KR101333577B1 - 개선된 크로마토그래피 매질의 제조방법 및 사용방법 - Google Patents

개선된 크로마토그래피 매질의 제조방법 및 사용방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 공유결합된 4급 암모늄 폴리머 사슬을 갖는 매크로다공성(macroporous) 폴리머 매질을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 매질을 크로마토그래피 정제에 적용하여, 개선된 단백질 결합 용량(binding capacity) 및 수지 선택성을 갖는 다공성 기재(porous substrate)를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 매질의 제조 및 사용과 관련된 방법에 관한 것이다.

Description

개선된 크로마토그래피 매질의 제조방법 및 사용방법{PROCESS FOR MAKING IMPROVED CHROMATOGRAPHY MEDIA AND METHOD OF USE}
본 발명은 공유결합된 폴리머 사슬을 갖는 다공성(porous) 폴리머 매질을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 매질을 크로마토그래피 정제에 적용하여, 개선된 단백질 결합 용량(binding capacity), 결합 역학(kinetics) 및 결합 선택성을 갖는 다공성 기재(porous substrate)를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 매질의 제조 및 사용과 관련된 방법에 관한 것이다.
생체(living organism)로부터 생성된 치료 단백질(therapeutic protein)은 현대의 건강 관리에서 점점 중요한 역할을 하고 있다. 이러한 단백질들은 전통적인 약학에 있어서 질병 타겟에 대한 특이성과 효율성을 증가시키는 등, 많은 이점들을 제공한다. 포유류 면역 시스템은 다양한 단백질들을 사용하여 질병의 위협을 억제하고 제어한다. 유전공학 및 단백질 공학의 출현으로 많은 "설계된" 또는 재조합 단백질 치료법의 발전이 가능하게 되었다. 이러한 치료법들은 단일 단백질, 화학적 개질된 단백질, 단백질 절편 또는 단백질 컨쥬게이트에 기초한 것일 수 있다. 크로마토 그래피 분리법은 이러한 생물 약제학상의 제조에 널리 사용되고 있다. 산업이 발전함에 따라서, 분리기술을 강화하기 위한 신규/선진 기술 및 방법들이 이행되어 생물치료의 생산자들이 보다 적은 비용으로 더 많은 환자들에게 이러한 약제를 제공할 수 있도록 하였다.
단백질을 정제하기 위해 사용되는 일반적인 크로마토그래피 방법에는, 친화성, 생체친화성(bioaffinity), 이온 교환, 역상(reversed phase), 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 크기 배제(size exclusion) 및 다른 것들과의 혼합 모드(상술한 카테고리의 조합을 포함하는 수지)가 포함된다. 각 타입의 크로마토그래피 과정의 적용 및 효율은, 용질 분자와, 각각이 액체 이동상(mobile liquid phase)과 상호작용하는 크로마토그래피 시스템의 고정상(stationary phase)(크로마토그래피 매질) 간의 표면-표면 상호작용의 선택성에 의존한다. 다양한 고정상 크로마토그래피 지지체 물질이 상업적으로 이용가능하다.
불순물로부터 생성물의 성공적으로 분리하는 비결은 종종, 고정상, 베이스 매트릭스(base matrix)(화학 조성 및 공극 구조) 및 리간드 특성(리간드 타입, 리간드 밀도, 리간드 분포, 리간드 길이 및 물질 조성), 및 이동상 또는 용액 특성(버퍼 타입, pH 및 전도성)의 올바른 조합에 의존된다. 베이스 매트릭스 및 리간드의 특정적인 설계에 의해, 단백질 결합 용량, 선택성, 베드 투과성(bed permeability), 화학적 안정성 또는 스루풋(throughput) 등의 몇 가지 핵심적인 속성들로 특징될 수 있는 크로마토 그래피 매질을 얻게 된다. 정제 방법에는, 생성물에 우세하게 결합하는 것(결합 및 용출), 불순물에 우세하게 결합하는 것(플로-스루) 및 상술한 것들의 조합(소위, 약한 분할 및 기타) 등이 포함된다. 이러한 기술을 설계하는데 있어서는, 확실하게 분리될 수 있도록 앞서 언급된 크로마토그래피 매질 특성을 제어하여 정제된 단백질 생성물을 얻는 것이 매우 중요하다.
