CN103108693A - 改善色谱介质性能的接枝方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及将聚合物延伸剂接枝在具有扩散孔的多孔基材例如是用于蛋白质分离中的那些上的改进方法，而不填充所述基材的扩散孔，并且不限制通过其的扩散。通过改变接枝条件和/或单体组成，所得到的具有接枝在其上的聚合物延伸剂的多孔基材具有提高的蛋白质结合容量和树脂选择性，从而增强了基材的蛋白质分离效率。接枝的聚合物延伸剂提供在较高电导率下具有显著结合容量的基材。本发明还涉及使用并将聚合物延伸剂接枝在具有扩散孔的多孔树脂基材上的试剂盒和方法。

Description

改善色谱介质性能的接枝方法
技术领域
本发明涉及用于接枝聚合物延伸剂(polymer extender)的改善方法。本发明还涉及将聚合物延伸剂接枝在用于蛋白质分离的多孔基材上的方法上的改进，其产生具有提高的蛋白质结合容量和树脂选择性的多孔基材，以及涉及试剂盒及其制造和使用的相关方法。
背景技术
从活生物体制得的治疗性蛋白质在现代健康中起着越来越重要的作用。这些蛋白质提供许多优于传统药物的益处，包括对疾病靶点的特异性和功效的提高。哺乳动物的免疫系统利用各种蛋白质，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM以控制和消除疾病威胁。遗传和蛋白质工程的到来已使许多“设计的”或重组的蛋白质疗法得以发展。这些疗法可基于单一的蛋白质、化学改性的蛋白质、蛋白质片段或蛋白质复合物。这些治疗性蛋白质的一个子类单克隆抗体(MAbs)在保健和诊断中已有广泛应用。色谱分离广泛地用于这些生物药品的制造。随着工业的成熟，使用新型/先进技术和方法以增强分离将提供生物疗法生产商向更多病患以较低成本提供这些医药的能力。
用以提纯蛋白质的常规色谱方法包括亲和、生物亲和、离子交换、反相、疏水性相互作用、亲水性相互作用、尺寸排阻和混合模式（上述种类的组合）等。这些类型的色谱方法的应用和效率取决于各自与流动液相相互作用的溶质分子和色谱系统的固定相（色谱介质）之间的表面-表面相互作用的选择性。各种各样的固定相色谱载体材料是可商购的。
从杂质中成功分离出产物的关键往往在于固定相、基质和配体性质（配体类型、配体密度、孔结构、配体分布、材料组成）的正确组合、以及流动相或溶液的性质（缓冲液类型、pH和电导率）。基质和配体的特定设计产生可具有多个关键性质的色谱介质，所述关键性质包括蛋白质结合容量或通量、选择性、床渗透性和化学稳定性。提纯方法包括结合产物为主(结合和洗脱)、结合杂质为主(流通)和上述的组合(所谓的弱分区等)。在这些技术的设计中，关键的是控制以上教导的色谱介质的性质，以能够并确保稳定的分离得到提纯蛋白质产物。
蛋白质分离可在各种多孔基材或基质上实现。用于树脂和珠粒(bead)结构的常规材料包括多糖(琼脂糖、纤维素)、合成聚合物(聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯和聚丙烯酰胺)和陶瓷例如二氧化硅、氧化锆和可控的多孔玻璃。这些材料通过通常约为
Figure BDA00002746450500021
的“扩散孔”吸附蛋白质，所述扩散孔远小于通常约为>5μm的“对流孔”，其控制床渗透性，并由填充床中的珠粒间的空间形成。
膜和整体式材料也常用于色谱，特别是流通应用。常规的膜组成包括合成聚合物，例如聚偏氟乙烯、聚乙烯、聚醚砜、尼龙和多糖例如纤维素。
已从聚苯乙烯、多糖和许多其它合成性聚合物中开发整体式材料(monoliths)。膜和整体式色谱不同于珠粒的是这些材料在相同的控制膜和整体式材料的渗透性的“对流孔”中吸附蛋白质。常规的膜和整体式对流孔的大小为约0.6μm-约10μm。在这些基材中加入配体可通过各种熟知的技术实现。
使用配体“触手”或“延伸剂”以改善蛋白质的结合容量并改变树脂的选择性包括例如通过接枝将配体置于与基质偶联的聚合物链上，并从基质表面延伸出来。配体延伸剂通常产生更高的结合容量，因为延伸剂提高配体可利用性，其中目标分子结合超过在表面上的单层吸附。例如，在Jansen等人的″Absorption of Proteins on Porous and Non-PorousPoly(ethyleneimine)and Tentacle-Type Anion Exchangers”(Journal ofChromatography,vol.522,1990,77-93)中教导了用作离子交换剂的表面改性的多孔二氧化硅材料的制备，通过援引将其公开并入本文。
已开发了用于接枝聚合物延伸剂的两种标准方法以在多孔基材，例如在用于蛋白质分离等的色谱等中使用的那些多孔基材上产生表面延伸剂：1)通过表面基团从载体接枝单体(“从......接枝单体”)和2)通过活性基团将预形成的聚合物接枝至载体上(“将聚合物接枝至......”)。
用于将延伸剂与树脂偶联的一种已有方法是通过从基质表面接枝聚合物链，然后使用金属/氧化产生的自由基引发单体聚合，这通常产生大于50%的蛋白质结合容量的增加(参见例如Muller的美国专利5,453,186)。已开发多种其它方法，包括使用葡聚糖接枝至基质表面(参见例如Berg的美国专利6,428,707)；使用高度支化的聚合物接枝(参见例如Amersham Bioscience的WO 2004/003542)和使用疏水聚合物接枝(参见例如GE HealthcareBio-Sciences的WO 2005/098415)。将这些美国专利和公开的国际专利申请公开的内容援引并入本文。
例如，相对于简单的表面结合的配体，在WO 05/098415中所教导的将疏水聚合物接枝至基质树脂改变了树脂的蛋白质选择性。这些改变中的每一种都通过“从表面接枝单体”(引发自由基聚合)或“将聚合物接枝至表面”(预形成的聚合物的附着)向基质表面加入聚合物链。
使用自由基聚合反应从多孔材料接枝单体是熟知的技术。通常，可由多孔表面材料或由溶液中的引发剂引发反应。
通过暴露于反应性环境例如辐射、金属氧化和吸附的引发物而在表面上产生自由基，从而可实现由表面引发自由基聚合(参见例如“PolymerSurfaces”,Fabio Garbassi,John Wiley-Sons Inc.,New York,1998)。但是，这些“从...接枝单体”方法需要非常可控的溶液条件和/或特殊设备，这使得它们的实施复杂且耗时。
当由溶液引发反应时，需要在接枝之前将表面反应性基团附着至表面以能够在新形成的聚合物和多孔材料的表面之间形成永久性的连接。通常，表面反应性基团能够与溶液中的单体(例如相似类型的单体，例如锚固所形成的丙烯酸酯聚合物的附着的丙烯酸酯)进一步聚合。但是，由于降解性链转移自由基聚合受到限制，优选不使用烯丙基单体例如烯丙基缩水甘油醚(AGE)(参见例如“Principles of Polymerization”,George Odian,JohnWiley-Sons Inc.,New York,1991)，将其公开内容援引并入本文。
但是，已知使用烯丙基官能团作为表面反应性基团。例如，烯丙基表面反应性基团可用以改性可用于形成孔径>1mm并产生有效对流(>200mL/min)的多孔结构(所谓的“jelly rolls”)的纤维素纤维或二氧化硅(参见例如Hou的美国专利4,663,163和4,724,207)，将这些美国专利的公开内容援引并入本文。
