CN104768536B - 官能化微粒状载体材料和其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

公开了适合用于色谱柱或筒，例如液相色谱(HPLC)柱的官能化微粒状载体材料。还公开了含有所述官能化微粒状载体材料的色谱柱或筒，制备该官能化微粒状载体材料的方法、和使用官能化微粒状载体材料例如色谱柱或筒中的介质的方法。

Description

官能化微粒状载体材料和其制备和使用方法
发明领域
本发明主要涉及适合用于色谱柱或筒，例如液相色谱柱的官能化微粒状载体材料。本发明进一步涉及含有所述官能化微粒状载体材料的色谱柱或筒，制备官能化微粒状载体材料的方法、和使用官能化微粒状载体材料例如色谱柱或筒中的介质的方法。
发明背景
阳离子和阴离子交换色谱材料是已知的。阳离子交换色谱材料通常含有具有表面连接的阴离子基团例如磺酸基（例如S强阴离子交换）和/或羧甲基（例如CM弱阳离子交换）的介质。阴离子交换色谱材料通常含有具有表面连接的阳离子基团例如季铵（例如Q强阴离子交换）和/或二乙基氨基乙基（例如DEAE弱阴离子交换）的介质。
在分离过程，例如蛋白纯化中，提出的极高分子量(MW)的那些生物分子，高MW生物分子扩散到所述介质表面是非常有限的。为了处理该问题，开发“触角”概念并发现其非常有用和宽范围的应用。在“触角”概念中，将包括接枝聚合物链的触角接枝到所述介质表面上。所述接枝的聚合物链包含从聚合物端连接至介质表面的离子基团的重复单元。这些聚合物链可以自由旋转，使得发生蛋白分子和聚合物固定相之间的相互作用而不需要生物分子扩散到介质表面上并因此能够实现高蛋白载量。
在触角涂层概念中涉及的最通常的化学使用“从...接枝”概念。在此类化学中，从介质颗粒表面引发基团聚合。对于阳离子交换介质，Ce(IV)盐(例如授予E. Merck的美国专利No.5,453,186)用于表面二醇基的氧化还原化学（例如在聚合之前通过连接的环氧基的水解制备）以生成表面基团，其聚合含磺酸的单体，例如2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS)。该化学不是环境友好的，因为其生成明显有害的废料。
努力继续开发适合用作阳离子和/或阴离子交换色谱介质的节约成本的介质，以及包括此类节约成本的介质的色谱柱或筒，包括单次使用和/或一次性色谱柱或筒。
发明概述
本发明涉及适合用作阳离子和/或阴离子交换色谱材料的节约成本的介质。所公开的介质，在本文中称为“官能化微粒状载体材料”适合用于色谱柱或筒，例如在高效液相色谱(HPLC)柱和快速蛋白液相色谱(FPLC)中。
在本发明的一种实施方案中，所述官能化微粒状载体颗粒包含具有颗粒表面的颗粒；和从所述颗粒表面伸出的官能团的组合，所述官能团的组合包括(i) 第一组官能团，通过该第一组官能团能够使一种或多种单体聚合到所述颗粒表面上，和(ii) 第二组官能团，其提高所述颗粒表面的润湿性。在本发明的示例性的实施方案中，所述颗粒包含一种或多种无机金属氧化物颗粒，例如一种或多种二氧化硅或硅胶颗粒。
在本发明的另一种实施方案中，所述官能化微粒状载体材料包含具有颗粒表面的颗粒；和从所述颗粒表面伸出的官能团的组合，所述官能团的组合包括(i) 键合至从所述颗粒表面伸出的至少一种聚合物的颗粒表面上的第一组官能团，和(ii)提高所述颗粒表面的润湿性的第二组官能团。
在本发明的其他实施方案中，所述官能化微粒状载体材料包括具有颗粒表面和至少150 Å的中值孔径的颗粒；和从所述颗粒表面伸出的第一官能团，在所述颗粒表面上的所述第一组官能团键合至从所述颗粒表面伸出的至少一种聚合物。在另一种实施方案中，所述官能化载体材料包含提高所述颗粒表面的润湿性的第二组官能团。
本发明进一步涉及适合用于色谱装置的色谱柱或筒，其中所述色谱柱或筒包括本文中公开的本发明的官能化微粒状载体材料。在本发明的示例性实施方案中，所述色谱柱或筒包括具有柱体积的柱结构；和位于柱结构的柱体积中的官能化微粒状载体材料，其中所述官能化微粒状载体材料包含多个颗粒，其中所述多个颗粒内的一个或多个颗粒包括具有颗粒表面的颗粒；和从所述颗粒表面伸出的官能团的组合，所述官能团的组合包括(i)第一组官能团，通过该第一组官能团使一种或多种单体能够聚合到所述颗粒表面上，和(ii) 第二组的官能团，其提高所述颗粒表面的润湿性。
本发明甚至进一步涉及包括本文中公开的色谱柱或筒的色谱装置。在一种示例性实施方案中，本发明的色谱装置包括包含官能化微粒状载体材料的色谱柱或筒，其中所述官能化微粒状载体材料包含多个颗粒，其中所述多个颗粒内的一个或多个颗粒包括具有颗粒表面的颗粒；和从所述颗粒表面伸出的官能团的组合，所述官能团的组合包括(i) 第一组官能团，通过该第一组官能团使一种或多种单体能够聚合到所述颗粒表面上，和(ii) 第二组的官能团，其提高所述颗粒表面的润湿性。
本发明还涉及制备官能化微粒状载体材料的方法。在一种示例性实施方案中，制备官能化微粒状载体材料的方法包括处理颗粒的颗粒表面从而导致获得从所述颗粒表面伸出的官能团的组合，所述官能团的组合包括(i) 第一组官能团，通过该第一组官能团能够使一种或多种单体聚合到所述颗粒表面上，和(ii) 第二组官能团，其提高所述颗粒表面的润湿性。例如，在一些实施方案中，所述处理步骤可以包括使所述颗粒表面暴露于(i)至少一种包含来自第一组官能团的官能团的硅烷，和(ii) 至少一种包含来自第二组官能团的官能团的硅烷。
本发明甚至进一步涉及制备包含官能化微粒状载体材料的色谱柱或筒的方法。在一种示例性实施方案中，制备色谱柱或筒的方法包括：(1) 密封管状结构的第一端；(2) 采用本发明的官能化微粒状载体材料至少部分地填充管状结构的柱腔；(3) 采用官能化微粒状载体材料的浆液至少部分地填充所述管状结构的柱腔；和(4) 密封所述管状结构的相对端。所得色谱柱或筒可以引入色谱装置中并用于分离样品。
本发明还涉及使用官能化微粒状载体材料的方法、柱或筒、和检测给定样品中一种或多种目标分子（例如一种或多种生物分子）存在的装置。在一种示例性实施方案中，分离目标分子的方法包括分离能够含有至少一种目标分子（例如，生物分子诸如蛋白或肽）的混合物，其中所述方法包括使该包含至少一种目标分子（例如，生物分子诸如蛋白或肽）的样品与本文公开的本发明的官能化微粒状载体材料接触。例如，分离样品的公开的方法可以用于隔离至少一种生物分子的存在，所述生物分子包括抗体、蛋白、肽、多肽、非肽基化合物、寡核苷酸、其衍生物、其类似物、或其任何组合。
本发明的这些和其他特征和优点在浏览后文的所公开的实施方案的详细描述和所附权利要求之后变得明显。
附图简要描述
本发明参考所附的附图进一步描述，其中：
图1描绘本发明的示例性色谱装置的图；
图2描绘本发明的色谱介质的示例性实施方案的反应方案；和
图3描绘本发明的色谱介质的示例性实施方案的反应方案；
图4描绘本发明的色谱介质的示例性实施方案的反应方案；和
图5描绘本发明的色谱介质的示例性实施方案的反应方案。
发明的详细描述
本发明涉及适合用于色谱柱或筒，例如液相色谱（例如高效液相色谱(HPLC)或快速液相色谱）的官能化微粒状载体材料。本发明进一步涉及包含官能化微粒状载体材料的色谱柱或筒。本发明甚至进一步涉及制备官能化微粒状载体材料的方法和色谱柱或筒的方法，以及使用官能化微粒状载体材料和色谱柱或筒以分析样品，包括复合混合物（例如，包含各生物组分的混合物）（其能够含有一种或多种目标分子）的方法。
必须注意如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”和“该”包括复数指示物，除非上下文以另外的方式清楚地指明。因此，例如“氧化物”是指包括多个此类氧化物，并且“氧化物”是指包括一种或多种氧化物和本领域技术人员已知的其等价物等。
描述本公开的实施方案中使用的“约”修饰的，例如组合物中的成分、浓度、体积、处理温度、处理时间、回收率或产率、流速、和类似值的量和其范围是指例如可以如下发生的数量的变化；和类似的近似考虑：通过典型的测量和处理程序；通过这些程序中的疏忽的错误；通过用于进行所述方法的成分中差别。术语“约”还包括由于具有特定初始浓度的配制品或混合物的老化导致不同的量，和由于混合或处理采用特定的初始浓度的配制品或混合物导致不同的量。无论是否由术语“约”修饰，所附的权利要求包括这些量的等价值。
本文中使用的术语“生物分子”是指由活体产生的任何分子，包括大分子如蛋白质、多糖、脂质、和核酸；和小分子例如原生代谢物、次生代谢物、和天然产物。生物分子的实例包括细胞和细胞碎片；蛋白质和肽；核酸，例如DNA和RNA；内毒素；病毒；疫苗等。生物分子的其他实例包括在WO 2002/074791和U.S. 5,451,660中叙述的那些。
如本文使用的，“无机氧化物”定义为二元氧化合物，其中所述无机组分为阳离子，所述氧化物为阴离子。所述无机材料包括可以也包括准金属的金属。金属包括在元素周期表上从硼到钋画出的对角线左边的那些元素。准金属或半金属包括在该线右边的那些元素。无机氧化物的实例包括二氧化硅、氧化铝、二氧化钛、氧化锆等，和其混合物。
如本文使用的，“颗粒”包括由无机材料、有机材料、或无机材料（例如金属、半金属、和它们的合金；陶瓷，包括无机氧化物等）和有机材料（例如有机聚合物）的组合，例如复合材料（其在性质上为多相或均相的）构成的颗粒。例如，多相复合材料仅包括材料、层状材料、芯-壳等的混合物。均相复合材料的实例包括合金、有机-无机聚合物杂合材料等。所述颗粒可以为多种不同的对称的、不对称的或不规则形状，包括链、棒或板条状。所述颗粒具有不同的结构，包括无定形或结晶等。所述颗粒可以包括包含不同组成、尺寸、形状或物理结构的颗粒的混合物，或除了不同的表面处理之外是相同的那些。在较小颗粒团聚形成较大颗粒的情况下，所述颗粒的孔隙可以为颗粒内的或颗粒间的。在一种示例性实施方案中，所述颗粒由无机材料例如无机氧化物、硫化物、氢氧化物、碳酸盐、硅酸盐、磷酸盐等构成，但优选为无机氧化物。其可以通过任何已知方法形成，包括但不限于溶液聚合例如用于形成胶体颗粒、连续火焰水解例如用于形成熔融颗粒、凝胶化例如用于形成胶凝颗粒、沉淀、喷雾、模板、溶胶-凝胶等。
如本文使用的，术语“官能化”是指已经通过与官能化合物的反应改性以改变至少一部分所述颗粒表面（包括所述颗粒外部部分上的表面区域和/或内孔的表面区域）的选择性而表面改性的颗粒。所述官能化的表面可以用于形成键合相（共价键或离子键）、涂布表面（例如，反相C18键合的）、包层表面（例如，EP6中的碳包层）、聚合表面（例如，离子交换）、固有表面（例如，无机/有机杂合材料）等。例如，通过共价键合硅烷至无机表面（例如，C4,C8, C18等）使无机颗粒与十八烷基三氯硅烷反应形成“反相”。在另一实例中，无机颗粒与氨基丙基三甲氧基硅烷的反应，然后氨基季铵化，形成“阴离子交换相”。在第三实例中，可以通过无机颗粒与氨基丙基三甲氧基硅烷反应然后用酰氯形成酰胺从而形成键合相。其他键合相包括二醇、氰基、阳离子、亲和力、手性、氨基、C18、亲水性相互作用(HILIC)、疏水性相互作用(HIC)、混合模式、尺寸排斥等。作为键合相或官能化表面的一部分，可以使用配体示出与目标分子或生物分子（例如ligate）的特定相互作用，例如在U.S. 4,895,806中所述的那些。
如本文所使用的，术语“平均分子量”定义为由于在各聚合物链中的不同数目的重复单元而具有一定分子量分布的聚合物的分子量的摩尔质量平均值。使用凝胶渗透色谱(GPC)分析测量该值。
如本文使用的术语“色谱”是指使溶解于流动相中的混合物通过装载在柱或筒或其他容器中的固定相（即色谱介质）的过程，其使目标分子与混合物中的其他分子分离并使其待分离。取决于所使用的色谱的类型，目标分子可以吸附到固定相上，同时不需要的组分通过所述装置，反之亦然。术语“液相色谱”是其中液体用作流动相并且固体载体上的固体或液体作为固定相的色谱形式。术语“快速色谱”是指在正压(例如最高达300 psi)下进行的液相色谱。术语“高效液相色谱”(HPLC)是指在高正压(例如最高达5000 psi)下进行的液相色谱。术语“制备型色谱”是指用于分离和纯化目标化合物或分子的HPLC。术语“快速蛋白液相色谱”(FPLC)是用于分离生物分子的HPLC形式。
如本文使用的术语“杂质”是指存在于无机颗粒中，除了所述无机材料之外的材料。
如本文使用的术语“不规则”当其应用于无机颗粒时是指从一个颗粒到下一个的颗粒形状是不均匀的（即无规颗粒形状），长宽比大于1.0。
如本文使用的术语“壳体”是指用于保持固定相用于色谱中的器皿或容器，包括筒、柱、管、装置、床、袋等。
如本文使用的术语“固定相”或“色谱介质”或“色谱载体”是指示出在样品混合物中对于不同组分具有不同的亲和力的材料，其用于色谱中以使目标分子与一种或多种其他分子分离。固定相包括如本文定义被官能化的有机和无机材料或其杂合物，并可以为颗粒、整料、膜、涂层等形式。
在本发明的一种实施方案中，所述官能化微粒状载体颗粒包含具有颗粒表面的颗粒；和从所述颗粒表面伸出的官能团的组合，所述官能团的组合包括(i) 第一组官能团，通过在该第一组官能团和所述一种或多种单体之间形成共价键能够使一种或多种单体聚合到所述颗粒表面上，和(ii) 第二组官能团，其提高所述颗粒表面的润湿性。在本发明的示例性的实施方案中，所述颗粒包含一种或多种无机金属氧化物颗粒，例如一种或多种二氧化硅或硅胶颗粒。
在本发明的另一种实施方案中，所述官能化微粒状载体材料包含具有颗粒表面的颗粒；和从所述颗粒表面伸出的官能团的组合，所述官能团的组合包括(i) 键合至从所述颗粒表面伸出的至少一种聚合物的在所述颗粒表面上的第一组官能团，和(ii) 第二组官能团，其提高所述颗粒表面的润湿性。
在本发明的其他实施方案中，所述官能化微粒状载体材料包括具有颗粒表面和至少150 Å的中值孔径的颗粒；和从所述颗粒表面伸出的第一官能团，在所述颗粒表面上的所述第一组官能团键合至从所述颗粒表面延伸的至少一种聚合物。在另一种实施方案中，所述官能化载体材料包含提高所述颗粒表面的润湿性的第二组官能团。
在一种示例性实施方案中，所述官能化微粒状载体材料的第二官能团可以键合至一种或多种单体或键合至所述颗粒表面。在另一实施方案中，所述第一组官能团包括不饱和键，例如乙烯基、烯丙基、丙烯酰基、甲基丙烯酰基、或其任何组合。在另一实施方案中，所述第二组官能团包括至少一种亲水性有机基团，例如羟基、二醇基、氧乙烯基、聚乙烯基、羧酸基、胺基、酰胺基、或其任何组合。在另一实施方案中，所述第一组官能团包括乙烯基，第二组官能团包括二醇基团。在另一实施方案中，所述第一组和第二组官能团可以为包含偶氮基团和羧酸基团的分子的一部分。在另一实施方案中，至少一部分所述第一组官能团与一种或多种单体和一种或多种间隔基单体聚合从而形成从所述颗粒表面伸出的聚合物链。所述间隔基单体使所述一种或多种单体彼此分离，其可以帮助所述聚合物上的官能团定向。所述一种或多种单体可以包括阴离子或阳离子单体。在其中一种或多种单体可以为阴离子单体的实施方案中，所述单体可以为2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸，所述一种或多种任选的间隔基单体可以为亚甲基双丙烯酰胺。在其中所述一种或多种单体可以为阳离子单体的实施方案中，所述一种或多种单体包括3-丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵或甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵，和所述一种或多种任选的间隔基单体可以包括二烯丙基二甲基氯化铵。在另一实施方案中，所述聚合包括降低所述聚合物的链长或分子量的链转移剂，所述链转移剂可以包括硫基、硫醇羰基、硫醇酯基、硫醇碳酸酯基和其组合。在另一实施方案中，所述聚合物链包括相同或不同的具有下式的重复单元
其中
R1为H或CH3;
R'和R''各自独立地为H或CH3;
Y为
或；
R2和R3各自独立地为
