JPS6247516B2 - - Google Patents

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JPS6247516B2
JPS6247516B2 JP53018001A JP1800178A JPS6247516B2 JP S6247516 B2 JPS6247516 B2 JP S6247516B2 JP 53018001 A JP53018001 A JP 53018001A JP 1800178 A JP1800178 A JP 1800178A JP S6247516 B2 JPS6247516 B2 JP S6247516B2
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JP
Japan
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acrylonitrile
polymer
monomer
porous structure
amino group
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JP53018001A
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JPS5548392A (en
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Kunio Matsumoto
Rokuro Izumi
Hideji Seijo
Hiroyuki Mizuguchi
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Toyo Jozo KK
Original Assignee
Toyo Jozo KK
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Publication date
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Priority to FR7904043A priority patent/FR2417513A1/fr
Priority to GB8123539A priority patent/GB2090601B/en
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Priority to US06/211,807 priority patent/US4371612A/en
Priority to US06/505,376 priority patent/US4486549A/en
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
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    • C12P35/02—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin by desacylation of the substituent in the 7 position
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
    • C12P37/06—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin by desacylation of the substituent in the 6 position

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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、多孔質構造を有する水不溶性アミノ
基含有アクリロニトリル系ポリマーからなる支持
体と生物学的活性蛋白質とを結合した新規な固定
材、およびその製法、ならびにそれを用いてなる
方法に関するものである。 従来より、ニトリル基を有してなるポリアクリ
ロニトリルが生物学的活性物質である酵素を吸着
することは知られている（特開昭51−121592号公
報、特開昭52−7485号公報）。しかし、ポリアク
リロニトリルへの酵素の吸着において、吸着され
る酵素量は少なく、また吸着された酵素が容易に
脱離されるため良好な酵素の支持体となり得るも
のではなかつた。 本発明者らは、多孔質構造を有するポリアクリ
ロニトリルの有するニトリル基を固相で一部還元
せしめて得られるアミノ基含有ポリアクリロニト
リルが、意外にも酵素吸着量が著しく大きく、処
理前のポリアクリロニトリルに比べ約２〜30倍も
吸着し得るものであることを知り、さらにこの吸
着された、酵素は容易に脱離されない良好なもの
であることを知つた。また、このポリアクリロニ
トリルの代りに、アクリロニトリル系モノマー、
例えばアクリロニトリル、メタアクリロニトリ
ル、α―クロロアクリロニトリル、シンナムニト
リルなどのモノマーからなるホモポリマー、コポ
リマー、さらにこのアクリロニトリル系モノマー
と共重合し得るモノマーとのコポリマーの還元に
よつて得られたアミノ基含有ポリアクリロニトリ
ル系ポリマーも良好なものであることを知つた。
さらにまた、この支持体と、生物学的活性蛋白質
である酵素との結合は物理学的に吸着されるだけ
でなく、必要に応じて縮合剤、架橋化剤を用い
て、その結合を強固にせしめても、これによつて
その生物学的活性蛋白質は失活または劣化するこ
となく、著しく強固に固定化さたもので、これら
の支持体と生物学的活性蛋白質との結合した固定
材はその生物学的活性蛋白質の性質に応じて、そ
の生物学的活性蛋白質の活性により作用を受ける
物質に、長期間安定かつ効率よく使用し得るもの
であることを知つた。 本発明は、上記の知見に基いて完成されたもの
で、その目的は、生物学的活性蛋白質を著しく多
量に、安定に結合せしめた支持体からなる固定
材、およびその製法、ならびにそれを用いる装
置、方法、さらにその支持体の製造法を提供する
ものである。 次に、本発明を実施するに当つて、本発明の支
持体について述べる。 まず、アクリロニトリル系ポリマーとしては、
例えばアクリロニトリル、メタクリロニトリル、
α―クロロアクリロニトリル、シンナムニトリル
などのアクリロニトリル系モノマーのホモポリマ
ー、コポリマー、さらにこれらのアクリロニトリ
ル系モノマーとエチレン性二重結合を含む他のコ
モノマー、例えばスチレン、メチルスチレン、エ
チルスチレン、ニトロスチレン、クロルスチレ
ン、ブロムスチレン、クロロメチルスチレンなど
のスチレン系モノマー、アクリル酸メチル、アク
リル酸エチル、メタアクリル酸メチル、メタアク
リル酸エチル、メタアクリル酸エチレングリコー
ルエステルなどのアクリル酸エステル系モノマ
ー、メチルビニルケトン、エチルイソプロペニル
ケトンなどのビニルケトン系モノマー、ビニルク
ロライド、ビニリデンクロライドなどのハロゲン
化オレフイン、イソブテン、エチルビニルエーテ
ル、ブチルビニルエーテルなどのビニルケトン系
モノマー、酢酸ビニル、安息香酸ビニルなどのビ
ニルエステル系モノマー、ブタジエン、イソプレ
ンなどの共役ジエン、ジビニルベンゼン、ジビニ
ルトルエンなどの多官能性モノマー、Ｎ―ビニル
スクシンイミド、Ｎ―ビニルピロリドン、Ｎ―ビ
ニルフタルイミド（メタ）アクリルアミド、Ｎ，
Ｎ―ジメチル（メタ）アクリルアミドなどのアミ
ド系ビニルモノマー、ビニルピリジン、メチルビ
ニルピリジン、ビニルイミダゾール、Ｎ，Ｎ―ジ
エチルアミノエチル（メタ）アクリレートなどの
塩基性モノマー、などとを、必要に応じて架橋重
合剤、例えばジビニルベンゼン、ジビニルトルエ
ンを用いて、共重合せしめたものが挙られ、これ
はまた多成分共重合体でもよく、またこれらの重
合においては公知の方法を適宜使用して行なえば
よく、さらに一般に市販されているニトリル基を
有するポリマー、例えば繊維原料たる未加工のポ
リアクリロニトリルを使用すればよい。 次いで、このアクリロニトリル系ポリマーは、
その性質を良好となすため、多孔質構造となすも
のであるが、この多孔質構造となすに当つては、
例えばアクリロニトリルをホモ、あるいはコポリ
マーの条件下、そのモノマーを水系で懸濁重合ま
たは乳化重合せしめるか、または該ポリマーをジ
メチルホルムアミド、ジメチルスルホキサイド、
濃硝酸、ロダン塩水溶液、塩化亜鉛水溶液などの
可溶化溶媒に溶解せしめ、これを水、アセトン含
有水溶液、ジメチルホルムアミド水溶液、エタノ
ール含有水溶液などの凝固浴中に滴下、糸状ある
いはフイルム状にて押し出して、多孔質構造を有
する粒状、繊維状、膜状にせしめればよい。さら
に、中空糸状の繊維状になしてもよい。このよう
にして得られる多孔質構造は、多分、生物学的活
性蛋白質をその内部に浸透せしめる役割を有する
大孔径の孔と、その表面および内部で生物学的活
性蛋白質を捕捉する役割を有する小孔径とを有し
ているものと推定され、これにより、生物学的活
性体が結合されるものと認められるもので、その
孔は約40〜9000Å、好ましくは約50〜4000Å、さ
らに平均的には約100〜2000Å程度の孔径と推定
される。 本発明の多孔質構造を有する水溶性アミノ化ポ
リアクリロニトリル系ポリマーは、この多孔質構
造を有したアクリロニトリル系ポリマーを、好ま
しくは不活性非溶媒中還元されるものであるが、
この還元の目的は該ポリマー中に存在するニトリ
ル基の一部をアミノメチル基に還元せしめて、多
孔質構造を有するアミノ基含有アクリロニトリル
系ポリマーとなすものであつて、この還元に使用
される不活性非溶媒としてはジエチルエーテル、
ジオキサン、テトラヒドロフランなどの媒体にて
行なわれるもので、また還元剤としては通常水素
化リチウムアルミニウムが挙げられる。その使用
割合は目的とする遊離アミノ基含量によつて異な
るが、そのニトリル基の推定量に対し等モル以上
の還元剤を用いればよく、一般にその反応は室温
ないし、使用する媒体の沸点温度で行なえばよ
く、反応時間は、反応温度、使用するボリマーの
形状、構造、重合度などにより異なるが、通常10
分程度から48時間程度の間で適宜行なわれる。 このようにして得られたアミノ基含有アクリロ
ニトリル系ポリマーは、必要に応じて水冷、水
洗、酸水溶液洗浄、アルカリ水溶液洗浄などを行
なえばよい。また、この還元によつて得られる遊
離アミノ基の含量は、アミノ基含有アクリロニト
リル系ポリマーが実質的に水溶性にならないまで
の範囲内で有し、通常は該ポリマーｇ当り20μＭ
から1000μＭ有する。さらにこの本発明の支持体
は、あらかじめ多孔質構造となしているアクリロ
ニトリル系ポリマーから製造されるため、その還
元はポリマーを溶解しない媒体を使用して固体状
にて反応せしめて、多孔質構造のまま得られるも
のである。アクリロニトリル系該アクリロニトリ
ル系ポリマーの孔が多孔質構造となつていない場
合には、そのニトリル基のアミノメチル基への還
元は弱いため遊離のアミノ基のニトリル基に対す
る比率は少なくなるので、還元されるアクリロニ
トリル系ポリマーは予め多孔質構造であるのが好
ましい。 本発明においては、アミノ基含有ポリアクリロ
ニトリル系ポリマーは、必要に応じて生物学的活
性体と結合せしめる以前に、不活性媒体、例えば
水性媒体下にグルタルアルデヒドなどの架橋化剤
を用いて、グルタルアルデヒドの重合を防止のた
めに冷却化にて処理し、さらにこれに例えばヘキ
サメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミンな
どのアルキレンジアミン、リジンなどのスペーサ
ーとしての化合物を、同様な水性媒体下０℃〜室
温にて処理し、再度架橋化剤にて処理して、目的
の支持体となしてもよい。 次いで、この多孔質構造を有する水不溶性のア
ミノ基含有アクリロニトリル系ポリマーから支持
体と、生物学的活性蛋白質とを結合せしめるもの
であるが、この生物学的活性蛋白質としては、酵
素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、転位酵
素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどであ
つて、また酸化還元酵素としてはアルコールデヒ
ドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、
グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、ラクテー
トデヒドロゲナーゼ、ガラクトースデヒドロゲナ
ーゼ、グルコース―６―リン酸デヒドロゲナー
ゼ、３―ヒドロキシブチレートデヒドロゲナー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオ
キシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コリン
オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸オキシダー
ゼ、アミンオキシダーゼ、ザルコシンオキシダー
ゼ、ジアホラーゼ、ウリカーゼ、パーオキシダー
ゼ、カタラーゼ、リポキシゲナーゼなどが挙ら
れ、加水分解酵素としてはリパーゼ、ホスホリパ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、コレステロ
ールエステラーゼ、ホスフアターゼ、アミラー
ゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ペプシ
ン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ブ
ロメライン、ウレアーゼ、アミノアシラーゼ、ペ
ニシリンアシラーゼ、セフアロスポリンアシラー
ゼ、ペニシリナーゼ、セフアロスポリナーゼ、ク
レアチナーゼ、クレアチニナーゼなどが挙られ、
転位酵素としてはクレアチンホスキナーゼ、ピル
ベートキナーゼ、ヘキソキナーゼ、グリセロール
キナーゼなどが挙られ、イソメラーゼとしてはア
ラニンイソメラーゼ、グルコースイソメラーゼ、
グルコースホスフエートイソメラーゼなど、リガ
ーゼとしてはグルタチオンシンテターゼが挙ら
れ、以上の外に、蛋白質であつて生物学的活性を
有しているもので、該支持体と結合し得るもので
あればよく、またこれらの蛋白質を公知の種々の
手段をもつて、その誘導体となしたものであつて
もよく、さらに使用される該生物学的活性蛋白質
は、単独または２以上を同時に用いてもよい。次
いで、上記の種々な支持体と、生物学的活性蛋白
質とを結合せしめるのであるが、この支持体をカ
ラムに充填したカラム法、または容器に分散せし
めたバツチ法のいずれを用いてもよく、その際に
用いられる不活性媒体としては使用する生物学的
活性蛋白質が失活しない媒体であればよく、水、
または種々のPHに調整した緩衝液（例えばPH４〜
６酢酸緩衝液、PH６〜８のリン酸緩衝液、PH８〜
９のホウ酸緩衝液など）、含水アセトンなどの水
性媒体が好ましく、また結合における温度は同様
に失活しない温度であればよく、通常０〜30℃程
度であり、さらに使用する生物学的活性蛋白質の
量としては、該支持体の結合容量が充分満される
まで使用してもよく、その際は結合後の不活性媒
体中の生物学的活性蛋白質の活性の有無により判
断してもよく、また得られた固定材の生物学的活
性の測定を行なつてもよく、例えば後述実施例に
おける、アクリロニトリル55部、ジビニルベンゼ
ン25部、ビニルエチルベンゼン20部よりなる共重
合体の多孔質構造の還元後の遊離アミノ基および
ニトリル基を有してなる支持体のバチルス・メガ
テリウム―Ｂ―400（Bacillus megaterium Ｂ―
400：FERM―ＰNo.748）の生産するアシラーゼ
に対する結合は150u／mg、コマモナス・エス・
ピー・SY―77―１（Comamonas sp.SY―77―
１：FERM―ＰNo.2410）の生産するアシラーゼ
に対する結合は670u／mg、アースロバクター・
グロビフオーミス・Ｂ―0577（Arthrobactor
globiformis Ｂ―0577：FERM―ＰNo.3518）の生
産するコリンオキシダーゼに対する結合は7.0u／
ｇであつて、このように、使用する生物学的活性
体に応じて適宜その結合における使用量を変更す
ればよい。 このように処理することにより、アミノ基含有
アクリロニトリル系ポリマーからなる支持体と生
物学的活性蛋白質とを結合した固定材が得られる
ものであつて、さらにこれは必要に応じて、同一
系または別の系として結合化剤を使用して固定化
してもよい。使用される結合化剤としては、該支
持体の反応性の基、例えば遊離アミノ基と生物学
的活性蛋白質の遊離基例えばアミノ基、カルボキ
シル基、ヒドロキシル基、などを利用するもので
あつて、例えばヘキサメチレンジイソシアネー
ト、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、トル
エンジイソシアネート、キシレンジイソシアネー
ト、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドスター
チ、ジメチルアジピミデート、ジメチルスベリイ
ミデート、ジメチル―３，3′―ジチオビスプロピ
オンイミデート、無水コハク酸、クロトンアルデ
ヒド、アクロレインなどの架橋化剤を用いること
により、該支持体と生物学的活性蛋白質が架橋結
合される。また、支持体と生物学的活性蛋白質と
を直接共有結合する場合には、縮合剤、例えば１
―エチル―３―（３―ジメチルアミノプロピル）
―カルボジイミドなどの水溶性縮合剤が使用され
る。上記の如くの、結合化剤を用いるに当つて
は、不活性媒体、例えばテトラヒドロフラン、ア
セトン、エタノールなどを含有してもよい水性媒
体中で行なわれる。その際、室温下の条件が好ま
しく、また使用する生物学的活性蛋白質の安定な
PHの範囲、一般にPH４〜12の範囲にて適宜選択し
て行なえばよく、また使用する結合化剤は結合せ
しめる遊離基に対し１〜２倍モル程度でよい。 以上の如くして得られた固定材において、その
生物学的活性は著しく良好であり、この固定材は
その生物学的活性蛋白質の性質に応じて種々に利
用されるものである。従つてまた、以上の如くし
て得られた固定材は、その一定量をカラムなどの
一定容器に入れ、これを遊離アミノ基およびニト
リル基を有してなる支持体を生物学的活性蛋白質
とを結合した固定材の系となし、この際に必要に
応じて生物学的活性蛋白質の安定を保つため緩衝
液を使用することが好ましく、またこの系に対し
て、用いた生物学的活性蛋白質の活性により作用
を受ける物質を含有する系を設けるものである
が、この系に使用される物質としては、前記の生
物学的活性蛋白質に対応するものであればよく、
例えば、前記の種々の酵素の場合においてはその
基質が挙げられるものであつて、またその基質は
状態により種々有るが、水溶液、水性媒体（例え
ば緩衝液など）、血液、溶液またはこれらの処理
液などの体液の状態のものであつてもよく、例え
ば前記の生物学的活性蛋白質が酵素である場合に
おいては、酵素としてアシラーゼを挙げるならば
基質としては７―アシル―セフアロスポラン酸誘
導体の溶液、６―アシル―ペニシラン酸誘導体の
溶液、７―アミノ―３―セフエム―４―カルボン
酸またはその誘導体または６―アミノ―ペナム―
３―カルボン酸またはその誘導体とチエニル酢酸
メチルエステルとの溶液が一例として挙げられる
もので、また酵素としてコリンオキシダーゼ、
種々のホスホリパーゼ、ウリカーゼ、グルコース
オキシダーゼを挙げるならば対応するリン脂質、
尿酸、グルコースなどの血液、尿溶液などの体液
が挙られるものである。さらにこれらの系に、上
記の組合せの系によるその酵素反応系の変化をえ
る系を組合せることがよく、例えば、以下の如く
の装置、方法による系が挙られる。 まず、第１―１図に示す装置であるが、その第
１―１図においては、該固定材をカラム１に充填
して反応槽となし、この固定材を有した系からな
る反応槽とガラス管などにて接続した計測部分２
に電極３例えばガラス電極、酸素電極などをセツ
トした。この際、反応槽、計測部分２の容積はで
きるだけ小さくして反応液の拡散による誤差を小
さくする。電極３は必要に応じて微分変換器を具
備したエレクトロメーターまたはデイゾルブドオ
キシゲンメーター５（電位差計または溶存酸素
計）に接続し、さらにこれを記録計６に接続す
る。定量に際して、反応槽に必要に応じてPHを予
じめ一定にした試料または標準液を試料口より一
定量流入させ、酵素反応によりその基質濃度に対
応する電気的変化（電位変化、溶存酸素変化）を
生ぜしめ、例えばその電位の値と検量線とから試
料濃度を定量する。定量に際し、ガラス電極を用
いる場合は、窒素ガスを導入する。空気を導入す
れば空気中の炭酸ガスの影響によりPHの変化（電
極３においても同様）をうけるからである。PHメ
ーター８は標準液と試料液とのPHの差を補正す
る。 試料投入口又は標準投入口は同一のものであつ
てもよい。この場合には交互に使用する。別々の
投入口を設ける場合には同一の機能を有するもの
を別々に設ければよい。又該装置上に２ケ所の投
入口を設ければよい。 恒温槽７は酵素反応をなしうる温度であればよ
く、好ましくは30〜37℃でその酵素反応に必要な
時間反応させる。 またこの定量法は回分方式でもまた連続方式で
も実施できる。 試料の投入量は使用する酵素活性に影響をあた
えるが、連続方式の場合、通常１〜２ml／分程度
が試料中の基質を良好に反応せしめることができ
る量である。試料濃度は使用する酵素活性により
ことなるが、高濃度の場合には必要に応じて希釈
すればよい。 また、これらの種々の装置において、その酵素
反応系における反応生成物は、公知の方法を用い
て単離、回収してもよく、さらに上記の定量など
を合せて実施する場合、それらの目的に応じて試
料濃度、試料の量を決定すればよい。 なお、上記の定量装置において、電極２が酸素
電極である場合は、必ずしもPHメーター８を必要
とするものではなく、さらに記録計において微分
変換器を介して記録せしめてもよく、この組合せ
は適宜変更すればよく、また第１―２図、第１―
３図、第１０図に示す装置を用いてもよく、これ
らは何んら限定されるものではない。 さらに、体液中のリン脂質、コリン、ベタイン
アルデヒドを有する液体の系について述べれば、
コリンオキシダーゼを有する支持体からなる固定
材を単独、または、該支持体に結合せしめたホス
ホリパーゼＤの固定材もしくは未処理のホスホリ
パーゼＤとともにその目的に応じて他の呈色剤、
緩衝液、さらにそれに付属される装置とともに組
合せて使用すればよいものであつて、これらの固
定材を該液体と一定時間インキユベートせしめれ
ばよく、その酵素反応系により過酸化水素、ベタ
インが生成され、酸素の減少が生じるものであつ
て、次いで、この反応による過酸化水素、ベタイ
ン、酸素の測定をするのであるが、酸素の測定に
おいては酸素電極を用いる方法が最も簡便であ
り、ベタインの測定においてはライネツケ塩法が
好ましく、またベタインをエステル化してガスク
ロマトグラフイーなどにて行なつてもよい。また
過酸化水素の測定においては、好ましくは過酸化
水素電極によるメーター（例えばYSI社製オキシ
ダーゼメーター）を用いた上記の如くの装置にて
測定するか、その過酸化水素を反応してその色調
に変化を生ずる１種もしくは２種以上の呈色剤か
らなる系にて、比色測定によつて測定することが
好ましい。測定する方法としては、例えば、生成
する過酸化水素と反応して安定した赤色を形成す
る４価のチタン化合物とキシレノールオレンジに
よる反応、或はフエノール、４―アミノアンチピ
リンおよびパーオキシダーゼによる反応などを利
用する方法などが挙げられる。このフエノール、
４―アミノアンチピリン、パーオキシダーゼによ
る反応を利用する過酸化水素の測定において、４
―アミノアンチピリンは生成する過酸化水素量に
対し1/2モル以上、好ましくは２モル以上、さら
にパーオキシダーゼは0.1u以上、好ましくは0.2
〜0.5u程度使用することが望ましい。さらにまた
４―アミノアンチピリンの代りに４―アミノフエ
ナゾーンを用いてもよく、これらの各試薬は溶液
としてあらかじめ混合、調製すればよい。このよ
うにして呈色せしめた色調を適当な波長にて測定
し、その検量線より存在する過酸化水素を定量
し、存在するコリンまたはベタインアルデヒドも
しくはコリンの誘導体またはベタインアルデヒド
の誘導体の定量、またはコリンの誘導体を加水分
解する酵素活性などの定量を行なう。また上記の
方法以外に、２，６―ジクロルフエノールインド
フエノールとパーオキシダーゼの組合せによる過
酸化水素の定量測定、グアヤク脂とパーオキシダ
ーