KR20130028939A - 크로마토그래피 매질 성능을 개선하기 위한 그라프팅 방법 - Google Patents

크로마토그래피 매질 성능을 개선하기 위한 그라프팅 방법 Download PDF

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닐 소이체
조아퀸 우마나
유 장
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이엠디 밀리포어 코포레이션
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Abstract

본 발명은 기재의 확산성 기공을 채우지 않고 또 그를 통한 확산을 제한하지 않는 단백질 분리에서 사용되는 확산성 기공을 갖는 다공성 기재 상으로 중합체 연장제를 그라프팅하는 개선된 방법에 관한 것이다. 그라프팅 조건 및/또는 단량체 조성을 변경함으로써, 증가된 단백질 결합능 및 수지 선택성을 갖는 그라프팅된 중합체 연장제를 갖는 다공성 기재를 초래하며, 그에 따라 기재의 단백질 분리 효능을 향상시킨다. 그라프팅된 중합체 연장제는 더 높은 도전성에서 현저한 결합능을 갖는 기재를 제공한다. 본 발명은 또한 확산성 기공을 갖는 다공성 수지 기재 상으로 중합체 연장제를 사용하여 그라프팅하는 키트 및 방법도 제공한다.

Description

크로마토그래피 매질 성능을 개선하기 위한 그라프팅 방법{Grafting method to improve chromatography media performance}
본 발명은 중합체 연장제(extender)를 그라프팅(grafting)하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 중합체 연장제를 단백질 분리에 사용된 다공성 기재(porus substrates)에 그라프팅하여 개선된 단백질 결합능과 수지 선택성을 갖는 다공성 기재를 초래하는 방법 개선에 관한 것일 뿐만 아니라 이를 제조하고 사용하는 키트 및 방법에도 관한 것이다.
살아있는 생물로부터 생성된 치료성 단백질은 현대 보건에서 점점 더 중요한 역할을 하고 있다. 이들 단백질은 특이성 증가 및 질병 표적에 대한 효능을 비롯한 전통적인 약제에 대하여 다수의 이점을 제공한다. 포유동물 면역계는 질병의 위험을 제어하고 제거하기 위하여 다양한 단백질, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 이용한다. 유전자 및 단백질 엔지니어링의 출현으로 다수의 "설계된" 또는 재조합 단백질 치료제의 개발이 허용되었다. 이들 치료제는 단일 단백질, 화학변형된 단백질, 단백질 단편 또는 단백질 결합물(conjugate)을 기본으로 할 수 있다. 이들 치료성 단백질의 하나의 종류인 모노클로날 항체(MAb)는 보건 및 진단학에서 다양한 적용을 갖는 것으로 밝혀졌다. 크로마토그래피 분리는 이들 생물의약의 제조에 광범위하게 이용된다. 산업이 성숙하여 감에 따라, 분리를 증진시키는 신규/진보된 기술 및 방법의 실시로 생물치료제 제조자들에게 더 많은 환자에게 이들 의약을 저 비용으로 제공하는 능력을 제공할 것이다.
단백질을 정제하기 위해 사용된 일반적인 크로마토그래피 방법은 그 중에서도 친화성, 생물친화성, 이온 교환, 역상, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 크기 배제 및 혼합 모드(상술한 카테고리의 조합)를 포함한다. 이들 유형의 크로마토그래피 과정 각각의 적용과 효율은 각기 이동성 액체상과 상호작용하는, 크로마토그래피 시스템의 용질 분자와 정지상(크로마토그래피 매질) 사이의 표면-표면 상호작용의 선택성에 따라 달라진다. 다수의 정지상 크로마토그래피 지지재(support materials)가 시판되고 있다.
불순물로부터 생성물을 성공적으로 분리하는 열쇠는 흔히 정지상, 베이스 매트릭스(matrix) 및 리간드 특성(리간드 유형, 리간드 밀도, 기공 구조, 리간드 분포, 물질 조성)의 올바른 조합, 및 이동상 또는 용액 특성(완충액 유형, pH 및 도전성)에 따라서 달라진다. 베이스 매트릭스 및 리간드의 특정 디자인은 단백질 결합능 또는 처리량(throughput), 선택성, 층(bed) 투과성 및 화학적 안정성을 비롯한 몇가지 주요 요인에 의해 특징화될 수 있는 크로마토그래피 매질을 초래한다. 정제 방법은 생성물을 지배적으로 결합(결합 및 용출), 불순물을 지배적으로 결합(플로우-쓰루: flow-through) 및 상술한 것의 조합(소위 약한 분배 및 기타)을 포함한다. 정제된 단백질 생성물을 초래하는 튼튼한 분리를 가능하고 하게 보장하기 위하여 상기 시사된 크로마토그래피 매질 특성을 제어하는 것이 이들 기술의 디자인에서 중요하다.
다양한 다공성 기재 또는 베이스 매트릭스를 기초로 단백질 분리를 달성할 수 있다. 수지 또는 비드 구조에 통상적인 물질은 다당류(아가로오스, 셀룰로오스), 합성 중합체(폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트 및 폴리아크릴아미드) 및 실리카, 지르코니아 및 제어된 기공 유리와 같은 세라믹을 포함한다. 이들 물질은 전형적으로 약 >5 ㎛인 "대류성(convective) 기공"보다 훨씬 작고, 층 투과성을 제어하며 충진층(packed bed)에서 비드간 간격에 의해 형성되는, 전형적으로 약 200Å 내지 3,000Å의 "확산성 기공(diffusive pore)"을 통하여 단백질을 흡착한다.
막 및 모노리쓰(monolith) 물질은 크로마토그래피, 특히 플로우-쓰루 적용을 위해 흔히 사용된다. 전형적인 막 조성은 폴리비닐리덴플루오라이드, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰, 나일론과 같은 합성 중합체, 및 셀룰로오스와 같은 다당류를 포함한다.
모노리쓰는 폴리스티렌, 다당류 및 다수의 기타 합성 중합체로부터 개발되었다. 막 및 모노리쓰 크로마토그래피는 이들 물질이 막과 모노리쓰 물질의 투과성을 제어하는 동일 "대류성 기공"에서 단백질을 흡착하는 점에서는 비드와 상이하다. 전형적인 막 및 모노리쓰 대류성 기공 크기는 0.6 ㎛ 내지 약 10 ㎛ 범위이다. 이들 기질에 대한 리간드 부가는 다양한 잘 개발된 수법을 통하여 달성될 수 있다.
단백질 결합능을 개선하고 또 수지 선택성을 조절하기 위해 리간드 "촉수" 또는 "연장제(extender)"를 사용하는 것은 그라프팅에 의해 베이스 매트릭스에 커플링된 중합체 사슬 상에 리간드를 배치하고, 또 베이스 매트릭스 표면으로부터 멀어지게 연장한다. 리간드 연장제는 전형적으로 더 큰 결합능을 생성하는데, 이는 상기 연장제가 리간드 유용성(availability)을 증가시켜, 표적 분자 결합이 표면 상에서 단층 흡착의 분자 결합을 초과하기 때문이다. 예를 들어, 이온교환체로서 사용하기 위한 표면 변형된 다공성 실리카 물질의 제제는 Jansen 등에 의한 "Absorption of Proteins on Porus and Non-Porus Poly(ethyleneimine) and Tentacle-Type Anion Exchangers", (Journal of Chromatography, vol. 522, 1990, 77-93)에 개시되어 있고, 이 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
단백질 분리를 위한 크로마토그래피에 사용되는 것과 같은 다공성 기재 상에 표면 연장제를 생성하기 위해 중합체 연장제를 그라프팅하기 위한 2개의 표준 방법이 개발되었다: 1) 표면 라디칼을 통하여 지지체로부터 단량체("~로부터 단량체 그라프팅")의 그라프팅, 및 2) 활성기를 통하여 지지체에 대한 예비성형된 중합체의 그라프팅("~으로 중합체 그라프팅").
연장제를 수지에 커플링하기 위한 1개의 초기 방법은 베이스 매트릭스 표면으로부터 중합체 사슬을 그라프팅한 다음 금속/산화 생성된 라디칼에 의한 단량체 중합화의 개시에 의한 것으로 전형적으로 단백질 결합능에서 50% 이상의 증가를 초래한다 (참조: 예를 들어, 울러에게 허여된 미국 특허번호 5,453,186호). 베이스 매트릭스 표면을 덱스트란에 의해 그라프팅(참조: 예를 들어, 베르그에 허여된 미국 특허번호 6,428,707호); 고분기된(highly branched) 중합체를 사용한 그라프팅(참조: 예를 들어, 애머샴 바이오사이언스에 의한 WO 2004/003542); 및 소수성 중합체를 사용한 그라프팅(참조: 예를 들어, 지이 헬쓰케어 바이오사이언스에 의한 WO 2005/098415호)을 비롯한 몇 개의 다른 방법이 개발되었다. 이들 미국 특허 및 공개된 국제특허 출원의 개시내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
예를 들어, WO 05/098415호에 개시된 바와 같이 베이스 수지에 소수성 중합체를 그라프팅하는 것은 단순한 표면 결합된 리간드에 비하여 수지의 단백질 선택성을 변형시킨다. 이들 변형 각각은 "표면으로부터 단량체를 그라프팅"하는 것에 의해 (라디칼 중합화의 개시) 또는 "표면으로 중합체 그라프팅"(예비성형된 중합체의 부착)을 통하여 베이스 매트릭스 표면에 중합체 사슬을 부가한다.
라디칼 중합 반응을 이용하여 다공성 물질로부터 단량체를 그라프팅하는 것은 잘 개발된 기술이다. 일반적으로, 다공성 표면 물질로부터, 또는 용액 중의 개시제로부터 반응이 개시될 수 있다.
