CN104245078A - 分离方法和分离基质 - Google Patents

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Abstract

本发明公开将生物分子与液体中的至少一种其它组分分离的方法，其包括使所述液体与包含固体载体和与所述固体载体结合的聚合物链的分离基质接触的步骤。聚合物链包含从结构CH2=CH-L-X的第一个单体衍生的单元，其中L是共价键或包含2-6个碳原子的烷基醚或羟基取代的烷基醚链，和X是磺酸根或膦酸根基团。

Description

分离方法和分离基质
本发明的技术领域
本发明涉及生物分子的分离，和更具体地涉及蛋白的离子交换分离。本发明还涉及适合于生物分子的分离的分离基质和涉及制备这样的基质的方法。
发明背景
有许多情况需要从液体分离一种化合物，例如污染物或所需的分子。基于电荷-电荷的相互作用被用于许多领域以捕获并因而分离荷电的或可荷电的化合物。
在化学和生物技术领域，目标化合物如药物或药物候选物通常需要从来源于生产过程的污染物质中分离。例如，通过重组宿主细胞的表达产生的蛋白药物或药物候选物将需要例如从宿主细胞和可能的细胞碎片、其它宿主细胞蛋白、DNA、RNA和源自发酵或细胞培养液的任何其它化合物中分离。由于其对目标化合物通用性和灵敏性，在许多当前使用的生物技术纯化方案中，色谱作为至少一个步骤被包括在内。术语色谱包括一系列密切相关的分离方法，所有这些方法均基于使两个相互不混溶的相接触这一原理。更具体地，目标化合物被引入流动相，所述流动相与固定相接触。然后目标化合物在其被流动相携带通过系统时，将经历固定相和流动相之间的一系列相互作用。相互作用利用样品组分的物理或化学特性的差异。
色谱中的固定相包含配体(其为能够与目标化合物相互作用的官能团)已与之偶联的固体载体。因此，配体将赋予载体进行分离、鉴定和/或纯化感兴趣的分子的能力。液相色谱方法通常按照分离化合物所利用的相互作用原理命名。例如，离子交换色谱是基于电荷-电荷的相互作用；疏水相互作用色谱(HIC)利用疏水相互作用；和亲和色谱是基于特异性的生物亲和性。
众所周知，离子交换是基于荷电的目标化合物和相反荷电的色谱基质之间的可逆相互作用。最常见通过增加盐浓度进行洗脱，但改变pH同样是可能的。离子交换剂分为阳离子交换剂(其中荷负电的色谱基质用于吸附荷正电的目标化合物)和阴离子交换剂(其中荷正电的色谱基质用于吸附荷负电的目标化合物)。术语"强"离子交换剂用于在广泛的pH间隔内荷电的离子交换剂，而"弱"离子交换剂在某些pH值下是可荷电的。一种通常使用的强阳离子交换剂包括磺酸根(sulphonate)配体，称为S基团。在某些情况下，这样的阳离子交换剂按照由官能团及其连接于载体的接头形成的基团命名；例如SP阳离子交换剂，其中S基团通过丙基连接于载体。
离子交换剂中的荷电基团(通常称为配体)可以不同的方式连接于载体或支持材料。几篇出版物(US5453186、WO2008145270、US8092682、WO2012015379、EP2412433和EP2412435)描述了荷电单体如何才能接枝聚合到支持材料上，以形成其中配体存在于与支持物共价连接的悬挂接枝聚合物链(pendant graft polymer chains)上的离子交换剂。然而，特别是在生物加工领域，对分离基质的需求不断增加，因此存在着对进一步开发基质，特别是关于提供改进的选择性和容量以及在碱性清洗过程中的稳定性的基质的需求。
发明概述
本发明的一个方面是提供一种具有高通量和高选择性的分离方法。这可用如在权利要求1中定义的方法实现。一个优点是对目标蛋白的高结合容量可与例如单体的和聚集的免疫球蛋白之间的高选择性一起获得。另外的优点是在升高的离子强度下的高结合容量、快速的物质传输/结合动力学和高碱稳定性 –允许在基质必须被更换之前进行很多次循环 – 可得以实现。
本发明的另一个方面是提供具有对目标蛋白的高结合容量和高选择性，以及高碱稳定性的分离基质。这可使用如在权利要求16中定义的基质实现。
本发明的第三个方面是提供一种制备具有对目标蛋白的高结合容量和高选择性，以及高碱稳定性的分离基质的方法。这可采用如在权利要求29中描述的方法实现。
本发明的其它合适的实施方案在所附的权利要求书中描述。
附图简述
图1显示用烯丙基缩水甘油醚使载体上的羟基烯丙基化的反应流程。
图2显示用于接枝的以下单体的混合物：a) 乙烯基磺酸(VSA)和乙烯基吡咯烷酮 (VP)、 b) 3-烯丙氧基, 2-羟基-1-丙烷磺酸(APS)和乙烯基吡咯烷酮和 c) 甲基丙烯酸羟乙基酯(HEMA)和乙烯基膦酸(VPA)。
图3显示为除去聚集的抗体的理想(实线)选择性曲线和不太理想的(虚线)曲线。
图4显示对VP-VSA原型S67-G1-A100和S67-G1-A200与参照物比较的聚集体除去选择性曲线。
图5显示对VP-VSA原型S50-G1-A25和S50-G1-A50与参照物比较的聚集体除去选择性曲线。
图6显示对VP-VSA原型S50-G2-A25和S50-G3-A25与参照物比较的聚集体除去选择性曲线。
图7显示对VP-VSA原型S50-G4-A200和S67-G1-A200与参照物比较的聚集体除去选择性曲线。初始的聚集体浓度是7%。
图8显示对VP-VSA原型S67-G1-A200、S67-G1-A450和S50-G4-A200与参照物比较的聚集体除去选择性曲线。初始的聚集体浓度是7%。
图9显示对VP-VSA原型S77-G1-A200和S77-G1-A450与参照物比较的聚集体除去选择性曲线。
图10显示对VP-VSA原型S80-G1-A200与参照物比较的聚集体除去选择性曲线。