(a) C1-10-烷基, 苯基, 苯基-C1-10-烷基, 环烷基, C1-10-烷基-环烷基或C1-10-烷基苯基，
(b) 被氨基、单或二烷基氨基、三烷基铵、羧基、或磺酰基的每一个单取代的或多取代的(a)中的上述基团之一，
(c) 具有5-10个C原子的环或双环基团，其中一个或多个CH或CH2基团被(i) N或NH, (ii) N或NH和S, 或(iii) N或NH和O替代，或
(d) R2或R3之一为H；
和其中R2和R3彼此配合从而使这两个基团为酸性或碱性，或基团的一个为中性的，一个是酸性或碱性的；和
R4为C1-10-烷基, 苯基, 苯基-C1-10-烷基, 环烷基或C1-10-烷基-环烷基, 或C1-10-环烷基苯基，每一个被氨基、单或二烷基氨基、三烷基铵、羧基、或磺酰基的每一个单取代或多取代；和
n为2至1000。
本发明进一步涉及适合用于离子交换柱的刚性载体材料，例如图1中所示的示例性刚性载体材料151。本发明的刚性载体材料，优选无机载体，包括一种或多种以下组分。
适合用于本发明的无机载体包括作为色谱介质商购的产品。所述无机载体可以使用本领域中已知的方法制备。所述无机基底提供用于一种或多种施加至无机基底表面的另外的组分的载体。总之，所述无机基底为无机氧化物，更适合地无机金属氧化物、硅酸盐或铝硅酸盐或受控的孔玻璃。无机金属氧化物是更需要的。适合用于本发明的无机氧化物通常具有能够与其他化学官能团键合或与之反应的游离羟基。期望地，所述无机氧化物具有约1至约10个羟基/平方纳米固体无机氧化物。
合适的无机氧化物包括但不限于二氧化硅例如色谱级二氧化硅或硅胶、氧化铝、二氧化硅-氧化铝、氧化锆、锆酸盐、受控孔玻璃或二氧化钛。在本发明的一种需要的实施方案中，所述无机金属氧化物为二氧化硅，更期望地，色谱级二氧化硅或硅胶。WO 98/31461中公开的磁性敏感的无机氧化物，例如硅质氧化物涂布的磁性颗粒（其公开内容整体并入本文中作为参考）也可以用于本发明。也可以使用混合无机氧化物，例如二氧化硅和氧化铝的共凝胶，或共沉淀物。
所述固体无机氧化物可以为微粒状、纤维板或其组合的物理形式。期望地，所述固体无机氧化物为具有基本上球形的微粒或颗粒的物理形式。无论物理形式如何，所述固体无机氧化物通常具有最高达约150微米(µm)的最长尺寸（即，长度、宽度或直径）。当所述固体无机金属氧化物包括多个具有基本球形的颗粒时，期望所述多个颗粒具有约1 µm至约120 µm的中值粒径。在本发明的一个期望的实施方案中，所述固体无机金属氧化物包括具有基本上球形的多个二氧化硅或硅胶颗粒，其中所述多个二氧化硅或硅胶颗粒具有约10 µm至约130 µm, 或约20 µm至约120 µm的中值粒径。
在本发明中可以使用各种商购固体无机氧化物。合适的固体无机氧化物包括但不限于可以商品名DAVISIL®商购自W. R. Grace & Co., (Columbia, MD)的二氧化硅颗粒，其为具有约300 Å至约3000 Å, 期望约500 Å至1500 Å的中值孔径的不规则形状，或具有类球状和约300 Å的中值孔径的VYDAC®二氧化硅。在本发明的一个期望的实施方案中，在使用改性成提高中值孔径至约800 Å之后具有类球状和约300 Å的初始中值孔径的VYDAC®二氧化硅。有机材料包括琼脂糖胶、聚苯乙烯二乙烯基苯(PSDVB)树脂、聚（甲基丙烯酸甲酯）树脂等。杂合材料包括由溶胶-凝胶方法制备的乙烯桥联的二氧化硅杂合颗粒，例如购自Waters Corp的Xterra®颗粒。
处理或改性上述无机载体的表面（即官能化）从而降低非特异性、非选择性结合和/或非目标分子（即并非目标分子的材料的非特异性结合）和配体-特异性目标分子（即目标分子(即ligate)的非特异性结合到并非由一种或多种配体提供的反应性位点的反应性位点）吸附到无机基底上。所得改性载体表面具有(i) 由于在无机表面上存在相对惰性的R基团导致用于非目标分子（即并非目标分子的材料）的较小的亲和力，和(ii) 用于直接或通过连接基选择性键合至无机基底表面的一种或多种配体（下述）的受控量的反应性位点。用于选择性键合至一种或多种配体的反应性位点的量导致感兴趣的一种或多种分子选择性地、受控地结合至与无机载体表面连接的一种或多种配体。
本发明进一步涉及制备上述官能化微粒状载体材料的方法。在另一种实施方案中，本发明包括通过处理颗粒的颗粒表面制备官能化微粒状载体材料从而导致获得从所述颗粒表面伸出的官能团的组合的方法，所述官能团的组合包括(i) 第一组官能团，通过该第一组官能团能够使一种或多种单体聚合到所述颗粒表面上，和(ii) 第二组官能团，其提高所述颗粒表面的润湿性。在另一种实施方案中，所述处理步骤可以包括使所述颗粒表面暴露于(i)至少一种具有来自第一组官能团的官能团的硅烷，和(ii) 至少一种具有来自第二组官能团的官能团的硅烷。在另一实施方案中，所述处理步骤使至少一种所述第一组官能团或第二组官能团键合至所述颗粒表面，然后进行所述聚合。在一种示例性实施方案中，所述官能化微粒状载体材料的第二官能团可以键合至一种或多种单体或键合至所述颗粒表面。在另一实施方案中，所述第一组官能团包括不饱和键，例如乙烯基、烯丙基、丙烯酰基、甲基丙烯酰基、或其任何组合。在另一实施方案中，所述第二组官能团包括至少一种亲水性有机基团，例如羟基、二醇基、氧乙烯基、聚乙烯基、羧酸基、胺基、酰胺基、或其任何组合。在另一实施方案中，所述第一组官能团包括乙烯基，第二组官能团包括二醇基团。在另一实施方案中，所述第一和第二组官能团可以为包含偶氮基团和羧酸基团的分子的一部分。在另一示例性实施方案中，在聚合之前采用季铵盐（例如四甲基氯化铵）或季铵阳离子（例如四甲基铵阳离子）进一步处理所述颗粒表面，其随后被通过洗涤从颗粒表面除去。在另一实施方案中，至少一部分所述第一组官能团与一种或多种单体和一种或多种间隔基单体聚合从而形成从所述颗粒表面伸出的聚合物链。所述一种或多种单体可以包括阴离子或阳离子单体。在其中一种或多种单体可以为阴离子单体的实施方案中，所述单体可以为2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸，所述一种或多种任选的间隔基单体可以为亚甲基双丙烯酰胺。在其中所述一种或多种单体可以为阳离子单体的实施方案中，所述一种或多种单体包括3-丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵或甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵，和所述一种或多种任选的间隔基单体可以包括二烯丙基二甲基氯化铵。在另一实施方案中，所述聚合包括降低所述聚合物的链长或分子量的链转移剂，所述链转移剂可以包括硫基、硫醇羰基、硫醇酯基、硫醇碳酸酯基和其组合。在另一实施方案中，所述聚合物链包括相同或不同的具有下式的重复单元
其中
R1为H或CH3;
R'和R''各自独立地为H或CH3;
Y为qq
或；
R2和R3各自独立地为
(a) C1-10-烷基, 苯基, 苯基-C1-10-烷基, 环烷基, C1-10-烷基-环烷基或C1-10-烷基苯基，
(b) 被氨基、单或二烷基氨基、三烷基铵、羧基、或磺酰基的每一个单取代的或多取代的(a)中的上述基团之一，
(c) 具有5-10个C原子的环或双环基团，其中一个或多个CH或CH2基团被(i) N或NH, (ii) N或NH和S, 或(iii) N或NH和O替代，或
(d) R2或R3之一为H；
和其中R2和R3彼此配合从而使这两个基团为酸性或碱性，或基团的一个为中性的，一个是酸性或碱性的；和
R4为C1-10-烷基, 苯基, 苯基-C1-10-烷基, 环烷基或C1-10-烷基-环烷基, 或C1-10-环烷基苯基，每一个被氨基、单或二烷基氨基、三烷基铵、羧基、或磺酰基的每一个单取代或多取代；和
n为2至1000。
在另一示例性实施方案中，在聚合之后通过暴露所述颗粒表面于盐溶液例如5wt%氯化钠溶液而进一步处理所述颗粒表面以除去任何未连接的聚合物或单体。