단백질 분리는 다양한 다공성 기재 또는 베이스 매트릭스에서 수행될 수 있다. 수지 또는 비드(bead) 구조를 위한 통상적인 물질에는, 다당류(아가로오스, 셀룰로오스), 합성 폴리머(폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트 및 폴리아크릴아미드) 및 세라믹(실리카, 지르코니아 및 제어된 공극 글래스(controlled pore glass)) 등이 포함된다.
또한, 막(membrane)과 모노리스(monolith) 물질이 일반적으로 크로마토그래피용으로, 특히 플로-스루 적용에 사용된다. 전형적인 막 조성물에는, 합성 폴리머, 예컨대, 폴리비닐리덴플루오라이드, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰, 나일론, 및 다당류, 예컨대, 셀룰로오스가 포함된다. 모노리스는 폴리스티렌, 다당류, 폴리메타크릴레이트 및 기타 합성 폴리머, 다당류 및 세라믹으로부터 개발되어 왔다. 막과 모노리스 크로마토그래피는 이들 물질이, 막과 모노리스 물질의 투과성을 조절하는 동일한 "대류 공극(convective pore)"에서 단백질을 흡수한다는 점에서 비드와 다르다. 전형적인 막과 모노리스 대류 공극 크기는 약 0.6μm 내지 약 10μm이다. 이들 기재와 더불어 리간드 역시, 본원에서 서술된 내용을 포함하는 다양한 개발 기술을 통하여 수행될 수 있다.
단백질 결합 용량을 개선하고 수지 선택성을 조정하기 위해 리간드 "익스텐더"를 사용하는 것은, 예컨대, 베이스 매트릭스로부터 확장시키는 그라프팅(grafting)에 의해 베이스 매트릭스로 작용성 폴리머 사슬을 커플링하는 것을 포함한다. 리간드 익스텐더는 전형적으로 보다 우수한 결합 용량을 제공하는데, 이는 타겟 분자의 결합이 폴리머 지지체 표면상 단백질의 단층(monolayer) 흡착을 초과하여, 리간드 익스텐더가 작용기의 이용을 증가시키기 때문이다. 이러한 리간드 기술의 사용은 US 2004/0059040에 개시되어 있다. US 공개공보 2004/0059040에는, 지지체상으로 코팅된 폴리머를 포함하는 크로마토그래피용 흡착 물질로서, 상기 폴리머 골격(backbone)이 하나 이상의 아미드기를 포함하는 하나 이상의 결합에 의해 지지체에 결합되어 있는 것이 개시되어 있다. 또한, US 2004/0059040에는, 폴리머를 지지체와 반응하여 공유 결합을 형성하는 것이 개시되어 있다. 상기 방법은 입자 표면을 이동상(mobile phase)과의 상호작용으로부터 보호하여(예: 실리카 입자가 높은 pH 이동상에 의해 용해되는 것을 방지), 입자상에 표면 코팅을 제공하는데 유용하다. 이러한 방법은 리간드가 비드를 포함하는 입자의 표면을 코팅하도록 하지만, 리간드가 공극으로 확장되어 나가지 않아서 생체분자에 대해 높은 용량을 제공하게 된다.
폴리머 익스텐더를 다공성 물질 표면에 첨가하는 것은 개선된 단백질 결합 용량, 결합 역학 및 단백질 선택성에서 퍼텐셜 변화를 제공하게 된다. 그러나, 단백질 분리가 더욱 요구됨에 따라, 새롭고 보다 효율 높은 기술 및 방법을 개발하여 신규한 폴리머 구조를 창출하는 것이 보다 중요하다. 따라서, 단백질 분리에 사용되는 것으로서, 개선된 단백질 결합 용량 및 개선되거나 개질된 단백질 선택성을 갖는 다공성 폴리머 기재를 개발하는 것이 바람직하다.
새로운 다공성 폴리머 기재에 대한 상기 필요성들에 대하여, 단백질 분리에 유용하고, 개선된 단백질 결합 용량 및 수지 선택성을 갖는, 다공성 폴리머 기재상으로, 뒤에 폴리머 지지체와 반응할 수 있는 작용성 말단기로 만들어지는 폴리머 익스텐더를 그라프팅하는 새로운 방법이 개발되어 왔다.