표면으로부터 라디칼 중합반응을 개시하는 것은 방사선, 금속 산화 및 흡착된 개시 종과 같은 반응성 환경에 대한 노출을 통하여 표면에서 라디칼을 생성하는 것에 의해 달성될 수 있다(참조: 예를 들어 "Polymer Surfaces", Fabio Garbassi, John Wiley-Sons Inc., New York, 1998). 그러나, 이들 "~로부터 단량체를 그라프팅"하는 방법은 아주 제어된 용액 조건 및/또는 특수한 장치를 필요로 하므로 그 실시를 복잡하게 하고 또 시간 소모적이다.
상기 반응이 용액으로부터 개시될 때, 그라프팅 이전에 표면 반응성 기를 표면에 부착하는 것이 새롭게 형성된 중합체 및 다공성 물질의 표면 사이의 영구적인 결합을 가능하게 하는데 필요하다. 전형적으로, 상기 표면 반응성 기는 용액 중의 단량체와 더 중합될 수 있다(예컨대 성형성 아크릴레이트 중합체를 고정하는 부착된 아크릴레이트와 같은 유사한 유형의 단량체). 그러나, 분해성 사슬 전달로 인하여, 라디칼 중합반응이 제한되며, 또 알릴 글리시딜 에테르(AGE)와 같은 알릴 단량체는 바람직하게 사용되지 않는다(참조: 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함되는 예를 들어, "Principles of Polymerization", George Odian, John Wiley-Sons Inc., New York, 1991).
그러나, 표면 반응성 기와 같은 알릴 작용기를 사용하는 것이 알려져 있다. 예를 들어, 알릴 표면 반응성 기는 기공 크기가 > 1 mm이고 효과적인 대류성 유동(>200 mUmin)을 허용하는 다공성 구조(소위 "젤리 롤")를 형성하기 위해 사용될 수 있는 셀룰로오스 섬유 또는 실리카를 변형하기 위해 사용될 수 있다(참조: 예를 들어, 각각 호우(Hou)에게 허여된 미국 특허번호 4,663,163호 및 4,724,207호). 이들 미국 특허 각각의 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
다르게는, 아크릴아미드는 중합되어 아가로오스 매트릭스(예를 들어, 15% wt 아가로오스)에 부착될 수 있으므로, 매트릭스로의 단백질 확산은 효과적으로 감소될 수 있어 부착된 중합된 아크릴아미드를 갖는 아가로오스 매트릭스는 HPLC 적용에 유용하다(HPLC 적용은 분석물 용해를 최대화하기 위하여 비다공성 비드를 사용한다) (참조: 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 예를 들어, 흐제르텐(Hjerten)에게 허여된 미국 특허번호 5,135,650호).
그러나, 호우(Hou)도 흐제르텐도 확산성 기공을 갖는 다공성 크로마토그래피 지지체의 표면에 커플링되고, 다공성 지지체는 그의 소망하는 단백질 흡착 특징을 유지하는, 아크릴아미드 또는 단량체를 개시하거나 제시하지 않고 있다.
열적 반응성 중합체를 그라프팅할 때, 잔류 메타크릴레이트 기는 LCST 함유 중합체(더 낮은 임계 용액 온도)의 그라프팅 수율을 증가시키기 위하여 부가적 비닐 또는 알릴기에 의해 보충될 수 있다 (참조: 예를 들어, 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 피터스에게 허여된 미국 특허번호 5,929,214호). 그러나, 이들 변형은 대류성 기공(> 1 pm)을 갖는 지지체 상에서 달성될 수 있고, 그 목표는 온도 변화 및 그라프팅된 LCST 중합체에 의한 "게이팅" 대류성 유동이다. 마이크로미터 크기 기공에서 유동 감소를 달성하기 위하여, 그라프팅된 사슬은 상기 크기의 기공을 "채우거나(fill)" 또는 "막는(plug)" 상당한 길이 및 밀도여야 한다. 흐제르텐에게 허여된 미국 특허번호 5,135,650호(그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된)에 개시된 바와 같이, 상기 그라프팅 방법은 필수적으로 기공을 채우거나 또는 막는다. LCST 중합체는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)용으로 사용되며, 또 LCST 중합체가 결합능에 대한 강한 온도 의존성을 나타내기 때문에, 이들의 다공성 크로마토그래피에서 전체적 실시적용은 제한된다.
연장제 사슬길이를 최소화하는 것에 의해 표면 변형을 생성하기 위하여, 분해성 사슬 전달을 용이하게 거치는 표면 반응성기 및 단량체를 사용하는 것에 의한 전략들이 이용되어 왔다. 알릴 표면 반응성 기 및 알릴 단량체의 조합은 연장제 사슬 길이를 최소하기 위하여 유리하다.
다공성 물질 표면에 중합체 연장제를 부가하는 것은 개선된 단백질 결합능 및 수지 선택성에서 소망하는 포텐셜 변경을 포함한다. 그러나, 단백질 분리가 더욱 더 요망됨에 따라, 신규한 중합체 구조를 생성하기 위하여 새로운 기술과 방법을 개발하는 것이 더욱 중요하게 된다. 따라서, 개선된 단백질 결합능을 개발하여 단백질 분리에 사용된 다공성 기재의 수지 선택성을 변형하는 것이 바람직할 것이다.
발명의 요약
단백질 분리에 유용하며, 개선된 단백질 결합능 및 수지 선택성을 갖고 확산성 기공을 갖는 다공성 기재 상으로 중합체 연장제를 그라프팅하는 것과 관련된 문제를 갖는 새로운 다공성 기재에 대한 상기와 같은 필요에 따라서, 확산성 기공을 갖는 중합체 연장제를 다공성 기재상으로 그라프팅하기 위한 새로운 방법이 개발되었다.
따라서, 본 발명에 따르면, 확산성 기공을 갖는 다공성 기재 상으로 중합체 연장제를 커플링하기 위한 새로운 그라프팅 방법이 개발되어, 다공성 기재의 확산성 기공을 막힘 또는 채우지 않고 개선된 단백질 결합능 및/또는 결합 선택성을 갖는 기재를 초래한다.
본 발명은 분해성 사슬 전달을 이미 거친 표면 반응성기에 라디칼을 그라프팅하는 것을 비롯하여, 기재의 표면에 커플링된 확산성 기공 및 표면 반응성 불포화 기를 갖는 다공성 기재 상으로 중합체 연장제를 그라프팅하기 위한 새로운 방법을 적어도 부분적으로 제공한다.
다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 확산성 기공을 갖고 단백질 분리 등에 사용되는 다공성 비드 상으로 중합체 연장제를 그라프팅하여 개선된 단백질 결합능 및 소망하는 수지 선택성을 갖는 비드를 초래하는 새로운 방법을 적어도 일부 기초로 한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 다공성 중합체 크로마토그래피 비드, 다공성 아가로오스 크로마토그래피 비드 및 다공성 세라믹 크로마토그래피 비드 상으로 중합체 연장제를 그라프팅하는 것을 적어도 부분적으로 기본으로 한다.
다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 약 100Å 초과((>100Å)이고 약 1 μ 미만(< 1μ)인 기공 크기를 갖는 확산성 기공을 갖는 다공성 기재상으로 중합체 연장제를 그라프팅하는 것을 적어도 부분적으로 기본으로 한다.
다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 확산성 기공 및 표면 반응성 작용성을 갖는 다공성 기재 상으로 중합체 연장제를 그라프팅하기 위한 새로운 방법을 적어도 부분적으로 기본으로 한다:
a) 확산성 기공 및 커플링되어 있는 표면 반응성 작용기를 갖는 다공성 크로마토그래피 비드를 제공하는 단계;
b) 그라프팅 단량체 또는 그라프팅 단량체의 혼합물 및 용해성 라디칼 중합반응 개시제를 포함하는 용액을 제공하는 단계;
c) 상기 크로마토그래피 비드를 상기 용액과 접촉시키는 단계;
d) 용액 중에 라디칼 중합반응 개시제의 도입에 의해 비드 상의 표면 반응성 작용기와 그라프팅 단량체 또는 그라프팅 단량체의 혼합물 사이의 자유 라디칼 중합반응을 개시하여 비드에 커플링된 중합체 사슬 연장제를 형성하는 단계;
e) 과량의 미반응 그라프팅 단량체, 그라프팅 단량체의 혼합물 또는 미부착 중합체 사슬을 제거하기 위하여 비드를 세척하여, 100 g/L 초과의 단백질 결합능을 갖는 다공성 기재를 초래하는 단계; 및
f) 크로마토그래피 비드 표면에 부착된 중합체 사슬에 리간드를 커플링시키는 단계.
부가적 실시양태에 따르면, 본 발명은 확산성 기공을 갖는 다공성 기재 상으로 중합체 연장제를 그라프팅하는 신규 방법을 적어도 부분적으로 기본으로 하며, 상기 그라프팅 단량체 또는 그라프팅 단량체의 혼합물은 메타크릴레이트, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 아크릴산, 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산, [3-(메타크릴로일아미노) 프로필] 트리메틸암모늄 클로라이드, 2-아크릴아미도-글리콜산, 이타콘산 또는 에틸 비닐 케톤, 글리시딜 메타크릴레이트, N,N-디메틸아크릴아미드, 아크릴아미드, 히드록시프로필 메타크릴레이트, N-페닐아크릴아미드, 히드록실프로필 아크릴아미드, 및 이들의 조합을 포함한다.
다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 중합체 연장제를 다공성 기재 상으로 그라프팅하는 신규 방법을 적어도 부분적으로 기본으로 하며, 중합체 사슬 연장제에 커플링된 리간드는 강한 양이온 교환기, 설포프로필 기, 설폰산 기, 음이온 교환기, 트리메틸암모늄 클로라이드 기, 약(weak) 양이온 교환기, 카복시산 기, 약 음이온 교환기, N,N 디에틸아미노 기, DEAE 기, 소수성 상호작용 기, 페닐 기, 부틸 기, 및 프로필 기, 및 친화성 기, 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 L, 및 그의 조합을 포함한다.