图11显示对基于聚二乙烯基苯的VP-VSA原型P63-G1-A200在pH 5.0下与参照物比较的聚集体除去选择性曲线。
图12显示对基于聚二乙烯基苯的VP-VSA原型P63-G1-A200在pH 5.25下与参照物比较的聚集体除去选择性曲线。
图13显示蛋白混合物和单克隆抗体在 a) 参照基质SP Sepharose HP和b) 本发明的VPA-接枝基质上的色谱图。
实施方案详述
本发明的一个方面公开一种将生物分子与液体中的至少一种其它组分分离的方法。所述方法包括使液体与分离基质接触的步骤，所述分离基质包含固体载体和与固体载体结合的聚合物链，其中聚合物链包含从结构CH2=CH-L-X的第一个单体衍生的单元，其中L是 i) 共价键或 ii) 烷基醚或羟基取代的烷基醚链(其任何一个包含2-6个碳原子)，和X是磺酸根或膦酸根基团。聚合物链中的这些单元的结构是：
所述生物分子可溶于液体，并且所述其它组分也可溶于液体。接触步骤可例如经输送液体通过柱、膜吸附剂或用分离基质装填的其它装置发生，但它也可通过例如其中将基质和液体混合在容器中的分批吸附进行。分离可通过将生物分子或其它组分吸附到基质上而发生。接触步骤中的pH可例如是4-7，例如4.5-6或4.75-5.5，并且离子强度可以是例如10-100 mM，例如20-60 mM。液体可以是含水缓冲液并可包含缓冲组分例如乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐等和诸如碱金属氯化物、碱金属硫酸盐、硫酸铵等盐。它也可包含添加剂如去垢剂、氨基酸、水-可混溶的溶剂、水溶性聚合物、离液剂、cosmotrope等。
在某些实施方案中，生物分子是生物大分子，例如蛋白、肽或核酸。合适的蛋白的实例包括血浆蛋白、免疫球蛋白和重组蛋白像例如促红细胞生成素、干扰素、凝血因子等，而肽的实例可以是胰岛素等。生物分子也可以是疫苗抗原，包括病毒颗粒、病毒蛋白、细菌多糖和细菌蛋白。
在某些实施方案中，生物分子是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫球蛋白的蛋白，例如抗体、抗体片段、抗体缀合物或抗体融合蛋白。免疫球蛋白，以及片段和免疫球蛋白融合蛋白是一类重要的生物药物，本发明的方法特别适合于从这些物质中除去污染物。
在某些实施方案中，所述至少其它组分是蛋白，例如宿主细胞蛋白、蛋白A或免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫球蛋白的蛋白的聚集体。聚集体的实例可以是例如二聚体、三聚体和/或更高级的多聚体。本发明的方法特别适合于蛋白-蛋白分离，例如从免疫球蛋白和相关物质中除去宿主细胞蛋白、蛋白A、聚集体、荷电变体(charge variants)、错折叠蛋白等。这些污染物的有效清除在生物药物的生产中是必需的，因为它们可引起免疫原性和其它不需要的副作用。其它组分还可以是例如在细胞培养期间加入的抗生素、内毒素、病毒或溶剂和为灭活病毒所加入的去垢剂。其它组分还可以是用于形成缀合物的反应物，例如，抗体-药物缀合物的药物组分或在PEG-化蛋白的情况下的PEG。
在某些实施方案中，液体是来自先前的色谱步骤的洗脱液，所述色谱步骤例如亲和步骤、离子交换步骤、多峰(multimodal)步骤或疏水相互作用步骤。本发明的方法特别适合于除去存在于例如从先前的色谱步骤洗脱的蛋白溶液中残留的污染物。先前的步骤可以是捕获步骤例如蛋白A或蛋白L色谱步骤，并且残余的污染物可以是例如宿主细胞蛋白、聚集体、沥出的蛋白A或L或病毒。
在某些实施方案中，液体是来自分离基质的流通液，所述分离基质例如离子交换基质、多峰基质或疏水相互作用基质。方法可例如在先前的流通色谱步骤，例如在抗体处理中的蛋白A步骤后应用的阴离子交换或多峰阴离子交换流通步骤之后应用。
在某些实施方案中，所述生物分子是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫球蛋白的蛋白，例如抗体、抗体片段、抗体缀合物或抗体融合蛋白，且其中至少1%，例如至少5%或至少10%的所述生物分子呈聚集体的形式，例如二聚体、三聚体和更高级的多聚体。方法特别用于除去聚集体，所述聚集体可在细胞培养期间或者在处理期间产生，例如当免疫球蛋白在洗脱蛋白A柱期间或在病毒灭活期间暴露于低pH时产生。
在某些实施方案中，该方法还包括用洗脱缓冲液从所述分离基质洗脱所述生物分子的步骤。本发明的方法可以结合-洗脱模式进行，在该情况下生物分子被吸附到基质上和之后用洗脱缓冲液洗脱。其它组分可在流通液中通过基质，或它们可结合至某种程度并分别地从生物分子中洗脱。可随着缓冲液组成或pH的梯级变化、一系列的梯级变化或者通过缓冲液组成或pH的梯度进行洗脱。所述方法还可包括使用洗涤缓冲液的洗涤步骤。该步骤用于除去非结合或松散结合的其它组分的目的，并可例如在接触步骤之后和洗脱步骤之前应用。洗脱和洗涤缓冲液可包含缓冲物质如乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸等。它们还可包含中性盐、易溶盐、去垢剂、氨基酸、水-可混溶的溶剂、水溶性聚合物、离液剂、cosmotrope和其它添加剂。
该方法也可以流通模式应用，其中其它组分吸附到基质上，而生物分子不吸附或吸附极弱并可在流通液中以纯化的形式回收。然后可通过应用于基质的剥离缓冲液(strip buffer)除去吸附的其它组分。