或者，可将丙烯酰胺聚合并附着至琼脂糖基质(例如15重量%的琼脂糖)，由此有效降低进入基质的蛋白质扩散，使得具有附着于其上的聚合丙烯酰胺的琼脂糖基质可用于HPLC应用(HPLC应用使用非多孔性珠粒以使分析物的分辨率最大)(参见例如Hjerten的美国专利5,135,650)，将其公开内容援引并入本文。
但是，Hou或Hjerten都没有教导将偶联至具有扩散孔的多孔色谱载体表面上的丙烯酰胺或单体聚合，其中所述多孔载体保持其理想的蛋白质吸附性质。
当接枝热响应性聚合物时，残余的甲基丙烯酸酯基团可补充额外的乙烯基或烯丙基基团以改善含LCST聚合物(较低的临界溶液温度)的接枝产率(参见例如Peters的美国专利5,929,214)，将其公开内容援引并入本文。但是，这些改性在具有对流孔(>1μm)的载体上实现，其中目的是用温度变化和接枝的LCST聚合物“门控”对流。为了达到在微米孔径的孔中的流动降低，接枝的链必须具有较大的长度和密度以“填充”或“堵塞”该孔径的孔。如Hjerten的美国专利5,135,650(将其公开内容援引并入本文)中所教导的，该接枝方法基本上填充或堵塞孔。LCST聚合物用于疏水作用色谱(HIC)，并且因为LCST聚合物证实了结合性质对温度强的依赖性，它们在多孔色谱中的总体实际应用有限。
为了通过使延伸剂的链长最小化而产生表面改性，已采用使用表面反应性基团和易进行降解性链转移的单体的策略。烯丙基表面反应性基团和烯丙基单体的组合对于使延伸剂的链长最小化是有利的。
向多孔材料表面上加入聚合物延伸剂提供了改善的蛋白质结合容量和树脂选择性上的理想变化。但是，由于蛋白质分离变得要求更高，更为关键的是开发新技术和方法以产生新型聚合物结构。因此，将希望开发改善的蛋白质结合容量并对用于蛋白质分离的多孔基材的树脂选择性进行改变。
发明内容
为了以上对于可用于蛋白质分离、具有改善的蛋白质结合容量和树脂选择性的新多孔基材的需求、以及在具有扩散孔的多孔基质上接枝聚合物延伸剂的问题，已开发一种用于将聚合物延伸剂接枝在具有扩散孔的多孔基材上的新方法。
因此，根据本发明，已开发了一种用于将聚合物延伸剂偶联在具有扩散孔的多孔基材上的新接枝方法，其产生具有改善的蛋白质结合容量和/或结合选择性的基材，而不堵塞或填充多孔基材的扩散孔。
本发明至少部分地提供用于将聚合物延伸剂接枝在具有扩散孔和与基材的表面偶联的表面反应性不饱和基团的多孔基材上的新方法，其包括自由基接枝至易进行降解性链转移的表面反应性基团。
根据另一个实施方案，本发明至少部分地基于将聚合物延伸剂接枝在具有扩散孔并用于蛋白质分离等的多孔珠粒上的新方法，其产生具有改善的蛋白质结合容量和理想的树脂选择性的珠粒。
在又一个实施方案中，本发明至少部分地基于将聚合物延伸剂接枝在多孔聚合物色谱珠粒、多孔琼脂糖色谱珠粒和多孔陶瓷色谱珠粒上。
根据又一个实施方案，本发明至少部分基于将聚合物延伸剂接枝在具有孔径大于(>)约
Figure BDA00002746450500051
且小于(<)约1μ的扩散孔的多孔基材上。
根据又一个实施方案，本发明至少部分地基于将聚合物延伸剂接枝在具有扩散孔和表面反应性官能团的多孔基材上的新方法，其包括以下步骤：
a)提供多孔色谱珠粒，其具有扩散孔以及与其偶联的表面反应性官能团；
b)提供包含接枝单体或接枝单体混合物的溶液、以及可溶性自由基聚合引发剂；
c)使所述色谱珠粒与所述溶液接触；
d)在所述溶液中加入所述自由基聚合引发剂，由此在所述珠粒上的表面反应性官能团和所述接枝单体或接枝单体混合物之间引发自由基聚合反应，以形成与所述珠粒偶联的聚合物链延伸剂；
e)洗涤所述珠粒以去除任何过量未反应的接枝单体、接枝单体混合物或未附着的聚合物链，得到蛋白质结合容量大于100g/L的多孔基材；和
f)将配体与附着在色谱珠粒表面上的聚合物链偶联。
根据又一个实施方案，本发明至少部分地基于将聚合物延伸剂接枝在具有扩散孔的多孔基材上的新方法，其中所述接枝单体或接枝单体混合物包括甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、丙烯酸、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、[3-(甲基丙烯酰基氨基)丙基]三甲基氯化铵、2-丙烯酰氨基-乙醇酸、衣康酸或乙基乙烯基酮、甲基丙烯酸缩水甘油酯、N,N-二甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟丙酯、N-苯基丙烯酰胺、羟丙基丙烯酰胺及它们的组合。
根据另一个实施方案，本发明至少部分地基于将聚合物延伸剂接枝在多孔基材上的新方法，其中与聚合物链延伸剂偶联的配体包括强阳离子交换基团、磺丙基、磺酸基、阴离子交换基团、三甲基氯化铵基团、弱阳离子交换基团、羧酸基、弱阴离子交换基团、N,N-二乙基氨基、DEAE基团、疏水作用基团、苯基、丁基和丙基、以及亲和基团、蛋白质A、蛋白质G和蛋白质L及它们的组合。
在一些其它实施方案中，本发明至少部分地基于将聚合物延伸剂接枝在多孔基材上的新方法，其中将表面反应性官能团与多孔基材表面偶联的连接剂包括甲基丙烯酸酯、酰胺、丙烯酰胺、环氧化物、胺、丁二醇二缩水甘油醚、环氧氯丙烷、聚乙二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、氯乙酸烯丙酯、氯丙烯、烯丙基(氯)二甲基硅烷、烯丙基缩水甘油醚、溴丙烯、甲基丙烯酸烯丙酯及它们的组合。
根据另一个实施方案，本发明至少部分地基于将聚合物延伸剂接枝在具有扩散孔和表面反应性不饱和官能团的多孔基材上的新方法，其中所述不饱和官能团是烯丙基。
在其它实施方案中，本发明至少部分地提供使用自由基聚合引发剂将聚合物延伸剂接枝在多孔基材上的新方法，所述自由基聚合引发剂包括过硫酸铵、过硫酸钾、偶氮双(4-氰基戊酸)、Irgacure
Figure BDA00002746450500061
2959、2,2′-偶氮双(2-脒基-丙烷)盐酸盐及它们的组合。
本发明的另一目的是提供涉及形成和使用用于将聚合物延伸剂接枝在具有扩散孔的用于蛋白质分离的多孔基材上的新方法的试剂盒和方法，其产生改善的蛋白质结合容量和理想的树脂选择性。
本发明的其它特征和益处将在以下的详述和权利要求中给出。对于本领域技术人员明显的是，不背离它的精神和范围的情况下可对本发明进行许多修改和变化。应理解以上的概述和以下的详述、权利要求以及附图仅是示例性和解释性的，并且旨在提供本发明教导的各种实施方案的解释。本文教导的具体实施方案仅以实施例的方式提供，并且不以任何方式表示是限制性的。
具体实施方式
出于本说明书和所附权利要求的目的，除非另有说明，所有表示成分量、材料百分比或比例、反应条件和其它在本说明书和权利要求中使用的数值应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。
因此，除非相反地指出，在以下的说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是约值，其可根据希望通过本发明得到的理想性质而变化。至少，并且不为了限制权利要求范围的等同原则的使用，各数值参数应至少根据所给出的有效数，并通过采用常规的舍入技术进行诠释。