특정 다른 실시양태에서, 본 발명은 중합체 연장제를 다공성 기재 상으로 그라프팅하는 신규 방법을 적어도 부분적으로 기본으로 하며, 표면 반응성 작용기를 다공성 기재 표면으로 커플링하는 링커는 메타크릴레이트, 아미드, 아크릴아미드, 에폭사이드, 아민, 부탄디올 디글리시딜 에테르, 에피클로로히드린폴리에틸렌디올 디글리시딜 에테르, 에틸렌디올 디글리시딜 에테르, 알릴 클로로아세테이트, 알릴 클로라이드, 알릴(클로로)디메틸실란, 알릴 글리시딜 에테르, 알릴 브로마이드, 알릴 메타크릴레이트, 및 이들의 조합을 포함한다.
부가적 실시양태에 따르면, 본 발명은 확산성 기공 및 표면 반응성 불포화 작용기를 갖는 다공성 기재 상으로 중합체 연장제를 그라프팅하는 방법을 적어도 부분적으로 기본으로 하며, 상기 불포화 작용기는 알릴 기이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 암모늄 퍼설페이트, 포타슘 퍼설페이트, 아조비스(4-시아노발레르산), Irgacure® 2959, 2,2'-아조비스(2-아미디노-프로판)하이드로클로라이드 및 이들의 조합을 비롯한 라디칼 중합반응 개시제를 사용하여 중합체 연장제를 다공성 기재 상으로 그라프팅하는 신규 방법을 적어도 부분적으로 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 단백질 분리에 사용된 확산성 기공을 갖는 다공성 기재상으로 중합체 연장제를 그라프팅하여, 개선된 단백질 결합능 및 소망하는 수지 선택성을 초래하는 신규 방법을 제조하고 이용하는 것에 관련된 키트 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 부가적 특징 및 이점은 이하의 상세한 설명과 특허청구범위에 자세하게 기재되어 있다. 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 본 발명의 정신과 범위로부터 벗어남 없이 다수의 변형 및 변이가 행해질 수 있다. 상술한 일반적 기재 및 하기 상세한 설명, 특허청구의 범위 뿐만아니라 첨부한 도면은 예시적 목적으로 제시된 것이며, 본 발명의 다양한 실시양태의 설명을 제공하기 위한 것임을 이해해야 한다. 본 명세서에 개시된 특정 실시양태는 예시를 위해 제공된 것이고 어떠한 의미로든 제한을 의미하지 않는다.
실시양태의 설명
본 명세서 및 첨부한 특허청구범위의 목적을 위하여, 특별히 다르게 나타내지 않는 한, 성분의 양 및 물질의 % 비율, 반응 조건 및 기타 명세서 및 특허청구 범위에서 사용된 임의의 수치에 관한 모든 숫자는 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해된다.
따라서, 상반되게 나타내지 않는 한, 이하의 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 숫자 변수는 본 발명에 의해 달성하고자 하는 소망하는 특성에 따라 다양하게 달라질 수 있는 대략적인 값을 의미한다. 적어도, 특허청구범위의 등가 원칙의 적용을 제한하려는 의도가 아니라, 각 숫자 변수는 보고된 디지트 수 측면에서 적어도 이해되고 통상의 반올림 수법을 적용하여 이해된다.
본 발명의 광범위를 설명하는 숫자 범위 및 변수는 대략적인 수임에도 불구하고, 특정 예에서 개시된 숫자는 가능한한 정확한 것으로 본다. 그러나 어떤 숫자 값은 각 시험 측정에서 발견되는 표준 편차에 기인하는 특정의 오차를 필수적으로 가질 것이다. 또한, 본 명세서에 개시된 모든 범위는 본 명세서에 포함되는 모든 하부범위도 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, "1 내지 10" 범위는 최소 1에서 최대 10 사이의(및 비롯한) 모든 가능한 하부범위를 포함하며, 즉 1과 동일하거나 그보다 큰 최소값과 10과 동일하거나 10 미만의 최대값, 예를 들어 5.5 내지 10의 모든 하부 범위를 포함한다.
본 발명을 더욱 자세하게 설명하기 전에, 다수의 용어를 정의한다. 이들 용어의 사용은 본 발명의 범위를 제한하지 않지만, 본 발명의 기재를 용이하게 하기 위해서 제공된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나", "하나의", 및 "그"는 내용이 분명히 다르게 나타내지 않는 한 복수의 수도 포함한다.
"분해성 사슬 전달"은 증식성 라디칼이 매우 반응성일 때 생기지만, 단량체에 의한 사슬 전달 생성물은 반응성이 아니다(안정한 라디칼 형성). (참조: 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 "Principles of Polymerization", George Odian, John Wiley-Sons Inc., New York, 1991). 이 표면 사슬 전달은 현저하게 감소된 중합반응 속도 및 중합체 분자량을 초래한다. 이것은 저분자량 표면 변형이 필요할 때 그라프팅에서 유리할 수 있다(참조: 예를 들어, 이레에게 각각 허여된 미국 특허번호 7,048,858호 및 7,060,187호). 그러나, 더 반응성인 단량체가 사용되면, 상기 표면 반응성 기는 중합체가 그자리에서 형성될 때 "중합체를 그라프팅"하는데 있어서 더 긴 연장제 또는 촉수에 대한 사슬종료 앵커로 된다. 이들은 개선된 결합능과 변형된 선택성을 갖는 자연히 생성된 연장제를 초래한다. 이 방법은 아크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴레이트, 및 다양한 범위의 기재 또는 베이스 물질(중합체 비드, 아가로오스 비드 및 세라믹 비드와 같은)과 같은 단량체 상에 다양한 범위에 의해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 수 있는 디른 "다공성 기재" 또는 "베이스 매트릭스"는 비제한적으로 확산성 기공 및 알릴 표면 반응성 기를 갖는 물질을 포함한다. 사용될 수 있는 다공성 기재 또는 베이스 매트릭스에 대한 바람직한 물질은 다당류, 합성 중합체, 아가로오스, 셀룰로오스, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 알릴 메타크릴레이트를 함유하는 폴리스티렌 등 및 상술한 것의 하이브리드 또는 조합을 포함한다. 가장 바람직한 물질은 알릴 표면 반응성 기에 의해 변형된 아가로오스, 알릴 표면 반응성 기를 함유하는 폴리메틸아크릴레이트 물질을 포함한다. 알릴 표면 반응성기에 의해 변형된 폴리메틸아크릴레이트 물질, 및 알릴 메타크릴레이트를 혼입하는 폴리메타크릴레이트 물질을 포함한다.
본 명세서에 사용될 수 있는 "작용기"의 예는 비제한적으로 이온 교환기, 생물친화성 기, 소수성 기, 친티오(thiophilic) 상호작용 기, 킬레이트 또는 킬레이팅 기, 표적 화합물과 소위 파이-파이 상호결합을 갖는 기, 수소 결합 기, 및 친수성 기를 포함한다.
본 명세서에 사용될 수 있는 "리간드"의 예는 비제한적으로 이온 교환기, 소수성 상호작용 기, 친수성 상호작용 기, 친티오 상호작용 기, 금속 친화성 기, 친화성 기, 생물친화성 기, 및 혼합 모드 기(상술한 것의 조합)을 포함한다. 본 명세서에 사용될 수 있는 일부 바람직한 리간드는 비제한적으로 설포프로필, 설폰산과 같은 강한 양이온 교환기; 트리메틸암모늄 클로라이드와 같은 강한 음이온 교환기; 카복시산과 같은 약 양이온 교환기; N,N 디에틸아미노 또는 DEAE와 같은 약 음이온 교환기; 페닐, 부틸, 프로필, 헥실과 같은 소수성 상호작용 기; 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 L과 같은 친화성 기를 포함한다.
본 명세서에 사용될 수 있는 "라디칼 중합반응 개시제"의 예는 비제한적으로 암모늄 퍼설페이트, 포타슘 퍼설페이트, 아조비스(4-시아노발레르산, 이르가큐어 ® 2959(Ciba-Geigy, Hawthorn, N.Y.), 2,2'-아조비스(2-아미디노-프로판)하이드로클로라이드 등을 포함한다. 반응으로의 그라프팅은 당업계에 공지된 방법, 바람직하게는 열개시(가열) 또는 UV 조사에 의해 개시될 수 있다.
본 명세서에 사용될 수 있는 "표면 반응성 불포화 기 또는 작용기"의 예는 비제한적으로 알릴 기를 포함한다. 바람직한 표면 반응성 불포화 작용기는 구조식 R-0-CH2-CH=CH2을 갖는 알릴 기를 포함하며, 이때 R은 다공성 기재 표면 또는 표면과 알릴 기 사이의 링커이다.
본 명세서에 사용될 수 있는 "링커"의 예는 비제한적으로 라디칼 중합반응 동안 고 수준의 분해성 사슬 전달을 거친 기를 함유하는 분자를 포함한다. 본 명세서에 사용될 수 있는 링커는 에테르 결합을 함유하는 화합물, 메타크릴레이트, 아미드, 아크릴아미드, 에폭사이드, 아민 등과 같이, 가성 용액에 대하여 상당한 안정성을 갖는 분자 또는 작용기를 포함한다. 부탄디올 디글리시딜 에테르, 에피클로로히드린, 폴리에틸렌디올 디글리시딜 에테르, 에틸렌디올 디글리시딜 에테르와 같은 바람직한 링커는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 알릴 글리시딜 에테르와 같은 알릴 함유 기에 의해 더욱 변형될 수 있다. 바람직한 링커는 알릴 클로로아세테이트, 알릴 클로라이드, 알릴(클로로)디메틸실란, 알릴 글리시딜 에테르, 알릴 브로마이드 및 알릴 메타크릴레이트를 포함한다. 가장 바람직한 링커는 알릴 글리시딜 에테르, 알릴 브로마이드 및 알릴 메타크릴레이트를 포함한다.
