JPH01500836A - 固体担体およびそれに結合した特定のリガンドによる、水溶液から酵素を分離するアフィニティークロマトグラフ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 固体担体およびそれに結合した特定のりガントによる、水溶液から酵素を分離す るアフィニティークロマトグラフ法 ポリ１化ビニル、ポリエチレン、ポリアミドのうよなポリマー担体物質のグラフ ト改良に関する文献より、多くの方法が周知である。好ましくは微粉砕形状のポ リマー担体は、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＣＨｏ　、−Ｎ）Ｉ、等のような官能基 を含むビニルモノマーによりグラフトされる。蛋白質、酵素、抗体、抗源または 他の生物的に活性な作用分子の形状の生物触媒は、それらの官能基と化学的に結 合できる（固定化）。化学工学の目的は、物質反応が酵素により得られ、次いで 固定された生物触媒が、簡単な方法で反応した生成物より分離される生物工学方 法において、これらの固定された生成触媒を用いることである。すでに獲得され た技術的重要性の例は、固定されたグルコースイソメラーゼによるグルクトース ーフルクトース産出およびペニシリンアシラーゼの産出である。日本の田辺製薬 株式会社は、固定化アミノアクリラーゼを異なるアミノ酸の製造に用いる方法を 開発した。この種のポリマー担体の他の重要な適用分野は、原出願（Ｐ３６１３ ４０７．４−４１）に述べられたような、クロマトグラフ分離工程である。この 微粉砕された機能化ポリマー担体は、分離媒体として用いられる。しかし、この 利用のため、従来の使用は、例えばグリシジルアクリレート基材上のポリマー１ 、または改良されたポリサッカライド（デキストラン）が用いられるように、懸 濁またはビーズ重合により生ずる担体の固定のため主に行なわれた。グラフトコ ポリマーは原則的により良し）物理的および生物的特性を有する、これらの担体 物質グラフト化コボＩＪマーの置換の従来の実験はもう実験室ではおこなわれな し）。

これは、比較的大きな生物分子が、グラフト担体の官能基への接近容易性が限定 されている、すなわち固定化能およびそれと平行する、担体のユニットあたり得 られる反応活性が低いままであるという事実は一部帰因する。グラフトコポリマ ーにだけ用いられるのではない多くのタイプの担体の他の欠点は、入念なおよび 高価な結合方法が必要であることである。これらは、カルボジイミド、臭化シア ンまたは活性化エーテル法を用いる固定化を含む。グルタルアルデヒドを用し） の場合、還元剤による後処理を必要とする一連の反応を調べる難かしさの観点か ら、最初に述べた方法について明確な利点はない。

グラフト技術により適当な担体物質を製造するためには、以下の基準を満たすべ きである。

ａ）適当な粒度の安価な出発物質； ｂ）適当な化学官能価−すなわち適当な結合基の数；Ｃ）簡単、安価な固定を可 能にする官能基の導入；ｄ）官能中心の光学的接近容易性を得るように、グラフ ト担体の物理形態学的微細構造をつ（る；ｅ）親水性微小環境の創造、特に主と して出発物質の疎水性基体特性を考慮する； 上記基準をみたすため、新規グラフト技術が開発され、新しい改良方法が用いら れた。

ａ）出発物質は、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチル メタクリレート、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン、等のようなあらゆ る現行のプラスチックでよい。この材料の粒度は、４０〜２５０ｕの範囲にある 。

特にクロマトグラフに使用するために最適のサイズは、４０〜１００ｕである。

ｂ）機能ビニルモノマーは、エポキシまたはイソシアネート基を有するものがよ い。これらの基による結合は、特にイソシアネートでは短時間で生ずる。この種 の七ツマ−の例として、グリシジルメタクリレート、グリシジルアクリレート、 アリルグリシジルエーテルあるいはアリルイソシアネート、３−ビニルフェノー ルイソシアネートあるいはメタクリル酸−β−イソシアネートエチルエステルが 挙げられる。これらの官能基の導入は別として、ヒドロキシ機能の方法も用いて よい。

第一工程において、例えばヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチ ルメタクリレート、または酢酸ビニル（これは、その後アルコールに鹸化される ）のようなヒドロキシ基含有モノマーがグラフトされ、次いでイソシアネート基 を含む成分により活性化される。

これらのモノマーのグラフトは、好ましくは溶液中または溶媒の混合物中で行な われ、その際この千ツマ−は最大５０体積％の濃度で存在する。

適当な溶媒は、例えばメタノール、エタノール、水、テトラヒドロフラン、ジオ キサン、塩化メチレン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　、ホルムアミド、ア セトン２．メチルエチルケトン、クロロホルム、トリクロロエチレン、等である 。この溶媒は、基材ポリマーに関して膨潤性に基づき選択される。

そのような膨潤性は、例えば現行の物質すべてに対し文献により包含される溶媒 とポリマーの溶解度パラメータ・−の比較により決定される。明確な区別は、パ ラメーターを３種の成分、つまり水素結合、極性および非極性パラメーターに分 けることにより行なわれる。さらに、適当な溶媒の選択の基準は、グラフトコポ リマーに関する、その膨潤／溶解特性である。グラフトに対する最適条件をつ（ るため、基材ポリマーとグラフト相の両方に膨潤親和性を有する少なくとも２種 の成分からなる溶媒混合物を用いるべきである。さらに、この溶媒選択の基準は 、均一液体相中で形成されるポリマーまたはコポリマーに対するその溶解特性で ある。文献は、ポリマー阻害剤として銅または鉄（ＩＩ）塩の形状の種々の添加 剤を述べており、原出願に係る方法で述べられる方法の大部分は、それらの添加 剤を不必要にする。

形成したポリマーは担体の細孔中に付着し、接近容易性に悪影響を有するので、 溶液相中でのホモ重合の抑制は、重要な役割を果たす、今日のグラフト改良の方 法は、はとんど独占的に、１種のビニル成分を用いる。しかし、親水性機能を有 するが、結合性側鎖を有しないビニルモノマーの添加が、単一成分のグラフトに 利点を有することを示すことは可能である（原出願参照）。そのような添加モノ マーの例として、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリルアミドまたはメタクリルアミ ドがあげられる。これらのグラフトコポリマーは、２つの機能を果たしている。

一方でグラフト受容体として作用し、他方で多くの結合性基が、未結合成分の静 的混入により調節され、これは、結合の蓄積がコンホーメーション変化をおこし 、それにより生物分子の不活性化をおこすので、生物的に活性な分子の最適な固 定化のため重要である。同じ基準がアフィニティークロマトグラフィーの担体の 製造に適用され、この場合もアフィニティーリガンドと分離すべき生物分子の間 の適当な相互作用を確実にするため、適当な静的条件が必要である。アフィニテ ィーリガンドの蓄積はしばしば担体の分離能に悪影響を及ぼす。

Ｃ）結合に用いられる基は、エポキシおよびイソシアネート基である。相応する エポキシ基の導入は、原出願に開示された。イソシアネートは基本的に２とおり の方法で導入される。

１、相応するビニルモノマー、例えばアリルイソシアネート、３−ビニルフェニ ルイソシアネートまたはメタクリル酸−β−イソシアネートエチルエステル、の グラフトによるこれら官能基の直接導入、または、 ２、　ヒドロキシ成分（例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒド ロキシエチルメタクリレート）のグラフトおよびその後の担体とイソシアネート 基含有成分（例えば、２−トルエン−４−ジイソシアネート、ヘキサメチレンジ イソシアネート、キシレンジイソシアネート、１．５−ジイソシアネートナフタ リン、３，５．５−トリメチル−１−イソシアネートメチルシクロヘキサン、４ ．４−ジイソシアネートジシクロヘキシルメタン、等）との反応による。

イソシアネートは、ＤＭＦ、塩化メチレン、アセトン、ジオキサン、等のような 中性溶媒中でポリウレタン形成を促進する触媒、例えばオクタン酸錫、チタン酸 テトラブチル、塩化錫（ｎ）、）リエチレンジアミン（ＤＡＢＣＯ）、塩化ブチ ル錫（ＩＶ）の添加で反応することが好ましい（キルヒャ−（Ｋ、Ｋｉｒｃｈｅ ｒ）ニブラスチック加工における化学反応、Ｈａｎｓｅｒ発行、Ｖｉｅｎｎａ。

１９８２年）。

「前述のイソシアネートによる活性化は、通例の方法に利点を有し、例えば、リ ガンドに対し加水分解耐性関係のシアン化臭素活性化が形成される。さらに、前 述の物質に行なわれる予防手段は、それほど困難ではない。結合は室温でおこり 、３時間で終了する。

ｄ）許容できる活性を有して、生物的に活性な分子を固定する目的の上述のグラ フト方法は、適切なグラフト産生にもかかわらず（出発ポリマーに対し１００％ まで）、導入された基が結合に十分役に立たないという立体的理由のため、今ま で失敗してきた。グラフト担体の微細構造は、とても密であるので、蛋白質のよ うな巨大分子は担体の内部に分散できず、他の種類のクロマトグラフィーでおこ るような化学結合または他のイオン性相互作用により内部に入ることはできない 。

この理由のため、これらの基の立体的接近容易性を確実にし、担体の固定容量を 完全に使用する追加工程が必要である。これは、原出願に述べられたように、グ ラフトポリマーの体積膨潤を可能にする中性の成分（Ｎ−ビニルピロリドン、ア クリルアミド）により行なわれ、しかし、荷電基を含み、１０体積％を越えない モノマーハツチ３種の成分、例えばビニルスルホン酸、マレイン酸、４−ビニル とリジン、アクリル酸、メタクリル酸、２−ジメチルアミノエチルメタクリレー ト、２−ジエチルアミノエチルアクリレート等に加えることがより有効である。

同じ電荷の基の導入は、コロイド状ポリマー構造を表わし、こうして官能基の接 近容易性を実質的に改良する。生物分子の立体空間的細部により、微孔質は、グ ラフトコポリマー中の荷を基の含量を変えることにより固定すべき特定の生物分 子に適用される。

上記の荷電基を導入する方法に加えて、エポキシ基を用いてもよい。もちろんエ ポキシは、環の開裂を伴なう核試薬と反応する。二級および三級゛アミンは、こ のようにしてオキシラン環ととても簡単に反応し、用いたアミンにより正電荷を 変える。この方法は、微孔質の調節だけでなく、重要な陰イオン交換の調製に用 いられる。この場合、アミンの選択はイオン交換体の塩基性度を決定し、概して 、二級アミンは弱塩基になり、三級アミンは強塩基性陰イオン交換体となる。実 施における可能な変形は、利用可能なアミンと同目的の範囲におよぶ。この種の イオン交換体は、生命工学の分野における生物分子の固定化およびクロマトグラ フの両方に用いてもよい。

ｅ）親水性担体は、基本的に疎水性担体よりも固定化に対し、より適当である。

担体マトリックスと生物分子の間の親水性相互作用は、疎水性相互作用はど明ら かではなく、従うて疎水性微細環境が結合した分子のより高い生物的安定性をも たらすことは、経験が示し、さらに、特にアフィニティークロマトグラフィーに 対し重要であり、非特異的蛋白質脱着が実質的に抑制される。基本的グラフト技 術は、モノマーおよび溶媒の適切な選択により、ポリエチレン、ポリプロピレン 、ポリエステル、等のような疎水性塩基性ポリマーを完全に湿潤性の親水性造担 体に転化することが可能となる。

実施例 グラフトコポリマーの製造 肛 ２０ｇの２−ヒドロキシエチルアクリレート、１％のＮ−ビニルビロリドン、５ ％のアクリル酸、４０％の水および３４％のメタノールを、分子量４００万、サ イズ１００〜２００ｕの市販ポリエチレン粉末に加えた。

次いでガンマ線の輻射を１時間、総量０．３　Ｍｒａｄ行ワた。

すべての％は体積％である。

２０％のグリシジルメタクリレート、１０％のＮ−ビニルピロリドン、および７ ０％のテトラヒドロフランを例１の市販ポリエチレン粉末に加えた。

１０時間、総量０．２５Ｍｒａｄでガンマ輻射を行った。

土工 ３０％のメタクリル酸−β−イソシアネートエチルエステル、１０％のＮ−ビニ ルピロリドン、２％の２−ジメチルアミノエチルメタクリレート、３０％のテト ラヒドロフラン、２７％のアセトンおよび１％のＤＭＦを、分子量１００万、サ イズ１（１０〜２５０　ｕの市販ポリプロピレンに加えた。

ガンマ輻射：５時間、総量０．２　ＭｒａｃＬ班土 ２０％のグリシジルメタクリレート、１０％のアクリルアミド、１％のメタクリ ル酸、１０％ＤＭＦ、３０％のメタノールおよび２９％のジオキサンを、分子量 ２５０００　、サイズ１００〜２００ｕの市販のポリアミド−６粉末に加えた。

ガンマ輻射：１０時間、総量０．１５Ｍｒａｄ輻射後、すベアのサンプルを数時 間、メタノールまたはアセトンで抽出した。

■五 機能結合性側基の導入 ジイソシアネートによる例１のグラフト担体の反応この担体をまず数回アセトン で洗う。次いで１０−のアセトン、２−のへキサメチレンジイソシアネート、お よび５０μｌのＤＡＢＣＯを担体１ｇあたり加えた。５５℃で３０分以内で活性 化がおこった０次いでアセトンで数回洗った。洗浄後、例５および６の担体を、 リガンドまたは生物分子に結合してよい。

土工 蛋白質の固定化 例５の担体上のグルコースイソメラーゼの固定化１０．０００Ｇ、　！　、のグ ルコースイソメラーゼをｐＨ７，５，０，５Ｍの燐酸カリウム緩衝液１０ｍに溶 かした。１〇−酵素溶液を担体１ｇあたり加えた。この酵素溶液を１晩インキエ ーベーシヲンしたのち、担体を緩衝液溶液で洗った０次いで標準グルコース溶液 をこの固定化した担体に加え、６０℃で１時間インキュベーションした。グルコ ース−フルクトースの回転はＨＰＬＣで測定した。

土工 α−アミラーゼのアフィニティークロマトグラフィーによる分離 α−アミラーゼの精製のための担体の調製例４の担体１０ｇを、オキキラン蟇の 容量に相当するマルトース、ｐＨ９，５の硼酸緩衝液と、４０℃で１６時間反応 させた。活性化した担体をＩＭの緩衝液（酢酸／硼酸、ｐＨ４／ｐＨ８）で数回 洗った後、さらにこの担体を室温で１６時間、ＩＭのエタノールアミン溶液で処 理した０次いでこの担体をｐＨ６、０，ＯＯＩＭの燐酸緩衝液で洗い、この緩衝 液をカラムに入れ平衡化した。相応する酵素アミラーゼを、同じ緩衝液に入れた 。溶出はｐＨ６、０，２５Ｍ燐酸緩衝液で行った。

土工 陰イオン交換体の調製 濃縮トリエチルアミンを例２のポリマー担体に入れ、ガラスオートクレーブ中で ２時間７０℃で処理した０次いで多量の水で洗浄した。この担体はイオン交換マ トリックスとして、または蛋白質固定化の媒体として用いてもよい。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．官能結合性側基を有するビニルモノマーが、ガンマ線または他の基産生方法 により不溶性ポリマー基質にグラフトされることを特徴とする。特許出願（Ｐ３ ６１３４０７．４−４１）の請求の範囲第１項、第２項および第３項記載の方法 。 ２．グラフトにおいて、第三のビニル成分が荷電基を含んで用いられるか、また はグラフトされた後荷電基に転化されることを特徴とする、請求の範囲第１項記 載の方法。 ３．第三のビニル成分が、下式； ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｒ１およびＲ２：あらゆる構造のアルキル基、好ましくはメチルまた はエチル、Ｒ３：あらゆる構造のアルキル基または水素、Ｘ：あらゆるビニル基 、を表わす）を有する正電荷を含むことを特徴とする、請求の範囲第２項記載の 方法。 ４．モノマーのクラフトが、少なくとも２種の溶剤を含む溶剤混合物より行なわ れることを特徴とする、請求の範囲第１項、第２項および第３項記載の方法。 ５．溶剤が、基材ポリマーまたはグラフトコポリマーを膨潤させるよう用いられ るが、溶解せず、一方でグラフトの間液相中に形成したポリマーに関して、良好 な溶解性を有することを特徴とする、請求の範囲第４項記載の方法。 ６．ヒドロキシ基とグラフトした担体が、一般式ＯＣＮ−Ｒ−ＮＣＯ，▲数式、 化学式、表等があります▼で表わされる芳香族あるいは脂肪族ジイソシアネート またはトリイソシアネートにより有機相から活性化されることを特徴とする、請 求の範囲第１項記載の方法。 ７．有機相が、グラフトコポリマーに対し顕著な膨潤性を有する中性溶媒（例え ば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ジオキサン、アセトン、塩化メチレン、トルクロロエチ レン、テトラヒドロフラン）である、請求の範囲第６項記載の方法。 ８．イソシアネートが、通常ポリウレタン形成を促進する触媒をイソシアネート 成分の０．１〜１モル％加えることにより反応することを特徴とする、請求の範 囲第６項記載の方法。 ９．エポキシ基を含む担体が、一般式、▲数式、化学式、表等があります▼，▲ 数式、化学式、表等があります▼（上式中、Ｒはあらゆるアルキル基を表わす） を有する二級または三級アミンと反応し、必要な塩基性の陰イオン交換体を与え ることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の方法。 １０．モノマーまたはオリゴマー化合物が、同時に一部分最終生成物または抑制 剤となることを特徴とする、原出願の請求の範囲第１項記載の方法。