尽管阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是约值，但是在具体实施例中阐述的数值尽可能精确地给出。然后，任何数值固有地包括由于它们各自的测试中的标准偏差必然导致的一定误差。此外，本文教导的所有范围应理解为包括所有归入其中的子范围。例如，范围“1-10”包括最小值1和最大值10之间(且包括该值)的任何子范围，也就是说，最小值等于或大于1且最大值等于或小于10的所有子范围，例如5.5-10。
在更详细地描述本发明之前，将定义一些术语。这些术语的使用不限制本发明范围，而仅起到便于本发明说明的作用。
本文使用的单数形式“一个/种”和“该”包括复数指代，除非另有清楚的说明。
当增长的自由基非常具有反应性时发生“降解性链转移”，但具有单体的链转移产物不具有反应性(形成稳定的自由基)(参见“Principles ofPolymerization”,George Odian,John Wiley-Sons Inc.,New York,1991)，将其公开内容援引并入本文。该链转移导致大幅下降的聚合速率和聚合物分子量。当希望低分子量的表面改性时，这在接枝中是有利的(参见例如Ihre的美国专利7,048,858和7,060,187)。但是，当使用更具反应性的单体时，表面反应性基团变为原位形成聚合物时在“将聚合物接枝至……”方法中的更长的延伸剂或触手的链终止锚固物。这些原位产生的延伸剂提供改善的结合容量和改进的选择性。所述方法是有利的，因为它可用于广泛的单体，例如丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯和广泛的基材或基质(例如聚合物珠粒、琼脂糖珠粒和陶瓷珠粒)。
本文中可使用的其它“多孔基材”或“基质”包括但不限于任何具有扩散孔和烯丙基表面反应性基团的材料。本文中可使用的用于多孔基材或基质的优选材料包括包含甲基丙烯酸烯丙酯等的多糖、合成聚合物、琼脂糖、纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯，以及上述的混合物。最优选的材料包括用烯丙基表面反应性基团改性的琼脂糖、包含烯丙基表面反应性基团的聚丙烯酸甲酯材料、用烯丙基表面反应性基团改性的聚丙烯酸甲酯材料和加入甲基丙烯酸烯丙基甲基酯的聚甲基丙烯酸酯材料。
本文中可使用的“官能团”的实例包括但不限于离子交换基团、生物亲和基团、疏水基团、亲硫作用基团、螯合物或螯合基团、与目标化合物具有所谓的π-π相互作用的基团、氢键基团和亲水基团。
本文中可使用的“配体”的实例包括但不限于离子交换基团、疏水作用基团、亲水作用基团、亲硫作用基团、金属亲和基团、亲和基团、生物亲和基团和混合模式基团(上述的组合)。本文中可使用的一些优选的配体包括但不限于强阳离子交换基团，例如磺丙基、磺酸基；强阴离子交换基团，例如三甲基氯化铵基团；弱阳离子交换基团，例如羧酸基；弱阴离子交换基团，例如N,N-二乙基氨基或DEAE基团；疏水作用基团，例如苯基、丁基、丙基和己基；以及亲和基团，例如蛋白质A、蛋白质G和蛋白质L。
本文中可使用的“自由基聚合引发剂”的实例包括但不限于过硫酸铵、过硫酸钾、偶氮双(4-氰基戊酸)、Irgacure2959(Ciba-Geigy,Hawthorn,N.Y.)、2,2′-偶氮双(2-脒基-丙烷)盐酸盐等。接枝反应可使用本领域已知的方法引发，优选热引发(加热)或UV辐射。
本文中可使用的“表面反应性不饱和基团或官能团”的实例包括但不限于烯丙基。优选的表面反应性不饱和官能团包括具有式R-O-CH2-CH=CH2的烯丙基，其中R是多孔基材表面或该表面和烯丙基之间的连接基。
本文中可使用的“连接物”的实例包括但不限于包含在自由基聚合反应中进行高水平的降解性链转移的基团的分子。本文中可使用的连接物还包括对碱性溶液具有显著稳定性的分子或官能团，例如包含醚键、甲基丙烯酸酯、酰胺、丙烯酰胺、环氧化物、胺等的化合物。使用本领域已知的方法可将优选的连接物例如丁二醇二缩水甘油醚、环氧氯丙烷、聚乙二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚进一步用含烯丙基的基团例如烯丙基缩水甘油醚改性。优选的连接物包括氯乙酸烯丙酯、氯丙烯、烯丙基(氯)二甲基硅烷、烯丙基缩水甘油醚、溴丙烯和甲基丙烯酸烯丙酯。最优选的连接物包括烯丙基缩水甘油醚、溴丙烯和甲基丙烯酸烯丙酯。
本文中可使用的“接枝单体”或“接枝单体混合物”的实例包括但不限于甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯和丙烯酰胺。最优选的接枝单体包括但不限于丙烯酸、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-烷丙磺酸、[3-(甲基丙烯酰基氨基)丙基]三甲基氯化铵、2-丙烯酰氨基-乙醇酸、衣康酸或乙基乙烯基酮、甲基丙烯酸缩水甘油酯、N,N-二甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟丙酯、N-苯基丙烯酰胺、羟丙基丙烯酰胺及它们的组合。
在常规的接枝方法中，或者残余的不饱和物保持进一步聚合的反应性，或者表面引发需要谨慎控制的条件。例如，丙烯酸酯官能团与表面的附着使得生长的聚合物链与表面反应，然后继续生长，使得延伸剂与表面附着的位置基本上是无序的。例如，在链生长的任意时间点，在表面基团上聚合链可反应并继续生长，由此沿延伸剂无序地接入表面反应性基团。在表面引发的情况中，例如羟基的金属氧化，必须控制溶液条件以保持金属的活性氧化状态，并避免终止表面活化反应。
在本文教导的接枝方法中克服了这两个缺陷。在较不严格的条件下，在溶液中模拟聚合物延伸剂的聚合，并且与多孔基材的附着更可能终止，由于表面反应性基团的降解性链转移起着抑制剂的作用，终止聚合物链的生长。(参见“Principles of Polymerization”,George Odian,John Wiley-SonsInc.,New York,1991)，将其公开内容援引并入本文。
与进行降解性链转移的烯丙基表面反应性基团接枝对于整体式材料、纤维素纤维和二氧化硅颗粒是已知的。但是，已知对整体式材料、纤维素纤维和二氧化硅颗粒的改性在对流孔(>1μm)上实现，所述对流孔远大于在基于珠粒的技术中发现的扩散孔。对纤维素和二氧化硅颗粒改性，然后构成具有大对流孔的多孔结构。
在多孔结构形成之前使用延伸剂的材料改性不是有利的，并且也不易用于基于珠粒的技术，因为希望仅在内部结构/表面积的表面上(配体可与目标分子相互作用)具有延伸剂。通过由这些改性颗粒形成多孔结构而对颗粒(例如纤维素和二氧化硅)改性产生堵塞的对流孔和延伸剂的无规分布，由此提供有限的且大幅下降的配体与目标分子的相互作用。
另外，接枝的延伸剂加入到本体多孔结构上(即在珠粒形成之前接枝延伸剂)可折衷或改变材料的机械性质和孔的形态。整体式材料的改性产生微米孔径的孔中的孔限制(降低流速)。这些观察到的孔限制表明具有聚合物延伸剂改性的整体式材料完全填充或堵塞所提供的较小的扩散性整体式材料的孔。
如上引用的Hjerten教导了具有被聚合的聚丙烯酸酯接枝而完全堵塞的孔的琼脂糖基质，使得孔中的蛋白质扩散被消除，使得能够将该材料用于非多孔性珠粒的应用，例如分析型HPLC。在如本文教导的本发明的方法中，改进结合容量的表面反应性基团密度、引发剂浓度和单体浓度的组合可改变选择性，并产生新型的分离树脂。
实施例
实施例1A.使用表面反应性基团和阳离子交换延伸剂改性多糖树脂