본 명세서에 사용될 수 있는 "그라프팅 단량체" 또는 "그라프팅 단량체의 혼합물"의 예는 비제한적으로 메타크릴레이트, 아크릴레이트, 및 아크릴아미드를 포함한다. 가장 바람직한 그라프팅 단량체는 비제한적으로 아크릴산, 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산, [3-(메타크릴로일아미노) 프로필] 트리메틸암모늄 클로라이드, 2-아크릴아미도-글리콜산, 이타콘산 또는 에틸 비닐 케톤, 글리시딜 메타크릴레이트, N,N-디메틸아크릴아미드, 아크릴아미드, 히드록시프로필 메타크릴레이트, N-페닐아크릴아미드, 히드록실프로필 아크릴아미드, 및 이들의 조합을 포함한다.
전형적인 그라프팅 수법에서, 잔류 불포화는 다른 중합반응에 대한 반응성을 유지하거나 또는 표면 개시가 조심스럽게 제어되는 조건을 필요로 한다. 예를 들어, 아크릴레이트 작용기를 표면에 부착하는 것은 표면과 반응하는 중합체 사슬이 성장하게 한 다음 계속 성장하게 하여, 표면에 대한 연장제 부착을 필수적으로 무작위로 생기게 한다. 예를 들어, 중합화 사슬은 그의 사슬 성장의 임의 지점 동안 표면 기에서 반응하여 계속 성장함으로써, 연장제를 따라 표면 반응성 기를 무작위로 혼입할 수 있다. 히드록실 기의 금속 산화와 같은 표면 개시의 경우에서, 상기 용액 조건은 금속의 활성 산화 상태를 유지하고 또 표면 활성화 반응 중지를 피하도록 제어되어야 한다.
본 명세서에서 개시된 그라프팅 방법에서, 이들 2개의 단점이 극복된다. 중합체 연장제의 중합반응은 덜 제한적인 조건하의 용액에서 모의되며 또 다공성 기재의 표면에 대한 부착은 표면 반응성 기의 분해성 사슬 전달이 억제제처럼 작용하여 중합체 사슬 성장을 끝내므로 말단이 될 가능성이 있다(참조: 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 "Principles of Polymerization", George Odian, John Wiley-Sons Inc., New York, 1991).
분해성 사슬 전달을 거치는 알릴 표면 반응성기에 대한 그라프팅은 모노리쓰, 셀룰로오스 섬유 및 실리카 입자에 대해 알려져 있다. 그러나, 모노리쓰, 셀룰로오스 섬유 및 실리카 입자에 대한 공지된 변형은 비드 기제 기술에서 발견되는 확산성 기공에 비하여 훨씬 더 큰 대류성 기공(>1 ㎛)을 토대로 달성되었다. 상기 셀룰로오스 및 실리카 입자를 변형한 다음 큰 대류성 기공을 갖는 다공성 구조로 만들수 있다.
다공성 구조 형성 이전에 연장제를 사용한 물질의 변형은 유리하지도 않고 비드 기제 기술에 적용될 수 없는데, 이는 내부 구조/표면 영역의 표면에서만 연장제를 갖는 것이 바람직하기 때문이다(리간드는 표적 분자와 상호작용할 수 있다). 이들 변형된 입자로부터 다공성 구조의 형성에 의한 입자(셀룰로오스 및 실리카와 같은)의 변형은 막혀진 대류성 기공 및 연장제의 무작위 분포를 초래하므로, 제한되지만 현저히 감소된 리간드 대 표적 분자 상호작용을 제공한다.
부가적으로, 그라프팅된 연장제를 괴상 다공성 구조(즉, 비드 형성 이전의 그라프팅 연장제) 상으로 혼입하는 것은 물질의 기계적 특성 및 기공 형태를 상충하거나 변경시킬 수 있다. 모노리쓰 변형은 마이크로미터 크기 기공에서 기공 제한(유동의 제한)을 초래한다. 이들 관찰된 기공 제한은 제공된 더 작은 확산성 모노리쓰 기공을 완전히 채우거나 또는 막는 중합체 연장제 변형을 갖는 모노리쓰를 제시한다.
앞에서 예시한 참고문헌의 흐제르텐은 중합화된 폴리아크릴레이트의 그라프팅에 의해 완전히 막힌 기공을 갖는 아가로오스 매트릭스를 개시하므로, 기공에서 단백질 확산이 제거되어, 분석적 HPLC와 같은 비-다공성 비드 적용을 위한 물질의 사용을 가능하게 한다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 방법에서, 결합능을 개선시키는 표면 반응성 기 밀도, 개시제 농도 및 단량체 농도의 조합은 선택성을 변경할 수 있고 또 새로운 분리 수지를 생성한다.
실시예
실시예 1A. 표면 반응성 기 및 양이온 교환 연장제를 사용한 다당류 수지의 변형
아가로오스 비드(Sepharose 4B)(GE Healthcare, Piscataway N.J.)는 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Porath and Fornstedt, "Group Fractionation of Plasma Proteins on Dipolar Ion Exchangers",(Journal of Chromatography, vol. 51, 1970, pp. 479-489)의 지시내용에 따라 에피클로로히드린을 사용하여 가교시켰다. 상기 비드를 다음 방법에 따라 표면 반응성 기인 알릴 글리시딜 에테르(AGE)에 의해 변형시켰다: 항아리에서 10 mL의 비드를 18g의 8M NaOH, 4g의 AGE, 3g의 Na2S04에 부가한 다음 50℃에서 철야로 교반하였다. 이 비드를 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하고 여과하여 습윤 케이크를 얻었다. 상기 습윤 케이크를 플라스틱 백 내에 2.4 g의 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산, 17.3 g의 Milli-Q® 물, 0.2 g의 N,N-디메틸아크릴아미드 및 0.12 g의 Irgacure® 2959(CIBA)를 함유하는 20 mL 용액에 부가하였다. 상기 플라스틱 백을 2개의 폴리에틸렌 시트 사이에 두었다. 폴리에틸렌 샌드위치를 테이핑처리하여, "H" 벌브를 구비한 Fusion Systems UV 노출 랩 유닛(exposure lab unit)을 통하여 수송 유닛으로 보내었다. 어셈블리가 상기 UV 유닛을 얼마나 빠르게 움직이가에 의해 노출 시간을 조절하였다. 이 실시예에서, 어셈블리는 UV 챔버를 통하여 15 피트/분으로 이동하였다. 플라스틱 백을 제거하기 전에 어셈블리를 5분간 방치하고 또 비드를 여과하며 또 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 실시예 6에 따라 측정된 ㅍ평형 단백질 결합능을 표 1에 나타낸다.
실시예 1B. 표면 반응성 기 및 양이온 교환 연장제를 사용하지 않은 다당류 수지의 변형
아가로오스 비드(Sepharose 4B)(GE Healthcare, Piscataway N.J.)는 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Porath and Fornstedt, "Group Fractionation of Plasma Proteins on Dipolar Ion Exchangers",(Journal of Chromatography, vol. 51, 1970, pp. 479-489)의 지시내용에 따라 에피클로로히드린을 사용하여 가교시켰다.
상기 비드를 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하고 또 여과하여 습윤 케이크를 얻었다. 이 습윤 케이크를 플라스틱 백 내에 2.4 g의 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산, 17.3 g의 Milli-Q® 물, 0.2 g의 N,N-디메틸아크릴아미드 및 0.12 g의 Irgacure® 2959(CIBA)를 함유하는 20 mL 용액에 부가하였다. 이 플라스틱 백을 폴리에틸렌 시트 사이에 놓았다. 폴리에틸렌 샌드위치를 테이핑처리하여, "H" 벌브를 구비한 Fusion Systems UV 노출 랩 유닛(exposure lab unit)을 통하여 수송 유닛으로 보내었다. 어셈블리가 상기 UV 유닛을 얼마나 빠르게 움직이가에 의해 노출 시간을 조절하였다. 이 실시예에서, 어셈블리는 UV 챔버를 통하여 15 피트/분으로 이동하였다. 플라스틱 백을 제거하기 전에 어셈블리를 5분간 방치하고 또 비드를 여과하며 또 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 실시예 6에 따라 측정된 평형 단백질 결합능을 표 1에 나타낸다.
실시예 1C. 표면 반응성 기 및 음이온 교환 연장제를 사용한 다당류 수지의 변형
아가로오스 비드(Sepharose 4B)(GE Healthcare, Piscataway N.J.)는 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Porath and Fornstedt, "Group Fractionation of Plasma Proteins on Dipolar Ion Exchangers",(Journal of Chromatography, vol. 51, 1970, pp. 479-489)의 지시내용에 따라 에피클로로히드린을 사용하여 가교시켰다. 상기 비드를 다음 방법에 따라 표면 반응성 기인 알릴 글리시딜 에테르(AGE)에 의해 변형시켰다: 항아리에서 10 mL의 비드를 18g의 8M NaOH, 12g의 AGE, 3g의 Na2S04에 부가한 다음 50℃에서 철야로 교반하였다. 이 비드를 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하고 여과하여 습윤 케이크를 얻었다. 상기 습윤 케이크를 6 g의 75%(3-아크릴아미도프로필)트리메틸암모늄 클로라이드 용액, 13.6 g의 Milli-Q® 물 및 0.2 g의 암모늄 퍼설페이트를 함유하는 용액에 부가하였다. 이 혼합물을 65℃에서 17시간 동안 교반하였다. 이 비드를 500mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 실시예 6의 방법에 따라 평형 단백질 결합능을 표 1에 나타낸다.