본 발명은 폴리머 지지체에 폴리머 리간드를 공유 결합으로 고정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 실시하여, 보다 일반적인 라디칼 그라프팅 기술 중에 일어나는 부반응을 줄이거나 최소화시켜, 생성되는 관능성 폴리머 매질의 안정성을 개선시킨다.
또한, 본 발명은 공유 결합된 폴리머 리간드 사슬을 갖는 매크로다공성(macroporous) 폴리머 매질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 매질은 크로마토그래피 정제에 적용될 수 있다.
본 발명의 제1면으로서, 폴리머 지지체상에 고정된 폴리머 리간드를 포함하는 크로마토그래피용 흡착 물질이 제공되고, 여기에서 상기 폴리머 리간드는, 하나 이상의 작용기를 포함하는 하나 이상의 결합에 의해 폴리머 지지체에 결합된다.
본 발명의 제2면으로서, 폴리머 지지체상에 폴리머 리간드를 고정하는 단계를 포함하는 크로마토그래피용 흡착 물질의 제조방법이 제공되고, 여기에서, 상기 폴리머 지지체는 폴리머 골격을 포함하는 폴리머 리간드와 반응하여, 폴리머 골격과 폴리머 지지체 간에 하나 이상의 결합을 형성하고, 각각의 결합은 하나 이상의 작용기를 포함한다.
본 발명의 제3면으로서, 혼합물을 폴리머 지지체상에 고정된 폴리머 리간드를 포함하는 크로마토그래피용 흡착 물질과 접촉하는 단계를 포함하는, 혼합물로부터 화학적 화합물을 분리하는 방법이 제공되고, 여기에서, 폴리머 골격은, 하나 이상의 작용기를 포함하는 하나 이상의 결합에 의해 지지체에 결합된다.
본원에서 사용되는 용어의 단수형은 문맥에서 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 대상을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리머 리간드" 및 "폴리머성 리간드"는, 용어 "폴리머성 지지체" 및 "폴리머 지지체"와 마찬가지로 동일한 용어이다.
본원에서 사용되는 용어 "바람직하게", "보다 바람직하게", 및 "가장 바람직하게"는 보다 우수한 것으로 간주되는 방식을 암시하고자 하는 것은 아니며, 보다 넓은 범위 또는 그룹의 보다 적절한 좁은 범위를 구체화하는 것을 의미한다.
본원에 교시된 모든 범위들은, 그 안에 속하는 모든 범위들도 포함하고 조합 가능하다.
본원에서 사용되는 다공성은, "확산 공극(diffusive pore)"을 통하여 단백질을 흡수하는 물질을 의미하고, 전형적으로 약 200Å 내지 3,000Å이다. 폴리머 수지 입자를 제조하는 본 발명의 방법의 일부 구체예로서, 모든 후속 모노머의 총 중량에 대한 포로겐(porogen)의 중량의 비는 0.1 이상; 0.25 이상; 또는 0.5 이상이다. 폴리머 수지 입자를 제조하는 본 발명의 방법의 일부 구체예로서, 모든 후속 모노머의 총 충량에 대한 포로겐의 중량의 비는 10 이하; 5 이하; 또는 2.5 이하이다.
본 발명의 폴리머 지지체는, 적어도 하나의 반응성 기(reactive group)와 함께 적어도 하나의 비닐 모노머를 포함하는 모노머 혼합물을 중합하여 적절하게 제조되는 임의의 폴리머 비드를 포함한다. 반응성 기의 적절한 예에는, 친전자성이거나 친전자체로 전환되는 기 또는 친핵성이거나 친전자체로 전환되는 기가 포함된다.