在本发明的另一示例性实施方案中，在处理步骤之后，在 70℃干燥过夜之后，所述颗粒表面上的碳含量为基于所述颗粒的总重量计低于或等于约3.5重量%, 或低于或等于约3.0重量%, 或低于或等于约2.5重量%, 或低于或等于约2.0重量%, 或低于或等于约1.5重量%。在本发明的另一示例性实施方案中，在聚合步骤之后，在70℃下干燥过夜之后，所述颗粒表面上的碳含量为至少约3.5重量%, 或至少约4.0重量%, 或至少约4.5重量%,或至少约5.0重量%, 或至少约5.5%。在根据本发明的其他示例性实施方案中，在聚合步骤之后在颗粒表面上的碳含量与处理之后颗粒表面上的碳含量的比率为至少约1.5, 或至少约2.0, 或至少约2.5, 或至少约3.0, 或至少约3.5, 或至少约4.0。
本发明涉及离子交换柱，例如示例性离子交换柱11，如图1所示，包括一个或多个如下组件。如本文使用的术语“离子交换柱”包括具有一个或多个如下组件的柱，包括离子交换柱，例如阴离子或阳离子交换柱。
本发明的离子交换柱包括具有需要尺寸的柱结构、柱体积和结构完整性。通常，所述柱结构在管状结构的两端上包括具有可除去端盖的管状结构。端盖形成具有管状结构的防漏密封从而防止材料从管状结构不期望地脱离。本发明的示例性离子交换柱100如图1所示。
图1提供本发明的示例性色谱柱100的图。如图4所示，示例性色谱柱100包括柱壳体150；和位于柱壳体150中的介质床空间151。期望地，介质151包括具有至少10埃(Å)的中值孔径的多孔无机颗粒。如图1进一步所示的，柱壳体150通常包括管状壳体构件156、第一管状壳体构件端盖152、第二管状壳体构件端盖153、相对的端盖152、柱入口154、和柱出口155。所述柱100可以采用浆料形式的多孔无机颗粒通过柱入口154装填，所述柱入口包括其中具有通道的中心钻孔147和喷嘴158。可以使用宽范围的喷嘴，其有助于床空间内的浆料的分步和均匀装填。过滤器159各自位于端盖152、153的内表面，并与管状构件156一起作用以限定床空间151，还防止颗粒介质从床空间151泄漏。分布通道160横向通过第一端盖152和/或第二端盖153的表面，并与过滤器159流体连通。所述流体分布通道160有助于液体的径向分布。以简单形式，所述分布通道160在第一和/或第二端盖152和153的表面上包括至少一个圆周和/或径向凹槽。布置所述凹槽从而使其实现从入口154的喷嘴158放射的液体的圆周和/或径向分布。理解为宽范围的柱容量是可以的，当使用所述柱作为一次性柱时通常为0.1至2000升，和0.1至100升。还参见US 2008/0017579，其全部主题并入本文中作为参考。
可以从各种材料形成柱壳体150。通常，柱壳体150包含聚合物材料、金属材料、玻璃材料、陶瓷材料、或其复合材料，期望地，包含聚合物材料。用于形成柱壳体150的合适的聚合物材料包括但不限于任何合成的或半合成的有机固体，例如塑料，其为可模塑的，包括聚烯烃。
柱壳体150可以使用常规热成型技术成型。例如，柱壳体150的管状壳体构件156、第一管状壳体构件端盖152、和第二管状壳体构件端盖153可以各自独立地通过模塑步骤成型。在一些实施方案中，柱壳体150的管状壳体构件156和(i)第一管状壳体构件端盖152和(ii)第二管状壳体构件端盖153之一通过单模塑步骤成型（即，一个端盖完整地在管状壳体构件156的一端上成型）。
管状结构150可以从各种材料制备并具有壁结构从而在管状结构150内取得相对高的性能。期望地，管状结构150具有取得最高达约6000 psi (400 bar), 更期望地，约15psi (1 bar)至约4500 psi (300 bar)的恒压的结构完整性。形成管状结构150的合适的材料包括但不限于聚合物例如聚醚醚酮(PEEK)和聚丙烯；金属例如不锈钢；和无机材料例如玻璃。在本发明的一个期望的实施方案中，管状结构150包含聚醚醚酮(PEEK)或聚己内酯。
管状结构150可以具有根据多个因素而改变的尺寸，所述因素包括但不限于粒径和几何结构、流速、注射体积、需要的板数等。通常，管状结构150具有环形截面区域，外径为约2 mm至约5000 mm, 内径为约1 mm至约4000 mm, 总长为约2 mm至约5000 mm。
用于管状结构150的端盖152和153通常从PEEK形成，并具有一定尺寸从而为管状结构150的端部形成防漏密封。
应该注意到尽管需要具有环形截面区域的管状结构，但具有其他截面区域的管状结构也在本发明的范围内。用于各种管状结构的合适的截面构造包括但不限于方形、矩形、三角形、椭圆形、五边形和六边形截面结构。
本发明的色谱柱和筒可以使用以下步骤制备：
(1) 密封管状结构的第一端；
(2) 至少部分填充具有刚性载体材料，例如任何上述刚性载体材料的管状结构的柱腔；
(3) 采用第一缓冲溶液至少部分地填充管状结构的柱腔以封装所述刚性载体材料；和，任选地
(4) 密封所述管状结构的相对端（即第二端）。
可以储存所述离子交换柱用于将来使用或可以随后连接至包括一个或全部上述装置组件的装置。
本发明甚至进一步涉及分离能够含有感兴趣的一种或多种分子的样品的方法。在本发明的一种示例性实施方案中，所述方法包括如下步骤(a) 将所述样品引入包括刚性载体的离子交换柱，其中所述刚性载体包括多个无机金属氧化物颗粒，其中各颗粒包括(i)金属氧化物基底；(ii) 降低非目标分子材料（即并非目标分子的材料的非特异性结合）和配体特异性目标分子（即目标分子的非特异性结合至并非通过一种或多种配体提供的反应性位点的反应性位点）的非特异性结合至无机基底的改性的基底表面；和(iii) 一种或多种键合至无机基底的配体。
在另一实施方案中，本发明提供从混合物分离目标分子的方法，其包括：a) 使包含目标分子的混合物与离子交换色谱基质接触，其中所述基质包括1) 包含二氧化硅颗粒的固体载体，所述二氧化硅颗粒具有大于150 Å并小于6000 Å 的中值孔径和大于20微米的平均粒径，和2) 具有对于连接至固体载体的目标分子的特异性的离子交换配体；和b) 从所述离子交换色谱基质洗脱目标分子。
在又另一实施方案中，本发明提供从混合物分离目标分子的方法，其包括：a) 使包含目标分子的混合物与色谱基质接触，其中所述离子交换色谱基质容纳在壳体例如柱内，并且其中填充离子交换色谱基质的柱具有至少400 cm/hr的最大流速，并且其中所述基质包含1) 二氧化硅颗粒和2) 具有对目标分子的特异性的离子交换配体，其中目标分子的基质的动态容量为在10%穿透率下至少45 g/L；和任选地b) 从所述离子交换色谱基质洗脱目标分子。
在其他实施方案中，本发明提供从混合物分离目标分子的系统，其包括：a) 离子交换色谱介质，其中所述基质包括固体载体，该固体载体包含1) 具有大于150 Å并小于6000 Å 的孔径和大于20微米并小于120微米的中值粒径的二氧化硅颗粒，和2) 具有对于连接至固体载体的目标分子的特异性的离子交换配体；和b) 用于包括所述离子交换色谱基质的壳体。所述系统可以任选包括检测从离子交换色谱基质洗脱目标分子的器件。
在其他实施方案中，本发明提供从混合物分离目标分子的系统，其包括：a) 离子交换色谱基质，其中所述离子交换色谱基质容纳在壳体例如柱内，并且其中填充离子交换色谱基质的柱具有至少400 cm/hr的最大流速，并且其中所述基质包含1) 二氧化硅颗粒和2) 具有对目标分子的特异性的离子交换配体，其中目标分子的基质的动态容量为至少45g/L。所述系统可以任选包括检测从离子交换色谱基质洗脱目标分子的器件。
在其他实施方案中，本发明提供容器，其包括离子交换色谱基质和至少一个容器，所述基质包括具有大于150 Å并小于6000 Å的中值孔径和大于20微米并小于120微米的中值粒径的二氧化硅颗粒。
在其他实施方案中，本发明提供一种装置，其包括离子交换色谱基质和至少一个容器，其中所述离子交换色谱基质容纳在壳体例如柱内，并且其中填充离子交换色谱基质的柱具有至少400 cm/hr的最大流速，并且其中所述基质包含1) 二氧化硅颗粒和2) 具有对目标分子的特异性的离子交换配体，其中目标分子的基质的动态容量为至少45 g/L。