在某些实施方案中，该方法还包括用清洗液清洗所述分离基质的步骤。清洗液体可以是包含至少0.1 mol/l的碱金属氢氧化物如NaOH或KOH的碱性清洗液。它可以是例如0.5-2 mol/l NaOH或KOH溶液，例如约1 M NaOH的水溶液。除了碱金属氢氧化物外，该溶液还可包含离液剂、溶剂、去垢剂、盐等以改进清洗效率。本发明方法的特定优点是可使用碱性清洗而不引起对基质的降解。包括用碱性清洗液(例如1 M NaOH)清洗步骤的方法可重复许多次，例如至少10、至少50、10-100或50-100次。这允许在很多次循环中重复使用基质，这对于良好的处理经济性是重要的。
该方法还可包括另外的后续分离步骤。该方法可例如跟有一个或多个色谱步骤，例如离子交换、阳离子交换、多峰、羟磷灰石、疏水相互作用或尺寸排阻色谱。该方法还可后接膜过滤，例如超滤。
在某些实施方案中，聚合物链是共聚物链且还包含从第二个非荷电单体衍生的单元。共聚物链可以是例如无规共聚物链或它们可具有交替或分段(segmented)结构。在链中具有非-荷电单元的一个优点是可控制链的局部电荷密度，其能够改进结合容量和选择性。通过掺入非-荷电的共聚单体，还可能在基质的生产期间增加缓慢聚合的荷电共聚单体的掺入。
在某些实施方案中，第二个非荷电单体是N-乙烯基酰胺。n-乙烯基酰胺可例如选自N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基甲酰胺和N-乙烯基乙酰胺。这些单体与CH2=CH-L-X单体组合提供有利的链结构，并且聚合物为对碱性降解有高度抗性的。
在某些实施方案中，L是共价键或-CH2-O-L’-，其中L’是C2-C4或C3-C4亚烷基链，其任选地被至少一个羟基取代。当L是共价键时，X将直接连接于CH2=CH基团(并从而连接于聚合物的主链)，并且当L是-CH2-O-L’-时，单体将是烯丙基醚。这些结构不含羰基且赋予聚合物优越的碱稳定性。还显示形成的聚合物有利于提供好的选择性和结合容量。
在某些实施方案中，第一个单体选自乙烯基磺酸盐、乙烯基膦酸盐和烯丙氧基羟基丙基磺酸盐。在某些实施方案中，第一个单体从这组选出，或为乙烯基磺酸盐，并且第二个单体是N-乙烯基酰胺，例如N-乙烯基吡咯烷酮。这些单体的组合给出特别的碱稳定聚合物，以及单体显示出有利的共聚合行为，以致可以制备具有合适量的接枝聚合物和合适的离子容量的基质。
在某些实施方案中，在所述共聚物链中，从第一个单体衍生的单元与从第二个单体衍生的单元的摩尔比是0.05至5，例如0.10至2或0.5至2。
在某些实施方案中，聚合物或共聚物链通过从烯丙基醚例如烯丙基羟基丙基醚衍生的接头单元结合至载体。
一方面，本发明公开包含固体载体和与固体载体结合的共聚物链的分离基质，其中共聚物链包含从以下单体衍生的单元：
a) 结构CH2=CH-L-X的第一个单体，其中L是共价键或包含2-6个碳原子的烷基醚或羟基取代的烷基醚链，和X是磺酸根或膦酸根基团，和
b) 第二个非荷电单体。
共聚物链可接枝于固体载体，对于每条链具有一个或多个与载体的连键。链可例如基本由第一和第二个单体单元组成，但它们也可包含其它单体单元。共聚物链可具有无规结构，但它们也可以是交替或分段的。本发明的基质的实施方案适用于上述分离方法。
在某些实施方案中，L是共价键或-CH2-O-L’-，其中L’是C2-C4或C3-C4亚烷基链，其任选地被至少一个羟基取代。如上所述，这些结构提供高的碱抗性并有利于提供高容量和选择性。
在某些实施方案中，荷电单体选自乙烯基磺酸盐、乙烯基膦酸盐和烯丙氧基羟基丙基磺酸盐。这些市售可获得的单体适合于接枝并提供好的容量/选择性以及碱稳定性。
在某些实施方案中，所述第二个非荷电单体是N-乙烯基酰胺。N-乙烯基酰胺与荷电单体很好地共聚，并得到显著的碱抗性聚合物。这特别适用于环状N-乙烯基酰胺(例如N-乙烯基内酰胺)。
在某些实施方案中，所述第二个非荷电单体选自N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基甲酰胺和N-乙烯基乙酰胺。在某些实施方案中，第一个单体从这组选出，或为乙烯基磺酸盐，和第二个单体是N-乙烯基酰胺，例如N-乙烯基吡咯烷酮。这些单体的组合给出特别对碱稳定的聚合物，和所述单体显示出有利的共聚合行为，以致可以制备具有合适量的接枝聚合物、接枝聚合物的合适组成和合适的离子容量的基质。这些共聚物的碱稳定性高于如例如在US20100181254中所描述的丙烯酰胺或(甲基)丙烯酸酯聚合物，并且虽然单体像乙烯基磺酸盐通常被认为是缓慢聚合或难以聚合的，但发明人的结果表明接枝聚合的性能是令人吃惊地良好且它们有效地与例如乙烯基吡咯烷酮共聚，以生产具有高的碱稳定性和好的色谱性质的接枝基质。
在某些实施方案中，在所述共聚物链中，从第一个单体衍生的单元与从第二个单体衍生的单元的摩尔比是0.05至5，例如0.10至2或0.5至2。摩尔比可通过光谱方法确定，并且它也可从离子容量和共聚物链的总含量计算出(见下文)。如果硫或磷仅存在于第一个单体中和氮仅存在于第二个单体中，摩尔比也可从元素分析数据确定。
在某些实施方案中，基质的(氢)离子容量是15-300或20-300微摩尔/ml，例如70-300、20-200、20-80或30-70微摩尔/ml。氢离子容量可通过熟知的滴定方法测定。如果硫或磷仅存在于酸性基团中，离子容量也可从元素分析数据计算。约30-70微摩尔/ml的离子容量可提供高蛋白容量和高单体-聚集选择性二者，但也可能使用最高可达至少200微摩尔/ml的离子容量，特别是当需要高蛋白容量时。
基质中(共)聚合物链的总量可以是2-80或2-60 mg/ml，例如4-35、4-20、3-12、12-20、20-80或25-75 mg/ml。这可通过光谱方法、通过元素分析(取决于所用的单体)确定并作为在制备基质期间的重量添加(weight add-on)。相对低的含量(例如2-20 mg/ml)对于单体-聚合的选择性是有利的，而较高的含量(例如20-80 mg/ml)可提供更高的蛋白结合容量。