본 발명의 폴리머 지지체는 현탁, 에멀젼 또는 분산 중합 또는 이들의 조합으로 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리머 지지체를 제조하기 위해 사용되는 적절한 비닐 모노머에는, 단일의 비닐기를 갖는 것들, 다중의 비닐기를 갖는 것들 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이에 한하지 않는다. 일부 적절한 비닐 모노머에는, 예를 들면, 비닐 카복실레이트, 비닐 우레탄 모노머, 비닐 방향족 모노머, (메트)아크릴레이트 에스테르, 치환된 (메트)아크릴레이트 에스테르, (메트)아크릴아미드, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 비닐 카복실레이트 중 하나의 적절한 예는 비닐 아세테이트이다. 비닐 우레탄 모노머 중 하나의 적절한 예는 트리알릴 이소시아누레이트이다. 적절한 비닐 방향족 모노머의 예에는, 스티렌, 디비닐 벤젠, 및 이들의 치환된 형태(예컨대, 알파-메틸 스티렌)가 포함된다. 일부 적절한 치환된 (메트)아크릴레이트 에스테르에는, (메트)아크릴산과 폴리하이드릭 알콜의 에스테르, 예를 들면, 글리시딜 메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 하이드록시 에틸 메타크릴레이트, 글리세롤 디메타크릴레이트, 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 및 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 적절한 치환된 (메타)아크릴아미드는 (3-아미노프로필)메타크릴아미드 하이드로클로라이드 및 하이드록시에틸 메타크릴아미드이다.
폴리머 지지체 물질은 입자성(particulate) 물질이거나, 또는 피스(piece), 시트, 로드(rod), 튜브, 또는 모세관 코팅의 형태일 수 있다. 바람직하게, 지지체 물질은 입자성 물질이고, 적절하게 약 0.5 내지 약 500μm, 바람직하게 약 0.7 내지 약 200μm, 가장 바람직하게 약 10 내지 약 120μm의 부피 평균 입자 크기를 갖는다. 입자는 바람직하게 실질적으로 구형이다. 입자성 물질은 적절하게 공극을 포함한다. 입자성 지지체 물질의 공극 크기, 공극 부피 및 구체적인 표면적은, 사용되는 지지체 물질의 타입, 지지체에 연결되는 폴리머의 특성 및 사용되는 경우 원하는 분리의 특성에 따라서 변할 수 있다. 공극 크기는 약 20 내지 약 4000Å, 바람직하게 약 50 내지 약 1500Å이다. 관류(perfusion) 공극에 대하여, 공극 크기는 적절하게 약 2000 내지 약 80000Å, 바람직하게 약 5000 내지 약 50000Å이다. 공극 부피는 적절하게 약 0.1 내지 약 4 ml/g, 바람직하게 약 0.3 내지 약 2 ml/g, 가장 바람직하게, 약 0.5 내지 약 1.5 ml/g이다. 구체적인 표면적은 적절하게 약 1 내지 약 1000 m2/g, 바람직하게 약 25 내지 약 700 m2/g, 가장 바람직하게 약 50 내지 약 300 m2/g이다.
폴리머 리간드의 적어도 하나의 반응성 기는 본 발명의 폴리머 지지체에 공유 결합된다. 본 발명의 폴리머 지지체와 반응하기 쉬운 폴리머 리간드의 적절한 반응성 기에는, 친전자체, 예컨대, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 알데히드, 활성 에스테르, 활성화된 알코올, 에폭사이드, 카보네이트, 카보양이온 및 합성 등가물(equivalent) 및 이들의 조합 또는 친핵성 기, 예컨대, 알코올, 아민, 카보음이온 및 합성 등가물, 티올, 및 카복실레이트 및 이들의 조합 또는 자유 라디칼 수용체, 예컨대 불포화 이중 결합이 포함되나, 이에 한하지 않는다.
본 발명의 폴리머 리간드와 반응하기 쉬운 폴리머 지지체상의 적절한 반응성 기에는, 친전자체, 예컨대, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 알데히드, 활성 에스테르, 활성화된 알코올, 에폭사이드, 카보네이트, 카보양이온 및 합성 등가물 및 이들의 조합 또는 친핵성 기, 예컨대, 알코올, 아민, 카보음이온 및 합성 등가물, 티올, 및 카복실레이트 및 이들의 조합 또는 자유 라디칼 수용체, 예컨대, 불포화 이중 결합이 포함되나, 이에 한하지 않는다.
본원에서 사용될 수 있는 폴리머 리간드를 포함하는 폴리머의 예에는, 아크릴, 메타크릴, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 다당류 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이에 한하지 않는다.