실시예 1D. 저 이온 강도에서 최적 결합을 갖는 표면 반응성 기 및 양이온 교환 연장제를 사용한 다당류 수지의 변형
아가로오스 비드(Sepharose 4B)(GE Healthcare, Piscataway N.J.)는 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Porath and Fornstedt, "Group Fractionation of Plasma Proteins on Dipolar Ion Exchangers",(Journal of Chromatography, vol. 51, 1970, pp. 479-489)의 지시내용에 따라 에피클로로히드린을 사용하여 가교시켰다. 상기 비드를 다음 방법에 따라 표면 반응성 기인 알릴 글리시딜 에테르(AGE)에 의해 변형시켰다: 항아리에서 10 mL의 비드를 18g의 1M NaOH, 2.4g의 AGE, 3g의 Na2S04에 부가한 다음 50℃에서 철야로 교반하였다. 상기 비드를 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하고 또 여과하여 습윤 케이크를 얻었다. 이 습윤 케이크를 항아리 내에서 1 g의 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산, 18.8g의 Milli-Q® 물, 0.15 g의 N,N-디메틸아크릴아미드 및 0.08g의 암모늄 퍼설페이트를 함유하는 20mL 용액에 부가하였다. 상기 항아리를 교반하고 또 1시간 동안 65℃로 가열하였다. 상기 비드를 여과하고 또 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 실시예 6의 방법에 따라 측정된 평형 단백질 결합능을 표 1에 나타낸다.
실시예 1E. 고 이온 강도에서 최적 결합을 갖는 표면 반응성 기 및 양이온 교환 연장제를 사용한 다당류의 변형
아가로오스 비드(Sepharose 4B)(GE Healthcare, Piscataway N.J.)는 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Porath and Fornstedt, "Group Fractionation of Plasma Proteins on Dipolar Ion Exchangers",(Journal of Chromatography, vol. 51, 1970, pp. 479-489)의 지시내용에 따라 에피클로로히드린을 사용하여 가교시켰다. 상기 비드를 다음 방법에 따라 표면 반응성 기인 알릴 글리시딜 에테르(AGE)에 의해 변형시켰다: 항아리에서 10 mL의 비드를 18g의 1M NaOH, 12g의 AGE, 3g의 Na2S04 를 부가한 다음 50℃에서 철야로 교반하였다. 상기 비드를 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하고 또 여과하여 습윤 케이크를 얻었다. 이 습윤 케이크를 항아리 내에서 2 g의 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산, 17.8g의 Milli-Q® 물, 0.2 g의 N,N-디메틸아크릴아미드 및 0.08g의 암모늄 퍼설페이트를 함유하는 20 mL 용액에 부가하였다. 상기 항아리를 교반하고 또 1시간 동안 65℃로 가열하였다. 상기 비드를 여과하고 또 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 실시예 6의 방법에 따라 측정된 평형 단백질 결합능을 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
실시예 2A. 낮은 이온 강도에서 최적 결합을 갖는 표면 반응성 기 및 양이온 교환 연장제를 사용한 합성 중합체의 변형
폴리메타크릴레이트 비드, 50mL,(HW-65, 45㎛, TOSOH Bioscience)를 25℃에서 2시간 동안 1M NaOH에 침지시킨 다음 500mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 상기 비드를 표면 반응성기인, 알릴 글리시딜 에테르(AGE)를 사용하여 하기 방법에 따라 변형시켰다: 항아리내에, 15 mL의 비드, 18 g의 1M NaOH, 2.4 g의 AGE, 3g의 Na2SO4를 부가하고 또 50℃에서 철야로 교반하였다. 상기 비드를 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하고 또 여과하여 습윤 케이크를 얻었다. 10 mL의 습윤 케이크를 항아리 내에서 1.2 g의 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산, 0.08g의 암모늄 퍼설페이트, 18.5g의 Milli-Q® 물 및 0.24g의 N,N-디메틸아크릴아미드를 함유하는 용액에 부가하였다. 상기 항아리를 교반하고 또 1시간 동안 65℃로 가열하였다. 상기 비드를 여과하고 또 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 실시예 6의 방법에 따라 측정된 평형 단백질 결합능은 표 2에 나타낸다.
실시예 2B. 높은 이온 강도에서 최적 결합을 갖는 표면 반응성 기 및 양이온 교환 연장제를 사용한 합성 중합체의 변형
폴리메타크릴레이트 비드, 50mL,(HW-65, 45㎛, TOSOH Bioscience)를 25℃에서 2시간 동안 1M NaOH에 침지시킨 다음 500mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 상기 비드를 표면 반응성기인, 알릴 글리시딜 에테르(AGE)를 사용하여 하기 방법에 따라 변형시켰다: 항아리내에, 15 mL의 비드, 18g의 1M NaOH, 2.4g AGE, 3g Na2S04를 부가하고 또 50℃에서 철야로 교반하였다. 이 비드를 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하고 여과하여 습윤 케이크를 얻었다. 이어 10mL의 습윤 케이크를 2.8 g의 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산, 0.08g의 암모늄 퍼설페이트, 17g의 Milli-Q® 물 및 0.12g의 N,N-디메틸아크릴아미드를 함유하는 용액에 부가하였다. 상기 항아리를 교반하고 또 1시간 동안 65℃로 가열하였다. 상기 비드를 여과하고 또 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 실시예 6의 방법에 따라 평형 단백질 결합능을 표 2에 나타낸다.
실시예 2C. 양이온 교환 연장제를 사용하지 않은 합성 중합체 수지의 변형
폴리메타크릴레이트 비드, 50mL,(HW-65, 45㎛, TOSOH Bioscience)를 25℃에서 2시간 동안 1M NaOH에 침지시킨 다음 500mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 상기 비드를 표면 반응성기인, 알릴 글리시딜 에테르(AGE)를 사용하여 하기 방법에 따라 변형시켰다: 항아리내에, 15 mL의 비드, 18g의 1M NaOH, 2.4g AGE, 3g Na2S04를 부가하고 또 50℃에서 철야로 교반하였다. 이 비드를 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하고 여과하여 습윤 케이크를 얻었다. 표면 반응성 기는 하기 방법에 의해 표준 양이온 교환 작용기로 전환시켰다: 항아리 내에서, 6 g 비드, 4.7 mL의 Milli-Q® 물, 0.8 g의 50%wt NaOH 및 2.3 g의 나트륨 메타-비설파이트를 부가하고 또 실온에서 철야로 교반하였다. 상기 비드를 3 x 500 mL의 Milli-Q® 품질의 물에 의해 세척하였다. 이 과정은 연장제 없는 제어 수지를 생성하며, 상기 단백질은 수지의 표면에 결합할 수 있지만, 연장제나 그라프팅된 사슬은 없었다. 실시예 6의 방법에 따라 측정된 평형 단백질 결합능을 표 2에 나타낸다.
실시예 2D. 표면 반응성 기 및 음이온 교환 연장제를 사용한 합성 중합체 수지의 변형
폴리메타크릴레이트 비드, 20mL,(HW-65, 45um, TOSOH Bioscience)를 25℃에서 2시간 동안 1M NaOH에 침지시킨 다음 500mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 상기 비드를 표면 반응성기인, 알릴 글리시딜 에테르(AGE)를 사용하여 하기 방법에 따라 변형시켰다: 항아리내에, 15 mL의 비드, 18g의 1M NaOH, 2.4g AGE, 3g Na2S04를 부가하고 또 50℃에서 철야로 교반하였다. 이 비드를 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하고 여과하여 습윤 케이크를 얻었다. 10mL의 습윤 케이크를 항아리내에 6 g의 75% (3-아크릴아미도프로필)트리메틸암모늄 클로라이드 용액, 0.12 g의 암모늄 퍼설페이트 및 13.6 g의 Milli-Q® 물을 함유하는 용액에 부가하였다. 상기 항아리를 교반하고 또 1시간 동안 65℃로 가열하였다. 상기 비드를 여과하고 또 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 실시예 6의 방법에 따라 측정한 평형 단백질 결합능을 표 2에 나타낸다.
실시예 2E. 표면 반응성 기를 사용하지 않고 또 연장제를 사용하지 않고 합성 중합체를 변형하여 합성 중합체 수지의 생성
폴리메타크릴레이트 비드, 10mL,(HW-65, 45um, TOSOH Bioscience)를 25℃에서 2시간 동안 1M NaOH에 침지시킨 다음 500mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하고 또 여과하여 습윤 케이크를 얻었다. 이 습윤 케이크를 항아리 내에 6 g의 75% (3-아크릴아미도프로필)트리메틸암모늄 클로라이드 용액, 0.12 g의 암모늄 퍼설페이트 및 13.6 g의 Milli-Q® 물을 함유하는 용액에 부가하였다. 상기 항아리를 교반하고 또 1시간 동안 65℃로 가열하였다. 상기 비드를 여과하고 또 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 이 과정은 수지의 표면에 대한 단백질 결합이 가능한 연장제 제어 수지를 생성하였지만, 연장제 또는 그라프팅된 사슬은 없었다. 실시예 6의 방법에 따라 측정한 평형 단백질 결합능을 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
실시예 2A-2D는 상기 방법이 실시예 1에서 폴리메타크릴레이트 대 아가로오스와 같이 1 이상의 유형의 베이스 매트릭스에 그 능력에서 유사한 개선을 이루면서 적용될 수 있음을 나타낸다. 양이온 및 음이온 교환 연장의 경우, 알릴 표면 반응성 기에 대한 연장제 그라프팅에 대해 2-3배 더 높은 성능이 관찰되었다. 또한, 실시예 1D 및 1E에 대한 능력은 "종래기술의" 연장제 변형된 수지인 Fractogel® S보다 더 높았다. 이는 IgG와 같은 대형 단백질의 확산이 그라프팅된 연장제에 의해서도 본 발명에 의해 가능하며 또 상기 성능은 종래 기술에 비하여 더 개선된다.