在某些实施方案中，聚合物或共聚物链通过从烯丙基醚例如烯丙基羟基丙基醚衍生的接头单元结合于载体。链可通过每条链一个或多个这样的接头单元来结合。
在某些实施方案中，固体载体包含多羟基聚合物，例如多糖。多糖的实例包括琼脂、琼脂糖、角叉菜胶、葡聚糖、纤维素、支链淀粉等，并且其它多羟基聚合物的实例包括聚乙烯基醇、聚缩水甘油等。多羟基聚合物载体的优点包括它们的亲水性(其可消除或减少非特异性相互作用)、它们的碱稳定性和它们形成具有大的表面区域和快速的物质传输的多孔结构的倾向性。
在某些实施方案中，固体载体包含天然或衍生形式的琼脂或琼脂糖。这些多糖形成具有良好机械性能和良好物质传输性能的大孔载体以用于生物分离。珠形式的琼脂糖载体为市售可获得的，例如以Sepharose和Capto的商标名(GE Healthcare Bio-Sciences AB)且它们可例如如在Hjertén等(Biochim Biophys Acta 79, 393-398 (1964))中所述制备。载体的孔径可受生产它们所用的琼脂糖溶液浓度控制，并通过交联条件控制至某种程度。在乳液(或气溶胶)形成期间，通过输入机械能可控制珠的粒度，并且通过筛分制备多分散性珠材料的部分也是可能的。
在某些实施方案中，固体载体是交联的，例如与羟基烷基醚交联。交联改进刚性和化学稳定性，因而使用羟基烷基醚交联的优点是它们对碱稳定且不引起与蛋白的非特异性相互作用。这样的交联可例如通过使用表卤醇(epihalohydrins)、双环氧化物(diepoxides)和烯丙基卤化物/烯丙基缩水甘油醚作为交联剂产生。例如通过在US6602990或US7396467中描述的方法制备的高刚性交联琼脂糖可有利地用作固体载体。
在某些实施方案中，固体载体是多孔的，例如呈多孔珠或多孔膜的形式。
在某些实施方案中，固体载体具有对应于0.5-0.9，例如0.6-0.8的KD值的孔径，所述KD值用Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量。孔径不仅对容量而且对选择性具有重要性。在溶胀材料如琼脂糖和其它多糖凝胶中，孔径最好通过逆尺寸排阻(inverse size exclusion)色谱方法估算，其中测定探针分子例如Mw 110 kDa的葡聚糖可达到的体积分数Kd。这种方法在例如L Hagel等: J Chromatogr A 743, 33-42 (1996)中描述。
在某些实施方案中，分离基质具有对应于0.1-0.8，例如0.2-0.6或0.2-0.4的Kd值的孔径，所述Kd值用Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量。Kd值定义为0和1之间的值，并且由于所述材料经接枝加入到固体载体中，因此在大多数情况下，基质(含接枝聚合物)的Kd值将低于在接枝前的固体载体的对应值。0.2和0.6之间或0.2和0.4之间的Kd值提供良好的聚集体去除并提供高容量。
在一个方面，本发明公开了依据上述任何一个实施方案制备分离基质的方法，该方法包括以下步骤：
a) 提供包含可共聚的C=C双键的部分或易于形成游离基的部分的固体载体；
b) 使固体载体与包含第一和第二个单体的混合物接触；和
c) 引发基团聚合。
载体可固有地包含双键(例如在甲基丙烯酸酯或苯乙烯-二乙烯基苯载体上残留的双键)或易于形成游离基的部分(例如多羟基聚合物载体中羟基的α-氢)或这些部分的任何一个可如下述引入。基团聚合的引发可通过照射或者通过使用许多已知的引发系统例如过氧化物引发剂、偶氮引发剂、过硫酸盐、过氧化氢、铈(IV)盐、光引发剂、氧化还原系统、ATRP等中的一种的热/化学引发来实现。
在某些实施方案中，步骤c)在得以实现以下的条件下进行：形成包含从第一和第二个单体衍生的单元的共聚物链，并通过用C=C双键的共聚合作用或者通过引发或从易于形成游离基的部分的链转移而共价连接于固体载体。
在某些实施方案中，该方法还包括在步骤a)之前用包含可共聚的C=C双键的部分或易于形成游离基的部分衍生固体载体的步骤。C=C双键可例如由多羟基聚合物中的羟基与烯丙基化试剂如烯丙基卤化物或烯丙基缩水甘油醚反应而引入。引入C=C双键的方法的其它实例包括羟基与亲电子试剂如缩水甘油(甲基)丙烯酸酯、乙烯基苄基氯等的反应。易于形成游离基的部分可以是例如a)引发剂物质，例如氢过氧化物(其通过在氧存在下，经γ或E-束照射而形成)或偶氮引发剂(通过与例如偶氮双氰基戊酸反应而形成)；或b)链转移基团，例如硫醇基(可例如通过使环氧-活化的载体与二硫醇或硫化物离子反应而引入)。
在某些实施方案中，包含可共聚的C=C双键的部分是烯丙基，例如烯丙基醚基或烯丙基羟基丙基醚基。烯丙基在与单体例如乙烯基磺酸或乙烯基膦酸的接枝的组合中，任选地在与N-乙烯基酰胺单体例如乙烯基吡咯烷酮的组合中是特别有利的，这是因为总的共聚合率是完全匹配的。
在某些实施方案中，所述易于形成游离基的部分包含：i)链转移基团，例如硫醇基或羟基的α位上的氢；或ii)引发基团如过氧化物、氢过氧化物、过硫酸盐或偶氮化合物。
如在实施例中所示的，通过在碱性基质上提供不同浓度的可共聚的双键和通过在接枝期间提供不同的单体浓度，可控制接枝聚合物的量。通过改变单体组成和通过改变接枝聚合物的量，可控制离子容量。技术人员应认识到，将需要某些常规实验以用给定的起始原料达到特定值。
实施例
方法
方法1. 珠的干重
将原型悬浮液的50% (v/v)浆液加入到玻璃滤器中，滤器上带有一个1.00 ml的腔室。然后通过真空抽吸排干凝胶，和当出现干燥表面时，将凝胶吸干另外30 s。然后将1 ml排干的凝胶加入到预称重的用5*20 ml丙酮洗涤的玻璃滤器中。然后将玻璃滤器放入105℃的烘箱中经24 h，然后测量干重(4位数)。测量一式两份样品。