본원에서 사용될 수 있는 작용기에는, 이온 교환기(ion exchange group), 소수성 상호작용기, 친수성 상호작용기, 친황성(thiophilic) 상호작용기, 금속 친화성기, 친화성기, 생체친화성기(bioaffinity group) 및 혼합 모드기(mixed mode group)(상술한 것들의 조합) 등이 포함되나, 이에 한하지 않는다. 본원에서 사용될 수 있는 적절한 작용성 폴리머 리간드의 예에는, 강한 양이온 교환기, 예컨대, 설포프로필, 설폰산; 강한 음이온 교환기, 예컨대, 트리메틸암모늄 클로라이드; 약한 양이온 교환기, 예컨대, 카복시산; 약한 음이온 교환기, 예컨대, N,N-디에틸아미노 또는 DEAE; 소수성 상호작용기, 예컨대, 페닐, 부틸, 프로필, 헥실; 및 친화성기, 예컨대, 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 L 및 다른 작용기로의 추가 변형이 가능한 비작용성 모노머 또는 매개(intermediary) 모노머(예: 이온 교환 또는 친화성 리간드로 변형되는 글리시딜 메타크릴레이트), 및 이들의 혼합물 등이 포함되나, 이에 한하지 않는다.
일 구체예로서, 작용성 폴리머 리간드는 이원-작용성(dual-functional) 사슬 전달제의 존재하에, 작용성 모노머의 자유 라디칼 중합을 통해 발생된다. 사슬 전달제를 첨가하여 폴리머 리간드의 분자량에 영향을 주고, 폴리머 지지체와 반응하게 한다. 중합 중에 이원-작용성 사슬 전달제와 모노머의 반응은 작용성 말단기로 종결되는 폴리머 리간드로 된다. 적절한 이원-작용성 사슬 전달제는 자유 라디칼 사슬을 전달시키는 그룹과 폴리머 리간드와 폴리머 지지체의 반응에 적합한 작용기를 모두 포함한다. 적절한 사슬 전달기에는, 예를 들면, 할로메탄, 디설파이드, 티올(머캅탄이라고도 함), 및 금속 복합체가 포함된다. 추가적으로 적절한 사슬 전달제에는 적어도 하나의 쉽게 앱스트랙트 할 수 있는(abstractable) 수소 원자를 갖는 다양한 기타 화합물들 및 이들의 혼합물들이 포함된다. 적절한 반응성 기에는, 친전자체, 예컨대, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 알데히드, 활성 에스테르, 활성화된 알코올, 에폭사이드, 카보네이트, 카보양이온 및 합성 등가물 및 이들의 조합 또는 친핵성 기, 예컨대, 알코올, 아민, 카보음이온 및 합성 등가물, 티올, 및 카복실레이트 및 이들의 조합 또는 자유 라디칼 수용체, 예컨대, 불포화 이중 결합이 포함되나, 이에 한하지 않는다. 사슬 전달제를, 하나 이상의 첨가로, 또는 연속적으로, 선형으로(linearly) 또는 그렇지 않게, 전체 반응 시간의 대부분 또는 전부에 걸쳐 또는 반응 시간의 제한된 부분에만 첨가할 수 있다. 사슬 전달제는, 0.01% 내지 5%, 보다 바람직하게 0.1% 내지 1%의 수준으로 반응에 첨가될 수 있다.
가교제, 가지화제(branching agent) 및 비작용성 모노머는, 폴리머 리간드의 형태학 또는 상호작용을 제어하기 위한 목적으로 폴리머 리간드에 결합될 수 있다. 그러나, 폴리머 리간드 상의 이러한 가교제 또는 가지화제는, 적절하게 5% 미만, 보다 바람직하게 1% 미만의 낮은 수준으로 존재한다. 적절한 가교제 또는 가지화제에는, 모노머, 예컨대, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 디비닐 벤젠, 트리메틸프로필 트리메타크릴레이트 및 메틸렌 비스아크릴아미드 또는 다작용성 사슬 전달제가 포함되나, 이에 한하지 않는다.