根据Porath和Fornstedt,″Group Fractionation of Plasma Proteins onDipolar Ion Exchangers″,(Journal of Chromatography,vol.51,1970,pp.479-489)(将其公开内容援引并入本文)的教导，使用环氧氯丙烷交联琼脂糖珠粒(Sepharose 4B)(GE Healthcare,Piscataway N.J.)。然后根据以下方法用表面反应性基团烯丙基缩水甘油醚(AGE)对珠粒改性：在罐中，将10mL的珠粒加至18g的8M NaOH、4g的AGE、3g的Na2SO4中，然后在50℃下搅拌过夜。然后用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500101
水洗涤珠粒，并过滤成湿饼。在塑料袋中将湿饼加至包含2.4g的2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、17.3g的Milli-Q水、0.2g的N,N-二甲基丙烯酰胺和0.12g的Irgacure
Figure BDA00002746450500103
2959(CIBA)的20mL溶液中。将塑料袋放置在两个聚乙烯板之间。然后将聚乙烯夹层板用带捆扎在将组装件输送通过具有″H″灯泡的Fusion Systems UV曝光实验装置的输送装置上。曝光时间由组装件移动通过UV单元的速度控制。在该实施例中，组装件以每分钟15英尺移动通过UV室。使组装件静置5分钟，然后去除袋子，过滤珠粒，并用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500111
水洗涤。根据表1中所示的实施例6中的方法测试平衡蛋白质结合容量。
实施例1B.不使用表面反应性基团和阳离子交换延伸剂的情况下改性多糖树脂
根据Porath和Fornstedt,″Group Fractionation of Plasma Proteins onDipolar Ion Exchangers″,(Journal of Chromatography,vol.51,1970,pp.479-489)的教导，使用环氧氯丙烷交联琼脂糖珠粒(Sepharose 4B)(GEHealthcare,Piscataway N.J.)。
然后用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500112
水洗涤珠粒，并过滤成湿饼。在塑料袋中将湿饼加至包含2.4g的2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、17.3g的Milli-Q
Figure BDA00002746450500113
水、0.2g的N,N-二甲基丙烯酰胺和0.12g的Irgacure2959(CIBA)的20mL溶液中。将塑料袋放置在两个聚乙烯板之间。然后将聚乙烯夹层板用带捆扎在将组装件输送通过具有″H″灯泡的Fusion Systems UV曝光实验装置的输送装置上。曝光时间由组装件移动通过UV单元的速度控制。在该实施例中，组装件以每分钟15英尺移动通过UV室。使组装件静置5分钟，然后去除袋子，过滤珠粒，并用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500115
水洗涤。根据表1中所示的实施例6中的方法测试平衡蛋白质结合容量。
实施例1C.使用表面反应性基团和阴离子交换延伸剂改性多糖树脂
根据Porath和Fornstedt,″Group Fractionation of Plasma Proteins onDipolar Ion Exchangers″,(Journal of Chromatography,vol.51,1970,pp.479-489)的教导，使用环氧氯丙烷交联琼脂糖珠粒(Sepharose 4B)(GEHealthcare,Piscataway N.J.)。然后根据以下方法用表面反应性基团烯丙基缩水甘油醚(AGE)对珠粒改性：在罐中，将10mL的珠粒加至18g的1MNaOH、12g的AGE、3g的Na2SO4，然后在50℃下搅拌过夜。然后用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500116
水洗涤珠粒，并过滤成湿饼。将湿饼加至包含6g的75%(3-丙烯酰氨基丙基)三甲基氯化铵溶液、13.6g的Milli-Q水和0.2g的过硫酸铵的溶液中。将混合物在65℃下搅拌17小时。然后用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500122
水洗涤珠粒。根据表1中所示的实施例6中的方法测试平衡蛋白质结合容量。
实施例1D.使用表面反应性基团和阳离子交换延伸剂改性多糖树脂，在低离子强度下具有最佳的结合
根据Porath和Fornstedt,″Group Fractionation of Plasma Proteins onDipolar Ion Exchangers″,(Journal of Chromatography,vol.51,1970,pp.479-489)的教导，使用环氧氯丙烷交联琼脂糖珠粒(Sepharose 4B)(GEHealthcare,Piscataway N.J.)。然后根据以下方法用表面反应性基团烯丙基缩水甘油醚(AGE)对珠粒改性：在罐中，将10mL的珠粒加至18g的1MNaOH、2.4g的AGE、3g的Na2SO4，然后在50℃下搅拌过夜。然后用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500123
水洗涤珠粒，并过滤成湿饼。在罐中将湿饼加至包含1g的2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、18.8g的Milli-Q水、0.15g的N,N-二甲基丙烯酰胺和0.08g的过硫酸铵的20mL溶液中。将罐搅拌，并在65℃下加热1小时。然后过滤珠粒并用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500125
水洗涤。根据表1中所示的实施例6中的方法测试平衡蛋白质结合容量。
实施例1E.使用表面反应性基团和阳离子交换延伸剂改性多糖树脂，在高离子强度下具有最佳的结合
根据Porath和Fornstedt,″Group Fractionation of Plasma Proteins onDipolar Ion Exchangers″,(Journal of Chromatography,vol.51,1970,pp.479-489)的教导，使用环氧氯丙烷交联琼脂糖珠粒(Sepharose 4B)(GEHealthcare,Piscataway N.J.)。然后根据以下方法用表面反应性基团烯丙基缩水甘油醚(AGE)对珠粒改性：在罐中，将10mL的珠粒加至18g的1MNaOH、12g的AGE、3g的Na2SO4，然后在50℃下搅拌过夜。然后用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500126
水洗涤珠粒，并过滤成湿饼。在罐中将湿饼加至包含2g的2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、17.8g的Milli-Q
Figure BDA00002746450500127