方法2. 离子容量
将约4ml排干的凝胶放入一个小玻璃滤器，然后用总量40ml的0.5M HCl洗涤数次，再用总量100ml的1mM HC洗涤数次。然后使颗粒达到1ml立方体积，此时经真空抽吸排干凝胶，并当出现干燥表面时，将凝胶吸干另外30 s。然后将1 ml排干的凝胶与20ml蒸馏水一起加入到40ml烧杯中。然后通过滴定测定1 ml凝胶的氢离子容量。
方法3. 烯丙基含量
将原型悬浮液的50%浆液加入到1ml试管中。然后通过真空抽吸排干凝胶，并当出现干燥表面时，将凝胶吸干另外30 s。然后将1 ml排干的凝胶与另外5ml水一起加入到具有真空配置的250 ml e-烧瓶中。然后在真空抽吸下，用磁力搅拌器搅拌悬浮液，同时加入饱和的溴水至悬浮液中。然后在真空抽吸下搅拌混合物以除去过量的溴30 min，然后将混合物加入到30ml滴定杯中。然后使用硝酸银，滴定该混合物中的溴离子。
实施例1. 1-乙烯基-2-吡咯烷酮(VP)和乙烯基磺酸(VSA)的接枝
1 a) 琼脂糖珠载体的烯丙基化
将50g高刚性的排干的琼脂糖珠(依据在US6602990中描述的方法制备)加入到500 ml圆底烧瓶中并通过搅拌在101.4g 50% NaOH水溶液和77.04g蒸馏水中混合。使温度升高至50℃达30分钟。此后，以产生依据表2的AGE/反应物体积比的量加入烯丙基缩水甘油醚(AGE)，并于50℃将反应继续过夜17小时。然后过滤出珠并用乙醇(5 x 300 ml)洗涤，然后用蒸馏水(5 x 300ml)洗涤。
使用4种不同孔径的琼脂糖珠，对应于针对葡聚糖Mw 110 kDa的0.50、0.67、0.77和0.80的Kd值。使用配备有A-900自动取样器的AKTATM探测器进行Kd评价。将Shimadzu RI-检测器(RID-bA)连接于AKTATM系统以检测葡聚糖样品。采用以下条件：流速：0.2ml/min；流动相: 0.2M NaCl；样品体积：100微升。依据本领域熟知的方法评价葡聚糖峰。然后将Kd值如下计算为有效孔隙表面的量度：Kd = (Ve - V0)/(Vc - V0 - V凝胶基质) = (Ve - V0)/(Vt - V0)。Ve = 洗脱的葡聚糖的保留体积(ml)，V0 = 空隙体积(原料葡聚糖空隙标记的保留) (ml), Vc = 计算的柱体积(床高(cm) x 柱表面积(cm2) ) (ml)，Vt = 总液体体积(NaCl的保留体积) (ml)。
还使用相同的方法，相对于葡聚糖Mw 110kD的Kd值，评价一些接枝原型。由于接枝聚合物链的空隙-填充效果，这些例子中的Kd值一般低于非-接枝载体珠。
1 b) 接枝
将α,α,偶氮二异丁基脒二盐酸盐(ADBA)引发剂加入到一40 ml玻璃小瓶中，此时加入17g排干的烯丙基化的珠。然后将蒸馏水、VP和VSA水溶液加入到小瓶中。小瓶用一个塑料顶部封闭，然后放入一个加热的震摇设备中，其中小瓶于室温下震摇5min，然后将温度上升至55℃。聚合反应进行17h过夜，然后将颗粒在玻璃滤器上用8个凝胶体积(GV)的蒸馏水、8 GV的99.5%乙醇、然后8 GV的水洗涤。
表1. VP-VSA接枝条件
接枝配方 浆液浓度[w/w%] mol/kg浆液 mol/kg 引发剂浓度 [%w/w对于单体] 温度 % mol VSA/(VP+VSA)
G1 45 1,75 0,962 55 62
G2* 45 1,75 0,962 55 62
G3 20 2,55 0,962 55 62
G4 13 2,55 0,962 55 70
*G2：用VSA溶液洗涤凝胶3次，然后将真空排干的凝胶加入到小瓶中
表2. VP-VSA接枝原型
原型 AGE比率[v/v] Kd dx 110K碱性基质 粒径[微米] 烯丙基水平[微摩尔/ml] 接枝聚合物的量[mg/ml] 离子容量[微摩尔/ml]
S50-G1-A50 0,5 0,5 41 26 - -
S50-G1-A25 0.25 0,5 41 22 3 27
S50-G2-A200 2 0,5 41 31 - 75
S50-G3-A25 0,25 0,5 41 19 - 28
S50-G4-A200 2 0,5 41 31 - 76
S67-G1-A450 4,5 0,67 51 44 - 73
S67-G1-A200 2 0,67 51 31 - 47
S67-G1-A100 1 0,67 51 21 - 24
S77-G1-A450 4,5 0,77 64 38 12 60
S77-G1-A200 2 0,77 64 25 6 39
S80-G1-A200 2 0,8 65 31 3 37
原型S67-G1-A200具有对葡聚糖110 kD的0.295的Kd值和参照Fractogel? EMD SE Hicap (Merck)具有0.093的对应值。
实施例2. 评价用VP和VSA接枝的原型
柱装填和测试
沉降原型媒介并在Tricorn 5/50柱中压缩。装填后，通过注射含3% (v/v)丙酮的10 μl 2 M NaCl，在0.4 M NaCl中以0.065 ml/min测试柱。登记A280、A260和电导峰并积分。
对于成功装填的可接受的标准为0.8和1.5之间的不对称值。
Mab样品制备
将蛋白A纯化的Mab用HiPrep脱盐(HiPrep Desalting) 26/10柱经缓冲液交换为50 mM乙酸钠 + 10 mM NaCl (pH 5.25)。然后蛋白浓度用分光光度法测定。
经A 280 的浓度测定
蛋白浓度通过分光光度法于280 nm使用Lambert Beer定律测定(方程1).
方程1：C = A/(l * ε)
其中C是浓度(mg/ml)，l是路径长度(cm)和ε是在1 mg/ml的吸光系数，从摩尔消光系数导出。
色谱
用超环(superloop)将样品以50 mg/ml媒介的荷载施用于预平衡的柱。然后洗柱，用NaCl梯度液洗脱，剥离(=再生)，用1 M NaOH清洗并最终再平衡(表3)。全部运行在?KTA探测器100系统上，用Unicorn 5.11作为控制软件进行。原型和参照媒介用相同的起始缓冲液和洗脱缓冲液测试，以获得相同梯度长度和斜率。因此，起始缓冲液(乙酸盐和磷酸盐二者)补充有10 mM NaCl，以减少可能的非惯例行为。
起始样品、FT和收集的流分经SEC分析，并在选择的情况下经HCP分析(Gyrolab)。
表3: 选择性方法概观
SEC分析
单体纯度通过尺寸排阻色谱(SEC)，使用两个串联的Superdex?200 5/150 GL柱评价。流动相是磷酸盐缓冲的盐水(PBS)和流速是0.35 ml/min经15 min (针对原型为8分钟)。将10微升的各样品施用于柱。在?KTA探测器10系统上，用Unicorn 5.11作为控制软件进行分析。
SEC也用于单体浓度测定。基本上，通过使样品的单体面积与起始样品的单体面积相关联，测定单体浓度。首先，测定单体起始浓度(方程2)。
方程2: C单体起始物 = C总起始物 * 单体纯度 
其中C总起始物在浓度测定中经A280获得和单体纯度经SEC纯度测定获得。然后，样品的单体浓度可通过使用方程3计算。
方程3: C单体样品= 面积单体样品/ 面积单体起始物 * C 单体起始物
其中单体面积通过在SEC分析中积分单体峰获得。
HCP分析
HCP水平使用市售的抗-CHO HCP抗体(Cygnus Technologies)测定。基本上，ELISA方法适合于使用Gyrolab Bioaffy 200 HC微型实验盘(microlaboratory disc)的Gyrolab Workstation LIF (Gyros AB)。
表达数据
分析(SEC)收集的流分的单体浓度和聚集体浓度。从这些数据，可计算流分1至x中累计的单体得率和相同部分中累计的聚集体含量。当将累计的单体得率对累计的聚集体含量作图时，获得如图2中的曲线，图2描绘了理想化曲线，其中大多数聚集体以高单体得率除去。实验曲线(在图2中用虚线说明)一般将显示，原型的累计得率越低和选择性越好，对于各个累计聚集体值的累计得率值将越高。在呈现的选择性曲线中，从Fractogel? EMD SE Hicap (Merck)衍生的数据已被用作参照曲线。该阳离子交换基质的磺基乙基位于接枝聚合物链上，并且该基质被推荐用于去除抗体处理中的聚集体。
pH选择
进行pH的最佳化以发现用于这些运行的合适pH。在pH 4.75、5.0和5.25时测试代表性的原型，最好的结果在pH 5.25。在两种不同的pH值：5.0和5.25下，运行两种参照媒介Capto? SP ImpRes (GE Healthcare)和Fractogel? EMD SE Hicap (Merck)。在较高pH下单体与聚集体的分离是更佳的。而且，第三个峰，被认为是由沉淀的抗体组成，在pH 5.25时几乎不存在。因此，所有的媒介从50 mM乙酸钠 + 10 mM NaCl (pH 5.25)至50 mM乙酸钠 + 500 mM NaCl (pH 5.25)的梯度液中运行。包括NaCl以减少/排除非惯例行为。
动态结合容量(DBC)
柱装填和测试
沉降原型媒介并使用0.2 M NaCl + 20%乙醇作为流动相，以4 ml/min压入Tricorn 5/50柱中。
装填后，通过注射含3% (v/v)丙酮的20 μl 1 M NaCl，在0.4 M NaCl中以0.25 ml/min测试柱。登记A280、A260和电导峰并积分，但电导值是报告的电导值。对于成功装填的可接受的标准为0.8和1.5之间的不对称值。
样品制备
MAb洗脱液(~24 mg/mL)通过使用HiPrep脱盐(HiPrep Desalting) 26/10 经缓冲液柱交换，用50 mM乙酸盐缓冲液(pH 5.25)得到约15 mg/ml的浓度。
然后将样品稀释至3.7-3.8 mg/ml的浓度。
样品溶液的浓度通过于280nm测量UV来确定，并使用Lambert Beer定律和消光系数1.5计算。
DBC方法
平衡后，用超环(super loop)施用样品(4 min保留时间)直至达到85 %的最大吸光度。然后洗涤媒介，洗脱，再生并用0.5 M NaOH进行CIPped (清洗)并最终再平衡。然后从280 nm的色谱计算DBC (Qb 10%)。
对于VP-VSA原型和Fractogel EMD SE Hicap的DBC值示于表4。
表4. 对于IgG (单克隆)的动态结合容量。
原型 DBC(mg/ml)
S50-G1-A50 81
S50-G1-A25 60
S50-G2-A200 70
S50-G3-A25 86
S50-G4-A200 121
S67-G1-A450 138
S67-G1-A200 125
S67-G1-A100 70
S77-G1-A450 124
S77-G1-A200 96
S80-G1-A200 90
Fractogel EMD SE Hicap 119
聚集体去除
对于VP-VSA原型的聚集体去除选择性与参照Fractogel EMD SE Hicap的比较示于图4-10中。用低烯丙基含量制备的原型获得最佳选择性，但是对于DBC，必需进行权衡(trade-off )。基质孔径的增加具有正面效果，并且用具有对Mw 110 kDa的葡聚糖的0.67-0.80的Kd的载体获得特别好的结果。
