장거리에서 형성될 수 있고, 기본적으로 구조적, 기능적, 또는 합성적 조건에 좌우되는데, 즉, 결합 부위와 활성 부위를 형성하는 구조들 사이에서 공간 그룹을 포함할 수 있다. 이러한 공간은 경성 또는 연성 및 가변성 길이일 수 있고, 긴 공간 그룹은 증가된 구조 유연성을 변형시키는 경우, 우호적인 기하학을 채택하기 위해서 흡착제의 부착 부위 및 표적 단백질 또는 펩타이드 사이의 착물이 때때로 필요할 수 있다. 공간은 별개의(가능한 균질한) 반응에서 상응하는 헤테로방향족 구조와 먼저 커플링되고, 형성된 콘쥬게이트는 전체 잔기와 유사하고, 이후 선택적 탈보호후 중합체와 커플링시키거나, 또는 공간은 중합체와 먼저 커플링시키고, 형성된 콘쥬게이트는 선택적 탈보호후, 상응하는 헤테로방향족 구조와 커플링되어 전체 잔기를 형성한다. 2개의 커플링 반응은 동일하거나 상이한 종류일 수 있다. 일반적으로, 1차 아미노 기능기를 함유하는 중합체는 필름-형성 중합체로서 사용되는 경우, 작용성 아미노 그룹의 질소 원자를 잔기 내로 직접적으로 포함시킬 수 있다.
바람직한 유도 시약은 아민, 에폭시드, 카복실산 또는 에스테르, 및 이소(티오)시아네이트를 포함하고, 바람직한 중합체 기능기과 아미드, 우레탄, 또는 요소 결합을 형성할 수 있다. 구조적, 안정성, 및 편리성의 이유로, 유도 단계가 기능기과 잔기 사이, 즉, 아미노-함유 중합체와 카복실-종결된 유도 시약 사이 또는 카복실-함유 중합체와 아미노-종결된 유도 시약 사이에 아미드 결합의 형성을 수행하는 경우가 가장 바람직하다. 아미노 중합체와 결합에 있어서, 특히 바람직한 유도 시약은 활성화된 카복실산 유도체이다.
화학적 활성이 유도 이전에 필수적인 경우, 유도 단계의 추가 상향 단계 또는 유도 단계와 동시에 수행될 수 있다. 중합체 기능기 또는 바람직하게는 유도 시약이 활성화될 수 있다. 예를 들면, 카복실 그룹의 활성화가 고체 상 펩타이드 합성의 표준 기술, 예를 들면, OBt(벤조트리아졸릴옥시) 또는 ONB(노르보르넨디카복시이미딜옥시) 에스테르와 같은 활성화된 에스테르를 통해 달성될 수 있다. 하이드록실 그룹은 유사하게 처리될 수 있다. 경제적이고, 이에 따라 특히 바람직한 양태에서, 활성화는 펩타이드 화학으로부터 공지된 방법을 사용하여, 즉, 활성화된 종의 안정된-상태의 농도를 생산하지만 분리되지 않는 원-팟(one-pot) 반응으로서, 유도 단계 동안 적소에 수행될 것이다.
2개의 잔기를 단일 유도 단계에서 중합체로 도입할 수 있다. 임의로, 단일 유도 시약을 사용하여 잔기(또는 각각 이의 전구체) 둘 다를 이미 포함하거나 또는 제2 잔기를 포함하는 제1 잔기를 포함(또는 반대도 같음)한다. 또는 각각이 적어도 하나의 상이한 잔기를 포함하는 적어도 2개의 상이한 유도 시약을 혼합물로서 사용한다. 대안적으로 유도 단계는 각각의 잔기와 단계적으로 수행될 수 있다. 이후에 제1 유도 단계에서 사용된 유도 시약은 제1 잔기를 포함하고, 제2 유도 단계에서 사용된 유도 시약은 제2 잔기를 포함하며, 또는 반대도 같다.
제조 방법의 하나의 변화로, 단계 (iii) 및 (iv)는 단일 단계로서 수행될 수 있다. 이러한 양태는 중합체의 기능기의 유도 반응에서, 제1 및 제2 잔기 둘 다가 쉽게 동시에 도입될 수 있음을 설명한다. 이는 제1 유도시약이 제1 잔기를 포함하고, 제2 유도시약이 제2 잔기를 포함하는 적어도 2개의 유도 시약의 혼합물이 사용되는 방식으로 달성될 수 있다. 중합체 중쇄를 따라 2개의 잔기의 임의의 비규칙적인 분포가 생성되겠지만, 유도화된 중합체는 기본적으로 반응량 및 적어도 2개의 유도 시약의 반응성으로 측정될 제1 및 제2 잔기의 통계적 비율로 특징지을 수 있다. 또는, 이러한 유도 시약이 제1 및 제2 잔기 둘 다를 이미 포함하는 경우(또는 제1 잔기가 제2 잔기를 포함하는 경우, 또는 반대도 같음) 단지 하나의 유도 시약을 사용하는 것이 실현가능하다. 일반적으로, 이후 2개의 잔기가 생성된 유도된 중합체 중에 1:1 비율 및 예비-한정된 상호 위치- 및 입체화학으로 존재할 것이다. 2개의 완전히 발현된 잔기를 대신하여, 적어도 하나의 잔기가 전구체로서 유도 시약 중에 존재하는 것이 가능하다.
본 발명의 제조 방법의 동일한 변화이 범위 내에, 각각이 제1 및 제2 잔기 둘 다를 포함하는 유도 시약의 혼합물이 사용되는 구성이 실현될 수 있다. 특히, 이러한 혼합물에서, 제1 잔기(또는 이의 전구체)의 부분적 구조는 유도 시약 중에서 변화될 수 있는 반면 제2 잔기(또는 이의 전구체)는 동등하게 유지될 수 있거나, 또는 그 반대도 같다. 특히, 유도 시약은 제조 방법의 목적 달성을 위해 서로 합해질 수 있는데, 한정된 양으로 제1 및 제2 잔 사 둘 다를 함유하지만 다른 한정된 양으로 단지 제1 또는 단지 제2 잔기를 함유할 수 있다. 이후에 생성된 제품은 시약의 양과 반응성이 비교가능한 경우 하나의 잔기가 나머지에 대해 과량으로 나타날 것이다. 이러한 방식으로, 무엇보다도, 특별히 제조되지만, 여전히 균질하고 임의적인(통계적인), 중합체의 기능기들 사이의 제1 및 제2 잔기의 분포가 달성될 수 있다.
추가적인 제3, 제4 등의 잔기가 중합체로 도입되는 경우, 유도 단계는 임의적으로 이에 따른 목적하는 구조적 사상을 포함하는 추가의 잔기를 사용하여 순서적으로 수회 반복될 수 있다. 경제적으로는 약 4회 까지의 반복 단계가 실현가능하다. 바람직하게는, 각각의 유도 단계는 항상 유도의 대략 동일한 정도로 수행되고, 각각의 잔기에 대한 정도는 약 25%를 차지한다.
본 발명의 흡착제는 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 혼합물의 정제에 우월하게 적용될 수 있다. 제2의 방법론적 양태에서, 본 발명은 상기한 것처럼 표적 특이적으로 고안된 흡착제를 사용하여 상기 단백질 또는 펩타이드 및 임의의 부 생성물을 함유하는 혼합물로부터 하나 이상의 단백질 또는 펩타이드의 농도 및/또는 순도를 분리, 또는 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 적어도 다음 단계를 포함한다:
(i) 단백질 또는 펩타이드를 흡착제에 결합할 수 있는데 충분한 시간 동안, 제1 용액 중에 용해되거나 현탁되는 상기 혼합물을, 본 발명의 흡착제와 접촉시킴;
(iii) 단백질 또는 펩타이드를 상기 흡착제로부터 방출시키는데 충분한 시간 동안, 상기 결합된 단백질 또는 펩타이드를 갖는 상기 흡착제를, 제3 용액과 접촉시킴.
상기 방법의 제1 변화에서, 이상적으로는 정제하고자 하는 흡착제 잔기와 단백질 또는 펩타이드 사이에 비-공유 결합을 현저히 분열시키지 않거나, 또는 상기 흡착제-결합 단백질 또는 펩타이드를 방출하도록 작용하는 제2 (세척) 액체와의 별개의 세척 단계는 단계 (i) 및 단계 (iii) 사이에서 포함될 수 있다. 상기 제품의 종류와 수 및 혼합물에 함유된 추가의 구성성분에 따라, 분리 과정 동안 액체의 이러한 변화는 때때로 분리 효능을 증가시킬 수 있다. 제2 액체는 대부분 낮은 용출 강도를 가질 것이고 비특이적으로 용출될 것이다. 상기 방법은 다음의 선택적인 중간 단계를 포함한다:
(ii) 상기 흡착제를 제2 용액으로 세척시킴.
단계 (i)에서 표적 단백질 또는 펩타이드 및 상기 제품을 흡착제와 접촉시킨 후, 여기에 흡착된 단백질 또는 펩타이드를 갖는 흡착제를, 제1 용액에 함유된 남은 혼합물로부터 다시 분리한 후 이를 단계 (ii)에서 제2 액체로 세척할 수 있다. 남은 혼합물 자체는 가치 있는 부 생성물을 함유하는 경우 재회수될 수 있다. 후자의 변화는 많이 희석한 공급재료를 위한 캡처 수단으로서 사용될 수 있고, 이후의 완전하고 보다 정교한 크로마토그래피 분리에 방해가 되는 것으로 간주되는 빠른 뱃치 방법 내 잠재적인 부 생성물을 제거하는 실현가능한 방식이 될 수 있다. 이러한 가능한 부 생성물은 비가역적인 물리적 또는 화학적 흡착으로 흡착제의 낮은 저하로 이에 따라 축소된 칼럼 내구성을 유도할 수 있다.
실제로 특별하지만 중요한 경우에서, 제2 액체는 제1 (공급, 흡착) 액체와 동일하게 선택될 수 있다. 이는 표적 단백질 또는 펩타이드가 혼합물로서 단계 (i)에 흡착제에 적용되는 경우, 흡착되는 것으로서 동일한 액체로 단계 (ii)에서 세척되는 것을 의미한다. 이는 종종 제1 액체가 표적 단백질 또는 펩타이드에 대해 단지 중간-내지 빈곤한 가용성 특성을 갖도록 일반적으로 선택되기 때문에 가능한데 그 이유는 효율적인 흡착은 표적 단백질 또는 펩타이드와 액체 사이의 상호작용 엔탈피가 표적 단백질 또는 펩타이드와 흡착제 사이의 상호작용 보다 작은 경우 가능할 것이기 때문이다. 반면, 이러한 액체는 단계 (ii)에서 흡착제로부터 용출되도록 가정하는 부 생성물에 대한 양호한 가용성을 갖는 경우, 또한 표적 단백질 또는 펩타이드가 동시에 방출되지 않고 여전히 액체에 부착되면서 흡착제를 세척하는데 적용될 수 있다.
유사하게는, 제2 액체는 제3 (탈착, 용출) 액체와 동일하게 선택될 수 있다. 표적 단백질 또는 펩타이드 및 부 생성물에 대한 제3 액체의 가용성 특성이, 흡착제에 대한 이의 흡착 엔탈피가 비교가능하지만 충분히 크게 상이한 경우, 동일한 액체를 사용하여 흡착제를 세척할 수 있다. 이는 본질적으로 상기 방법의 단계 (ii) 및 (iii)이 이들 상황하에 하나의 단계로 합해질 수 있음을 의미한다. 연속적인 유도 시스템에서, 더 양호하게 가용화되는 부 생성물은 먼저 세척된 다음, 동일한 액체의 이후 용출된 분획으로 방출된 표적 단백질 또는 펩타이드를 세척할 것이다. 물론, 이러한 순서는 다시 추가의 덜 가용화됨에 따라 더 늦게 용출된 부 생성물을 함유하는 제3 용액의 추가적 분획이 수행될 수 있다.