水、0.2g的N,N-二甲基丙烯酰胺和0.08g的过硫酸铵的20mL溶液中。将罐搅拌，并在65℃下加热1小时。然后过滤珠粒并用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500136
水洗涤。根据表1中所示的实施例6中的方法测试平衡蛋白质结合容量。
表1.用于琼脂糖珠粒的平衡结合容量
Figure BDA00002746450500131
N.D.=未测试
实施例2A.使用表面反应性基团和阳离子交换延伸剂改性合成聚合物树脂，在低离子强度下具有最佳的结合
将50mL的聚甲基丙烯酸酯珠粒(HW-65,45um,TOSOH BioScience)浸泡在25℃下的1M NaOH中2小时，然后用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500132
水洗涤。然后根据以下方法用表面反应性基团烯丙基缩水甘油醚(AGE)对珠粒改性：在罐中加入15mL的珠粒、18g的1M NaOH、2.4g的AGE、3g的Na2SO4，然后在50℃下搅拌过夜。用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500133
水洗涤珠粒，并过滤成湿饼。然后在罐中将10mL的湿饼加至包含1.2g的2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、0.08g的过硫酸铵、18.5g的Milli-Q
Figure BDA00002746450500134
水和0.24g的N,N-二甲基丙烯酰胺的溶液中。将罐搅拌，并在65℃下加热1小时。然后过滤珠粒，
并用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500135
水洗涤。根据表2中所示的实施例6中的方法测试平衡蛋白质结合容量。
实施例2B.使用表面反应性基团和阳离子交换延伸剂改性合成聚合物树脂，在高离子强度下具有最佳的结合
将50mL的聚甲基丙烯酸酯珠粒(HW-65,45um,TOSOH BioScience)浸泡在25℃下的1M NaOH中2小时，然后用500mL的Milli-Q水洗涤。然后根据以下方法用表面反应性基团烯丙基缩水甘油醚(AGE)对珠粒改性：在罐中加入15mL的珠粒、18g的1M NaOH、2.4g的AGE、3g的Na2SO4，然后在50℃下搅拌过夜。用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500142
水洗涤珠粒，并过滤成湿饼。然后在罐中将10mL的湿饼加至包含2.8g的2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、0.08g的过硫酸铵、17g的Milli-Q水和0.12g的N,N-二甲基丙烯酰胺的溶液中。将罐搅拌，并在65℃下加热1小时。然后过滤珠粒并用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500144
水洗涤。根据表2中所示的实施例6中的方法测试平衡蛋白质结合容量。
实施例2C.不使用阳离子交换延伸剂的情况下改性合成聚合物树脂
将50mL的聚甲基丙烯酸酯珠粒(HW-65,45um,TOSOH BioScience)浸泡在25℃下的1M NaOH中2小时，然后用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500145
水洗涤。然后根据以下方法用表面反应性基团烯丙基缩水甘油醚(AGE)对珠粒改性：在罐中加入15mL的珠粒、18g的1M NaOH、2.4g的AGE、3g的Na2SO4，然后在50℃下搅拌过夜。用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500146
水洗涤珠粒，并过滤成湿饼。通过以下方法将表面反应性基团转变为标准阳离子交换官能团：在罐中加入6g的珠粒、4.7ml的Milli-Q
Figure BDA00002746450500147
水、0.8g的50重量%的NaOH和2.3g的焦亚硫酸钠，并在室温下搅拌过夜。用3x500ml的Milli-Q质量的水洗涤珠粒。该步骤产生无延伸剂的对照树脂，其中蛋白质可与树脂表面结合，但没有延伸剂或接枝的链。根据表2中所示的实施例6中的方法测试平衡蛋白质结合容量。
实施例2D.使用表面反应性基团和阴离子交换延伸剂改性合成聚合物树脂
将20mL的聚甲基丙烯酸酯珠粒(HW-65,45um,TOSOH BioScience)浸泡在25℃下的1M NaOH中2小时，然后用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500149
水洗涤。然后根据以下方法用表面反应性基团烯丙基缩水甘油醚(AGE)对珠粒改性：在罐中加入15mL的珠粒、18g的1M NaOH、2.4g的AGE、3g的Na2SO4，然后在50℃下搅拌过夜。用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500151
水洗涤珠粒，并过滤成湿饼。然后在罐中将10mL的湿饼加至包含6g的75%(3-丙烯酰氨基丙基)三甲基氯化铵溶液、0.12g的过硫酸铵和13.6g的Milli-Q
Figure BDA00002746450500152
水的溶液中。将罐搅拌，并在65℃下加热1小时。过滤珠粒并用500mL的Milli-Q水洗涤。根据表2中所示的实施例6中的方法测试平衡蛋白质结合容量。
实施例2E.不使用表面反应性基团和延伸剂的情况下改性合成聚合物树脂，由此产生标准阴离子交换树脂
将10mL的聚甲基丙烯酸酯珠粒(HW-65,45um,TOSOH BioScience)浸泡在25℃下的1M NaOH中2小时，然后用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500154
水洗涤，
并过滤成湿饼。然后在罐中将湿饼加至包含6g的75%(3-丙烯酰氨基丙基)三甲基氯化铵溶液、0.12g的过硫酸铵和13.6g的Milli-Q
Figure BDA00002746450500155
水的溶液中。
将罐搅拌并在65℃下加热1小时。过滤珠粒并用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500156
水洗涤。该步骤产生不含延伸剂的对照树脂，其中蛋白质可与树脂表面结合，
但没有延伸剂或接枝的链。根据表2中所示的实施例6中的方法测试平衡蛋白质结合容量。
表2.合成聚合物珠粒的平衡结合容量
Figure BDA00002746450500157
实施例2A-2D表明所述方法可适用于多于一种类型的基质，在此的聚甲基丙烯酸酯与实施例1中的琼脂糖，具有相似的容量改进。对于阳离子和阴离子交换延伸剂，观察到2-3倍的容量提高用于将延伸剂接枝至烯丙基表面反应性基团。此外，实施例1D和1E的容量高于现有技术的延伸剂改性的树脂FractogelS。这表明使用通过本方法的接枝延伸剂仍可扩散大蛋白质，例如IgG，并且事实上容量比现有技术改善。
实施例2F.使用表面反应性基团和疏水作用延伸剂改性合成聚合物树脂