具有聚苯乙烯碱性基质的原型
当使用基于聚二乙烯基苯(DVB)的碱性基质的原型P63-G1-A2时，也发现高选择性，并且对于这种原型的DBC是86 mg/ml。这种原型由40微米聚二乙烯基苯珠制得，所述珠具有对应于Mw 110 kDa的葡聚糖的0.63 Kd值的孔径。依据在US6420028中描述的方法对所述珠进行羟基化，依据以上的方法烯丙基化，得到2的AGE比率并且最后依据配方G4用乙烯基吡咯烷酮(VP)和乙烯基磺酸(VSA)接枝，得到66微摩尔/ml的离子容量。对这些珠的聚集体去除结果示于图11和12。
实施例3.　VP和3-烯丙氧基,2-羟基-1-丙烷磺酸(APS)的接枝
将琼脂糖珠在玻璃滤器上，用40% APS溶液(2 x 凝胶体积)洗涤几次。吸干悬浮液，此后将75 g加入到250ml三颈圆底烧瓶中。将1.5g ADBA与30g APS溶液和25.5ml VP一起加入到烧瓶中。于65℃开始聚合并搅拌约17h。用蒸馏水充分洗涤凝胶。
在96孔滤板中静态结合容量的测量
使用预-编程的Gilson自动仪，制备1%凝胶浆液并填充到96孔滤板中，对应于2微升沉降凝胶/孔。
填充在板中的凝胶的平衡通过自Tecan自动仪中制备的板中加入200微升衡缓冲液进行，接着以1100 rpm搅动1分钟，此后缓冲液通过真空抽吸除去。进行平衡步骤3次，在最后一次平衡后，用离心除去缓冲液。
将在各缓冲液中制备的200 μl样品加入到各孔中，接着搅动180分钟。将未结合的样品通过离心收集到UV-板中，并通过在Spectra Max读板仪上读板，记录4个波长(254、280、290和310 nm)的吸光度。校准曲线通过稀释起始溶液之一制得。每mL凝胶结合的样品的量使用辅助软件计算。
合成条件、接枝聚合物的量和离子容量列出于表5中，并且多克隆IgG对原型的静态结合容量列出于表6中。
表5. APS接枝条件
表6.  APS接枝原型的评价
实施例4. VSA的接枝
将烯丙基化琼脂糖珠在玻璃滤器上用30% VSA溶液(2 x 凝胶体积)洗涤数次。吸干悬浮液，此后将75 g加入到250ml圆底烧瓶中。然后将0.95 g ADBA与75g VSA溶液一起加入到烧瓶中。通过于65℃震摇约17h开始聚合。然后用蒸馏水充分洗涤凝胶。合成条件、接枝聚合物的量和离子容量列出于表7中，并且多克隆IgG对原型的静态结合容量列出于表8中。
表7. VSA接枝条件。
表8. VSA接枝原型的评价。
实施例5. 甲基丙烯酸羟基乙基酯(HEMA)和乙烯基膦酸(VPA)的接枝
将ADBA引发剂加入到30 ml玻璃小瓶中，此时加入15g吸干的凝胶(用40% APS预洗涤)。然后将蒸馏水、中性单体和离子单体溶液加入到小瓶中。小瓶用一个塑料顶部封闭，然后放入一个加热的震摇设备中，其中小瓶于室温下震摇5min，然后将温度上升至55℃。聚合反应进行17h过夜，然后将颗粒放置在玻璃滤器上，用8 x凝胶体积的蒸馏水、8 x凝胶体积的99.5%乙醇、然后8 x凝胶体积的水洗涤。合成条件、接枝聚合物的量和离子容量列出于表9中，并且多克隆IgG对原型的静态结合容量列出于表10中。
表9. VPA接枝条件。
表10.　VPA接枝原型的评价。
VPA和VPA/HEMA接枝原型对盐浓度(从0进行至100 mM NaCl)明显不敏感，仅失去10-20%的结合容量。而且，如在图13 b)中所示，原型VPA1能分辨蛋白质溶菌酶和细胞色素C，这用在图13 a)所示的参照媒介SP Sepharose HP (GE Healthcare)是不可能的。原型VPA2给出与VPA1极其相似的选择性。在选择性试验中，注入试验蛋白质溶菌酶、细胞色素C和核糖核酸酶A的混合物并用盐梯度液洗脱。单克隆抗体也单独注入并在相同的条件下洗脱。
本书面描述使用实施例来公开本发明，包括最佳方式，并且还能使本领域的任何技术人员实施本发明，包括制备和使用任何装置或系统和进行任何结合的方法。本发明的可专利性范围由权利要求书限定，并可包括本领域技术人员想到的其它实施例。如果这样的其它实施例具有不同于权利要求书的文字语言的结构要素，或如果它们包括与权利要求书的文字语言无实质性差别的等效结构要素，意欲使它们在权利要求书的范围内。应该注意到，可合并来自不同的实施方案和方面的特征，以建立进一步的实施方案。
所有的出版物、专利申请，和专利通过引用结合到本文中，其程度如同各独立的出版物和专利特别地和单独地被指明通过引用结合到本文中一样。

Claims (33)

1.一种将生物分子与液体中的至少一种其它组分分离的方法，所述方法包括使所述液体与包含固体载体和与所述固体载体结合的聚合物链的分离基质接触的步骤，其中所述聚合物链包含从结构CH2=CH-L-X的第一个单体衍生的单元，其中L是共价键或包含2-6个碳原子的烷基醚或羟基取代的烷基醚链，和X是磺酸根或膦酸根基团。
2.权利要求1的方法，其中所述生物分子是蛋白、肽或核酸。
3.权利要求1或2的方法，其中所述生物分子是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫球蛋白的蛋白，如抗体、抗体片段、抗体缀合物或抗体融合蛋白。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少其它组分是蛋白，例如宿主细胞蛋白；蛋白A；或免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫球蛋白的蛋白的聚集体。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述液体是来自先前的色谱步骤的洗脱液，所述色谱步骤例如亲和步骤、离子交换步骤、多峰步骤或疏水相互作用步骤。