심지어 모든 세가지 액체가 동일할 수 있다. 그러나, 2개 또는 3개의 액체가 동일하게 선택될지라도, 여전히 방법의 상이한 단계에서 상이한 유동율로 흡착제에 적용될 것이다. 크로마토그래피에서 용적 유동율은 일반적으로 적용된 압력 상황, 칼럼 특성, 및 액체 점성의 함수이다. HPLC에서 이동상의 상응하는 1차원 속도는 전형적으로 약 1 내지 5mm s-1의 순서이다. 숫자 제1, 제2, 제3,,, 액체는 상이한 작업을 수행하는 적용된 액체의 상대적 순서를 한정하는 역할을 수행하지만, 각각의 액체의 특정 조성물을 반드시 한정하는 것을 의미하는 것은 아니다. 액체의 종류 또는 이의 적용된 유동율을 별개로 또는 순서적으로(즉, 단계-구배로서) 교환하는 것 대신에, 기타 연속성 구배 형태, 특히, 선형 구배를 사용하여 상이한 액체 및/또는 유동율 사이에서 천천히 변화시킬 수 있다. 이는 각각 이전 액체로 이후의 액체의 증가하는 분획을 점차적으로 혼합시키는 메카니즘의 설치를 필요로 한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 제3 액체는 제1 및 임의로 제2 액체와 pH 면에서 상이할 것이다. 특정한 양태에서, 제3 액체의 pH는 제1 및 임의로 제2 액체의 pH보다 작다. 여전히 보다 바람직한 양태에서, 제1 및 임의로 제2 액체의 pH는 표적 단백질 또는 펩타이드의 등전점 pI(즉; ±1 단위 이내로 대략 부합됨)에 근접하고, 제3 액체는 이로부터 많이 상이한 pH, 적어도 계산값이 2 pH 단위로 특히 더 낮다. 제1 액체의 pH는 5.5 내지 8.5의 범위가 우호적이지만, 제3 액체의 생성 pH는 3 내지 6.5의 범위이다. 상기 양태는 흡착제와 표적 단백질 또는 펩타이드 사이의 결합 엔탈피가 결합 파트너 상에서 하나 이상의 이온화가능한 잔기(예를 들면, 아미노 그룹 또는 질소-함유 헤테로방향족)를 포함하는, 정전기 또는 기타 극성 상호작용(쌍극자 력, 수소 결합)에 의해 상당 부분 우세한 경우 처리된다. 특히, 소수성 극성 상호작용은 중성 pH에 우세하게 근접한 것으로 예측되는 반면, 이온성 척력은 극도의 pH 스펙트럼(예를 들면, 낮은 pH에서 양성자화된 질소 사이에서)에 접근하는 경우, 동일한 지금까지 변화되지 않은 잔기의 극성 유인력을 부분적으로 대체시키는 것으로 예측된다. 이러한 효과는 결합 엔탈피를 상당히 약하게 할 수 있고, 결과로서, 흡착제로부터 부착된 단백질 또는 펩타이드를 방출시킬 수 있다. 반대 방식에서, 이온성 유인 상호작용은 또한 pH 변화의 결과로서 결합 파트너의 점 전하의 손실시 약해질 수 있다. 특히 중요한 점은 이러한 측면에서 흡착제 상에서 잔기로서 질소-함유 헤테로방향족이며, 이들이 소수성 뿐만 아니라 극성/이온성 상호작용 둘 다를 나타낼 수 있기 때문이다. 본 발명의 분리 방법에서 사용하기 위한 이러한 헤테로방향족 잔기의 유인성은 이의 결합 특성이 생리학적 조건과 상당히 유사한 pH 값에서 변화할 수 있다는 사실에서 기인하며, 여기서 정확한 pH의 변화 값은 특정 잔기의 등전점에 좌우하고 이에 따라 구조가 미세-변화될 수 있으며 흡착제의 관련 조성물이 이러한 종류의 적어도 2개의 상이한 잔기를 함유한다. 반면, 결합 엔탈피의 pH 의존성은 흡착제와 분리하고자 하는 적어도 하나의 부 생성물 사이의 상호작용과 관련하여 덜 현저해야 한다. 이는 예를 들면, 표적 및 부생성물의 상이한 등전점에 기인할 수 있거나 또는 소수성/극성 vs. 정전기 상호작용의 정량적으로 상이한 상대적 기여에 기인할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 제3 액체는 이온성 강도에서 제1 액체 및 임의적으로 제2 액체와 상이할 것이다. 특정 양태에서, 제3 액체의 이온성 강도는 제1 및 임의적으로 제2 액체의 이온성 강도보다 더 크다. 상기 양태는 흡착제와 표적 단백질 또는 펩타이드 사이의 결합 엔탈피가 하나 이상의 이온성 또는 이온가능한 잔기의 침전 하에 정전기적 상호작용에 의해 상당 부분 우세한 경우로 처리되는데, 여기서 상기 침전은 흡착제와 분리하고자 하는 적어도 하나의 부 생성물 사이의 정전기적 상호작용에서 상이하고 특히 덜 현저하다. 반면, 모든 기타 매개변수가 일정한 경우, 결합 엔탈피에 대한 소수성 기여는 이온성 강도 내 증가시 강화될 것이다. 바람직하게는, 분리 방법의 흡착 단계 (i)가 제1 액체 중에 저-염 조건(0 내지 0.2M 염화나트륨) 하에 수행되지만, 방출 단계 (iii)은 제3 용액에서 1M 이하의 염화나트륨에서 수행될 수 있다. 본 발명의 흡착제가 고염 조건을 매우 잘 견딜지라도, 대부분의 상황에서 흡착제-결합 단백질 또는 펩타이드를 탈착하기 위해서 단계 (iii)의 제3 용액에 고염 농도를 가하는 것은 필요하거나 권고되지 않는다. 대신에, 다수의 단백질 또는 펩타이드에 대한 흡착제의 친화성은 염 농도의 변화에 일정할 수 있다. 따라서, 염 구배는 흡착된 단백질 또는 펩타이드를 방출하는데 이들 자체가 그저 효과적이지 않을 수 있지만, pH 구배와 조합하는데 효율적인 수 있다.
흡착제로부터 표적 단백질 또는 펩타이드의 방출은 이에 따라서 제1 액체 및 제2 액체와 비교하여 표적에 대해 제3 액체의 용매화 강도를 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 이는 제3 용액에 용해된 대체 시약과 함께 흡착제의 결합 부위로부터 표적 단백질 또는 펩타이드의 대체를 통해 대안적으로 달성될 수 있다. 대체 효과(완료 표적이라기보다는 흡착제에 의한 대체 시약의 바람직한 결합)는 대체 시약이 표적 단백질 또는 펩타이드를 초과하는 몰로 존재하는 경우 또는 흡착제에 대한 대체 시약의 결합 강도가 표적 단백질 또는 펩타이드의 것보다 훨씬 더 높은 경우 달성될 수 있다. 대체 시약은 자체로 표적, 또는 이의 단편으로서 유사한 특성을 갖는 단백질 또는 펩타이드일 수 있지만, 또한 C, N, O, S-헤테로방향족 잔기에 대한 높은 친화성을 갖는 작은 합성 분자일 수 있다. 또한 자체로 이핵 또는 단핵 C, N, O, S-헤테로방향족 분자일 수 있고; 대체는 흡착제의 잔기에 대해 바람직하게 표적 단백질 또는 펩타이드의 흡착제-상호작용 그룹을 가용성 헤테로방향족으로 포화시키는 결과로서 발생할 것이다. 과량의 대체 시약은 그러나 정제 형태로 표적 단백질 또는 펩타이드를 분리하기 위해서 용출제로부터 후에 제거해야 한다.
표적 단백질 또는 펩타이드가 흡착제로부터 완전히 방출된 후 다른 용출제 변화는, 크로마토그래피 해상력의 소비에서 크로마토그래피 수행을 가속화하기 위해서 경제적 측면으로 유사하게 유용할 수 있거나, 또는 기타 가치있는 제품이 후에 용출된다.
제2 변화로, 상기 방법은 (iii) 단계후 도입되는 임의의 최종 단계:
(iv) 흡착제를 제4 및/또는 제5 용액으로 세척 및/또는 재생성함으로써 증가시킨다.
여기서, 제4 (세척) 액체의 대부분이 매우 높은 용출 강도를 갖는 액체를 사용하여, 상기한 종류의 첨가제를 함유하고 비특이적으로 용출할 수 있다. 흡착제는 크로마토그래피 칼럼의 형태로 사용되는 경우, 제4 용액은 정상적이거나 역 방향으로 높은 용적 유동율에서 적용될 수 있는데, 그 이유는 이의 작업이 흡착제를 세척하고, 강하게 흡착하거나 화학적 또는 생물학적 불순도, 특히 미립자 물질을 차단하는 잔기의 임의의 제조를 영구히 제거하여 칼럼의 점차적인 부착, 막힘, 또는 성능 감소를 방지한다. 의학적 위생 및 안정성을 위해, 미생물 오염을 제거하는 전형적인 위생처리 또는 멸균 프로토콜(예를 들면, 염기성(1.0M 수산화나트륨), 산성(0.4M 아세트산), 산화(차아염소산) 및/또는 열 처리)이 또한 이 지점에서 흡착제에 적용될 수 있다. 제5(리컨디셔닝(reconditioning)) 액체를 사용하여, 흡착제, 팽창의 정도, 및 공격적으로 또는 강하게 용매화하는 액체로 처리하는 이전 처리 후 부착된 잔기의 용매화를 알맞은 상태로 조절하여 흡착제의 원래 상태가 회복되고 일정한, 평형된 조건이 각각의 분리 진행의 시작에서 착수되도록 한다. 용출제, 또는 액체 세척의 흔적을 제거하는 것에서 벗어나, 이온성 잔기의 반대이온이 존재하는 경우, 흡착제의 일정한 산/염기 특성을 유지하기 위해서 원래의 일정한 분포로 대체될 수 있다. 제5 용액은 제1 용액 또는 제2 용액과 동일할 수 있고, 동일한 유동률로 일반적으로 적용될 것이다. 또한, 예를 들면, 이들 오염물의 실제량에 좌우하여, 각각의 수행 후 빠르고 단순한 세척/재생성 프로그램으로부터 매 5, 10회 등 수행 후 보다 복잡한 시도된 과정으로 변화하는 것이 가능하고, 이는 제품 품질 세부사항에 도달하는데 중요하다.
분리 방법을 수행하는 가장 바람직한 방법은 중압 내지 고압 액체 크로마토그래피 기술로서 수행하는 것이다. 작업적 단순성으로 인해, 위에 인용된 다수의 변화들 중의 하나의 방식으로, 상기 방법은 또한 친화성 (막-) 여과 또는 고체상 추출 기술로 뱃치 정제의 방식에서 비연속적으로 또는 모의시행된 이동-베드(SMB) 기술로 연속적으로 사용될 수 있다. 또한 모든 변화가 서로 혼합될 수 있다.
