JP6540032B2 - 分離材 - Google Patents
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[1]多孔質ポリマ粒子と、上記多孔質ポリマ粒子の表面上に形成された、アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンが交互に積層されてなる交互積層膜と、を備える、分離材。
[2]比表面積が30m2/g以上である、[1]に記載の分離材。
[3]上記多孔質ポリマ粒子が、モノマとして、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で50質量%以上含む、[1]又は[2]に記載の分離材。
[4]上記多孔質ポリマ粒子における粒径の変動係数が3〜15%である、[1]〜[3]のいずれかに記載の分離材。
[5]上記アミノ基を有する親水性ポリマが多糖類である、[1]〜[4]のいずれかに記載の分離材。
[6]上記アミノ基を有する親水性ポリマがキトサンである、[1]〜[4]のいずれかに記載の分離材。
[7]上記ポリアニオンがアルギン酸ナトリウムである、[1]〜[6]のいずれかに記載の分離材。
[8]上記交互積層膜が架橋されている、[1]〜[7]のいずれかに記載の分離材。
[9]上記多孔質ポリマ粒子1g当たり30〜300mgの上記交互積層膜を備える、[1]〜[8]のいずれかに記載の分離材。
[10]カラムに充填した場合、カラム圧0.3MPaのときに通液速度が800cm/h以上である、[1]〜[9]のいずれかに記載の分離材。
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面上に形成された交互積層膜と、を備える。
本実施形態の多孔質ポリマ粒子は、多孔質化剤を含むモノマを硬化させた粒子であり、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成される。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、スチレン系のビニルモノマを使用することができる。具体的なモノマとしては、以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。
1)粒子を、超音波分散装置を使用して水(界面活性剤等の分散剤を含む)に分散させ、1質量%の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
2)粒度分布計(シスメックスフロー、シスメックス株式会社製)を用いて、上記分散液中の粒子約1万個の画像により平均粒径及び粒径のC.V.(変動係数)を測定する。
本実施形態の交互積層膜は、アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンが交互に積層されてなる。アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンを使用することによって、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となり、タンパク質吸着量が天然高分子を分離材として用いた場合と同等又はそれ以上となる。また、交互積層膜を架橋することによって、カラム圧の上昇をより抑制することが可能となる。
アミノ基を有する親水性ポリマは、水に溶解又は膨潤することが可能な親水性を有し、水中でアミノ基がプロトン化されて正電荷を帯びるという特性を有するものが好適に使用される。アミノ基を有する親水性ポリマとしては、1分子中に2個以上のアミノ基を有する親水性ポリマが好ましい。また、アミノ基を有する親水性ポリマは水酸基を有することが好ましく、該水酸基の数は2個以上であることがより好ましい。
アミノ基を有する親水性ポリマを含む溶液の溶媒としては、アミノ基を有する親水性ポリマを溶解できるものであれば、任意の溶媒を用いることができるが、電荷量をより多くすることができるという観点から、水又は無機塩類の水溶液を用いることが好ましい。
本明細書において、ポリアニオンとは、1分子中に2個以上のアニオン性基を有する化合物をいい、アニオン性基とは、アニオン基又はアニオンに誘導され得る基をいう。アニオン性基としては、例えば、カルボキシ基、カルボキシレート基、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基等が挙げられる。
ポリアニオンを含む溶液の溶媒としては、ポリアニオンを溶解できるものであれば、任意の溶媒を用いることができるが、ポリアニオンの電荷量をより多くすることができるため、水又は無機塩類の水溶液が適当である。
交互積層膜は、架橋剤等を用いて、架橋されていることが好ましい。分離材は、架橋処理することによって、3次元架橋網目構造を形成することができる。
架橋された交互積層膜を備える分離材は、イオン交換基、リガンド(プロテインA)等を表面上の水酸基等を介して導入することによりイオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
(吸湿後分離材質量−1)g/1g×100=吸湿度(質量%)
<多孔質ポリマ粒子1の合成>
500mLの三口フラスコに、純度96%のジビニルベンゼン(新日鉄住金化学株式会社製、商品名DVB960)を16g、スパン80を6g、過酸化ベンゾイルを0.64g加え、ポリビニルアルコール(0.5wt%)水溶液を調製した。この水溶液をマイクロプロセスサーバーを使用して乳化後、得られた乳化液をフラスコに移し、80℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約8時間撹拌した。得られた粒子をろ過後、アセトン洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子1を得た。得られた粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、上述の方法で平均粒径及び粒径のC.V.(変動係数)を算出した。結果を表1に示す。
アミノ基を有する親水性ポリマとしてキトサン水溶液(株式会社キミカ製:重量平均分子量90,000、粘度12.5mPa・s(20℃)、濃度0.1質量%)を用いた。また、ポリアニオンとしてアルギン酸ナトリウム水溶液(株式会社キミカ製:重量平均分子量100,000、粘度6.7mPa・s(20℃)、濃度0.1質量%)、pH調整用の有機酸としてリンゴ酸(和光純薬工業株式会社製)を用いた。