分离样品的方法可以包括如下步骤：(a) 使所述样品与刚性载体和在其上的配体接触；(b) 冲洗所述刚性载体以洗走不键合至所述配体的任何样品组分；(c) 将洗脱溶液引入离子交换柱从而使所述洗脱溶液与结合至刚性载体上的配体的一种或多种分子接触；(d) 使所述洗脱溶液保持与刚性载体接触一段时间从而形成能够含有一种或多种分子的洗脱样品；和(e) 分离所述柱的内容物以确定所述样品中的一种或多种分子的存在。
在本实施方案中，分离洗脱样品的方法，其中离子交换柱与所述离子交换柱流体连通，该方法可以进一步包括一个或多个如下步骤：
(1)将样品引入包含能够承受至多约200 bar的柱压的刚性载体的离子交换柱，其中所述刚性载体具有与之键合的一种或多种配体，其中所述一种或多种配体能够选择性键合至一种或多种分子；
(2)使所述样品与刚性载体和其上的配体接触；
(3)冲洗所述刚性载体以洗走除了一种或多种目标分子之外的任何样品组分；
(4)将洗脱溶液引入所述离子交换柱从而使所述洗脱溶液与结合至所述刚性载体上的配体的一种或多种目标分子接触；和
(5)使所述洗脱溶液保持与所述刚性载体接触一段时间从而形成洗脱样品。通常，所述洗脱溶液保持与所述刚性载体接触约1分钟至约4小时的一段时间。
本发明在上文描述并在下文通过实施例进一步示例，它们不以任何方式理解成强制限制本发明的范围。相反，清楚地理解在阅读本文说明书之后可本身暗示给本领域技术人员的各种其他实施方案、改变和其等价物而不脱离本发明精神和/或所附权利要求范围的手段。
实施例
以下实施例描述根据本发明的用于制造具有官能化表面包括离子交换的色谱介质的方法，但可以使用其他表面官能化。在实施例中示出的本发明的一种实施方案涉及多孔无机介质基离子交换材料，其通过由以下两个主要步骤构成的方法制备：
(1) 键合具有以下两种硅烷的大孔二氧化硅：(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷和甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基酯以形成初始键合的中间体；和(2) 在用于强阴离子交换介质(Q-二氧化硅)或强阳离子交换介质(S-二氧化硅)的初始键合的二氧化硅中间体的存在下采用偶氮引发剂进行的一种或多种离子单体的溶液聚合。
实施例中示出的本发明的另一实施方案是用于制备Q-二氧化硅的方法，其中所使用的单体为(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基氯化铵、少量二烯丙基二甲基氯化铵溶液，和所述引发剂为2,2’-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐(V-50引发剂)。
实施例中示出的本发明的另一实施方案为制备S-二氧化硅的方法。所述方法包括用四甲基氯化铵溶液洗涤初始键合的中间体的额外步骤，其中添加四甲基氯化铵溶液以帮助聚合。在该聚合实施方案中，所述单体为2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS), 所述引发剂为4,4’-偶氮双(氰基戊酸) (V-501 引发剂)。所述聚合使用链转移剂(CTA)，例如S,S’-双(α,α’-二甲基-α’’-乙酸)-三硫代碳酸酯，其可购自ABCR GmbH KG。CTA的功能是控制所述聚合的链长并帮助降低孔的任何堵塞（参见图2）。该方法基本上为可逆加成断裂链转移(RAFT)聚合，一种活性自由基聚合法。
通过这些方法官能化很多不同类型的多孔颗粒。在一些实例中，使用硅胶，其为具有75微米粒径的中值孔径为250, 500, 800, 1000 Å的硅胶。使用以下程序制造硅胶：将190g的19%硫酸溶液置于装配顶置式搅拌器并冷却至5℃的反应器中。单独地，使263g的硅酸钠溶液(22.9% SiO2)也冷却至5℃。随后，通过泵以15分钟内添加全量硅酸盐的速率将硅酸钠溶液添加至硫酸溶液。在添加期间，保持温度为5℃。在完成添加之后，将反应器温热至室温，并使内容物在不搅拌的情况下凝胶化。在凝胶化之后，凝胶团块分割成小块并在潜入水中，从而在反应期间除去形成的硅酸钠。随着洗涤水流走并添加新鲜水至凝胶，周期性检测材料中残余的硅酸钙含量。当所述含量降至低于1%时，将凝胶悬浮在水中，并将液体的pH调节至pH=9.7，并将溶液加热至67℃。该温度保持20小时20分钟。在加热时间的结尾，通过过滤回收凝胶并在160℃炉中干燥直到凝胶的水分含量低于约5重量%。因此，获得的硅胶具有325m2/g的氮BET表面积和1.24cc/g的氮孔体积。假设圆柱形孔并使用以下等式：孔径(埃) = 40000XPV/SA，该材料展现出153埃的孔径。随后，使用ACM研磨凝胶至需要的粒径（75微米），然后在高压釜中在300℃下热水处理直到实现需要的孔径。
通过光散射使用可获自Malvern Instruments Ltd.的Malvern Mastersizer2000按照ASTM B822-10测定实施例中报道的粒径。通过压汞法使用获自MicromeriticsInstrument Corp.的Autopore IV 9520和通过氮BET使用也获自MicrometricsInstrument Cop.的Tristar 3000测量孔径分布。本文涉及的孔体积代表形成孔10,000 A和更低的压汞法。还从氮吸附分析获得BET表面积。使用获自LECO Corp.的LECO碳和硫分析仪SC-632进行碳和硫含量的元素分析。通过GPC分析使用获自Waters Corp.的具有RI和粘度检测的GPCV 2000测定平均分子量。通过电感耦合等离子体(ICP)使用获自ShimadzuCorp.的ICPE-9000测量二氧化硅的纯度。
使用以下流程测定实施例11-24的样品的分子量：将0.5 g表面官能化的二氧化硅样品称重至50 ml离心管中，并添加10 ml去离子水，然后添加2.2 ml的48%氢氟酸，并在充分搅拌之后，使该样品静置30分钟。之后，添加3.5 g硼酸以螯合游离氟离子，并将该样品置于手动摇筛机上60分钟。在离心和通过带有真空的0.2 µm过滤器进行的过滤之后，收集清澈的上层清液用于分析。使用获自Waters Corp.的具有RI和粘度检测的GPCV 2000对所述上层清液施以凝胶渗透色谱(GPC)分析，所述GPCV 2000包括超水凝胶保护柱和120, 250,和1000柱。采用配备RI检测器的Waters HPLC系统将上文获得的溶液注射到流动相中的1%硝酸钾水溶液中。通过使用聚乙二醇和聚环氧乙烷作为校准用基准测定溶液的分子量。
上述聚合物的分子量低于约200-300 KD。
使用pH 8.0下具有50 mM Tris HCl缓冲剂的BSA(25 mg/ml缓冲剂中的浓度)进行Q的静态结合测试。结合/洗涤缓冲剂为在pH 8.0下的50 mM Tris-HCl，所述洗脱缓冲剂为在pH 8.0下的 50 mM/Tris-HCl/1 M NaCl。将干燥的二氧化硅样品称重至小瓶中，然后添加结合缓冲剂中的蛋白溶液。在过夜吸附之后，将样品离心并将上层清液分离/丢弃。用洗涤用缓冲剂洗涤所述二氧化硅样品三次并离心和分离。在洗涤步骤之后，添加洗脱缓冲剂，并重复洗脱第二次。在280 um下使用获自Thermo Fisher Scientific Inc.的Genesys 10SBio UV-Vis分光光度计对合并的洗脱溶液测量UV/Vis吸附。
使用pH 4.0下具有50 mM HOAc/NaOAc缓冲剂的鸡蛋白溶菌酶或牛γ球蛋白(在缓冲剂中的25 mg/ml浓度)进行S的静态结合测试。结合/洗涤缓冲剂为在pH 4.0下的50 mMHOAc/NaOAc，所述洗脱缓冲剂为在pH 4.0下的 1M NaCl/50 mM HOAc/NaOAc M。将干燥的二氧化硅样品称重至小瓶中，然后添加结合缓冲剂中的蛋白溶液。在过夜吸附之后，将样品离心并将上层清液分离/丢弃。用洗涤用缓冲剂洗涤所述二氧化硅样品三次并离心和分离。在洗涤步骤之后，添加洗脱缓冲剂，并重复洗脱第二次。在280 um下使用获自Thermo FisherScientific Inc.的Genesys 10S Bio UV-Vis分光光度计对合并的洗脱溶液测量UV/Vis吸附。