6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述液体是来自分离基质的流通液，所述基质例如离子交换基质、多峰基质或疏水相互作用基质。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述生物分子是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫球蛋白的蛋白，例如抗体、抗体片段、抗体缀合物或抗体融合蛋白且其中至少1%，例如至少5%或至少10%的所述生物分子呈聚集体的形式。
8.前述权利要求中任一项的方法，还包括用洗脱缓冲液从所述分离基质洗脱所述生物分子的步骤。
9.前述权利要求中任一项的方法，还包括用清洗液，例如包含至少0.1 mol/l NaOH或0.5-2 mol/l NaOH的碱性清洗液，清洗所述分离基质的步骤。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述聚合物链是共聚物链且还包含从第二个非荷电单体衍生的单元。
11.权利要求10的方法，其中第二个非荷电单体是N-乙烯基酰胺。
12.权利要求10或11的方法，其中所述第二个非荷电单体选自N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基甲酰胺和N-乙烯基乙酰胺。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中L是共价键或-CH2-O-L’-，其中L’是C2-C4或C3-C4亚烷基链，其任选地被至少一个羟基取代。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一个单体选自乙烯基磺酸盐、乙烯基膦酸盐和烯丙氧基羟基丙基磺酸盐。
15.权利要求10-14中任一项的方法，其中在所述共聚物链中，从第一个单体衍生的单元与从第二个单体衍生的单元的摩尔比是0.05至5，例如0.10至2或0.5至2。
16.一种分离基质，其包含固体载体和与所述固体载体结合的共聚物链，其中所述共聚物链包含从以下单体衍生的单元：
a) 结构CH2=CH-L-X的第一个单体，其中L是共价键或包含2-6个碳原子的烷基醚或羟基取代的烷基醚链，和X是磺酸根或膦酸根基团；和
b) 第二个非荷电单体。
17.权利要求16的分离基质，其中L是共价键或-CH2-O-L’-，其中L’是C2-C4或C3-C4亚烷基链，其任选地被至少一个羟基取代。
18.权利要求16或17的分离基质，其中所述至少一个荷电单体选自乙烯基磺酸盐、乙烯基膦酸盐和烯丙氧基羟基丙基磺酸盐。
19.权利要求16-18中任一项的分离基质，其中所述第二个非荷电单体是N-乙烯基酰胺。
20.权利要求16-19中任一项的分离基质，其中所述第二个非荷电单体选自N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基甲酰胺和N-乙烯基乙酰胺。
21.权利要求16-20中任一项的分离基质，其中在所述共聚物链中，从第一个单体衍生的单元与从第二个单体衍生的单元的摩尔比是0.05至5，例如0.10至2或0.5至2。
22.权利要求16-21中任一项的分离基质，其中所述基质的离子容量是20-300微摩尔/ml，例如20-200或20-80微摩尔/ml。
23.权利要求16-22中任一项的分离基质，其中固体载体包含多羟基聚合物，例如多糖。
24.权利要求16-23中任一项的分离基质，其中固体载体包含琼脂或琼脂糖。
25.权利要求16-24中任一项的分离基质，其中固体载体是交联的，例如与羟基烷基醚交联。
26.权利要求16-25中任一项的分离基质，其中固体载体是多孔的，例如呈多孔珠或多孔膜的形式。
27.权利要求16-26中任一项的分离基质，其中固体载体具有对应于0.5-0.9，例如0.6-0.8的KD值的孔径，所述KD值用Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量。
28.权利要求16-27中任一项的分离基质，其中基质具有对应于0.1-0.8，例如0.2-0.6的KD值的孔径，所述KD值用Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量。
29.一种制备权利要求16-28中任一项的分离基质的方法，包括以下步骤：
a) 提供包含具有可共聚的C=C双键的部分或易于形成游离基的部分的固体载体；
b) 使固体载体与包含第一和第二个单体的混合物接触；和
c) 引发基团聚合。
30.权利要求29的方法，其中步骤c)在使得实现以下的条件下进行：形成包含从所述第一和第二个单体衍生的单元的共聚物链，并通过用所述C=C双键的共聚合作用或者通过引发或从易于游离基形成的所述部分的链转移而共价连接至固体载体。
31.权利要求29或30的方法，还包括在步骤a)之前，用包含可共聚的C=C双键的部分或易于形成游离基的部分衍生所述固体载体的步骤。
32.权利要求29-31中任一项的方法，其中所述包含可共聚的C=C双键的部分是烯丙基，例如烯丙基醚基或烯丙基羟基丙基醚基。
33.权利要求29-32中任一项的方法，其中所述易于形成游离基的部分包含i)链转移基团，例如硫醇基或羟基的α位上的氢或ii)引发基团如过氧化物、氢过氧化物、过硫酸盐或偶氮化合物。
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