将50mL的聚甲基丙烯酸酯珠粒(HW-65,45um,TOSOH BioScience)浸泡在25℃下的1M NaOH中2小时，然后用500mL的Milli-Q水洗涤。然后根据以下方法用表面反应性基团烯丙基缩水甘油醚(AGE)对珠粒改性：在罐中加入10g的珠粒、18g的2M NaOH、12g的AGE、3g的Na2SO4，然后在50℃下搅拌过夜。用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500163
水洗涤珠粒，并过滤成湿饼。然后在罐中将5g的湿饼加至包含0.2g的N-苯基丙烯酰胺、0.08g的过硫酸铵、3.4g的N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)、3.4g的己二醇和3g的Milli-Q水的溶液中。将罐搅拌，并在80℃下加热17小时。过滤珠粒并用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500165
水洗涤。根据实施例6中的方法测得平衡蛋白质结合容量(IgG)为33g/L。
实施例2G.使用表面反应性基团和疏水作用延伸剂改性合成聚合物树脂
将50mL的聚甲基丙烯酸酯珠粒(HW-65,45um,TOSOH BioScience)浸泡在25℃下的1M NaOH中2小时，然后用500mL的Milli-Q水洗涤。然后根据以下方法用表面反应性基团烯丙基缩水甘油醚(AGE)对珠粒改性：在罐中加入10g的珠粒、18g的8M NaOH、12g的AGE、3g的Na2SO4，然后在50℃下搅拌过夜。用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500167
水洗涤珠粒，并过滤成湿饼。然后在罐中将5g的湿饼加至包含0.2g的N-苯基丙烯酰胺、0.08g的过硫酸铵、3.4g的N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)、3.4g的己二醇和3g的Milli-Q
Figure BDA00002746450500168
水的溶液中。将罐搅拌，并在80℃下加热17小时。过滤珠粒并用500mL的Milli-Q水洗涤。根据实施例6中的方法测得平衡蛋白质结合容量为40g/L。
实施例3A.具有特殊化学环境和两个不同的孔径区域的非对称性琼脂糖珠粒
内部结构的制备
根据美国专利申请2007/0212540中教导的方法制备非对称性琼脂糖珠粒：在80°下的第一油浴中，在恒定搅拌下将1000ml的15%琼脂糖溶液(D-5Agarose，来自Hispanagar)加至包含120ml的Span80乳化剂的2000ml的矿物油中，得到油相连续的乳液。然后将该乳液以3L/min的流速泵抽通过0.5英寸(12.7mm)直径、6英寸(152.4mm)长的Kenics静态混合器(KMR-SAN-12)进入5℃下的第二矿物油浴中。得到具有最大粒径为200μm的球形均匀琼脂糖珠粒。使珠粒沉降，用水、乙醇然后再用水洗涤，并过筛而得到75-125μm的珠粒粒径。然后根据Porath等人,″Agar derivatives forchromatography,electrophoresis and gel bound enzymes.Desulphated andreduced crosslinked agar and agarose in spherical bead form″,(Journal ofChromatography,vol.60,1971,pp.167-177)(将其公开内容援引并入本文)中教导的方法将该珠粒交联。然后用烯丙基缩水甘油醚(AGE)对该珠粒改性。在罐中加入120g的珠粒、150ml的8M NaOH、30g的硫酸钠和100g的AGE，并在45℃下搅拌过夜。用3x500ml的Milli-Q质量的水洗涤珠粒。在表3中显示选择性测试结果。
实施例3B.具有特殊化学环境和两个不同的孔径区域的非对称性琼脂糖珠粒：具有标准阳离子交换官能团的内部结构
将实施例3A中制备的部分珠粒改性而产生标准阳离子交换材料。用焦亚硫酸钠改性该珠粒。在罐中加入60g的珠粒、47ml的Milli-Q
Figure BDA00002746450500172
水、7.9g的50重量%的NaOH和23.4g的焦亚硫酸钠，并在室温下搅拌过夜。用3x500ml的Milli-Q质量的水洗涤该珠粒。
然后根据以下方法用6%的琼脂糖包覆该珠粒：将50ml的珠粒混入300ml的6%琼脂糖溶液(D-5 Agarose，来自Hispanagar)中而得到浆料。在恒定搅拌下将琼脂糖-珠粒混合物加入90℃下的1000ml的矿物油中，得到油相连续的乳液。然后将该乳液以3L/min的流速泵抽通过0.5英寸(12.7mm)直径、6英寸(152.4mm)长的Kenics静态混合器(KMR-SAN-12)进入5℃下的矿物油浴中。所得的琼脂糖珠粒具有10μm的预期外层厚度，并且珠粒群主要是单核的(>50%)。使珠粒沉降，用水、乙醇然后再用水洗涤，并过筛而得到75-125μm的珠粒粒径。然后根据Porath等人,″Agar derivatives forchromatography,electrophoresis and gel bound enzymes.Desulphated andreduced crosslinked agar and agarose in spherical bead form″,(Journal ofChromatography,vol.60,1971,pp.167-177)(将其公开内容援引并入本文)中教导的方法将该珠粒交联。用3x500ml的Milli-Q
Figure BDA00002746450500181
质量的水洗涤珠粒。
然后用溴丙烷磺酸(BPSA)对珠粒改性。在罐中加入10g的珠粒、30ml的5M NaOH、7.2g的BPSA，并在50℃下搅拌过夜。用500ml的Milli-Q
Figure BDA00002746450500182
质量的水洗涤珠粒，然后存放在20%的乙醇中。在表3中显示选择性测试结果。
实施例3C.具有特殊化学环境和两个不同的孔径区域的非对称性琼脂糖珠粒：使用本发明方法的内部结构；阳离子交换延伸剂，具有改善的结合强度/选择性
将实施例3A中制备的部分珠粒改性而产生具有改善的结合强度/选择性的阳离子交换材料。用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500183
水洗涤珠粒，并过滤成湿饼。然后在塑料袋中将湿饼(10mL)加至包含2.4g的2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、17.3g的Milli-Q
Figure BDA00002746450500184
水和0.2g的N,N-二甲基丙烯酰胺和0.12g的Irgacure
Figure BDA00002746450500185
2959(CIBA)的20mL溶液中。将塑料袋放置在两个聚乙烯板之间。然后将聚乙烯夹层板用带捆扎在将组装件输送通过具有″H″灯泡的Fusion Systems UV曝光实验装置的输送装置上。曝光时间由组装件移动通过UV单元的速度控制。在该实施例中，组装件以每分钟15英尺移动通过UV室。使组装件静置5分钟，然后去除袋子，过滤珠粒，并用500mL的Milli-Q
Figure BDA00002746450500186
水洗涤。