흡착제의 강한 화학적 안정성 뿐만 아니라 정적 및 동적 결합 성능(각각의 흡착제의 리터당 0.3g 공급 로드 또는 20g 단백질 또는 펩타이드 이하가 가능하다)은 방법에 사용된 모든 5개의 용액의 독립적으로 가변성에서 큰 자유도를 허용한다. 또한, 통상적인 친화성 크로마토그래피와 조합하지 않는 강하게 용매화하는 용출 시스템이 접근가능하여서 가용화력, 낮은 비용, 낮은 독성, 및 낮은 폐물질 생산과 같은 특성으로 액체를 최적화시킬 여지가 크다. 기본적으로 상기 방법의 수행에 적합한 액체 시스템은 분리 방법의 물질에 대해 적어도 약한 가용화 특성을 갖는 임의의 액체 또는 액체의 혼합물을 포함하고, 바람직하게는 부 생성물에 대해 단백질 또는 펩타이드이며, 후자는 제2 액체에 특히 중요하다. 본 발명의 흡착제 상의 크로마토그래피 분리는 일반적으로 생체적합성 제한 하에 수행될 것이기 때문에, 완충된 수성 매질이 종종 제1, 제2 및 제3 용액으로서 사용된다. 완충제 또는 금속 염 이외의 유기 개질제는 단백질 기능(예를 들면, 계면활성제, 카오트로픽 첨가제, 항산화제, 소포제)을 보존하는데 본질적이며 가설로 또한 액체에 추가할 수 있지만, 정제하고자 하는 단백질 또는 펩타이드의 높은 가능한 생물학적 활성을 보유하기 위해서, 이들 시약은 완전히 배제시키는 것이 최적이다. 특정 분석물의 검출성을 강화시키기 위한 이유로, 소량의 휘발성 유기산을 실제 분리 과정 전 또는 후에 가할 수 있다.
결국 추가의 첨가제를 사용하기는 하지만, 이들은 일반적으로 방법의 완료 후 단계 (iii)에서 수득한 표적 단백질 또는 펩타이드르 함유하는 액체로부터 후에 제거되어야 하고 이는 결정성 형태로 상기 단백질 또는 펩타이드를 수득하는 것이 필요한 경우에 특히 요구된다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 광범위한 이러한 잠재적인 추가 단계는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 첨가제를 제거하기 위해서, 본 발명의 방법은 따라서 임의의 기타 형태의 일반적인 분리 과정과 결과적으로 합해질 수 있다.
본 발명의 흡착제에 초과하는 유체를 포함하는 임의의 유기 또는 수성 액체 또는 액체 혼합물을 실제로 적용하는 것이 실현가능하겠지만, 고체 지지 물질의 표면 상에 존재하는 경우, 중합체 필름의 팽창을 용이하게 하는 극성 액체가 더 선호된다. 액체 혼합물의 정확한 극성은 조성물의 상태로 쉽게 조정시킬 수 있다.
흡착된 표적 단백질 또는 펩타이드(및 또한 부 생성물)는 방법의 단계 (iii)에서 종종 천천히 점차적이라기보다는 자연스럽게(온-오프 스테이트와 같음) 방출되지 않기 때문에, 단계 (iii) 자체는 전체 분리 과정의 증가된 해상에 대해서 분획으로서 단계적으로 수행되는 것이 바람직할 수 있다. 동일하거나 상이한 크기의 2개 이상의 고정된-용적 분획은, 흡착제가 충분한 시간 동안 제3 액체와 접촉한 후 제3 액체를 수동 또는 자동으로 수집한다. 단계 (iii)은 반복되고, 흡착제는 모든 결합 표적 단백질 또는 펩타이드가 방출될 때까지 신선한 제3 액체(필요한 경우, 개질된 조성물의)와 다시 접촉된다. 제3 액체의 연속적 공급은 또한 분획의 수집 동안에 실현가능하다. 각각이 분획에서 방출된 표적 단백질 또는 펩타이드의 순도 및 회수는 결과적으로 측정되며, 품질 및/또는 경제적인 관점에서 이미 세팅된 허용성 상세조건에 부합하는 이들 분획이 추가로 처리되는 동안 모든 기타 분획은 공급 물질 내로 버려지거나 재활용될 수 있다.
전두(frontal) 및 대역(zonal) 용출 기술을 사용할 수 있다. 최적의 성능 및 생산성은 구배 용출, 특히 극성 유기 용매(낮은 알콜, 아세토니트릴, 아세톤) 내지 제2 및/또는 제3 액체의 증가 함량으로 달성된다. 그러나, 과정 크로마토그래피 또는 일반적인 제조 환경 내에 사용되는 경우, 등용매 용출 또는 단순한 구배 형태, 예를 들면, 단계 구배는 작동상의 간단성 및 기술적 강인성에 대해 바람직할 수 있다. pH 및염 구배는 성공적으로 수행될 수 있다. 흡착제의 특정 잔기에 좌우하여, 짧은 기간 동안 1 내지 14, 및 연속성 작업 동안 2 내지 13 사이의 pH 값의 범위는 흡착제의 화학적 안정성을 고려하는 한 가능하다. 각각의 최적 액체 조성물은 흡착제의 유도의 실제 정도에 좌우될 것이고, 경우에 따라 실험적으로 결정되어야 한다.
상기 방법은, 단백질 또는 펩타이드가 임의의 네트 이온성 전하를 함유하지 않는, 즉, 가용성 배지의 pH가 등전점에 근접하게 유사한 경우로 분리작업에 특히 적용할 수 있다는 점에서 통상적인 이온 교환 흡착과 명백하게 구별될 수 있다. 음이온성 전하를, 양성자화가능한 질소-함유 잔기의 잠재적 함량으로 인해 본 발명의 흡착제를 향해 결합 강도에 가할 수 있을지라도, 이의 존재는 방법을 성공적으로 완료하기 위해 의무적인 것은 아니다. 동일한 상황이 부 생성물 및 혼합물의 기타 성분에 대해 사실이다. 전하된 상호작용이 흡착제 상의 화합물의 흡착 또는 분리에 영향을 미칠 수 있는 정도는 또한 쌍극성 특성 및 주위 매질의 염 농도로 결정된다. 흡착제 및 분석물의 반대 전하에 대해 위에 설명된 것은 일부 경우에 추가적 유도 대신에 흡착제의 방지 및 배제롤 유도할 수 있는 동일한 전치의 전하에 대해 사실이다.
상기 방법은 방출되는 제3 액체의 적어도 하나의 분획으로부터 단계 (iii) 이후에 단백질 또는 펩타이드의 분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 제조적 적용에서, 특성 및/또는 이후 처리의 목적을 위해 제3 용액에서 하나의 용액으로부터 농축되거나 또는 심지어 균형적 형태로 단백질 또는 펩타이드를 분리하는 것이 가능하다. 가장 쉬운 방법으로, 용매 증발(냉동 건조, 동결건조를 포함함)의 부드러운 방법으로 단계 (iii)의 액체로부터 회수될 수 있다. 용매화 증발은 그러나 제3 용액으로부터 차단하는 낮은 증발 압력의 가능하게 함유된 물질을 풍부하게 할 것이다. 이러한 물질은 첨가제, 예를 들면, 완충 염 또는 안정화 제제, 또는 오염물질, 예를 들면, 더 높은 비등 용매 균일성 및/또는 분해 생성물을 포함할 수 있는데, 이들은 시판적으로 이용가능한 품질의 용매 중의 미량으로 일반적으로 함유된다. 그러나, 흡착제의 높은 물리적 및 화학적 안정성으로 인해, 고정상으로부터 침출하는 것은 실질적으로 단계 (ii) 내지 (iv) 동안에 발생하지 않아서 단계 (iii)의 방출된 단백질 또는 펩타이드는 전형적으로 침출된 흡착제 또는 이로부터의 기타 침출가능한 물질(즉, 이의 구성성분(중합체, 잔기), 또는 분해 생성물)의 10ppm 미만을 함유할 것이다.
하나의 바람직한 분리 방법이 재-용해 후 필요한 경우, 정제된 단백질 또는 펩타이드 또는 상기 증발된 잔기를 함유하는 제3 액체의 결정 단계로 이루어진다. 예를 들면, 액체의 온도 및/또는 조성물을 변화시킴으로써 유도될 수 있는 이러한 결정 단계 동안, 심지어 더 높은 정도의 정제가 달성될 수 있는데 그 이유는 낮은 증발 압력의 구성성분이 용액 중에 일반적으로 유지되고, 이에 따라 표적된 생성 결정으로부터 분리되기 때문이다. 건조 후, 결정은 종종 조합 및 형성 과정에 사용할 수 있다. 건조 저장이 원하지 않거나 불가능한 경우, 상이한 조성물의 용액으로 정제된 생성물의 전달을 수행하는 것이 대체적으로 필수적일 수 있는데, 즉, 제3 용액을 투석, 이온 교환 등과 같은 표준 작업으로 저장 용액에 대해 교환될 것이다.
크로마토그래피에서 일반적인 것으로, 상기 방법 및 작동에 관련된 장치는 바람직하게는 또한 표적 단백질 또는 펩타이드 및/또는 부 생성물 또는 분명하고 미세한 분획을 위해 용출액에서 혼합물의 기타 성분의 농도의 정성적, 반-정량적 또는 정량적 측정을 허용하는 적합한 검출 기술로 보완할 수 있다. 바람직한 검출 방법은 물리적 또는 분광학적 특성, 예를 들면, 굴절계, 편광계, 전도도계, 형광 분석 장치의 자외선/가시광선 흡광도, 적외선 분석계, 질량 분석계, 및 핵 자기 공명 분광계의 온-라인 유동-세포 검출기를 포함한다. 온라인 예비- 또는 후-칼럼 유도 또는 분해 단위는, 분리하고자 하는 모든 또는 특정 성분의 혼합물을 향상된 검출성을 갖는 유도체 또는 단편으로 전환하거나 또는 이의 용출을 가속 또는 지연시키기 위해서 시스템에 가할 수 있다. 단백질 또는 펩타이드에 대한 통상적인 비-파괴적 검출 방법은 280nm의 파장에서 UV 흡광도이다.
큰 규모에서, 흡착제 및 흡착제를 사용하는 본 발명의 분리 방법은 사람 또는 수의학 용도(예를 들면, 항혈청 또는 백신)로 약제학적 또는 영양학적 조성물의 제조에 이롭게 사용될 수 있는데, 이 때 이러한 조성물이 흡착제에 결합할 수 있는 진단적, 치료학적, 또는 영양학적 값의 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 본 발명의 장점은 이러한 적용이, 과정이 길고 비용이 드는 과정에서 통상적인 방법으로만 실현가능하고, 심지어 경제학적 관점에서 금지될 수 있는 99%를 초과하거나 심지어 99.9%를 초과하는 중요한 활성 구배의 순도를 요구한다는 사실로부터 주로 야기된다.
소 규모에서는, 이들은 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드의 식별, 특성, 자질, 또는 실험적 정제로 대안적으로 사용될 수 있다. 정성적이고 정량적인 분석과 관련된 이러한 목적을 위해서, 분리 방법은 특정 생물학적 검정 또는 분광학적 방법, 예를 들면, 하이프네이트화(hyphenated)된 기술을 사용하여 보충되기 쉽지만, 또한 순수한 인증된 샘플 또는 펩타이드 기준을 가진 보유 용적과 비교하여 달성될 수 있다. 미세 크기 형식에서는, 이들은 프로테옴 적용, 즉, 세포 또는 유기체에서 다수의 상이한 단백질의 동시 식별 또는 발현 수준의 정량화 및 변화에 대해 이로울 수 있다.