실시예 2F. 표면 반응성 기 및 소수성 상호작용 연장제를 사용한 합성 중합체 수지의 변형
폴리메타크릴레이트 비드, 10mL,(HW-65, 45um, TOSOH Bioscience)를 25℃에서 2시간 동안 1M NaOH에 침지시킨 다음 500mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 비드를 표면 반응성 기, 알릴 글리시딜 에테르(AGE)를 사용하요 하기 방법에 따라 변형시켰다: 항아리내에서 10 g 비드, 18g의 2M NaOH, 12g AGE, 3g Na2S04를 부가하고 또 50℃에서 철야로 교반하였다. 상기 비드를 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하고 또 여과하여 습윤 케이크를 얻었다. 5 g의 습윤 케이크를 0.2 g의 N-페닐아크릴아미드, 0.08g의 암모늄 퍼설페이트, 3.4g의 N,N-디메틸 아세트아미드(DMAC), 3.4g의 헥실렌 글리콜 및 3g의 Milli-Q® 물을 함유하는 용액에 부가하였다. 상기 항아리를 교반하고 또 17시간 동안 80℃로 가열하였다. 상기 비드를 여과하고 또 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 실시예 6의 방법으로 측정한 평형 단백질 결합(IgG) 능력은 33 g/L인 것으로 밝혀졌다.
실시예 2G. 표면 반응성 기 및 소수성 상호작용 연장제를 사용한 합성 중합체 수지의 변형
폴리메타크릴레이트 비드, 50mL,(HW-65, 45um, TOSOH Bioscience)를 25℃에서 2시간 동안 1M NaOH에 침지시킨 다음 500mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 비드를 표면 반응성 기, 알릴 글리시딜 에테르(AGE)를 사용하는 하기 방법에 따라 변형시켰다: 항아리내에서 10 g 비드, 18g의 8M NaOH, 12g AGE, 3g Na2S04를 부가하고 또 50℃에서 철야로 교반하였다. 상기 비드를 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하고 또 여과하여 습윤 케이크를 얻었다. 5 g의 습윤 케이크를 항아리내에서 0.2 g의 N-페닐아크릴아미드, 0.08g의 암모늄 퍼설페이트, 3.4g의 N,N-디메틸 아세트아미드(DMAC), 3.4g의 헥실렌 글리콜, 및 3g의 Milli-Q® 물을 부가하였다. 이 항아리를 교반하고 또 17시간 동안 80℃로 가열하였다. 상기 비드를 여과하고 또 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다. 실시예 6의 방법에 따라 측정한 평형 단백질 결합(IgG) 능력은 40 g/L인 것으로 밝혀졌다.
실시예 3A. 독특한 화학 환경 및 2개의 뚜렷한 기공 크기 영역을 갖는 비대칭 아가로오스 비드
내부 구조의 제조
비대칭 아가로오스 비드는 US 특허출원 공개 번호 2007/0212540호에 개시된 방법에 따라 제조하였다: 1,000mL의 15% 아가로오스 용액(D-5 아가로오스, Hispanagar 제조)를 일정한 교반하, 80℃의 제1 오일조에서 120mL의 Span 80 유화제를 함유하는 2,000mL의 무기오일에 부가하여 오일 상이 연속적인 에멀젼을 얻었다. 이 에멀젼을 3L/분의 유동 속도로 0.5 인치(12.7 mm) 직경, 6 인치(152.4 mm) 길이 Kenics 정적 혼합기(KMR-SAN-12)를 통하여 5℃의 무기오일의 제2 배쓰에 펌핑하였다. 최대 입자 직경 200 ㎛의 구형의 균질 아가로오스 비드를 얻었다. 상기 비드를 침강시키고, 물, 에탄올 및 이어 물에 의해 세척한 다음 체질하여 75 내지 125 ㎛의 비드 크기 범위를 얻었다. 상기 비드를 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Porath et al., "Agar derivatives for Chromatography, 전기영동 and gel bound enzymes. Desulphated and reduced crosslinked agar and Agarose in spherical bead form",(Journal of Chromatography, vol. 60, 1971, pp. 167-177)에 개시된 방법에 따라 가교시켰다. 상기 비드를 알릴 글리시딜 에테르(AGE)에 의해 변형시켰다. 항아리내에서, 120 g 비드, 150 ml의 8M NaOH, 30 g 황산 나트륨 및 100 g의 AGE를 부가하고 또 45℃에서 철야로 교반하였다. 상기 비드를 3 x 500 mL의 Milli-Q® 품질의 물에 의해 세척하였다. 선택성 시험 결과를 표 3에 나타낸다.
실시예 3B. 독특한 화학 환경과 2개의 뚜렷한 기공 크기 영역을 갖는 비대칭 아가로오스 비드 : 표준 양이온 교환 작용기를 갖는 내부 구조
실시예 3A에서 제조된 비드의 일부를 변형시켜 표준 양이온 교환 물질을 생성하였다. 이 비드를 나트륨 메타-비설파이트에 의해 변형시켰다. 항아리 내에서, 60 g의 비드, 47 ml의 Milli-Q® 물, 7.9g의 50%wt NaOH 및 23.4 g의 나트륨 메타-비설파이트를 부가하고 또 실온에서 철야로 교반하였다. 상기 비드를 3 x 500 ml의 Milli-Q® 품질의 물에 의해 세척하였다.
상기 비드를 하기 방법에 따라 6% 아가로오스에 의해 코팅하였다: 50 ml의 비드를 300 ml의 6% 아가로오스 용액(D-5 아가로오스, Hispanagar 제조)에 부가하여 슬러리를 얻었다. 아가로오스-비드 혼합물을 일정한 교반하, 90℃의 1000 ml의 무기오일에 부가하여 오일 상이 연속적인 에멀젼을 얻었다. 이 에멀젼을 3L/분의 유동 속도로 0.5 인치(12.7 mm) 직경, 6 인치(152.4 mm) 길이 Kenics 정적 혼합기(KMR-SAN-12)를 통하여 5℃의 무기오일에 펌핑하였다. 생성한 아가로오스 비드는 10 ㎛의 추정된 외부 층 두께를 가졌고 또 비드 집단은 주로 단일 코어형(single-cored)이었다(>50%). 상기 비드를 침강시키고, 물, 에탄올 및 이어 물에 의해 세척한 다음 체질하여 75 내지 125 ㎛의 비드 크기 범위를 얻었다. 상기 비드를 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Porath et al., "Agar derivatives for Chromatography, 전기영동 and gel bound enzymes. Desulphated and reduced crosslinked agar and Agarose in spherical bead form",(Journal of Chromatography, vol. 60, 1971, pp. 167-177)에 개시된 방법에 따라 가교시켰다. 상기 비드를 3 x 500 mL의 Milli-Q® 품질의 물에 의해 세척하였다.
상기 비드를 브로모프로판 설폰산(BPSA)에 의해 변형시켰다. 항아리 내에서, 10 g의 비드, 30 ml의 5M NaOH, 7.2 g BPSA를 부가하고 또 50℃에서 철야로 교반하였다. 상기 비드를 500 mL의 Milli-Q® 품질의 물에 의해 세척한 다음 20% 에탄올에 저장하였다. 선택성 시험 결과를 하기 표 3에 나타낸다.
실시예 3C. 독특한 화학 환경과 2개의 뚜렷한 기공 크기 영역을 갖는 비대칭 아가로오스 비드 : 본 발명의 방법에 의한 내부 구조; 개선된 결합 강도/선택성을 갖는 양이온 교환 연장제
실시예 3A에서 제조된 비드의 일부를 변형시켜 표준 양이온 교환 물질을 생성하였다. 이 비드를 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하고 또 여과하여 습윤 케이크를 얻었다. 이 습윤 케이크(10mL)를 플라스틱 백 내에서 2.4 g의 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산, 17.3 g의 Milli-Q® 물, 0.2 g의 N,N-디메틸아크릴아미드 및 0.12 g의 Irgacure® 2959(CIBA)를 함유하는 20 mL 용액에 부가하였다. 상기 플라스틱 백을 2개의 폴리에틸렌 시트 사이에 두었다. 상기 폴리에틸렌 샌드위치를 테이핑하여 "H" 벌브를 구비한 Fusion Systems UV 노출 랩 유닛(exposure lab unit)을 통하여 수송 유닛으로 보내었다. 어셈블리가 상기 UV 유닛을 얼마나 빠르게 움직이는가에 의해 노출 시간을 조절하였다. 이 실시예에서, 어셈블리는 UV 챔버를 통하여 15 피트/분으로 이동하였다. 백을 제거하기 전에 상기 어셈블리를 5분간 방치하고 또 비드를 여과하며 또 500 mL의 Milli-Q® 물에 의해 세척하였다.
상기 비드를 하기 방법에 따라서 6% 아가로오스에 의해 코팅하였다: 50 mL의 비드를 300 mL의 6% 아가로오스 용액(D-5 아가로오스, Hispanagar 제조)과 혼합하여 슬러리를 얻었다. 상기 아가로오스-비드 혼합물을 일정한 교반하, 90℃의 1000 ml의 무기 오일에 부가하여 오일상이 연속적인 에멀젼을 얻었다. 이 에멀젼을 3L/분의 유동 속도로 0.5 인치(12.7 mm) 직경, 6 인치(152.4 mm) 길이 Kenics 정적 혼합기(KMR-SAN-12)를 통하여 5℃의 무기오일에 펌핑하였다. 생성한 아가로오스 비드는 10 ㎛의 추정된 외부 층 두께를 가졌고 또 비드 집단은 주로 단일 코어형이었다(>50%). 상기 비드를 침강시키고, 물, 에탄올 및 이어 물에 의해 세척한 다음 체질하여 75 내지 125 ㎛의 비드 크기 범위를 얻었다. 상기 비드를 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Porath et al., "Agar derivatives for Chromatogaraphy, Electrophoresis and gel bound enzymes. Desulphated and reduced crosslinked agar and Agarose in spherical bead form",(Journal of Chromatography, vol. 60, 1971 , pp. 167-177에 기재된 방법에 따라 가교시켰다. 상기 비드를 3 x 500 ml의 Milli-Q® 품질 물에 의해 세척하였다.