キトサン水溶液としては、上記0.1質量%のキトサン水溶液をそのまま用いた。アルギン酸ナトリウム水溶液としては、0.1質量%アルギン酸ナトリウム水溶液100質量部に対して、1質量%リンゴ酸水溶液1質量部を滴下したものを用いた。
(ア)キトサン水溶液中で多孔質ポリマ粒子1を3時間撹拌した後(多孔質ポリマ粒子1g当たり100mL)、リンス用の超純水(比抵抗18MΩ・cm)中で10分間撹拌した。(イ)アルギン酸ナトリウム水溶液に3時間浸漬した後(多孔質ポリマ粒子1g当たり100mL)、リンス用の超純水中で10分間撹拌した。(ア)及び(イ)を順番に行うことを1サイクルとして、このサイクルを3回繰り返すことによって、交互積層膜を作製した。得られた粒子について、乾燥後、XPS(X線光電子分光)を測定したところ、窒素原子、酸素原子及びナトリウム原子が確認された。このことから、交互積層膜が形成されていることを確認した。また、熱重量分析により、多孔質ポリマ粒子1gに対する交互積層膜の質量を測定した。結果を表2に示す。
次いで、交互積層膜を架橋するとともに、イオン交換基を導入した。交互積層膜が形成された粒子10gを分散させた0.4M水酸化ナトリウム水溶液350gにエピクロロヒドリンを5g添加し、12時間室温で撹拌した。その後、2質量%のドデシル硫酸ナトリウム熱水溶液で洗浄後、純水で洗浄し、水中で保管した。得られた分散液を遠心分離することにより、水を除去した。得られた粒子20gを、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩を所定量溶解させた水溶液100mLに分散させ、70℃で10分撹拌した。その水溶液に、70℃に加温したNaOH水溶液(5M)100mLを添加し、1時間反応させた。反応終了後、生成物をろ取し、水/エタノール(体積比8/2)で2回洗浄し、ジエチルアミノエチル(DEAE)基をイオン交換基として有する(DEAE変性)分離材を得た。分離材の平均細孔径、比表面積及び空隙率(ポロシティ)を水銀圧入法にて測定した。結果を表2に示す。
また、分離材のイオン交換容量を以下のように測定した。5mL容量の分離材を、0.1Nの水酸化ナトリウム水溶液20mLに1時間浸漬し、室温で攪拌した。その後、洗浄液として用いた水のpHが7以下となるまで洗浄を行った。洗浄した分離材を0.1Nの塩酸20mLに浸漬し、1時間攪拌させた。分離材をろ過で取り除いた後、ろ液の塩酸水溶液を中和滴定することによって、分離材のイオン交換容量を測定した。結果を表2に示す。
得られた分離材0.5gを、BSA(Bovine Serum Albumin)濃度20mg/mLのリン酸緩衝液(pH7.4)50mLに投入し、24時間室温で撹拌を行った。その後、遠心分離で上澄みをとり、分光光度計でろ液のBSA濃度より、分離材に吸着したBSA量を算出した。BSAの濃度は分光光度計により280nmの吸光度から確認した。その後、分離材をろ別して洗浄し、100mLのリン酸緩衝液(pH7.4)50mLに浸漬し、吸着させたBSAを回収することによって、回収率を算出した。回収率が95%以上であるものを「〇」、90%以上95%未満であるものを「△」、90%未満であるものを「×」とした。結果を表3に示す。
得られた分離材を濃度30質量%のスラリー(溶媒:メタノール)としてφ7.8×300mmのステンレスカラムに15分かけて充填した。その後、カラムに流速を変えながら水を通し、流速とカラム圧との関係を測定し、0.3MPa時の通液速度を測定した。結果を表2に示す。
また、動的吸着量は以下のようにして測定した。20mmol/L Tris−塩酸緩衝液(pH8.0)をカラムに10カラム容量通した。その後、BSA濃度2mg/mLの20mmol/LのTris−塩酸緩衝液を通し、UV測定によってカラム出口でのBSA濃度を測定した。カラム入口と出口のBSA濃度が一致するまで緩衝液を通し、5カラム容量分の1M NaCl Tris−塩酸緩衝液で希釈した。10%breakthroughにおける動的吸着量を以下の式を用いて算出した。結果を表3に示す。
q10=cfF(t10−t0)/VB
q10:10%breakthroughにおける動的吸着量(mg/mL wet resin)
cf:注入しているBSA濃度(mg/mL)
F:流速(mL/min)
VB:ベッド体積(mL)
t10:10%breakthroughにおける時間(min)
t0:BSA注入開始時間(min)
得られた分離材を0.5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で24時間撹拌し、リン酸緩衝液で洗浄後、カラム特性評価と同様の条件にて充填した。BSAの10%breakthrough動的吸着量を測定し、アルカリ処理前の動的吸着量と比較した。動的吸着量の減少率が3%以下であるものを「○」、3%超20%以下であるものを「△」、20%超であるものを「×」とした。結果を表3に示す。
吸湿度は、上述の方法で測定した。結果を表3に示す。
スパン80の使用量を8gに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子2を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子2を、多孔質ポリマ粒子1と同様の方法で処理することによって、分離材を得た。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
スパン80の使用量を9gに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子3を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子3を、多孔質ポリマ粒子1と同様の方法で処理することによって、分離材を得た。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
ジビニルベンゼン(16g)を、ジビニルベンゼン(14g)及びオクタノール(2g)に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子4を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子4を、多孔質ポリマ粒子1と同様の方法で処理することによって、分離材を得た。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