의학적 장치의 일부로서, 이들은 생물학적 유체로부터 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드를 제거하는데 사용될 수 있는데, 이는 상기 생물학적 유체에서 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드의 존재로 야기된 질병의 의학적 예방 또는 치료를 포함한다. 상기 장치는 모든 경우에서 환자가 유해하거나 감염된 단백질 또는 펩타이드, 예를 들면 항원에 의해 배출된 것으로서 이미 섭취했거나 섭취하려고 하는 모든 경우에, 및 환자 자체의 신체가 이러한 해롭거나 오염된 단백질을 생산하는, 자가면역 질환인 경우 해독 또는 오염제거의 종류로서 적용될 수 있다. 섭취의 잠재적 공급원은 음식, 물, 공기, 감염된 사람과의 접촉, 수혈 등을 포함한다. 특별화된 적용에서, 의학적 장치는 혈액성분채집용 또는 혈장반출용 유닛으로서 간주될 수 있다. 이러한 장치는 체외 또는 체내에서 우세하게 작동하지만, 축소되고 삽입가능한 장치로서 작제물은 예측 내에서 나타난다. 환자의 생물학적 유체는 환자로부터 취할 수 있고(연속적으로 또는 뱃치-방식으로) 흡착제와의 처리를 통해 오염물로부터 제거할 수 있으며 환자에게 되돌아 갈 수 있다. 외부 공급(기타 사람, 동물)으로부터의 생물학적 유체는 또한 흡착제와 처리돠어서 이의 유체 또는 부분 또는 이로부터 제조된 조성물이 이를 필요로 하는 환자에게 투여되기 전에 감염된 질환의 전달의 위험을 감소시킬 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 분리 방법을 사용하여 <값> 분획에서 표적 단백질 또는 펩타이드의 농도/순도를 감소시키고(이로써 내부 값의 단백질 또는 펩타이드의 순도를 증가시킴), 반면 <폐기> 분획이 농축될 것이다.
최종적으로, 흡착제와 분리방법을 사용하여 흡착제에 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드를 고정시킬 수 있다. 흡착제와 표적된 단백질 또는 펩타이드 사이의 상호작용의 비-공유적 특성으로 인해, 이러한 고정은 가역적일 것이다. 이는 여과가능한 시약 또는 촉매를 제조, 세포의 표면-부착 배양과 같은 적용, 약물 전달 장치(예를 들면, 약물 용출 또는 치료용 스텐트), 또는 약물 발견 스크리닝에서 잠재적으로 장점이 될 수 있다. 후자의 경우, 본 발명의 분리 방법은 추가의 화학적 또는 생물학적 구조를 고정화된 단백질 또는 펩타이드로 결합하기 위한 시험용 방법으로 보완될 수 있다. 이러한 제2 결합의 검출은 결합 파트너의 가능한 생리학적 효과의 제1 암시로서 역할을 수행할 수 있다. 중합체 피복이 사용되는 경우, 고정화된 단백질 또는 펩타이드는 주변 겔-형성 매질에 의해 물리적으로 포획될 수 있고, 이에 따라 높은 생체 적합성의 환경을 추가로 경험하게 될 것이다. 본원에 기재된 흡착제와 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드 사이에 형성된 상이하게 표현된, 비-공유적, 분리가능한 착물은 따라서 본 발명 내에 구체화된다. 본 발명의 바람직한 단백질로서 항체를 함유하는 이러한 착물은 면역흡착 기술에서 사용될 수 있다.
상기 주어진 설명으로부터 즉시 유도될 수 있는 본 발명의 추가의 목적은 관형 용기 내에 본 발명의 흡착제를 포함하여, 예비-패킹된 칼럼이다. 이러한 칼럼은 액체 크로마토그래피 또는 고체상 추출 적용에서 고정된 목적하는 크기(길이 x 직경)의 고정상으로서 사용될 수 있다. 관형 용기 외에, 이러한 칼럼은 선택적으로 추가의 성분, 예를 들면, 당해 분야에 공지된, 프릿, 필터 플레이트, 유동 배분기, 실(seal), 피팅(fitting), 스크류, 밸브, 또는 기타 유체 취급 또는 연결 요소를 포함할 수 있다. 흡착제는 중력 또는 원심력하에, 외부적으로 적용된 유체역학 압력, 또는 칼럼 내로 피스톤에 의한 추가적 축성 압축하에, 현탁액으로서 팩킹될 수 있거나, 또는 이러한 예비-팩킹된 형식으로 시판적으로 이용가능하다. 사용자가 더 편리하도록, 보다 재생산가능한 팩킹은 보장될 수 있고, 사용중이 아니고 크로마토그래피 시스템 내에서 빠르게 교환할 수 있는 경우 고정상은 쉽게 저장될 수 있다. 오염물질은 (스테인레스 스틸, 보로실리케이트 글래스, PEEK 등과 같은 플라스틱과 같은 화학적 및 생물학적으로 불활성 물질)로 이루어지고, 흡착제 자체의 높은 안정성이 희생되지 않도록 전형적으로 선택되는데, 이는 이상적으로는 전체 칼럼이 20 바 이하의 적용된 압력 또는 110℃ 이하의 적용된 열, 및 오토클레이브를 포함하는 일반적인 위생 프로토콜에 대해 물리적이고 화학적인 저항으로 특징지어야만 함을 의미한다. 바람직한 환경하에, 1,000 배 이하, 바람직하게는 5,000배 이하의 칼럼의 반복적 사용을 가능하게 할 것이고 전체 공정에서 경제성을 부가할 것이다. 그러나, 이는 또한 일회용 또는 제거용 유닛일 수 있다. 다른 선택 방안은 흡착제의 직접적 관형 하우징을 저렴하고 일회용으로 고안하고, 이를 모든 재-사용가능한, 보충 성분을 함유하는 수명이 길고 내구성이 좋은 물질로 이루어진 제2의 외부 하우징 내부에 위치시키는 것이다(카트리지 디자인).
칼럼은 전체 크로마토그래피 시스템의 일부일 수 있다. 상기한 검출 시스템과는 달리, 크로마토그래피 시스템의 기타 적절한 구성성분은 펌프, 유동 조절기, 액체 저장기, 탈가스기, 주입 포트, 칼럼 스위칭 밸브, 압력 및 유동 미터기, 온도-조절 챔버, 아웃렛 조절 트레이(캐러셀), 및 로봇 분류장치를 포함한다.
본 발명의 추가의 목적은 (입자 또는 블록(모놀리식) 디자인의) 느슨한 물질 또는 예비-팩킹된 칼럼, 카트리지(상기 참조), 또는 막으로서 본 발명의 다수의 동일하거나 상이한 흡착제의 집합(또는 "라이브러리")으로서, 여기서 각각의 흡착제는 동일하거나 상이할 수 있다. 상이한 흡착제의 수집은 예를 들면, 향후 보다 복잡한 제조 크로마토그래피 셋업에 사용되도록 예기되는 적합한 흡착제에 대한 초기 스크리닝 캠페인에 사용될 수 있는 반면, 일부 흡착제의 수집은, 예를 들면, 유사한 매트릭스를 갖는 다수의 샘플의 다중 의학적 진단적 시험, 또는 준-연속성 과정 모니터링에 사용될 수 있다. 이러한 수집의 장점은 수동 방식 또는 자동 방식 중의 하나로 병행하여 처리하는 능력이다. 이러한 병행 -일련의 가공과 비교하여 일정시간내 처리된 더 많은 샘플로 인해 시간을 절약하는 것 외에- 표준화되거나 적어도 동등한(재생산가능한) 조건하에 상이한 흡착제 또는 기타 공정 매개변수를 비교하도록 한다. 이러한 장점은 특히 개별 구성원의 수집이 표준화되고 위치적으로 설명가능한 형식, 바람직하게는 로봇 작업환경과 호환되는 2차원 직사각형 그리드, 예를 들면, 마이크로플레이트 분석 또는 마이크로칩 분석, 또는 다중-모세관 또는 미세유체 장치로 배열되는 경우 이용할 수 있다. 축소화된 양식의 판독에 대해서는, 단백질 유전 정보 기술이 다시 참조된다.
상기된 제조 방법의 가교결합/접목(grafting) 단계로 시작하는 모든 중간체 제품은 향후 사용을 위해 저장하도록 충분히 안정된다. 유도화 단계가 각각의 유도 시약으로 수행되는 경우 이러한 제품은 일부 하부세트로 나눠질 수 있다. 이러한 방식에서, 상이한 흡착제의 라이브러리(즉, 상이한 잔기 또는 이의 조합 또는 상이한 잔기 비 또는 유도화의 상이한 정도로 유도화된 흡착제)는 요구에 맞게 형성될 수 있다. 유도 단계는 전체 하부세트와 동시에 수행되는 경우, 분리 물체를 변화시키는데 빠르게 반응하는 주어진 적용에 대해 최고의 흡착제의 초기 스크리닝 조사를 수행하기 위해서 매우 짧은 시간에 이러한 라이브러리를 수행하는 것이 실현가능하다. 상이한 유도외에, 상이한 중합체 필름, 담체 및/또는 활성 화학의 가능성을 포함하여 상이한 고체 지지 물질은 흡착제 라이브러리의 형성에 적용될 수 있다.
임의의 또는 표적된 라이브러리 스크리닝은 합리적인 흡착제 설계를 보완하거나 심지어 대체할 수 있는 수단이다. 특히 구조적 정보가 불충분하거나, 또는 추가의 밀집 범위, 예를 들면, 적합한 액체 상의 선택을 고려하여 적용하는 경우, 흡착제 상의 상이한 잔기 및/또는 표적 단백질 또는 펩타이드 상의 반대 이온으로부터 상대적 기여의 중요성이 명백하지 않은 이러한 경우에 특히 사용된다.
주어진 분리 물체를 향하는 이러한 라이브러리의 스크리닝은, 특정 흡착제의 성능(친화성, 선택성, 성능, 회수, 안정성 등)을 특징으로 하는 하나 이상의 매개변수가 전체 라이브러리 또는 이의 하나 이상의 하부세트를 연속적으로 또는 동시에 측정하는 방식으로 수행될 수 있다. 가장 우세한 특징은 흡착제와 단백질 또는 펩타이드 표적 사이에 착물의 형성에 관한 친화성 및 선택성-관련된 열역학 및 운동력학 매개변수이다. 라이브러리에 삽입하는데 적합한 흡착제의 예비 선택은 계산적 방법으로 수행될 수 있다.
실현가능한 스크리닝 방법은 예를 들면, 적합한 뱃치 조건 하에 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드 및 부 생성물 및/또는 흡착제와 본 발명의 각각의 흡착제를 갖는 기타 성분을 함유하는 혼합물을 처리하는 것으로 이루어지고, 흡착제 및 표적된 단백질 또는 펩타이드 사이에 착물 형성의 개별 평형 깁스 엔탈피를 측정하는 것이다. 대안적인 방법은 한편으로는 표적된 단백질 또는 펩타이드와 흡착제의 착물의 형성과 다른 한편으로는 적절히 선택된 부 생성물과 흡착제의 착물의 형성 사이에서 시차 깁스 엔탈피를 측정하는 것으로 이루어진다. 당업자에게 공지된 모든 열역학적 및/또는 운동력학 방법, 예를 들면, 열량 측정을 사용하여 직접적으로 측정할 수 있다. 이러한 착물을 일시적으로 형성하는 예측되는 적용의 과정상의 조건 하에 크로마토그래피 수행을 사용하여 간접적으로 측정할 수 있고, 이로써 수득한 결과는 용출제 기여를 위해 수정될 필요가 있을 수 있다. 크로마토그래피 환경에서, k' 및 α값은 각각 깁스 엔탈피 또는 시차 깁스 엔탈피의 표시기로서 제1 근사치에서 충족할 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 진단 또는 실험 정제 키트로, 동일한 패키징 단위 내에 본 발명의 흡착제(흡착제의 집합, 또는 흡착제를 함유하는 칼럼) 외에, 본 발명의 분리 방법 또는 흡착제를 사용할 수 있는 상이한 분석적, 진단적, 또는 실험적 방법을 수행하는데 필요한 한 세트의 화학적 또는 생물학적 시약 및/또는 일회용품을 추가로(또는 심지어 전부) 포함한다. 올바른 수, 량, 또는 농도로 예비-패킹된 집한 물질은, 분리 방법이 수행된 후 표준화된 실험 프로토콜이 수행되어야만 하는 경우, 특히, 흡착제 또는 칼럼이 일회용 장치로서 사용되는 경우 사용자에게 편리성을 증가시켜 준다. 상기 프로토콜을 안정 데이타 시트와 함께 키트를 임의로 동반할 수 있는 사용 지시서에 포함시킬 수 있다.