상기 비드를 브로모프로판 설폰산(BPSA)에 의해 변형시켰다. 항아리 내에서, 10g의 비드, 30 ml의 5M NaOH, 7.2 g BPSA를 부가하고 또 50℃에서 철야로 교반하였다. 상기 비드를 500 ml의 Milli-Q® 품질 물에 의해 세척한 다음 20% 에탄올에 저장하였다. 선택성 시험 결과를 표 3에 나타낸다.
실시예 3D. 독특한 화학 환경 및 2개의 뚜렷한 기공 크기 영역을 갖는 비대칭 아가로오스 비드 : 본 발명의 방법에 의한 내부 구조; 개선된 결합 강도/선택성을 갖는 양이온 교환 연장제
실시예 3A의 비드를 다음과 같은 부가적인 최종 변형 단계와 더불어 실시예 3C와 동일하게 변형시켰다. 비드를 브로모프로판 설폰산(BPSA)으로 변형시켰다. 항아리 내에서, 10 g의 비드, 30 ml의 5M NaOH, 7.2 g BPSA를 부가하고 또 50℃에서 철야로 교반하였다. 상기 비드를 500 mL의 Milli-Q® 품질 물로 세척한 다음 20% 에탄올에 저장하였다. 선택성 시험 결과를 표 3에 나타낸다.
실시예 3E. 독특한 화학 환경 및 2개의 뚜렷한 기공 크기 영역을 갖는 비대칭 아가로오스 비드 : 본 발명에 의한 내부 구조; 개선된 결합 강도/선택성을 갖는 양이온 교환 연장제
실시예 3A의 비드를 다음과 같은 부가적인 최종 변형 단계와 더불어 실시예 3C와 동일하게 변형시켰다. 비드를 브로모프로판 설폰산(BPSA)으로 변형시켰다. 항아리 내에서, 10 g의 비드, 30 ml의 5M NaOH, 7.2 g BPSA를 부가하고 또 50℃에서 철야로 교반하였다. 상기 비드를 500 ml의 Milli-Q® 품질 물로 세척한 다음 20% 에탄올에 저장하였다. 선택성 시험 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
실시예 3C-3E는 그의 내부 비드 구조가 일련의 표준 양이온 교환 방법을 통하여 변형된 외부 구조를 갖는 본 발명의 방법에 따라 변형된 비대칭 아가로오스 비드를 개시한다. 대조적으로, 실시예 3B는 표준 이온 교환 방법에 의해 변형되는 내부 및 외부 구조를 갖는 비대칭 아가로오스 비드를 개시한다.
표 3은 염화 나트륨 구배 용출 동안 단백질을 용출하는데 필요한 컬럼 부피(CV) 면에서 IgG와 라이소자임(lysozyme) 사이의 분리를 나타낸다. 실시예 3B 및 시판되는 아가로오스 수지인 SP-세파로오스 패스트 플로우(Fast Flow)는 2개 단백질 사이에 유사한 분리를 제공함이 분명하다.
그러나, 본 발명의 방법에 따른 내부 구조를 갖는 실시예 3C-3E는 2개 단백질의 훨씬 개선된 분리를 제공한다.
실시예 4: 선택성 시험 방법
상이한 네트 전하(net charge) 및 분자량의 2개 단백질을 사용하여 전형적인 양이온 교환(CEX) 조건하에서 선택성 또는 분리 인자의 성질을 시험하였다. 0.5 mg/ml 폴리클로날 IgG(Sigma) 및 0.5 mg/ml 라이소자임(Sigma)을 50 mM 아세테이트 완충액 중에 함유하는 단백질과 pH 4.5에서 10 mS 도전성을 내기 위한 NaCl의 혼합물을 각 샘플 컬럼에 200 cm/hr (7 cm 층 높이, 0.66 cm 직경)로 적용하여 매질 상에 로딩된 네트 단백질이 10 mg/mL이 되게 하였다. 상기 단백질 혼합물은 10 mS에서 출발하여 80 mS에서 끝나는 30 CV NaCl 구배를 이용하여 200 cm/hr로 용출시켰다. 각 단백질에 대한 피크는 용출 구배의 개시(사 부피(dead volume)는 보정)로부터 컬럼 부피(CV) 면에서 기록하였다.
실시예 5. 표면 반응성 기 농도의 결정
표면 반응성 기, 알릴 글리시딜 에테르(AGE)의 부가 후, 상기에서 개시된 실시예 변형의 대표적인 샘플을 세척하고 또 수성 브롬을 사용하여 다음과 같이 적정하였다. 10% NaOBr(20mL) 및 50mM 아세트산 나트륨(80mL, pH 4.5)의 혼합물을 제조하였다. 용액 중의 브롬 농도는 물 중의 100 μL의 AGE를 적정하는 것에 의해 검량하였다. 표면 변형된 비드의 10mL 샘플은 AGE 표면기의 완전한 반응을 나타내는 브롬 색상이 지속될 때까지 브롬 용액에 의해 적정하였다.
실시예 6. 평형 단백질 결합능의 결정
상기 실시예 및 시판되는 제품에서 개시된 각 제품의 정적 또는 평형 능력은 다음 방법에 따라 결정하였다:
1. 적절한 평형 완충액(EQ 완충액, 참조: 표 4) 중에서 각 샘플로부터 비드 현탁액(10% 비드)을 제조하였다.
2. 상기 비드 현탁액을 교반하고 또 100 μL의 샘플을 피펫으로 3개의 15 mL 플라스틱 원추형 튜브로 옮겼다.
3. EQ 완충액 중의 적절한 단백질 용액(공급액, 모든 단백질은 시그마-알드리치로부터 입수한 폴리클로날임, 참조: 표 2)을 각 튜브(10 mL)에 부가하였다.
4. 상기 튜브에 마개를 하고 랩케이크(Labquake) 회전기/진탕기 상에서 서서히 (< 10 rpm) 회전시켰다.
5. 16시간 후, 상기 비드를 침강시키고 또 결합한 후 용액의 UV 판독치를 ㅍ판독하였다.
6. 상기 UV 흡수값을 공급 단백질에 대한 적절한 소광 계수(extinction coefficient)를 이용하여 단백질 농도로 전환하고 또 질량 균형(mass balance)을 이용하여 포화능력을 결정하였다.
Figure pct00004
본 명세서에서 개시된 방법의 단백질 결합 특성은 몇 개의 상이한 결합 조건 및 단백질 분리에 대한 전체 단백질 능력에 대해 조사하였다. 비교예 1A/1B, 2A/2C 및 2D/2E로부터, 알릴 표면 반응성 기의 부가가 그라프팅된 중합체 연장제 밀도를 개선시킴이 분명해졌고, 표면 반응성 기 및/또는 연장제를 갖지 않는 것에 대하여 상기 단백질 능력이 현저히 개선됨이 분명해졌다. 실시예 1A/1B에서, IgG에 대한 아가로오스 비드 능력은 표면 반응성 알릴 기에 그라프팅함에 있어, 11/L에 대하여 약 10 x 더 높은 100 g/L이었다.
본 명세서에 개시된 방법은 실시예 1D/1E 및 2A/2B에 대한 IgG 능력에 의해 나타낸 바와 같이 수지의 결합 강도를 변형한다.
또한, 실시예 1D 및 2A는 pH 5, 8 mS 도전성에서 IgG를 결합하기 위해 고안된다. 베이스 매트릭스, 아가로오스 또는 다른 합성 중합체에 상관없이, 연장제 화학은 특정 결합 조건에 맞춰질 수 있다. 특정 단백질 정제 공정의 경우, 소망하는 결합 조건은 더 높은 염 농도에서 생기며, 이는 일부 이온 교환체에 대해 문제일 수 있다.
예를 들어, 대조용 수지(Fractogel® S)는 염화 나트륨을 사용하여 도전성을 8 mS에서 16 mS로 증가시킬 때 IgG에 대한 결합능 감소를 나타낸다. 이것은 아마도 IgG에 대한 수지의 결합 강도 감소에 기인할 것이다.
본 명세서에 개시된 그라프팅 방법을 이용하여, 도전성을 8 mS에서 16 mS로 증가시킬 때 IgG에 대한 수지의 결합능 감소는 실시예 1E 및 2B에 나타낸 바와 같이 개선될 수 있다. 수지의 결합 특성은 베이스 매트릭스에 상관없이 맞출 수 있으며, 16 mS 도선성에서 높은 능력을 생성하고 이들 조건하에서 결합에서 >50% 증가를 가능하게 한다. 이것은 또한 더 높은 도전성에서 IgG의 효과적인 로딩을 가능하게 하여, 당업자들이 완충액 조건을 불순물로부터 목적하는 단백질 분리하는 것으로 확장할 수 있다.