使用具有0.66 cm直径的Omni玻璃柱进行动态结合测试。对于2 ml柱，柱长为约5.8 cm。采用去离子水de-fined二氧化硅样品，然后将该柱用Akta FPLC装填浆料并以约4000 cm/h线性速度进行。对于Q的穿透率曲线，pH 8.0 50 mM Tris-HCl 缓冲剂中的BSA蛋白（或在用于S的pH 4.0, 50 mM HOAc/NaOAc缓冲剂中的溶菌酶或γ球蛋白）以约500或1000 cm/h通过具有Akta的柱。使用获自General Electric的UV900测量在280 nm下的UV-Vis信号，记录色谱图并采用Microsoft Excel绘图。使用以下等式以5%穿透率点计算动态结合能力(DBC)：
。
在下表中记录结果。
图2示范用于制备Q-二氧化硅和S-二氧化硅材料的一般合成路线。
实施例1-10
通过采用处理剂1（乙烯基硅烷）（其为甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基酯）和/或处理剂2（环氧基硅烷）（其为3-(缩水甘油基氧基丙基)-三甲氧基硅烷）处理颗粒制造初始键合的多孔二氧化硅颗粒的样品。预混合所述乙烯基和环氧基硅烷。向圆底烧瓶中加入多孔颗粒，并将一定量的处理剂混合物添加至该烧瓶中。使该混合物搅动过夜。以1/10二氧化硅(以重量计)的量添加0.5M硫酸。在室温下搅动该混合物1小时，然后加热至最高达70℃，持续1小时。使所述烧瓶冷却，然后采用1 M硫酸浸泡二氧化硅30分钟，然后过滤。然后用去离子水洗涤5次，过滤，并在70℃下干燥过夜。提交所得样品的元素分析(LECO)用于测量碳在二氧化硅上的百分比，并分别标记实施例1-10。这些实施例的结果在下表1中记录：
表1
实施例# 粒径(µm) 中值孔径(Å) 表面积(m<sup>2</sup>/g) 颗粒量(g) 环氧基硅烷量(g) 乙烯基硅烷量(g) C%初始键合
1 75 1000 45 100 9 9 2.75
2 75 1000 45 4000 240 240 2.29
3 75 1000 45 200 0 20 3.05
4 75 1000 45 40 0.5 0.5 0.92
5 75 1000 45 100 1.2 1.2 0.77
6 75 1000 45 200 2.5 2.5 0.63
7 75 800 61 200 2.5 2.5 0.82
8 75 500 72 40 1.5 1.5 2.31
9 75 500 72 40 0.5 0.5 0.93
10 75 250 297 150 7.5 7.5 2.42
除了实施例3之外，等量的两种硅烷用于这些官能化，所获得碳量是使用的硅烷总量的常规比例。在实施例3中，仅将乙烯基硅烷用于干法键合。如表1中所示范的，在键合法之后通过清洁的和干燥的二氧化硅样品的元素分析测量的碳量用作测定表面官能化之后表面官能团的量的指示剂。
实施例11-24
实施例11-28描述制造强阴离子交换材料的方法（表2）。在这些实施例中，来自实施例1-10的初始键合的二氧化硅为使用以下第一单体：(3-丙烯酰胺基丙基)-三甲基氯化铵(75%水溶液); 备选单体1：[(3-(甲基丙烯酰基氨基)丙基)]三甲基氯化铵(50%水溶液);备选单体2：[(2-(丙烯酰基氧基)乙基)]三甲基氯化铵(80%水溶液); 第二单体：二烯丙基二甲基氯化铵(65%水溶液)；V-50引发剂；和另外的去离子水(DIW)处理的表面。
将三颈圆底烧瓶装配带有气密装置、氮气入口和出口的顶置式机械搅拌器和带有热电偶反馈的加热罩。首先将二氧化硅和除了引发剂之外的全部试剂加入烧瓶中。用氮气将该系统鼓泡20分钟。然后引入引发剂。在烧瓶逐渐加热至65℃之前，再用氮气鼓泡20分钟。在顶置式搅拌下在65℃下保持混合物2小时，然后冷却至室温。将所述混合物倾倒入在烧杯中的5% NaCl溶液中。用去离子水冲洗烧瓶以完全移出烧瓶中的残余二氧化硅。在采用顶置式搅拌器搅拌该混合物几分钟之后，将其过滤，并采用5% NaCl重复洗涤3次，和用去离子水重复洗涤三次。放置所述样品在空气中进行干燥，除了在90℃下干燥少量二氧化硅过夜，然后提交用于碳含量的元素分析。如上文所述，计算样品的结合能力。所得样品为标记的实施例11-24。
这些实施例的分析结果和结合能力记录在下表2中：
表1
试剂比为以重量级的反应中使用的试剂的量。表2中使用的全部单体都是水溶液，因此通过浓度乘积校正实际的量。例如，在实施例11中，试剂的量为：二氧化硅 = 10 g, 单体=6.6 g, 第二单体 = 0.6 g, 引发剂 = 0.045 g, 去离子水= 65g，比例计算为10:(6.6 x 0.75) : (0.6 x 0.65) : 0.045 : 65 = 1:0.5:0.04:0.0045:6.5。C%初始键合为初始键合步骤之后在干燥的二氧化硅样品上的碳量，如元素分析测量的。C%最终为在纯化的干燥的二氧化硅样品上的碳量，如元素分析测量的。C聚合物= C%最终 – C%初始键合为获自二氧化硅表面上的聚合基团的碳量。C聚合物/C初始键合比为两种碳数的商，其为相比于初始键合提供的碳相比的由聚合物提供的碳的量度。尽管不希望受理论束缚，据信较高的比例表示在表面上具有较少量链的长链聚合物，并且其相对于较小的比例是优选的，较小的比例表示对于较高蛋白结合的在表面上具有较多链的较短链，因为较长的量为键合的聚合物提供更多的柔软度。对于样品的全部结合测试，使用牛血清白蛋白(BSA)作为模型蛋白。较高的结合值是优选的。在表2中，(S)代表静态结合(SBC)，其中BSA在改性二氧化硅上的结合以静态模式测量（参见以下的测量程序）。(D)代表动态结合(DBC)，其中BSA在改性二氧化硅上的结合以动态流动模式测量（参见以下的测量程序）。注意不测量n/m平均值。
如可从表2中看出的，除了实施例13之外，全部样品都提供可接受的结合结果。在实施例13中，没有聚合物连接在二氧化硅表面上。在实施例14和15中，第二单体，二烯丙基二甲基氯化铵提供总体上较高的BSA蛋白结合。在实施例16中，提高C%聚合物/C%初始键合的比率，改善BSA的结合。在实施例17、18和20中，测试备选单体。备选单体1提供比来自第一单体的样品（实施例19）稍高的BSA结合，同时备选单体2提供比第一单体低得多的蛋白结合。在实施例21中，采用具有800 Å的孔直径/孔径的二氧化硅制造样品，获得最高的BSA蛋白结合。实施例22提供比23更高的BSA结合，因为其具有更高的碳数比。在实施例24中，获得较低的蛋白结合。
实施例25-28
实施例25-28示出制造强阴离子交换材料的另一方法。用于实施例25-28的初始键合样品（表3）的一般方法程序如下：在室温下在旋转蒸发仪上的1L圆底烧瓶中将50 g干燥的二氧化硅与0.6 g乙烯基硅烷和0.6 g环氧基硅烷混合过夜（16小时），然后将二氧化硅转移至1L烧杯并用500 ml的1M硫酸浸泡1小时。过滤和用5 x 500去离子水的洗涤获得在70℃下干燥过夜的初始键合的二氧化硅样品。
实施例25-27
实施例25-27的聚合方法程序如下：类似于实施例11-24中使用的方法，根据表3将来自先前步骤的30 g干燥的二氧化硅与单体、引发剂和水混合。实施例25-27的最终产物的分析结果和结合能力测量和计算也记录于表3中。
实施例28