ジビニルベンゼン(16g)及びスパン80(6g)を、ジビニルベンゼン(14g)、オクタノール(5g)及びスパン80(3g)に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子5を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子5を、多孔質ポリマ粒子1と同様の方法で処理することによって、分離材を得た。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
ジビニルベンゼン(16g)及びスパン80(6g)を、ジビニルベンゼン(4g)、ジヒドロキシプロピルメタクリレート(8g)及びスパン80(4g)に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子6を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子6を、交互積層膜を形成せずにDEAE変性することによって、分離材を得た。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
実施例1で得られた多孔質ポリマ粒子1をそのまま分離材として用いた。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
実施例1で得られた多孔質ポリマ粒子1をキトサン水溶液中で24時間撹拌した後(多孔質ポリマ粒子1g当たり100mL)、リンス用の超純水(比抵抗18MΩ・cm)中で10分間撹拌し、キトサンの単層膜を作製した。また、熱重量分析により、多孔質ポリマ粒子1gに対するキトサンの単層膜の質量を測定した。結果を表2に示す。その後、実施例1と同様にして、キトサンの単層膜を架橋し、DEAE変性することによって、分離材を得た。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
実施例1で得られた多孔質ポリマ粒子1をアルギン酸ナトリウム水溶液中で24時間撹拌した後(多孔質ポリマ粒子1g当たり100mL)、リンス用の超純水(比抵抗18MΩ・cm)中で10分間撹拌し、アルギン酸ナトリウムの単層膜を作製した。また、熱重量分析により、多孔質ポリマ粒子1gに対するアルギン酸ナトリウムの単層膜の質量を測定した。結果を表2に示す。その後、実施例1と同様にして、アルギン酸ナトリウムの単層膜を架橋し、DEAE変性することによって、分離材を得た。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
市販のアガロース粒子(Capto DEAE:GEヘルスケア)を、多孔質ポリマ粒子7として使用した。また、多孔質ポリマ粒子7をそのまま分離材として用いた。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
ジビニルベンゼン(16g)及びスパン80(6g)を、2,3−ジヒドロキシプロピルメタクリレート(11.2g)、エチレングリコールジメタクリレート(4.8g)、スパン80(5g)に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子8を合成した。洗浄後の多孔質ポリマ粒子8(4g)を、デキストラン(分子量15万)1g、水酸化ナトリウム0.6g及び水素化ホウ素ナトリウム0.15gを蒸留水に溶解させた溶液6gに加えて、多孔質ポリマ粒子8の細孔内に含浸させた。得られたデキストラン溶液含浸重合体を、1質量%エチルセルローストルエン溶液1Lに加えて攪拌し、分散、懸濁せしめた。得られた懸濁液中に、エピクロルヒドリン5mLを加えて50℃に昇温し、この温度で6時間攪拌して、多孔質ポリマ粒子8の細孔内に含浸されているデキストランを架橋反応させた。反応終了後、懸濁液をろ過して生成ゲル状物を分離し、トルエン、エタノール、蒸留水で順次洗浄することによって、分離材を得た。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
Claims (9)
- 多孔質ポリマ粒子と、
前記多孔質ポリマ粒子の表面上に形成された、アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンが交互に積層されてなる交互積層膜と、
を備え、
前記多孔質ポリマ粒子が、モノマとして、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で50質量%以上含み、
前記アミノ基を有する親水性ポリマが多糖類である、
生体高分子の分離又は精製に用いるための分離材。 - 多孔質ポリマ粒子と、
前記多孔質ポリマ粒子の表面上に形成された、アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンが交互に積層されてなる交互積層膜と、
を備え、
前記多孔質ポリマ粒子が、モノマとして、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で50質量%以上含み、
前記アミノ基を有する親水性ポリマがキトサンである、
生体高分子の分離又は精製に用いるための分離材。 - 前記ポリアニオンがアルギン酸ナトリウムである、請求項1又は2に記載の分離材。
- 多孔質ポリマ粒子と、
前記多孔質ポリマ粒子の表面上に形成された、アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンが交互に積層されてなる交互積層膜と、
を備え、
前記多孔質ポリマ粒子が、モノマとして、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で50質量%以上含み、
前記ポリアニオンがアルギン酸ナトリウムである、
生体高分子の分離又は精製に用いるための分離材。 - 比表面積が30m2/g以上である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマ粒子における粒径の変動係数が3〜15%である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記交互積層膜が架橋されている、請求項1〜6のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマ粒子1g当たり30〜300mgの前記交互積層膜を備える、請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離材。
- カラムに充填した場合、カラム圧0.3MPaのときに通液速度が800cm/h以上である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の分離材。
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