본 발명은 비제한적으로 크로마토그래피; 보존적 단백질 크로마토그래피 전기영동; 겔 여과; 샘플 원심분리; 온-라인 샘플 제조; 진단 키트 시험; 진단 시험; 화학물질의 수송; 생분자의 수송; 고처리량 스크리닝; 친화성 결합 에세이; 액체 샘플의 정제; 유체 샘플의 성분의 크기를 기본한 분리; 유체 샘플의 성분의 물리적 특성을 기본한 분리; 유체 샘플의 성분의 화학적 특성을 기본한 분리; 유체 샘플의 성분의 생물학적 특성을 기본한 분리; 유체 샘플의 성분의 정전특성을 기본한 분리; 및 이들의 조합을 포함하는 샘플 제조 방법과 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 확산성 기공을 채우거나 또는 막히게 함 없이 중합체 연장제를 표면에 부가하고 또 단백질 분리하는 동안 단백질 등의 확산을 제한하는 것에 의해 확산성 기공을 갖는 다공성 구조의 결합능을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 다공성 구조의 표면에 부가된 중합체 연장제는 더 높은 도전성에서 현저한 결합능을 제공한다.
용어 "키트"는 예를 들어, 각각의 성분이 단일 팩케이지에 조합된 것, 이때 각 성분은 개별적으로 포장되며 함께 시판되거나, 또는 각 성분을 카탈로그로 함께 제공(예를 들어 카탈로그 내의 동일 페이지 또는 이중 페이지 스프레드)될 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 본 발명의 그라프팅 방법은 기공을 채우지 않고 또 확산을 제한하지 않고 표면에 연장제를 부가하는 것에 의해 확산성 기공을 갖는 다공성 구조의 결합능을 증가시킬 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 본 발명의 그라프팅 방법은 효과적인 단백질 분리를 위해 필요한 중요한 2개의 수지 특성인 수지의 결합 강도 및 선택성을 변경시킬 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 이는 이용된 그라프팅 조건 또는 단량체 조성을 변경하는 것에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 마지막으로, 본 명세서에 개시된 바와 같은 본 발명의 그라프팅 방법은 더 높은 도전성에서 현저한 결합능을 갖는 연장제를 생성할 수 있다.
상술한 내용은 독립적 유용성을 갖는 다수의 뚜렷한 발명을 포함할 수 있다. 이들 발명의 각각은 바람직한 형태로 기재되었지만, 본 명세서에 기재된 특정 실시양태 및 상세한 설명은 제한적인 의미로 생각되어서는 안되며, 이는 다수의 변이가 가능하기 때문이다. 본 발명의 청구객체는 본 명세서에 개시된 다양한 요소, 특징, 작용 및/또는 특성의 모든 신규하고 비자명한 조합 및 하부조합을 포함한다. 이하의 특허청구범위는 신규하고 비자명한 특정의 조합 및 하부조합을 청구하는 것이다. 특징, 작용, 요소 및/또는 특성의 다른 조합 및 하부조합에 구현된 본 발명은 우선권 주장한 출원 또는 관련된 출원에서 특허청구될 수 있다. 이러한 특허청구항은 상이한 발명에 관련된 것인지 동일 발명에 관련된 것인지, 또 원래의 특허청구 범위에 대하여 더 넓은, 더 좁은, 동일하거나 또는 상이한 범위인지에 관련된 이러한 특허청구범위는 본 발명의 청구객체 내에 포함되는 것으로 간주된다.

Claims (21)

  1. a) 확산성 기공 및 기재의 표면에 부착된 표면 반응성 불포화 작용기를 갖는 다공성 기재를 제공하는 단계;
    b) 그라프팅 단량체 또는 그라프팅 단량체의 혼합물 및 용해성 라디칼 중합반응 개시제를 포함하는 용액을 제공하는 단계;
    c) 상기 기재를 상기 용액과 접촉시키는 단계;
    d) 용액 중에 라디칼 중합반응 개시제의 도입에 의해 기재 상의 표면 반응성 불포화 작용기와 그라프팅 단량체 또는 그라프팅 단량체의 혼합물 사이의 자유 라디칼 중합반응을 개시하여 기재에 커플링된 중합체 사슬을 형성하는 단계를 포함하는, 확산성 기공 및 표면 반응성 불포화 작용기를 갖는 다공성 기재의 변형(modifying) 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기재가 다공성 중합체 비드, 다공성 아가로오스 비드 및 다공성 세라믹 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계(d) 이후에
    e) 과량의 미반응 그라프팅 단량체, 그라프팅 단량체의 혼합물 또는 미부착 중합체 사슬을 제거하기 위하여 상기 기재를 세척하여, 100 g/L 초과의 단백질 결합능을 갖는 다공성 기재를 초래하는 단계를 더 포함하는 변형 방법.
  4. 제3항에 있어서, 단계(e) 이후에
    f) 다공성 기재 표면에 부착된 중합체 사슬에 리간드를 커플링시키는 단계를 더 포함하는 변형 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 라디칼 중합반응 개시제가 암모늄 퍼설페이트, 포타슘 퍼설페이트, 아조비스(4-시아노발레르산), Irgacure® 2959, 2,2'-아조비스(2-아미디노-프로판)하이드로클로라이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 불포화 작용기가 알릴 기를 포함하는 변형 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 알릴 기는 구조식 R-0-CH2-CH=CH2을 포함하고, 이때 R은 다공성 기재 표면 또는 표면과 알릴 기 사이의 링커인 변형 방법.
  8. 제1항에 있어서, 약 20 내지 약 400 μmol/mL의 표면 반응성 기가 구조식 R-0-CH2-CH=CH2을 갖고, 이때 R은 다공성 기재 표면 또는 표면과 알릴 기 사이의 링커인 변형 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 그라프팅 단량체 또는 그라프팅 단량체의 혼합물이 메타크릴레이트, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 아크릴산, 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산, [3-(메타크릴로일아미노) 프로필] 트리메틸암모늄 클로라이드, 2-아크릴아미도-글리콜산, 이타콘산 또는 에틸 비닐 케톤, 글리시딜 메타크릴레이트, N,N-디메틸아크릴아미드, 아크릴아미드, 히드록시프로필 메타크릴레이트, N-페닐아크릴아미드, 히드록실프로필 아크릴아미드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 다공성 기재 상의 확산성 기공이 > 약 100 Å 이고 < 약 1 μ인 기공 크기를 갖는 변형 방법.
  11. a) 확산성 기공, 표면 및 표면에 커플링되어 있는 표면 반응성 불포화 작용기를 갖는 다공성 크로마토그래피 비드를 제공하는 단계;
    b) 그라프팅 단량체 또는 그라프팅 단량체의 혼합물 및 용해성 라디칼 중합반응 개시제를 포함하는 용액을 제공하는 단계;
    c) 상기 크로마토그래피 비드를 상기 용액과 접촉시키는 단계;
    d) 용액 중에 라디칼 중합반응 개시제의 도입에 의해 상기 비드 상의 표면 반응성 불포화 작용기와 그라프팅 단량체 또는 그라프팅 단량체의 혼합물 사이의 자유 라디칼 중합반응을 개시하여 상기 비드에 커플링된 중합체 사슬 연장제를 형성하는 단계;
    e) 과량의 미반응 그라프팅 단량체, 그라프팅 단량체의 혼합물 또는 미부착 중합체 사슬을 제거하기 위하여 비드를 세척하여, 100 g/L 초과의 단백질 결합능을 갖는 다공성 크로마토그래피 비드를 초래하는 단계; 및
    f) 크로마토그래피 비드 표면에 부착된 중합체 사슬에 리간드를 커플링시키는 단계를 포함하는,
    확산성 기공을 갖는 다공성 크로마토그래피 비드를 표면 중합체 사슬 연장제를 사용하여 변형하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 다공성 크로마토그래피 비드가 중합체 비드, 아가로오스 비드 및 세라믹 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 라디칼 중합반응 개시제가 암모늄 퍼설페이트, 포타슘 퍼설페이트, 아조비스(4-시아노발레르산), Irgacure® 2959, 2,2'-아조비스(2-아미디노-프로판)하이드로클로라이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 불포화 작용기가 알릴 기를 포함하는 변형 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 알릴 기는 구조식 R-0-CH2-CH=CH2을 포함하고, 이때 R은 다공성 기재 표면 또는 표면과 알릴 기 사이의 링커인 변형 방법.
  16. 제11항에 있어서, 약 20 내지 약 400 μmol/mL의 표면 반응성 기가 구조식 R-0-CH2-CH=CH2을 갖고, 이때 R은 다공성 크로마토그래피 비드 표면 또는 상기 비드의 표면과 알릴 기 사이의 링커인 변형 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 그라프팅 단량체 또는 그라프팅 단량체의 혼합물이 메타크릴레이트, 아크릴레이트, 아크릴아미드 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  18. 제11항에 있어서, 상기 다공성 크로마토그래피 비드 상의 확산성 기공이 > 약 100 Å이고 < 약 1 μ인 기공 크기를 갖는 변형 방법.
  19. 제11항에 있어서, 상기 리간드가 강한 양이온 교환기, 설포프로필, 설폰산, 음이온 교환기, 트리메틸암모늄 클로라이드, 약 양이온 교환기, 카복시산, 약 음이온 교환기, N,N-디에틸아미노, DEAE, 소수성 상호작용 기, 페닐 기, 부틸 기, 및 프로필 기, 및 친화성 기, 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  20. 제7항, 제8항, 제15항 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 메타크릴레이트, 아미드, 아크릴아미드, 에폭사이드, 아민, 부탄디올 디글리시딜 에테르, 에피클로로히드린, 폴리에틸렌디올 디글리시딜 에테르, 에틸렌디올 디글리시딜 에테르, 알릴 클로로아세테이트, 알릴 클로라이드, 알릴(클로로)디메틸실란, 알릴 글리시딜 에테르, 알릴 브로마이드, 알릴 메타크릴레이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  21. 제4항에 있어서, 상기 리간드가 강한 양이온 교환기, 설포프로필, 설폰산, 음이온 교환기, 트리메틸암모늄 클로라이드, 약 양이온 교환기, 카복시산, 약 음이온 교환기, N,N 디에틸아미노, DEAE, 소수성 상호작용 기, 페닐 기, 부틸 기, 및 프로필 기, 및 친화성 기, 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
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