实施例28的聚合方法程序如下：在250 ml烧杯中，混合表3中的实施例28描述的量的试剂。搅拌以在水中溶解每一种物质。将溶液倾倒入含有30g初始键合的二氧化硅(0.76%碳)的250 ml Erlenmeyer烧瓶中。将氮气鼓泡到烧瓶中30分钟（偶尔摇动烧瓶以使二氧化硅和水溶液良好地混合），然后快速除去充气管，并用胶带密封烧瓶顶端。通常利用水浴将所述烧瓶逐渐加热至65℃（约30分钟），并在65℃下保持温度2小时。然后冷却所述混合物至室温。将该混合物倾倒入1L烧杯中的400-500 ml 10% NaCl溶液中，其中用一些去离子水冲洗以完全移出烧瓶内的残余二氧化硅。用抹刀搅拌二氧化硅几分钟，然后使颗粒静置。将顶部液相上层清液倾入废物中，并使残余二氧化硅与500 ml 5% NaCl溶液混合。然后用3 x500 ml的5% NaCl溶液和另外的3 x 500 mL去离子水洗涤二氧化硅样品，每次洗涤后在真空下过滤。最终样品在空气中放置干燥，除了在90℃下干燥少量样品，用于碳含量的元素分析。
表2
实施例29-38示范用于制备强阳离子交换材料S的方法（参见图2）。
实施例29-34
在20 ml闪烁管中预混乙烯基和环氧基硅烷(各2.5 g)。向2L圆底烧瓶中装入200g的D1000二氧化硅，并在良好的混合下将一定量的处理剂混合物逐滴加入烧瓶中。使烧瓶中的混合物在rotovap中搅动过夜。添加20 ml的0.5M硫酸。在室温下搅动该混合物1小时，然后加热至最高达70℃，持续1小时。使所述烧瓶冷却，然后采用500 ml的1 M硫酸浸泡二氧化硅30分钟，然后过滤。然后用去离子水洗涤5分钟，过滤。将100 g四甲基氯化铵溶解于1000 ml 甲醇中，并将二氧化硅浸泡在该溶液中1小时，然后过滤该二氧化硅，并用3 x 500ml甲醇洗涤。在70℃下干燥所述二氧化硅过夜。将所述样品提交用于元素分析(LECO)以测定二氧化硅上的碳的百分比。发现每100 g样品的含0.79 g碳的样品(0.79%)。在表4中记录的实施例29-34的全部初始键合都如上文所述制备。
将500 ml三颈圆底烧瓶装配带有气密装置、氮气入口和出口的顶置式机械搅拌器和带有热电偶反馈的加热罩。首先将采用四甲基氯化铵初始键合和处理的二氧化硅(30g)、37.5 g的AMPS、少量CTA和200 ml去离子水装入所述烧瓶中。用氮气将该系统鼓泡20分钟。然后，引入0.15 g的V501引发剂。在烧瓶逐渐加热至65℃之前，再用氮气鼓泡20分钟。在顶置式搅拌下在65℃下保持混合物2小时，然后加热至80℃，再持续2小时。使所述烧瓶冷却至室温。将所述混合物倾倒入在烧杯中的600 ml的5% NaCl溶液中。用去离子水冲洗烧瓶以完全移出烧瓶中的残余二氧化硅。在采用顶置式搅拌器搅拌该混合物几分钟之后，将其过滤，并采用500 ml 的5% NaCl重复洗涤3次，和用500 ml 去离子水重复洗涤3三次。放置所述样品在空气中进行干燥，除了在90℃下干燥少量二氧化硅过夜，然后提交用于碳和硫含量的元素分析。
表4
实施例# 二氧化硅(A) 初始C% 使用的CTA(g) 最终C% S% SBC(溶菌酶)(mg/ml) SBC(球蛋白)(mg/ml)
29 1000 0.74 0.3 2.88 0.85 153 39
30 1000 0.98 0.3 3.47 0.77 153 34
31 1000 0.74 0.2 3.64 1.01 166 19
32 1000 0.71 0.2 3.37 1.03 160 16
33 1000 0.74 0 6.29 1.61 68 2
34 1000 0.71 0 6.26 1.61 63 3
在实施例29-34中，将鸡蛋白溶菌酶(MW约17kD)和牛γ球蛋白(MW 约140kD)蛋白用于阳离子交换材料的静态结合能力(SBC)研究。测试程序与上文在实施例11-24中的Q-二氧化硅的BSA的相同，除了使用不同的蛋白（25 mg/ml浓度）之外，并且所述结合和洗涤缓冲剂为pH 4.0下的50 mM HOAc/NaOAc。洗脱缓冲剂为在pH 4.0下1 M NaCl/50 mM HOAc/NaOAc。
发现与Q-二氧化硅不同，AMPS的聚合需要涉及少量链转移剂(CTA)，例如S’-双(α,α’-二甲基-α’’-乙酸)-三硫代碳酸酯。在没有CTA的情况下，蛋白与二氧化硅样品的结合低得多。如从表4中可以看出的，CTA的量明显地不仅影响聚合物的量（如由碳和硫含量判断的）还影响样品的静态结合能力。较大量的CTA导致较小量的聚合物连接，较低的溶菌素的结合，但对于大得多的尺寸的球蛋白较高的结合。在没有CTA的情况下，对于溶菌素和球蛋白，实现明显较低的结合量。
实施例35和36
实施例35和36示范了与在聚合中使用的CTA的量相关的聚合物尺寸（不涉及二氧化硅）。向三颈圆底烧瓶中装入37.5 g (181 mmol)的AMPS, 1.4 g (18.1 mmol)的甲基丙烯酸, 0.2 g (1 g 对于实施例32)的CTA和200 ml去离子水。类似于上述内容进行聚合（没有二氧化硅）。在聚合之后，提交样品用于GCP分析以确定制成的聚合物的分子量。发现实施例31的MW为87471，实施例32的MW为20678。
实施例37
在该实施例中，展示出制备强阳离子交换相的替代方法。该方法涉及化学连接含有易受热分解的偶氮基团和亲水性羧酸基团的官能团。如图3所示，所述偶氮引发剂首先与氨基丙基三甲氧基硅烷偶联，然后用二氧化硅键合所述官能团。所述聚合伴随加热和在单体存在下进行。
将N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC), 11.5 g溶解于350 ml二氯甲烷中，用冰浴冷却该溶液至约5℃。向该溶液中加入7.78 g的4,4’-偶氮双(氰基戊酸) (V-501引发剂)，然后加入10 g氨基丙基三甲氧基硅烷。在冷却下搅拌该混合物3小时，然后在另外的2小时中使其温热至室温。在该反应之后，过滤掉未溶解的固体（基本上为脲副产物），将滤液与100 g的来自实施例7的未处理的二氧化硅(800 Å)混合。将该混合物置于1L圆底烧瓶中，在室温下在rotovap上搅动过夜，然后过滤并用4 x 400 ml甲醇洗涤。在室温下使固体在空气中干燥过夜。提交小量样品用于元素分析，获得该样品的2.03%的碳数。
将30 g的上述二氧化硅与40 g的AMPS单体在200 ml水中混合。在用氮气在混合物水溶液中鼓泡30分钟之后，在氮气下加热所述三颈圆底烧瓶，同时搅拌至65℃，持续2小时。在反应之后，过滤所述混合物并用3 x 500 ml的5% NaCl，然后用3 x 500 ml去离子水洗涤。在所述样品干燥之后，经干燥的样品的元素分析示出4.23%的碳数和1.17%的硫数。BSA蛋白的静态结合(具有pH 4.0, 50 mM乙酸钠缓冲剂)表示对于该实施例BSA的结合能力为150 mg/ml。
实施例38
在该实施例中，将不同组的反应用于制备强阳离子交换材料。如图4所示，硅胶首先与氨基丙基三甲氧基硅烷键合，然后在DMF中采用偶联催化(DCC)将改性的二氧化硅与偶氮引发剂偶联，然后在AMPS单体存在下在较高的温度下聚合。
采用类似于实施例1-10的程序首先使D1000 (75 μm平均粒度和1000Å平均孔径),200 g与20 g的氨基丙基三甲氧基硅烷键合。在过夜搅动之后，将二氧化硅浸泡在600 ml的0.1M HCl中，然后过滤。对于每步进行用1 L的去离子水洗涤三次，然后在真空下过滤。在70℃下干燥二氧化硅滤饼过夜，测定含有经干燥的二氧化硅的碳的量为0.80 %。
上述经干燥的二氧化硅35 g与1.92 g的DCC, 2.24 g的V-501偶氮引发剂和0.8 g的三乙胺在100 ml 的干燥DMF溶剂中的溶液混合。将所述混合物置于500 ml圆底烧瓶中并在室温下在旋转蒸发仪上搅动4小时。过滤所得混合物并用2 x 200 ml的DMF和2 x 150 ml丙酮洗涤。在炉中干燥样品，元素分析示出1.74%的碳含量。残余的二氧化硅在室温下在通风橱中干燥6小时。
将34 g的上述二氧化硅与40 g的AMPS单体在200 g去离子水中混合。在用氮气冲洗该系统20分钟之后，将其加热同时搅拌至65℃并在该温度下保持2小时。在此之后，将所述混合物冷却至室温，用3 x 500 ml的5% NaCl，然后用3 x 500 ml去离子水洗涤。在干燥所述样品之后，经干燥的样品的元素分析示出5.47%的碳数和1.69%的硫数，和在pH 7.0(5.0 mmol磷酸盐缓冲剂)下的125 mg/ml的溶菌酶蛋白的静态结合（5%穿透率）。