然后根据以下方法用6%的琼脂糖包覆珠粒：将50ml的珠粒混入300ml的6%的琼脂糖溶液(D-5Agarose，来自Hispanagar)中而得到浆料。在恒定搅拌下将琼脂糖-珠粒混合物加至90℃下的1000ml的矿物油中，得到油相连续的乳液。然后将该乳液以3L/min的流速泵抽通过0.5英寸(12.7mm)直径、6英寸(152.4mm)长的Kenics静态混合器(KMR-SAN-12)进入5℃下的矿物油浴中。所得的琼脂糖珠粒具有10μm的预期外层厚度，并且珠粒群主要是单核的(>50%)。使珠粒沉降，用水、乙醇然后再用水洗涤，并过筛而得到75-125μm的珠粒粒径。然后根据Porath等人,″Agar derivatives forchromatography,electrophoresis and gel bound enzymes.Desulphated andreduced crosslinked agar and agarose in spherical bead form″,(Journal ofChromatography,vol.60,1971,pp.167-177)(将其公开内容援引并入本文)中教导的方法将该珠粒交联。用3x500ml的Milli-Q
Figure BDA00002746450500191
质量的水洗涤珠粒。
然后用溴丙烷磺酸(BPSA)对珠粒改性。在罐中加入10g的珠粒、30ml的5M NaOH、7.2g的BPSA，并在50℃下搅拌过夜。用500ml的Milli-Q
Figure BDA00002746450500192
质量的水洗涤珠粒，然后存放在20%的乙醇中。在表3中显示选择性测试结果。
实施例3D.具有特殊化学环境和两个不同的孔径区域的非对称性琼脂糖珠粒：使用本发明方法的内部结构；阳离子交换延伸剂，具有改善的结合强度/选择性
使用如下一个额外的最终改性步骤与实施例3C相同地对实施例3A的珠粒改性：然后用溴丙烷磺酸(BPSA)对珠粒改性。在罐中加入10g的珠粒、30ml的5M NaOH、7.2g的BPSA，并在50℃下搅拌过夜。用500ml的Milli-Q
Figure BDA00002746450500193
质量的水洗涤珠粒，然后存放在20%的乙醇中。在表3中显示选择性测试结果。
实施例3E.具有特殊化学环境和两个不同的孔径区域的非对称性琼脂糖珠粒：使用本发明方法的内部结构；阳离子交换延伸剂，具有改善的结合强度/选择性
使用如下两个额外的最终改性步骤与实施例3C相同地对实施例3A的珠粒改性：然后用溴丙烷磺酸(BPSA)对珠粒改性。在罐中加入10g的珠粒、30ml的5M NaOH、7.2g的BPSA，并在50℃下搅拌过夜。用500ml的Milli-Q
Figure BDA00002746450500194
质量的水洗涤珠粒。然后用溴丙烷磺酸(BPSA)对该珠粒改性。在罐中加入10g的珠粒、30ml的5M NaOH、7.2g的BPSA，并在50℃下搅拌过夜。用500ml的Milli-Q
Figure BDA00002746450500201
质量的水洗涤珠粒，然后存放在20%的乙醇中。在表3中显示选择性测试结果。
表3.非对称性琼脂糖珠粒的选择性
实施例3C-3E教导了一种非对称性琼脂糖珠粒，其内部珠粒结构根据本发明方法改性，外部结构通过一系列标准阳离子交换方法改性。相比之下，实施例3B教导了具有通过标准离子交换方法改性的内部和外部结构的非对称性琼脂糖珠粒。
表3显示了在氯化钠梯度洗脱过程中洗脱蛋白质所需的柱体积(CV)上IgG和溶菌酶之间的分离。清楚的是实施例3B和SP-Sepharose Fast Flow即一种市售的琼脂糖树脂提供相似的两种蛋白质之间的分离。
但是，具有包含本发明方法的内部结构的实施例3C-3E提供了改善得多的两种蛋白质的分离。
实施例4选择性测试方法
将两种具有不同净电荷和分子量的蛋白质用以测试常规阳离子交换(CEX)条件下的选择性或分离因子。包含0.5mg/ml多克隆IgG(Sigma)和0.5mg/ml的溶菌酶(Sigma)的蛋白质在50mM乙酸盐缓冲液中与NaCl的混合物以得到在pH4.5下10mS的电导率，将该混合物以200cm/hr(7cm床高,0.66cm直径)施用于各样品柱，使得负载在介质上的净蛋白为10mg/mL。然后使用在10mS下开始并在80mS下结束的30CV的NaCl梯度，以200cm/hr洗脱蛋白质混合物。从洗脱梯度开始(对死体积校正)，根据柱体积(CV)记录各蛋白质的峰。
实施例5.表面反应性基团浓度的测定
在加入表面反应性基团-烯丙基缩水甘油醚(AGE)之后，如下使用溴水洗涤并滴定以上教导的实施例改性的代表性样品：制得10%NaOBr(20mL)和50mM乙酸钠(80mL，pH4.5)的混合物。通过在水中滴定100uL的AGE校正溶液中的溴浓度。使用溴溶液滴定10mL的表面改性的珠粒样品，直至溴的颜色持续不变，这表示AGE表面基团完全反应。
实施例6.平衡蛋白质结合容量的测定
使用以下方法对以上实施例中教导的各产物和市售基准物的静态或平衡容量进行测定：
1、在合适的平衡缓冲液(EQ缓冲液，参见表4)中制得各样品的珠粒悬浮液(10%的珠粒)
2、搅拌珠粒悬浮液，并将100μL的样品用滴管移入三个15mL的塑料锥形管中。
3、将EQ缓冲液中的合适的蛋白质溶液(进料,所有蛋白质是多克隆的，来自Sigma-Aldrich,参见表2)加入各管(10mL)中。
4、将管上盖，并在Labquake旋转器/震动器上缓慢旋转(<10rpm)。
5、在16小时后，使珠粒沉降，并在结合后取得溶液的UV读数。
6、使用合适的进料蛋白的消光系数将UV吸光度转换为蛋白质浓度，并用质量守恒确定饱和容量。
表4.用于平衡容量试验的缓冲液条件
Figure BDA00002746450500221
对于本文教导方法的蛋白质结合性质，测试多个不同结合条件和蛋白分离的总蛋白容量。从对比实施例1A/1B、2A/2C和2D/2E明显的是，加入烯丙基表面反应性基团改善了接枝的聚合物延伸剂的密度，使得蛋白质容量相对于不含表面反应性基团和/或不含延伸剂显著改善。在实施例1A/1B中，对于与表面反应性烯丙基的接枝，IgG的琼脂糖珠粒容量为约10倍更高(100g/L对11/L)。
如通过实施例1D/1E和2A/2B的IgG容量所证实的，本文教导的方法还改进了树脂的结合强度。
此外，实施例1D和2A设计为在pH5、8mS电导率下结合IgG。无论基质是琼脂糖或其它合成聚合物，延伸剂的化学性质可调整为特定的结合条件。对于某些蛋白质纯化方法，希望的结合条件出现在较高的盐浓度下，这对于一些离子交换剂可能是有问题的。
例如，对照树脂(FractogelS)在使用氯化钠将电导率从8mS提高至16mS时显示出IgG的结合容量的下降。这可能是由于树脂对于IgG的结合强度下降。
使用本文教导的接枝方法，如实施例1E和2B所证实的，在将电导率从8mS提高至16mS时树脂降低的IgG的结合容量可得到改善。同样不管基质如何，树脂的结合性质可进行调整，产生在16mS的电导率下的高容量，并且在那些条件下能使结合容量提高>50%。这能使得在较高电导率下有效负载IgG，这扩展了本领域技术人员可用来从杂质中分离目标蛋白质的缓冲液条件。
本发明可与任何样品制备方法一起使用，所述样品制备方法包括但不限于色谱；制备蛋白质色谱电泳；凝胶过滤；样品离心；在线样品制备；诊断试剂盒测试；诊断测试；化学品输送；生物分子输送；高通量筛选；亲和性结合测试；液体样品的提纯；流体样品组分的基于粒径的分离；流体样品组分的基于物理性质的分离；流体样品组分的基于化学性质的分离；流体样品组分的基于生物性质的分离；流体样品组分的基于静电性质的分离；及它们的组合。