실시예
일반적인 원리
제조사: 디오넥스(Dionex)(이전의 긴코텍(Gynkotek))로부터의 HPLC 시스템은 4개의 채널 저압 구배 펌프(LPG 580, LPG 680 또는 LPB 3400), 자동 샘플러(제조사: Gina 50, ASI-100 또는 WPS-300), 6-채널칼럼 스위칭 밸브(제조사: Besta), 칼럼 오픈 및 다이오드-어레이 UV 탐지기(UVD 170U, UVD 340S 또는 VWD 3400)로 이루어진다.
사용된 모든 흡착제는 각각의 실험적 기술에서 주어진 잔기와 임의로 분포된 방식으로 유도화된, 가교결합된 폴리비닐아민으로 커보되는 설폰화된 폴리스티렌-디비닐벤젠 공중합체(35㎛ 평균 입자 직경, 1000Å 평균 기공 직경)의 동일한 다공성 구형 담체를 기초로 하였다. 제1 및 제2 잔기로서 사용된 이핵 및 단핵 헤테로방향족 구조는 도 7의 화학식으로 나타난다. 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 5원 및 6원 헤테로사이클릭 환 둘 다를, 33.5 x 4mm 실측 베드 크기의 표준 스테인레스 스틸 HPLC 칼럼에서 사용하였고, 그렇지 않은 경우는 언급하지 않는다. 칼럼을 20바의 압력하에 물-메탄올(1:1) 현탁액의 유동 침적으로 팩킹(packing)하였다.
아래 표 1은 각종 실험에서 사용되었던 단백질을 나열한 것이다. 촉매, 수송, 면역 반응, 및 나타내는 시그날링/조절과 같은 상이한 기능을 가지고, 중간 크기 펩타이드에서 큰 다중 결합 단백질 착물에 이르는 광범위한 범위로 선택은 확장된다. 등전점 데이타는 문헌으로부터 수득되며 등전 집속을 사용하여 재생산되었다. 단백질 순도는 겔 침투 크로마토그래피로 추가로 확인되었다. 모든 기타 시약은 표준 실험 등급 품질로 사용되었다.
단백질 공급원 공급자 CAS 번호 분자량 등전점
알콜 탈수소효소 빵 효모 시그마(Sigma) 9031-72-5 141 kDa 5.4-5.8
카탈라아제 소 간 시그마 9001-05-2 250 kDa 5.4
카탈라아제 쥐 간 시그마 9001-05-2 250 kDa 6.7
α-키모트립시노겐 A 소 췌장 시그마 9035-75-0 26 kDa 9.5
콘알부민 계란 흰자 시그마 1391-06-6 77 kDa 6.7
시토크롬 C 소 심장 시그마 9007-43-6 12 kDa 10.5
헤모글로빈 사람 시그마 9008-02-0 64 kDa 7.4
헥소키나제 빵 효모 시그마 9001-51-8 54 kDa 4.5 - 5.0
면역글로불린 G(Gammanorm®) 사람 혈장 옥타파르마(Octapharma) 89957-37-9 144 kDa 6.4
인슐린 재조합 사람 비오톤(Bioton) 9004-10-8 6 kDa 5.3
리소자임 계란 흰자 플루카(Fluka) 12650-88-3 14 kDa 8.9
펩신 돼지 위 점막 시그마 9001-75-6 36 kDa 2.9
프로테이나제 K 트리티라키움 알붐(Tritirachium album) 시그마 39450-01-6 29 kDa 8.9
피루브산 키나제 토끼 근육 시그마 9001-59-6 237 kDa 7.6
표 1: 본 조사에 사용된 단백질의 목록
실시예 1: 상이한 비율로 잔기를 함유하는 인돌 및 이미다졸을 갖는 특정 흡착제의 합성
시판용 폴리스티렌-디비닐벤젠 공중합체 구형 수지 비드(Rohm & Haas Company: AmberchromTM)를 진한 황산에 먼저 과량으로 설폰화시킨 다음, 시판용 포리비닐아민-폴리비닐포름아미드 공중합체 용액(BASF: Lupamin®)을 다공성 비드 위로 흡착시키고 비스-에폭시드로 화학적으로 가볍게 가교결합시켰다. 0.35 내지 0.45 mmol/ml 자유 아미노산을 함유하는 이러한 비유도화된 중간체를 디메틸 포름아미드 중에 예비-팽창시키고, 표적된 정도의 유도에 상응하는 예비결정된 양을 약간 초과하여 표준 고체상 아미드 커플링 프로토콜을 통해 적소-활성화된 3-인돌릴프로피온산 및 4-이미다졸릴아크릴산을 성공적으로 독립적으로 아미노 그룹과 커플링시켰다. 흡착제를 과량의 시약으로 임의로 세척한 다음, 일정한 양을 달성할 때까지 건조시켰다. 잔류하는 아미노 그룹의 양성자 결합 성능의 차이로서 수성 톨루엔설폰산으로 고체상 적정을 통해 각각의 유도 단계 이후에 유도의 정도를 측정하였다. 상기 일반적인 과정에 따라, 표 2에 나열된 흡착제가 제조되었다.
3-인돌릴프로피오닐[유도%] 4-이미다졸릴아크릴[ 유도%] 3차 잔기(선택적)
12 21 -
14 9 아세틸
14 31 아세틸, 숙신산 아미드(12%), N-이미다졸리논-에틸옥시카보닐(15%)
18 32 -
20 6 아세틸
20 24 아세틸, 숙신산 아미드(26%), 숙신산 아미드(26%) + 아세틸, 숙신산 아미드(26%) + 숙신산
21 17 아세틸
22 13 아세틸
22 30 -
23 37 -
24 25 아세틸, 숙신산(6%, 23%)
25 30 -
26 19 아세틸, 숙신산 아미드(21%), N-이미다졸리논-에틸옥시카보닐 (10%, 19%), 2-하이드록시아세틸(8%, 12%)
27 14 아세틸
28 27 아세틸
28 37 -
29 33 아세틸
38 24 아세틸
38 60 아세틸
43 24 -
43 27 아세틸
43 32 아세틸
47 11 -
55 19 아세틸
표 2: 제조후 선택된 예시적 흡착제의 조성물(정확도 약 ±2%; 아세틸이 제3 잔기로서 존재하는 경우 혼합된 정도의 치환체와 100% 사이의 차는 아세틸 그룹의 함량과 일반적으로 동일하고; 제3 리간드가 존재하지 않는 경우, 치환체의 혼합된 정도와 100% 사이의 차는 잔류하는 아미노 그룹의 함량과 동일하다)
실시예 2: 상이한 단백질에 대한 본 발명의 흡착제의 집합의 결합 특성용 스크리닝.
실험: 순수한 단백질 콘알부민, 헤모글로빈, 카탈라아제(쥐 간에서 수득) 및 피루브산 키나제의 용액들(모두 6 내지 8 사이의 등전점, 25mM-포스페이트 완충액 pH 7.4를 가짐)을 15-18mg/ml(피루브산 키나제: 5mg/ml)의 농도로 제조하였다. 이들 용액의 30㎕(헤모글로빈: 125㎕)의 분석량을, 아래 표에서 나열된 것처럼 각각의 정도로 헤테로방향족 구조를 포함하는 하나 이상의 각각의 잔기로 유도화되었던 흡착제를 함유하는 상이한 HPLC 칼럼 위로 독립적으로 주입하였다. 단계 구배를 사용하여 25mM 인산염 완충액 pH 7.4 결합 단계를 0.25ml/분에서 40분 동안 시작한 다음, 50nM 아세테이트 완충액 pH 3.5 용출 단계를 0.5ml/분에서 20분 동안 수행하고, 1M 아세트산 수용액(pH 2.25)으로 추가 20분 동안 동일한 유동율로 최종 산성 퍼징(purging)하였다. 결합 완충액으로 20분 동안 1ml/분에서 리컨디셔닝하여 이후 작동을 위한 용출제의 원래 조건으로 회복시켰다. 용출된 단백질의 수율은 230nm, 280nm, 또는 500nm 파장에서 UV 흡광 신호의 통합을 통해 각 용출 단계에 대해 독립적으로 측정되었다. 추가적 바이패스(bypass) 수행으로 정량적 비교를 통해 총 단백질 회수를 측정하였다(칼럼을 설치하지 않았음).
결과:
스크리닝 결과가 표 3 내지 6(모든 3가지 용출 단계의 절대 수율의 합은 총 회수와 동등하다)에 나열되어 있고 상이한 제1 및 제2 잔기의 직접적인 비교 및 결실 잔기의 효과를 허용한다. 제2 잔기로의 유도화가 단지 흡착제의 감소된 결합 성능(더 높은 타개)을 생성하지만, 결합에 생성된 단지 제1 잔기와의 유도화는 실질적인(크로마토그래피) 목적에 대해 매우 강한 것으로 입증되었다. 가역성 및 재생산가능한 결합은 표적 단백질이 적당한 산성 완충된 용출 단계(여기서, pH 3.5) 동안 회수되는 경우에만 보증될 수 있다. 반면, 표적 단백질이 강한 산성 퍼징 단계에서 흡착제로부터 방출될 수 있는 경우, 변성될 수 있고, 이에 따라 제조 목적에 유용하지 않은 흡착제가 제조될 수 있다. 비가역성 결합은 때때로 퍼징 단계에서 사용된 수성 산이 충분한 용출 강도를 갖지 않아서 흡착제로부터 총량의 단백질을 방출시킴을 의미할 수 있는 낮은 총 회수로 나타났다. 일반적인 경향으로서, 단지 2개의 리간드가 흡착제 상에 존재하는 경우에만 최대 전체 성능이 달성되었다. 그러나, 흡착제의 최적 조성물은 특정 정도로 표적 단백질에 좌우되었다. 각각의 합성 성능에 좌우하여, 제1 및 제2 잔기 둘 다로 수행한 유도의 정도는 넓은 범위에 걸쳐 다양할 수 있다. 또한, 측정가능한 성능 반응은, 잔류한 잔기의 종류가 변하지 않는 경우 유도화의 정도의 최소 변화시 관측될 수 있다. 제1 또는 제2 잔기를 함유하지 않는 조사에서 포함된 기준 흡착제에 대해 가역성 보존력은 관측되지 않았다. 제3 리간드로서 아세틸 또는 숙신산 그룹과의 유도화는 오히려 역 특성을 전달하였다. 위에 적용된 동일한 조건 하에, 염기성 단백질, 예를 들면, 프로테이나제 K, 시토크롬 C, 또는 리소자임 및 산성 단백질, 예를 들면, 펩신 또는 인슐린은 대부분의 고정상에서 높은 퍼센트로 pH 7.4에서 파괴되거나 또는 pH 3.5에서 (부분적으로) 용출되도록 나타났다. 산성 퍼징 단계를 포함하여 모든 3개의 분획에서 발견되었던 단백질 헥소키나제는 제외되었다. 이들 단백질과의 총 회수는 종종 용납하지 않게 낮았다(데이타는 도시되지 않음). 150mM 염화나트륨을 결합 및 용출 완충액 둘 다에 첨가하여 헤모글로빈으로 수행된 병행 실험은 원 데이타를 현저히 변화시키지는 않았다. 용출제의 pH 저하 이전에 결합 pH 7.4에서 추가적인 고염 용출 단계(1M NaCl)는 인돌 구조(제2 잔기가 결여됨)를 포함하는 30% 잔기로 유도된 흡착제로부터 추가적 용출(12%)을 유도하였다.