본원에서 사용될 수 있는 "자유 라디칼 개시제"의 예에는, 폴리머 리간드, 예컨대, 퍼옥사이드, 예컨대, t-부틸하이드로퍼옥사이드, 큐멘 하이드로퍼옥사이드; 퍼옥시아세테이트, 예컨대, 퍼아세트산, 클로로퍼벤조산; 퍼설페이트, 예컨대, 암모늄 퍼설페이트, 소듐 퍼설페이트, 포타슘 퍼옥소디설페이트, 아조 개시제, 예컨대, 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산), Irgacure® 2959(Ciba-Geigy, Hawthorn, N.Y.), 2,2'-아조비스(2-아미노-프로판)하이드로클로라이드 등 및 이들의 혼합물을 형성하기 위하여 비닐 모노머와 반응할 수 있는 임의의 자유 라디칼 개시제가 포함되나, 이에 한하지 않는다. 그라프팅 반응은 업계에 공지된 방법으로, 바람직하게 열 개시(가열) 또는 UV 조사(irradiation)로 개시할 수 있다. 자유 라디칼 개시제는 수용해성 또는 유용해성(oil soluble)일 수 있다. 개시제는 0.01% 내지 15%, 보다 바람직하게 0.1% 내지 2%의 수준으로 반응에 첨가될 수 있다.
폴리머 리간드는 폴리머 지지체와 적절하게 공유 결합한다. 폴리머 리간드를, 폴리머 지지체의 현탁물에 용액으로 적절하게 첨가한다. 그 후, 폴리머 리간드를 당업자에게 공지된 방법으로 여과, 세척하고, 번갈아서 건조시킨다. 반응 중의 온도는 적절하게 약 25 내지 약 90℃, 바람직하게 약 50 내지 약 80℃이다. 일 구체예로서, 혼합물을 불활성 분위기하에서 유지시킨다.
본 발명은 추가적으로, 크로마토그래피 분리 방법에 있어서 크로마토그래피용 흡착 물질을 사용하는 것을 포함한다. 이러한 크로마토 그래피 분리 방법은, 예를 들면, 이온 교환, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 친황성 상호작용, 금속 친화성, 친화성, 생체친화성, 및 혼합 모드(상술한 것들의 조합), 초임계 유체 크로마토그래피(supercritical fluid chromatography; SFC), 및 모사 이동 베드(simulating moving bed; SMB) 일 수 있다.
본 발명은 추가적으로, 크로마토그래피 분리 방법에 있어서 크로마토그래피용 흡착 물질을 사용하는 것을 포함한다. 이러한 크로마토그래피 분리 방법은, 예를 들면, 저압 액체 크로마토그래피(low pressure liquid chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), HPLC, 초임계 유체 크로마토그래피(SFC), 및 모사 이동 베드(SMB) 일 수 있다.
본 발명은 추가적으로, 본 발명에 따른 크로마토그래피를 위하여 혼합물을 흡착 물질과 접촉하는 것을 포함하는 화학적 화합물을 분리하는 방법을 포함한다.
본 발명의 1차적인 이점은 크로마토그래피 캡쳐(capture) 및/또는 분자, 보다 상세하게는 생체분자의 정제를 위해, 미리 조작된(pre-fabricated) 폴리머 리간드 그라프팅을 사용하여 고용량 이온 교환 수지를 생성하는 것이다.
실시예
실시예에 포함된 물질들은 다음 공급원으로부터 얻었다.
GE healthcare: Q-Sepharose™
Fisher Scientific: HCl, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄
Sigma-Aldrich: BSA, 시린지(syringe) 필터, (3-아크릴아미도프로필)트리메틸암모늄, 2-아미노에탄티올 하이드로클로라이드, 2,2'-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)
실시예 1 - 폴리머 리간드의 제조
0.111 g의 2-아미노에탄티올 하이드로클로라이드(AETㆍHCl) 및 0.186 g의 2.2'-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)디하이드로클로라이드(ABMPAㆍ2HCl)을 분리된 칭량 접시(weighing dish)에서 무게를 재고, 38 g의 헹굼수(water rinse)와 함께 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 30 g의 (3-아크릴아미도프로필)트리메틸암모늄 클로라이드(AAPTMAC) 및 32 g의 물을 직접 플라스크에 무게를 재어 넣었다. N2 버블러와 함께 온도계 및 물이 채워진 콘덴서를 플라스크에 연결하여 설치하였다. 성분들을 플라스크에 넣은 후, 반응 혼합물을 78℃에서 5시간 동안 교반하였다.