本发明还提供可用以通过在蛋白质分离过程中向表面加入聚合物延伸剂，而不填充或堵塞扩散孔且不限制蛋白质的扩散等提高具有扩散孔的多孔结构的结合容量的试剂盒。加入到多孔结构表面的聚合物延伸剂在较高的电导率下提供显著的结合容量。
术语“试剂盒”包括例如在单个包装中组合的各组分、单独包装并一起销售的各组分、或在目录中一起展示的各组分(例如在目录中同一页或展开的双页上)。
本文教导的本发明接枝方法可通过向表面加入延伸剂提高具有扩散孔的多孔结构的结合容量，而不填充孔且不限制扩散。本文教导的本发明接枝方法还可改变树脂的结合强度和选择性，这是对于有效的蛋白质分离所需的两个关键性的树脂性质。如本文教导的，这可通过改变所使用的接枝条件或单体组成而容易地实现。最后，本文教导的本发明接枝方法还可制备在高电导率下具有显著结合容量的延伸剂。
以上的公开可包括多个具有独立用途的不同发明。尽管这些发明中每一个已以其优选形式公开，但是本文公开和说明的其具体实施方案不应以限制性的方式理解，因为可能有多种变化。本发明的主题包括本文教导的各种要素、特征、功能和/或性质的所有具有新颖性且非显而易见的组合和子组合。所附权利要求特别给出具有新颖性且非显而易见的某些组合和子组合。在特征、功能、要素和/或性质的其它组合和子组合中具体实施的发明可在要求本申请或相关申请的优先权的申请中要求保护。这些权利要求，无论涉及不同的发明或相同的发明，并且无论与原权利要求在范围上是更宽、更窄、相同或不同，都视为包括在本公开的发明主题中。

Claims (21)

1.改性具有扩散孔和表面反应性不饱和官能团的多孔基材的方法，所述方法包括：
a)提供多孔基材，所述多孔基材具有扩散孔以及与该基材的表面附着的表面反应性不饱和官能团；
b)提供包含接枝单体或接枝单体混合物的溶液以及可溶性自由基聚合引发剂；
c)使所述基材与所述溶液接触；和
d)在所述溶液中加入所述自由基聚合引发剂，由此在所述基材的表面上的表面反应性不饱和官能团和所述接枝单体或接枝单体混合物之间引发自由基聚合，以形成与所述基材偶联的聚合物链。
2.权利要求1的方法，其中所述基材选自多孔聚合物珠粒、多孔琼脂糖珠粒和多孔陶瓷珠粒。
3.权利要求1的方法，所述方法在步骤(d)之后还包括：
e)洗涤所述基材以去除任何过量未反应的接枝单体、接枝单体混合物或未附着的聚合物链，得到蛋白质结合容量大于100g/L的多孔基材。
4.权利要求3的方法，所述方法在步骤(e)之后还包括：
f)将配体与附着在所述多孔基材表面上的聚合物链偶联。
5.权利要求1的方法，其中所述自由基聚合引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾、偶氮双(4-氰基戊酸)、Irgacure
Figure FDA00002746450400011
2959、2,2′-偶氮双(2-脒基-丙烷)盐酸盐及它们的组合。
6.权利要求1的方法，其中所述不饱和官能团由烯丙基构成。
7.权利要求6的方法，其中所述烯丙基由式R-O-CH2-CH=CH2构成，其中R是多孔基材表面或所述表面和烯丙基之间的连接基。
8.权利要求1的方法，其中约20-约400μmol/mL的表面反应性基团具有式R-O-CH2-CH=CH2，其中R是多孔基材表面或所述表面和烯丙基之间的连接基。
9.权利要求1的方法，其中所述接枝单体或接枝单体混合物选自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、丙烯酸、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、[3-(甲基丙烯酰基氨基)丙基]三甲基氯化铵、2-丙烯酰氨基-乙醇酸、衣康酸或乙基乙烯基酮、甲基丙烯酸缩水甘油酯、N,N-二甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟丙酯、N-苯基丙烯酰胺、羟丙基丙烯酰胺及它们的组合。
10.权利要求1的方法，其中所述多孔基材上的扩散孔的孔径为>约
Figure FDA00002746450400021
且<约1μ。
11.使用表面聚合物链延伸剂改性具有扩散孔的多孔色谱珠粒的方法，所述方法包括：
a)提供多孔色谱珠粒，所述多孔色谱珠粒具有扩散孔、表面以及与所述表面偶联的表面反应性不饱和官能团；
b)提供包含接枝单体或接枝单体混合物的溶液以及可溶性自由基聚合引发剂；
c)使所述色谱珠粒与所述溶液接触；和
d)在所述溶液中加入所述自由基聚合引发剂，由此在所述珠粒上的表面反应性不饱和官能团和所述接枝单体或接枝单体混合物之间引发自由基聚合，以形成与所述珠粒偶联的聚合物链延伸剂；
e)洗涤所述珠粒以去除任何过量未反应的接枝单体、接枝单体混合物或未附着的聚合物链，得到蛋白质结合容量大于100g/L的多孔色谱珠粒；和
f)将配体与附着在所述色谱珠粒表面上的聚合物链偶联。
12.权利要求11的方法，其中所述多孔色谱珠粒选自聚合物珠粒、琼脂糖珠粒和陶瓷珠粒。
13.权利要求11的方法，其中所述自由基聚合引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾、偶氮双(4-氰基戊酸)、Irgacure
Figure FDA00002746450400031
2959、2,2′-偶氮双(2-脒基-丙烷)盐酸盐及它们的组合。
14.权利要求11的方法，其中所述不饱和官能团由烯丙基构成。
15.权利要求14的方法，其中所述烯丙基由式R-O-CH2-CH=CH2构成，其中R是多孔基材表面或所述表面和烯丙基之间的连接基。
16.权利要求11的方法，其中约20-约400μmol/mL的表面反应性基团具有式R-O-CH2-CH=CH2，其中R是多孔色谱珠粒或所述珠粒表面和烯丙基之间的连接基。
17.权利要求11的方法，其中所述接枝单体或接枝单体混合物选自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺及它们的组合。
18.权利要求11的方法，其中所述多孔色谱珠粒上的扩散孔的孔径为>约
Figure FDA00002746450400032
且<约1μ。
19.权利要求11的方法，其中所述配体选自强阳离子交换基团、磺丙基、磺酸、阴离子交换基团、三甲基氯化铵、弱阳离子交换基团、羧酸、弱阴离子交换基团、N,N-二乙基氨基、DEAE、疏水作用基团、苯基、丁基和丙基、以及亲和基团、蛋白质A、蛋白质G和蛋白质L。
20.权利要求7、8、15和16中任一项的方法，其中所述连接基选自甲基丙烯酸酯、酰胺、丙烯酰胺、环氧化物、胺、丁二醇二缩水甘油醚、环氧氯丙烷、聚乙二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、氯乙酸烯丙酯、氯丙烯、烯丙基(氯)二甲基硅烷、烯丙基缩水甘油醚、溴丙烯、甲基丙烯酸烯丙酯及它们的组合。
21.权利要求4的方法，其中所述配体选自强阳离子交换基团、磺丙基、磺酸、阴离子交换基团、三甲基氯化铵、弱阳离子交换基团、羧酸、弱阴离子交换基团、N,N-二乙基氨基、DEAE、疏水作用基团、苯基、丁基和丙基、以及亲和基团、蛋白质A、蛋白质G和蛋白质L。
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