제1 잔기 구조 제2 잔기 구조 제3 잔기 구조 pH 7.4 타개 수율 pH 3.5 용출 수율 pH 2.25 퍼징 수율 총 회수
벤즈이미다졸(13%) 이미다졸(10%) - 0% 100% 0% 63%
인돌(약 15%) 이미다졸(약 25%) - <1% 94% 6% 98%
인돌(25%) 이미다졸(20%) - 0% 86% 14% 84%
인돌(26%) 이미다졸(26%) - 0% 64% 36% 91%
퀴놀린(약 40%) 이미다졸(약 30%) - 2% 84% 14% 97%
벤즈이미다졸(약 50%) 이미다졸(약 30%) - 0% 100% 0% 59%
인돌(25%) 이미다졸(21%)) 아세틸(54%) 52% 43% 5% 88%
인돌(26%) 이미다졸(24%) 숙신산(약 50%) 87% 0% 13% 81%
인돌(약 25%) - - 0% 100% 0% 81%
인돌(30%) - - 0% 17% 83% 86%
퀴놀린(약 40%) - - 0% 100% 0% 83%
인돌(약 50%) - - 1% 13% 86% 69%
벤즈이미다졸(약 50%) - - 0% 100% 0% 72%
벤즈이미다졸(약 50%) - - <1% 92% 8% 97%
- 피리딘(24%) - 58% 42% 0% 61%
- 이미다졸(30%) - 29% 71% 0% 89%
- 이미다졸(62%) - 0% 100% 0% 59%
- 피리딘(약 20%) + 이미다졸(약 30%) 아세틸(약 50%) 91% 9% 0% 103%
- - - 42% 5% 53% 75%
- - - 36% 0% 64% 91%
- - 아세틸(약 100%) 100% 0% 0% 100%
- - 숙신산(약 100%) 100% 0% 0% 95%
표 3: 표적 단백질 콘알부민으로 수행된 상 스크리닝.
제1 잔기 구조 제2 잔기 구조 제3 잔기 구조 수율 타개 pH 7.4 수율 용출 pH 3.5 수율 퍼징 pH 2.25 총 회수
벤즈이미다졸(13%) 이미다졸(10%) - 0% 100% 0% 105%
인돌(약 15%) 이미다졸(약 25%) - 4% 95% 1% 88%
퀴놀린(19%) 이미다졸(30%) - 57% 43% 0% 92%
인돌(25%) 이미다졸(20%) - 3% 97% 2% 89%
인돌(26%) 이미다졸(26%) - 9% 89% 0% 59%
벤즈이미다졸(약 50%) 이미다졸(약 30%) - 0% 100% <1% 91%
인돌(25%) 이미다졸(21%) 아세틸(54%) 75% <1% 25% 93%
인돌(26%) 이미다졸(24%) 숙신산(약 50%) 60% 40% 0% 77%
인돌(약 26%) - - 0% 96% 4% 66%
인돌(약 30%) - - 0% 96% 4% 73%
퀴놀린(약 40%) - - 58% 41% 1% 67%
인돌(약 50%) - - 3% 90% 7% 56%
벤즈이미다졸(약 50%) - - <1% 99% 1% 88%
벤즈이미다졸(약 50%) - - 70% 30% 0% 74%
퀴놀린(약 40%) - 아세틸(약 60%) 100% 0% 0% 82%
- 이미다졸(30%) - 84% 16% 0% 83%
- 이미다졸(62%) - 81% 19% 0% 79%
- - - 89% 10% 2% 91%
- - - 85% 2% 13% 78%
- - 아세틸(약 100%) 100% 0% 0% 91%
표 4: 표적 단백질 헤모글로빈으로 수행한 상 스크리닝.
제1 잔기 구조 제2 잔기 구조 제3 잔기 구조 pH 7.4 타개 수율 pH 3.5 용출 수율 pH 2.25 퍼징 수율 총 회수
벤즈이미다졸(13%) 이미다졸(10%) 2% 98% n.d. 86%
퀴놀린(19%) 이미다졸(30%) 3% 97% n.d. 85%
인돌(25%) 이미다졸(20%) 4% 96% n.d. 45%
인돌(26%) 이미다졸(26%) 4% 75% n.d. 45%
벤즈이미다졸(약 50%) 이미다졸(약30%) 2% 98% n.d. 82%
인돌(25%) 이미다졸(21%) 아세틸(54%) 6% 94% n.d. 90%
인돌(26%) 이미다졸(24%) 숙신산(약 50%) 72% 28% n.d. 86%
인돌(약 25%) - - 29% 71% n.d. 25%
인돌(30%) - - 27% 73% n.d. 27%
- - - 63% 37% n.d. 49%
- - 아세틸(약 100%) 100% 0% n.d. 84%
표 5: 쥐 간으로부터 추출한 표적 단백질 카탈라아제로 수행한 상 스크리닝(n.d. = 측정되지 않음).
제1 잔기 구조 제2 잔기 구조 제3 잔기 구조 수율 타개 pH 7.4 수율 용출 pH 3.5 수율 퍼징 pH 2.25 총 회수
벤즈이미다졸(13%) 이미다졸(10%) <1% 100% n.d. 55%
인돌(약 15%) 이미다졸(약 25%) 0% 100% 0% 61%
퀴놀린(19%) 이미다졸(30%) 0% 100% n.d. 55%
인돌(25%) 이미다졸(20%) 0% 100% n.d. 31%
인돌(약 25%) 이미다졸(약 25%) 53% 47% 0% 13%
인돌(26%) 이미다졸(26%) 0% 0% n.d. 0%
벤즈이미다졸(약 50%) 이미다졸(약 30%) 0% 100% n.d. 44%
인돌(25%) 이미다졸(21%) 아세틸(54%) 31% 69% n.d. 87%
인돌(26%) 이미다졸(24%) 숙신산(약 50%) 100% 0% n.d. 58%
인돌(약 25%) - - 0% 0% 0% 0%
인돌(30%) - - 0% 0% n.d. 0%
퀴놀린(약 40%) - - 0% 100% 0% 56%
벤즈이미다졸(약 50%) - - 0% 0% 0% 0%
벤즈이미다졸(약 50%) - - 0% 100% 0% 45%
퀴놀린(약 40%) - 아세틸(약 60%) 100% 0% 0% 93%
- - - 100% 0% n.d. 36%
- - 아세틸(약 100%) 100% 0% n.d. 71%
표 6: 표적 단백질 피루브산 키나제로 수행한 상 스크리닝(n.d.= 측정되지 않음)
실시예 3: 중성 및 약 산성 단백질에 대한 인돌 및 이디다졸 함유 잔기를 갖는 흡착제의 부하 성능의 측정
실험: 3개의 단백질 헤모글로빈, 콘알부민, 및 카탈라아제(소 혈청으로부처 추출)를 각각 25mM 인산염 완충액 pH 7.4에서 농도 32mg/ml에서 각각 용해시켰다. 0.5...8mg 단백질의 절대량, 또는 ml당 1.2...19.0mg 단백질 고정상의 부하(0.2...3.6% 중량/중량과 동일함)에 상응하는 이들 스톡 용액의 용적(15...250㎕)를 각각 증가시켜 아래와 같이 나타낸 3-인돌릴프로피오닐 및 4-이미다졸릴아크릴 잔기로 다양한 정도로 유도화된 흡착제를 함유하는 HPLC 칼럼 위로 단계적으로 주입하였다.
ND 08240: 25% 3-인돌릴프로피오닐 + 20% 4-이미다졸릴아크릴 잔기
ND 08236: 14% 3-인돌릴프로피오닐 + 29% 4-이미다졸릴아크릴 잔기
ND 08037: 26% 3-인돌릴프로피오닐 + 26% 4-이미다졸릴아크릴 잔기
단계 구배를 사용하여 25mM 인산염 완충액 pH 7.4 결합 단계를 0.25ml/분으로 40분 동안 시작한 다음, 50mM 아세테이트 완충액 pH 3.5 용출 단계를 0.5ml/분d으로 20분 동안 수행한 다음, 1M 아세트산 수용액(pH 2.25)으로 추가 20분 동안 동일한 유동율로 최종 산성 퍼징하였다. 용출된 단백질의 수율은 280nm 또는 450nm 파장에서 UV 흡광 신호의 통합을 통해 각 용출 단계에 대해 독립적으로 측정되었다. 추가적 바이패스 수행과 정량적 비교를 통해 총 단백질 회수를 측정하였다(칼럼을 설치하지 않았음).
결과: 상이한 흡착제 상의 증가된 부하에서 3개의 단백질의 용출 특성은 표 7에 요약되어 있다. ND 08240: 중성 단백질 헤모글로빈에 대해 4.8 내지 19.0mg/ml의 측정된 범위에 대한 4.3% 내지 52%의 범위인 pH 7.4에서의 타개. 최대 부하 성능은 4.8mg/ml로 측정되었다. 더 높은 부하는 타개 부분의 급격한 증가를 유도하였다. 잔류하는 단백질은 부하의 전체 범위에 걸쳐 pH 3.5에서 용출되었다. ND 08236: 중성 단백질 콘알부민에 대해 1.2 내지 19.0mg/ml의 측정된 범위에 대한 0.32% 내지 47%의 범위인 pH 7.4에서의 타개. 최대 부하 선능은 7.13mg/ml로 측정되었다. 더 높은 부하는 타개 부분의 급격한 증가를 유도하였다. 잔류하는 단백질은 부하의 전체 범위에 걸쳐서 pH 3.5에서 용출하였다. ND 08037: 약산성 단백질 카탈라아제에 대해 1.2 내지 19.0mg/ml의 측정된 범위에 대한 2.1% 내지 10.4%의 범위인 pH 7.4에서의 타개. 최대 부하 성능은 11.88mg/ml로 측정되었다. 더 높은 부하는 타개 부분의 낮은 증가만을 유도하였다; 그러나, 잔류하는 단백질은 1.19mg/ml 부하시 56%에서 19.0mg/ml 부하시 16%로 감소하는 pH 2.25 부분에 의하여, 잔류하는 단백질은 산성 용출 단계들에서 분할되었다.
흡착제 번호 단백질 최대 부하[mg/ml] 수율 타개 pH 7.4 수율 용출 pH 3.5 수율 퍼징 pH 2.25
ND 08240 헤모글로빈 4.75 4% 92% 2%
ND 08236 콘알부민 7.13 3% 95% 2%
ND 08037 카탈라아제 11.88 5% 83% 13%
표 7: 각각의 최대 부하 성능에서 3개의 흡착제-단백질 조합에 대한 흡착 및 단계적 탈착 후의 수율.