실시예 2 - 흡착 물질의 발생(폴리머 리간드와 폴리머 지지체의 반응)
실시예 1에서 생성된, 진정된 폴리머 리간드 용액 90 g 및 10.6 g의 폴리GMA-GlyDMA 웨트 케이크(wet cake)를 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. N2 분위기하에서, 슬러리 용액을 오버헤드(overhead) 교반기(200 rpm)로 65℃에서 16시간 동안 교반하였다. 생성되는 진정된 현탁액을 여과하고 물(4×200 mL)로 세척하였다. 음이온 교환 수지를 수성 슬러리 용액으로 저장하였다. 음이온 교환 수지에 대한 소혈청으로부터의 알부민(BSA) 용량은 155 mg/mL 이었다.
흡착 물질에 대한 BSA 용량 테스트
용액 1(50 mM 트리스/HCl, pH 8.8)의 제조
12.1 g의 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄을 2 L 용량 플라스크 (volumetric flask)에 첨가하였다. 0.01N HCl 용액을 적용하여 2 리터 마크까지 채웠다. 용량 플라스크를 캡핑(capping)한 후 내용물을 흔들었다. 용액을 5분간 방치하고, 용액의 부피를 다시 체크하였다. 추가의 HCl을 첨가하여 2 L 마크까지 부피를 조정하였다. 8.6에서 pH를 체크하였다. 용액에 라벨(용액 1)을 붙이고 냉장하였다.
용액 2(2 mg/ml BSA 용액)의 제조
0.806 g의 BSA를 유리 쟈(glass jar)무게를 달고, 403 g의 용액 1에 첨가하였다. 내용물을 손으로 부드럽게 흔들어 용해시켰다. 0.5시간 동안 용액을 가라 앉혀 BSA 완전하게 용해되도록 하였다. 용액에 라벨(용액 2)을 붙였다.
1 ml의 DI 수를 Bio-Rad Poly-Prep 크로마토그래피 컬럼 측 아래로 천천히 첨가하여, 임의의 트랩핑된(trapped) 공기를 방지하였다. 물의 높이를 지워지지 않는 잉크 펜으로 표시하였다. 컬럼으로부터 말단 플러그(end-plug)를 제거하였다. 컬럼을 환기 후드(ventilation hood) 내 매니폴드(manifold)에 연결하였다. 보다 많은 DI 수를 컬럼에 첨가하고, 물의 수준이 컬럼의 바닥까지 1-2 cm가 될 때까지 온화한 진공을 컬럼에 적용하여 공기 갇힘(air entrapment)을 방지하였다.
슬러리 음이온 교환 수지 용액을 컬럼에 첨가하였다. 물의 헤드는 항상 수지 위로 유지시켰다. 패킹된 베드가 1 ml 높이에 이를 때까지 전달 피펫으로 희석된 수지 슬러리를 천천히 애들링(addling)하여 컬럼내 1 ml의 수지를 측정하였다. 용액이 수지 위로 1-2 cm가 될 때까지 온화한 진공을 컬럼에 적용하여 제거하였다. 수지의 수준이 1 ml 마크 미만으로 떨어졌을 때, 더 많은 수지 슬러리를 추가로 진공을 유지하면서 첨가하였다. 수지 비드로 공기가 도입되지 않도록 주의하였다(베드가 공기에 노출되기 전에 진공을 멈춤). 수지 비드가 공기에 노출되는 것을 방지하기 위해 필요한 것으로서, 추가량의 DI 수를 사용하였다. 패킹된 1 ml 수지를 약 10 ml의 DI 수로 헹구어 슬러리 용액을 교체하고, 패킹된 베드 위로 물의 수준이 1-2 cm가 될 때까지 액체를 부어 내었다. 그 후, 패킹된 1 ml 수지를 10 ml의 용액 1로 씻어내었다. 진공을 적용하여 용액 1을 모두 컬럼으로부터 제거하고, 1분간 컬럼을 통해 공기를 빨아들였다. 웨트 케이크를 포함하는 1회용 컬럼을 매니폴드로부터 제거하였다.
컬럼으로부터의 웨트 케이크를 스파츌라(spatula)로 8 oz 유리 쟈로 옮기고, 소량의 200 mL의 BSA 용액 2(다음 단계로부터)를 첨가하였다. 200 mL의 2 mg/mL BSA 용액 2를 유리 쟈로 옮겼다. 유리 쟈를 캡으로 안전하게 하였다. 파라필름(parafilm)으로 쟈를 밀봉하였다. 유리 쟈를 쉐이커에 수평으로 높고, 샘플을 18시간 동안 부드럽게 흔들었다.
18시간 후, 쉐이커로부터 샘플을 제거하고, 수지를 15분간 가라앉혔다. 15분 후, 8 oz 쟈를 열고, 쟈로부터 5 ml 시린지를 사용하여 3 mL 샘플을 제거하였다. 시린지 위에 0.22μm 필터를 두고, 시린지에 압력을 가하여 필터를 통해 1회용 UV 큐벳으로 BSA 용액을 천천히 밀어내었다. 18시간의 인큐베이션 후, 여과된 표면상의 BSA 용액의 278 nm UV 흡수로부터 BSA 결합 용량을 측정하였다.

Claims (11)

  1. 폴리머 지지체 상에 폴리머 리간드를 고정하는 단계를 포함하고,
    상기 폴리머 지지체가, 알데히드, 활성 에스테르, 활성화된 알코올, 에폭사이드, 카보네이트, 카보양이온 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 반응성 그룹을 가지며,
    상기 폴리머 지지체가, 폴리머 골격을 포함하는 폴리머 리간드와 반응하여 상기 폴리머 골격과 상기 폴리머 지지체 간에 결합을 형성하고, 각 결합은 하나 이상의 작용기를 포함하고,
    상기 폴리머 리간드가, 이원-작용성(dual-functional) 사슬 전달제의 존재하에 하나 이상의 작용기를 갖는 적어도 하나의 비닐 모노머를 포함하는 모노머 혼합물의 중합에 의해 제조되며,
    상기 이원-작용성 사슬 전달제가, 자유 라디칼 사슬이 전달되도록 하는 그룹 및 폴리머 리간드와 폴리머 지지체의 반응을 위한 작용기를 포함하는,
    크로마토그래피용 흡착 물질의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 이원-작용성 사슬 전달제 내의, 폴리머 리간드와 폴리머 지지체의 반응을 위한 작용기가 알코올, 아민, 카보음이온, 티올, 카복실레이트 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 폴리머 지지체가 0.5 내지 500μm의 부피 평균 입자 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 폴리머 리간드가 용액으로서 폴리머 지지체의 현탁물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 폴리머 지지체가 알데히드, 에폭사이드, 카보네이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 반응성 그룹을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 폴리머 지지체가 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택된 반응성 그룹을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항의 방법에 의해 제조되며, 폴리머 지지체 상에 고정된 폴리머 리간드를 포함하고, 상기 폴리머 리간드가 하나 이상의 작용기를 포함하는 결합에 의해 폴리머 지지체에 붙게 되는, 크로마토그래피용 흡착 물질.
  8. 제7항에 있어서, 폴리머 지지체가, 하나 이상의 작용기 및 폴리머 리간드와의 반응성이 있는 그룹을 갖는 적어도 하나의 비닐 모노머를 포함하는 모노머 혼합물을 중합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 흡착 물질.
  9. 제8항에 있어서, 폴리머 리간드와의 반응성이 있는 그룹이,
    알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 알데히드, 활성 에스테르, 활성화된 알코올, 에폭사이드, 카보네이트, 카보양이온 및 이들의 조합으로부터 선택되는 친전자체; 또는
    알코올, 아민, 카보음이온, 티올, 카복실레이트 및 이들의 조합으로부터 선택되는 친핵성기; 또는
    불포화 이중 결합으로부터 선택되는 자유 라디칼 수용체;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 흡착 물질.
  10. 제7항에 있어서, 폴리머 지지체가 0.5 내지 500μm의 부피 평균 입자 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 흡착 물질.
  11. 제7항의 크로마토그래피용 흡착 물질과 혼합물을 접촉하는 단계를 포함하는, 혼합물로부터 화학적 화합물을 분리하는 방법.
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