实施例39和40
在实施例39和40中，使用环氧基多孔树脂（聚甲基丙烯酸酯聚合物树脂）颗粒（参见图5）。由于所述颗粒（50 µm或100 µm平均粒径）具有环氧基，其在水性介质中水解提供二醇基团，对于采用Q聚合物的聚合的改性仅需要乙烯基。因此，在室温下在400 ml的NMP中用40 ml烯丙基胺(获自Aldrich)处理100 g所述颗粒1小时并在60℃下处理1小时。在冷却之后，过滤所述样品并用3 x 500 ml去离子水洗涤，然后用500 ml甲醇洗涤，并在空气中干燥过夜。采用如实施例11中所述的程序进行30 g的上述改性树脂的聚合。如可以从表5中看出的，两个样品都提供可接受的BSA蛋白的静态结合。
表5
基础颗粒 粒径 C% 来自Q单体的聚合 BSA蛋白的静态结合(mg/g)
实施例39 50 7.5 220
实施例40 100 n/a 73
尽管本发明采用有限数量的实施方案描述，但这些具体实施方案并非意在如本文中以其他方式描述和要求保护的限定本发明的范围。对于本领域普通技术人员明显的是，在浏览本文中的示例性实施方案之后，其他改变、等同物和改变是可能的。实施例和说明书其他部分中的全部部分和百分比以重量计，除非另外说明。此外，说明书和权利要求书中所述的任何数值范围，例如代表特定组的性质、量度的单位、条件、物理状态或百分比意在以引用的方式或其他方式在本文中逐字地清楚地并入落入此类范围内的任何数字，包括所述的任何范围内的数字的任何子组。例如，无论何时公开具有下限RL和上限RU的数值范围，都具体公开了落入所述范围的任何数字R。具体地，具体公开了所述范围内的以下数字R：R =RL + k(RU -RL), 其中k可在1%至100%变化，具有1%增量, 例如k为1%, 2%, 3%, 4%, 5%…50%, 51%, 52%… 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 或100%。此外，还具体公开了如上计算的由任何两个值R代表的任何数字范围。除了本文中示出和描述的那些之外，本发明的任何改变对于本领域的那些技术人员从上文描述和附图都是明显的。此类改变意在落入所附权利要求的范围内。本文中引用的全部公开都整体并入作为参考。

Claims (18)

1.一种官能化微粒状载体材料，其包含：
具有颗粒表面的二氧化硅颗粒；和
连接到所述二氧化硅颗粒表面并从所述颗粒表面伸出的官能团的组合，所述官能团的组合包括
(i) 包含不饱和双键的第一组官能团，其中所述官能团足以使一种或多种单体聚合到所述颗粒表面上，和
(ii) 第二组官能团，其包括至少一种足以提高所述颗粒表面的润湿性的亲水性官能团。
2.权利要求1所述的官能化微粒状载体材料，其中所述第二组官能团包括羟基、二醇基、氧乙烯基、聚乙烯基、羧酸基团、胺基、酰胺基、或它们的任何组合。
3.权利要求1或2所述的官能化微粒状载体材料，其中所述第一组官能团包括乙烯基、偶氮基团、烯丙基、丙烯酰基、甲基丙烯酰基、或它们的任何组合。
4.权利要求1所述的官能化微粒状载体材料，其中所述第一组官能团包括乙烯基，和所述第二组官能团包括二醇基。
5.权利要求1所述的官能化微粒状载体材料，其中所述第一组和第二组官能团为包含偶氮基团和羧酸基团的分子的一部分。
6.制备官能化微粒状载体材料的方法，其包括：
处理二氧化硅颗粒的颗粒表面从而获得连接到所述二氧化硅颗粒表面并从所述颗粒表面伸出的官能团的组合，所述官能团的组合包括
(i) 包含至少一个双键的第一组官能团，其足以使得能够经由所述第一组官能团使一种或多种单体聚合到所述颗粒表面上，和
(ii) 包含亲水性基团的第二组官能团，其提高所述颗粒表面的润湿性。
7.权利要求6所述的方法，其中所述第一组官能团包括乙烯基、偶氮基团、烯丙基、丙烯酰基、甲基丙烯酰基、或它们的任何组合。
8.权利要求6或7所述的方法，其中所述第二组官能团包括羟基、二醇基、氧乙烯基、聚乙烯基、羧酸基团、胺基、酰胺基、或它们的任何组合。
9.权利要求6所述的方法，其中所述处理步骤包括使所述二氧化硅颗粒表面暴露于(i)至少一种包含来自第一组官能团的官能团的硅烷，和(ii)至少一种包含来自第二组官能团的官能团的硅烷。
10.权利要求6-9中任一项所述的方法，其进一步包括：
聚合至少一部分所述第一组官能团。
11.权利要求6-10中任一项所述的方法，其进一步包括：
聚合至少一部分所述第一组官能团，所述聚合步骤包括在一种或多种间隔基单体存在下使第一组官能团与一种或多种单体反应从而形成从所述颗粒表面伸出的聚合物链。
12.权利要求11所述的方法，其中所述聚合物链包含相同或不同的具有下式的重复单元
其中
R1为H或CH3；
R'和R''各自独立地为H或CH3；
Y为
或；
R2和R3各自独立地为
(a) C1-10-烷基、苯基、苯基-C1-10-烷基、环烷基、C1-10-烷基-环烷基或C1-10-烷基苯基，
(b) 被氨基、单烷基氨基或二烷基氨基、三烷基铵、羧基、或磺酰基的每一个单取代或多取代的(a)中的上述基团之一，
(c) 具有5-10个C原子的环或双环基团，其中一个或多个CH或CH2基团被(i) N或NH，(ii) N或NH和S，或(iii) N或NH和O替代，或
(d) R2或R3之一为H；
和其中R2和R3彼此配合从而使这两个基团均为酸性或碱性的，或所述基团中的一个为中性的且一个为酸性或碱性的；和
R4为C1-10-烷基，苯基，苯基-C1-10-烷基，环烷基或C1-10-烷基-环烷基，或C1-10-环烷基苯基，各自被氨基、单烷基氨基或二烷基氨基、三烷基铵、羧基、或磺酰基的每一个单取代或多取代；和n为2至1000。
13.权利要求10至12中任一项所述的方法，其中聚合包括降低所述聚合物的链长或分子量的链转移剂。
14.权利要求1所述的官能化微粒状载体材料在色谱柱或筒中的用途。
15.色谱柱或筒，其包含权利要求1所述的官能化微粒状载体材料。
16.权利要求15所述的色谱柱或筒，其中至少一部分所述第一组官能团与一种或多种单体和一种或多种间隔基单体聚合从而形成从所述颗粒表面伸出的聚合物链。
17.权利要求16的色谱柱或筒，其中所述聚合物链包含相同或不同的具有下式的重复单元
其中
R1为H或CH3；
R'和R''各自独立地为H或CH3；
Y为
或；
R2和R3各自独立地为
(a) C1-10-烷基、苯基、苯基-C1-10-烷基、环烷基、C1-10-烷基-环烷基或C1-10-烷基苯基，
(b) 被氨基、单烷基氨基或二烷基氨基、三烷基铵、羧基、或磺酰基的每一个单取代或多取代的(a)中的上述基团之一，
(c) 具有5-10个C原子的环或双环基团，其中一个或多个CH或CH2基团被(i) N或NH，(ii) N或NH和S，或(iii) N或NH和O替代，或
(d) R2或R3之一为H；
和其中R2和R3彼此配合从而使这两个基团均为酸性或碱性的，或所述基团中的一个为中性的且一个为酸性或碱性的；和
R4为C1-10-烷基，苯基，苯基-C1-10-烷基，环烷基或C1-10-烷基-环烷基，或C1-10-环烷基苯基，各自被氨基、单烷基氨基或二烷基氨基、三烷基铵、羧基、或磺酰基的每一个单取代或多取代；和n为2至1000。
18.制备权利要求15至17中任一项所述的色谱柱或筒的方法，所述方法包括：
(1) 密封管状结构的第一端；
(2) 采用权利要求1至5中任一项所述的官能化微粒状载体材料或通过权利要求6-10中任一项所述的方法形成的官能化微粒状载体材料至少部分地填充管状结构的柱腔；
(3) 采用第一缓冲溶液至少部分地填充管状结构的柱腔以封装所述官能化微粒状载体材料；和，任选地
(4) 密封管状结构的相对端。
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