실시예 4: 인돌 및 이미다졸 함유 잔기를 갖는 흡착제 상의 면역글로불린 G의 부하 성능의 측정
실험:
10mg/ml 면역글로불린 G(IgG)의 용액을, 5ml 용적 플라스크에서 100mM 인산염 완충액 pH 7.4로 303㎕ 시판용 Gammanorm® 약제학적 제품을 희석함으로써 제조하였다. 8.58mg IgG의 절대량, 또는 ml당 20.4mg IgG 고정상의 부하에 상응하는 스톡 용액 842㎕를 인산염 완충액 pH 7.4 100mM의 약 70 칼럼 용적으로 기존에 평형화시킨 흡착제 ND 10003을 함유하는 HPLC 칼럼 상으로 주입시켰다. 이러한 흡착제는 22% 3-인돌릴프로피오닐 및 30% 4-이미다졸릴아크릴 잔기로 유도화시켰다. 주입하는 동안, 100mM 인산염 결합 완충액 pH 7.4를 0.1ml/분의 유동율로 적용시키고 90분 동안 유지시킨 다음, 100mM 아세트산 완충액 pH 4.3 + 50mM 염화나트륨 용출 완충액을 20분 동안 0.5ml/분, 및 0.5M 아세트산 수용액으로 추가 20분 동안 동일한 유동율로 pH 2.6 산성 퍼징시키며, 100mM 인산염 완충액 pH 7.4로 10분 동안 1ml/분으로 중간 희석시킨 다음, 1M 수산화나트륨 수용액으로 동일한 유동에서 12분 동안 최종 세척시켰다. 상응하는 크로마토그램이 도 8에 도시되어 있다. 상이한 pH의 용출제와 유사한 3가지 분획(pH 7.4, pH 4.3, pH 2.6)이 수집되었고, 280nm에서 광도측정으로 IgG 함량에 대해 오프-라인 분석되었다. 100% 기준 값의 평가에 대해서는, 빈 튜브 조각으로 대체하고 나머지를 동일한 조건으로 하는 칼럼으로 바이패스를 수행하였다.
결과: IgG를, 대부분이 pH 7.4에서 가역적으로 결합하고, pH 4.3에서 탈착하는 모든 분획에서 발견할 수 있었다. 3가지 분석가능한 분획 중에 IgG의 수율이 9%(타개 pH 7.4), 81%(용출 pH 4.3), 및 12%(퍼징 pH 2.6)로 측정하였다. 따라서, 모든 3가지 분획에 걸친 총 단백질 회수는 약 102%의 합으로 측정하였다. 흡착제 번호 ND 10003의 가역적 부하 성능(pH 4.3 분획)은 ml 고정상 당 16.5mg IgG로서 측정될 수 있고, 총 부하 성능(pH 7.4 미만의 타개 양으로 주입됨)은 ml 고정상 당 18.5mg IgG로서 측정될 수 있다. 상기 흡착제는 동일한 실험적 프로토콜 하에 반복적으로 사용되기 때문에 1M NaOH를 사용하는 세척/위생에 대한 흡착제의 안정성이 또한 탁월하다.
실시예 5: 본 발명의 상이한 흡착제 상의 카탈라아제의 분석적 분리
실험: 5개의 단백질인 카탈라아제(소 간으로부터 추출), 헥소키나제, 펩신, 시토크롬 C, 및 α-키모트립시노겐 A(각각은 25mM 인산염 완충액 pH 7.4 중에 0.48mg의 양으로 용해됨)의 혼합물을 아래 나열된 것처럼 제1 및/또는 제2 잔기로 유도화되었던 흡착제를 함유하는 상이한 HPLC 칼럼 상으로 주입하였다.
ND 08037: 25% 3-인돌릴프로피오닐 + 26% 4-이미다졸릴아크릴 잔기
ND 070002: 50% 벤즈이미다졸-5-카보닐 + 30% 4-이미다졸릴아크릴 잔기
ND 06380: 32% 벤즈이미다졸-5-카보닐 잔기
25mM 인산염 완충액 pH 7.4를 0.25ml/분에서 10분 동안 시작한 다음, 0.1M 아세트산 수용액(pH 2.86)으로 0.5ml/분에서 50분 내에 제1 선형 pH 변화 및 1M 아세트산 수용액(pH 2.25)으로 동일한 유동에서 추가 50분 내에 제2 선형 pH 변화를 수행하여 수준이 최종적으로 20분 동안 유지되도록 하는 구배로서 용출하였다. 용출 조성물을 흡광 파장 225nm, 280nm, 및 290nm에서 관측하였다. 비교를 위해, 각각의 단일 단백질을 순수 용액으로서 주입하였다. 상이한 흡착제 상의 크로마토그래피의 수행은 도 9 내지 11에 나타나 있다.
결과:
혼합물의 크로마토그램은 단일 단백질의 중첩과 일치한다. 표적된 단백질 카탈라아제의 전체 주입된 양의 용출은, 모든 3개의 흡착제 상에서 지연되었다. 예측한 것처럼, 산성 단백질 헥소키나제 및 펩신은 흡착제에 정전기적으로 결합하지만 낮은 성능을 갖는다(헥소키나제에 대해 5 내지 25% 타개; 펩신에 대해 35 내지 50% 타개). 펩신의 지속적으로 낮은 총 회수는 이러한 단백질의 결합 분획이 적용 최저 pH 값에서도 흡착제로부터 방출 될 수 없음을 제안한다. 기초 단백질들 사이에, 시토크롬 c는 타개 분획에서 전체적으로 발견되지만, α-키모트립시노겐 A의 약 25 내지 35%가 타개되었고, 나머지는 보존되었다. pH-구배를 따르는 용출제의 상대적 순서는 모든 경우에서 (1) α-키모트립시노겐 A- (2) 카탈라아제 - (3) 헥소키나제로 3 내지 9분 사이의 범위로 피크-투-피크 차이를 갖는 것으로 밝혀졌다. 용출된 피크는 항상 중첩되지만, 정량적 분석적 목적을 위해서, 카탈라아제는 적용된 구배 동안 2개의 단백질로부터 충분히 분해되는 동안 시토크롬 C 및 펩신으로부터의 분리는 실질적으로 완료되었다. 카탈라아제는 본 발명의 흡착제를 사용하여 산성 및 염기성 단백질이 동시에 존재하는 경우 검출될 수 있다. 흡착제 번호 ND 070002와 ND 06380을 비교하면, ND 070002에 존재하는 추가적 단핵 헤테로사이클릭 치환체는 보유에서 일반적인 증가 및 카탈라아제와 α-키모트립시노겐 A 피크의 감소된 중첩에 작용하는 것임이 입증된다.
흡착제 번호 α-키모트립시노겐 A 카탈라아제 헥소키나제
ND 08037 25.8 29.2 38.3
ND 070002 28.9 33.9 41.8
ND 06380 24.4 27.0 32.3
표 8: 실시예 5의 용출 구배에서 3가지 흡착제 상의 3개 단백질의 보유 시간[분]
실시예 6: 본 발명의 상이한 흡착제 상에서 단백질의 보유에 대해 추가된 염의 작용
실험: 5개 단백질인 콘알부민, 헥소키나제, 펩신, 시토크롬 C, 및α-키모트립시노겐 A의 혼합물(각각은 25mM 인산염 완충액 pH 7.4 중에 용해된 0.48mg의 양으로 포함됨)을 아래 상응하는 표에서 나타낸 잔기로 유도화된 흡착제를 함유하는 상이한 HPLC 칼럼 위로 주입하였다. 25mM 인산염 완충액 pH 7.4를 0.25ml/분에서 10분 동안 시작한 다음, 0 내지 1M 염화나트륨으로 고정 pH에서, 0.5ml/분에서 50분 내에 선형 염 증가시켜 수준이 고정 유동에서 20분 동안 유지되도록 하는 구배로서 용출하였다. 용출 조성물을 흡광 파장 225nm, 280nm, 및 290nm에서 관측하였다. 주어진 수율은 통합후 이들 신호를 기초로 하였다. 단백질 회수는 각각의 용출 단계의 수율을 합함으로써 계산하였다. 비교를 위해, 각각의 단일 단백질을 순수 용액으로서 주입하였다(참조: 도 12 내지 15).
결과: 모든 5개의 단백질의 보유 데이타가 표 9 내지 12에 나열되어 있다. 흡착제 번호 ND 08236 및 ND 06386은 표적된 콘알부민 또는 보다 산성인 단백질 헥소키나제 및 펩신의 결합 강도에서 임의의 주목할만한 영향을 나타내지 못하였다. 의도된 프로토콜에 따라, 이들 단백질은 산성 용출제를 사용하여 하향 pH 점프 후 흡착제로부터 용출될 수 있다. 염기성 단백질 α-키모트립시노겐 A(정전기적으로 결합하지 않음)의 작은 퍼센트율이 증가된 염 농도에서 용출되었다. 반면, 흡착제 번호 ND 07200 및 ND 07122를 함유하는 퀴놀릴-4-카보닐은 콘알부민과 α-키모트립시노겐 A의 보유에 대해서 적당한 염 효과를 나타내었다. 이러한 효과는 염 적용 동안 수율 손실의 측면에서 ND 07200보다 ND 07122에서 보다 현저하고, 이로써 ND 07200에서 결합 강도에 대해 추가적 단핵 헤테로방향족 리간드의 이로운 효과가 입증되었다. 이들의 발견은 흡착제의 결합 메카니즘이 단순한 이온 교환과는 상이하다는 사실로서 간주될 수 있다. 결과적으로, 단백질은 고농도의 pH-중염을 함유하는 (명시화되지 않음) 공급 용액으로부터 흡착제 상에 캡처될 수 있다. 반대로, 용출제의 염 농도를 추가적 매개변수로서 사용하여 보다 복잡한 혼합물의 분리에 있어서 단백질 선택성을 조절할 수 있다.
단백질 보유 시간[분] 염 용출 수율 타개 수율 염 용출 수율 산성 퍼징 총 회수
콘알부민 - - - 68% 68%
α-키모트립시노겐 A - 53% - 43% 96%
시토크롬 C - 88% - - 88%
헥소키나제 - 9% - 47% 56%
펩신 - 31% - - 31%
표 9: 흡착제 번호 ND 08236 상에서 가해진 염과의 보유 데이타(14% 3-인돌릴프로피오닐 + 29% 4-이미다졸릴아크릴 잔기)
단백질 보유 시간[분] 염 용출 수율 타개 수율 염 용출 수율 산성 퍼징 총 회수
콘알부민 25.1 - 28% 26% 52%
α-키모트립시노겐 A 21.3 48% 18% 3% 69%
시토크롬 C - 88% - - 88%
헥소키나제 - 17% - 21% 37%
펩신 - 32% - - 32%
표 10: 흡착제 번호 ND 07200(19% 퀴놀린-4-카보닐 + 30% 4-이미다졸릴아크릴 잔기) 상에서 추가된 염과의 보유 데이타
단백질 보유 시간[분] 염 용출 수율 타개 수율 염 용출 수율 산성 퍼징 총 회수
콘알부민 30.6 - 56% 32% 88%
α-키모트립시노겐 A 19.9 45% 42% 3% 91%
시토크롬 C - 83% - - 83%
헥소키나제 - 14% - 32% 46%
펩신 - 33% - - 33%
표 11: 흡착제 번호 ND 07122(19% 퀴놀린-4-카보닐 잔기) 상에서 추가된 염과의 보유 데이타
단백질 보유 시간[분] 염 용출 수율 타개 수율 염 용출 수율 산성 퍼징 총 회수
콘알부민 - - - 78% 78%
α-키모트립시노겐 A 10.5 61% 11% 28% 100%
시토크롬 C - 78% - - 78%
헥소키나제 - 10% - 38% 48%
펩신 - 28% - - 28%
표 12: 흡착제 번호 ND 06386 상에서 추가된 염과의 보유 데이타(13% 벤즈이미다졸릴-2-티오아세틸 잔기)
실시예 7: 이미다졸 및 인돌 또는 퀴놀린 중의 하나를 함유한 잔기를 갖는 흡착제 상의 단백질 혼합물로부터의 콘알부민의 반-제조 분리
실험:
5개의 단백질, 콘알부민, 헥소키나제, 펩신, 시토크롬 C, 및 α-키모트립시노겐 A의 혼합물(각각은 25mM 인산염 완충액 pH 7.4 중에 용해된 0.48mg의 양을 함유함)을 흡착제 번호 ND 07200(33.5 x 4mm) 또는 PRC 10014(250 x 4 mm; 0.96mg 로딩됨)를 함유하는 2개의 상이한 HPLC 칼럼 위로 주입하였다. 흡착제를 19% 퀴놀린-4-카보닐 및 30% 4-이미다졸릴아크릴 잔기(ND 07200) 또는 22% 3-인돌릴프로피오닐 및 28% 4-이미다졸릴아크릴 잔기(PRC 10014)로 유도하였다. 25mM 인산염 완충액 pH 7.4로 0.25ml/분에서 10분(PRC 10014: 40분)을 시작으로, 50mM 아세트산 완충액 pH 3.5로 0.5ml/분에서 50분 이내에 선형 완충 변화시켜 수준이 고정 유동율에서 20분(PRC 10014: 50분) 동안 최종적으로 유지되는 구배로서 용출하였다. 용출 조성물을 225nm(도 16a/b)의 흡광 파장에서 관찰하였고 7개의 분획으로 수집하였다. 원심분리된 막 여과를 통해 0.2ml의 용적으로 농축한 후, 각각의 분획의 단백질 함량을 SDS-PAGE로 정량적으로 분석하였다(ND 07200 상에서 분획에 상응하여 도 17에서 예시적으로 나타남). 비교하기 위해, 흡착제 번호 ND 07200 상에서 모든 5개의 각각의 단백질의 분석적 수행이 도 18에 나타나 있다.
결과: ND 07200: 분획 IV(31:30-40:40 분; 4.25ml)는 대다수의 콘알부민을 함유하고 일부 α-키모트립시노겐 A이 잔류하지만 임의의 추가의 단백질로 오염되지 않았다. 시토크롬 C는 분획 I에서 발견되었고, α-키모트립시노겐 A는 분획 II 및 III에서, 헥소키나제는 분획 V 및 VI에서 발견되었다. 소량의 콘알부민이 분획 II, III 및 V에서 검출되었다. 여전히 미완성이지만, 고정상 및 이동상의 선택된 조합의 정제 성능은 짧은 칼럼 치수 및 큰 분획을 고려하여 허용가능하였다. PRC 10014: 분획 V(98:00-109:00 분; 5.50ml)는 대다수의 콘알부민과 함께 부분적으로 분리되어 잔류하는 α-키모트립시노겐 A 및 헥소키나제를 함유하였다. 시토크롬 C는 분획 I에서, α-키모트립시노겐 A는 분획 IV 및 VI에서, 및 헥소키나제는 분획 V-VII에서 발견되었다. 소량의 콘알부민이 분획 IV 및 VI에서 검출되었다.
실시예 8: 벤즈이미다졸 및 이미다졸 함유 잔기를 갖는 흡착제 상의 단백질의 혼합물로부터 헤모글로빈의 분석적 및 반-제조 분리.
실험: 5개의 단백질 헤모글로빈, 헥소키나제, 펩신, 시토크롬 C, 및 α-키모트립시노겐 A(각각은 25mM 인산염 완충액 pH 7.4 중에 용해된 0.48mg의 양을 함유함)의 혼합물을 13% 벤즈이미다졸릴-2-티오아세틸 및 10% 4-이미다졸릴아크릴 잔기로 유도된 흡착제 번호 ND 07003을 함유하는 HPLC 칼럼 위로 주입하였다. 25mM 인산염 완충액 pH 7.4로 0.25ml/분에서 10분을 시작으로, 50mM 아세테이트 완충액 pH 3.5로 0.5ml/분에서 50분 내에 선형 완충액 변화시켜 최종 수준이 고정 유동율에서 20분 동안 유지되도록 용출하였다. 용출 조성물을 225nm(도 19), 280nm, 290nm, 및 500nm의 흡광 파장에서 관찰하였고 7개의 분획에서 수집하였다. 원심분리된 막 여과를 통해 0.2ml의 용적으로 농축한 후, 각각의 분획의 단백질 함량을 SDS-PAGE로 정량적으로 분석하였다(도 20). 비교하기 위해, 흡착제 번호 ND 07003 상에서 모든 5개의 각각의 단백질(헤모글로빈: 1.92mg 주입량)의 동시 분석적 수행이, 칼럼의 말단에서 수집된 용출의 측정된 pH 값과 함께 도 21에 나타나 있다. 이미다졸릴아크릴 잔기가 결손되었던, 유사한 기준 흡착제 번호 ND 06386의 분석적 수행이 도 22에 추가로 나타나 있다.
결과: 본 실험의 몇가지 중요한 데이타가 표 13에 요약되어 있다. 흡착제 번호 ND 07003으로 수득한 분석적 크로마토그램의 오버레이(overlay)는 고정상의 적당히 양호한 분리 효능을 입증한다. 헤모글로빈은 7.5분의 최소 보유 시간차로 산성 및 염기성 단백질의 동시 존재 하에 검출될 수 있고 100%로 회수될 수 있다(기준 흡착제 ND 06386: 86%). 또한, 혼합물의 크로마토그램은 단일 단백질 수행의 중첩과 일치한다. 예상된 것처럼, 산성 단백질 헥소키나제 및 펩신은 흡착제에 정전기적으로 결합되지만 저 성능(즉, 부분적 타개)을 갖는다. 해결하기 어려운 대부분의 문제는 후자의 광범위한 용출 특성에 기인한 헥소키나제로부터 헤모글로빈을 분리하는 것으로 결론지어졌다. 펩신의 지속적으로 낮은 총 회수는 이러한 단백질의 결합 분획이 적용된 최저 pH 값에서도 흡착제로부터 방출될 수 있는 것을 제안한다. 대조적으로, α-키모트립시노겐 A 및 헤모글로빈은 동일한 구배가 사용되는 경우 흡착제 번호 ND 06386(보유 시간 35.1 및 35.7분) 상에서 분리될 수 없다. 분석적 수행에 따라, 반 제조 수행(31:30 내지 40:00분; 4.25ml)의 분획 IV는 대부분의 헤모글로빈을 함유하고 α-키모트립시노겐 A가 잔류하지만 임의의 추가 단백질로 오염되지 않았다. 초기 혼합물의 기타 단백질은 분획 I(시토크롬 C) 및 분획 V 및 VI(헥소키나제, α-키모트립시노겐 A)에서 발견되었다. 소량의 헤모글로빈은 후자의 2개의 분획 내로 수반되었다.
단백질 보유 시간[분] 완충된 용출 대략적인 용출 pH 수율 타개 수율 완충된 용출 총 회수
헤모글로빈 25.5 6.8 4% 96% 100%
α-키모트립시노겐 A 33.0 5.6 36% 13% 49%
시토크롬 C - - 99% - 99%
헥소키나제 49.2 4.5 12% 48% 61%
펩신 - - 34% - 34%
표 13: 흡착제 번호 ND 07003 상에서 실시예 8의 시험 혼합물의 보유 데이타

Claims (16)

  1. 고체 지지 물질의 표면이 탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 이핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제1 잔기; 및
    탄소 원자 외에 적어도 하나의 헤테로원자 N, O, S를 포함하는 단핵 헤테로방향족 구조를 포함하는 제2 잔기;
    상기 제1 및 제2 잔기는 서로 직접적으로 연결되지 않지만, 담체로서 벌크 고체 지지 물질 자체 또는 이에 지지되는 중합체 필름 중의 하나에 분리되어 부착되는 것을 특징으로 하는 고체 지지 물질을 포함하는 흡착제.
  2. 제1항에 있어서,
    이핵 헤테로방향족 구조는 모든 가능한 아자-벤조피롤, 옥사벤조피롤(인돌) 구조, 및 티아-벤조피롤 구조를 포함하는 벤조피롤(인돌)구조이거나, 또는 모든 가능한 아자-벤조피리딘, 옥사-벤조피리딘, 및 티아-벤조피리딘 구조를 포함하는 벤조피리딘(퀴놀린 또는 이소퀴놀린) 구조인 흡착제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    단핵 헤테로방향족 구조는 모든 가능한 아자-피롤, 옥사-피롤, 및 티아-피롤 구조, 예를 들면, 3-아자피롤(이미다졸)을 포함하는 피롤 구조인 흡착제.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    제1 및/또는 제2 잔기는 1개 내지 20개 원자의 길이의 공유결합된, 구조적으로 유연한 링커를 포함하는 흡착제.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    고체 지지 물질의 표면은 제3 잔기 및 임의로 제4 잔기를 추가로 포함하는 흡착제.
  6. 제5항에 있어서,
    제3 잔기는 아민 또는 아미드 구조 또는 제1차 아민 구조를 포함하는 흡착제.
  7. 제6항에 있어서,
    제1, 제2 및 제3 잔기는 약 1:1:2의 몰 비로 존재하는 흡착제.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서,
    고체 지지 물질의 표면은 서로 동일하거나 상이할 수 있는 제1 및 제2 잔기, 및 선택적으로 제3 및 제4 잔기를 수반하는 제1 및 제2 기능기를 포함하는 중합체의 필름으로 덮어쌓여있는 흡착제.
  9. 제8항에 있어서,
    중합체는 서로 공유적으로 가교결합되지만, 담체의 표면에 공유결합되지 않는 각각의 쇄를 포함하거나 구성하고 있는 흡착제.
  10. 제8항 또는 제9항 중의 어느 한 항에 있어서,
    중합체는 폴리아민, 또는 폴리비닐 아민, 또는 폴리아민을 포함하는 공중합체 또는 중합체 블렌드인 흡착제.
  11. 제8항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서,
    중합체 필름의 상기 기능기의 제1 부분은 적어도 하나의 가교결합 시약으로 가교결합되고, 가교결합된 중합체의 상기 기능기의 제2 부분은 상기 제1 및 제2 잔기, 및 임의로 추가의 잔기들에 부착되는 흡착제.
  12. (i) 제1 및 제2 기능기를 갖는 중합체를 제공하며;
    (ii) 상기 중합체의 필름을 담체의 표면 위로 흡착시키며;
    (iii) 흡착된 중합체의 상기 기능기의 제1 부분을 적어도 하나의 가교결합 시약으로 가교결합시키고;
    (iv) 가교결합된 중합체의 상기 기능기의 제2 부분을 상기 제1, 제2 및 임의로 추가의 잔기들과 결합시키는 것을;
    포함하는, 청구항 11항의 흡착제를 제조하는 방법.
  13. (i) 단백질 또는 펩타이드를 흡착제에 결합시킬 수 있는데 충분한 시간 동안, 제1 용액 중에 용해되거나 현탁되는 상기 혼합물을, 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항의 흡착제 또는 제12항의 방법에 따라 제조된 흡착제와 접촉시킴;
    (ii) 상기 흡착제를 제2 용액으로 임의로 세척시킴;
    (iii) 단백질 또는 펩타이드를 상기 흡착제로부터 방출시키는데 충분한 시간 동안, 상기 결합된 단백질 또는 펩타이드를 갖는 상기 흡착제를, 제3 용액과 접촉시킴;
    (iv) 흡착제를 제4 및/또는 제5 용액과 임의로 세척 및/또는 재생성시킴을 포함하여, 상기 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 혼합물로부터 단백질 또는 펩타이드의 농도 및/또는 순도를 분리시키거나, 증가시키는 방법
  14. 제13항에 있어서,
    제1 및 임의로 제2 액체의 pH는 상기 단백질 또는 펩타이드의 등전점 pI에 근접하는 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    제1 액체의 pH는 5.5 내지 8.5의 범위에 있고, 제3 용액의 pH는 3 내지 6.5의 범위인 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 또는 펩타이드가 5.5 내지 8.5의 등전점 pI 및 100 내지 500,000Da의 분자량을 갖는 방법.
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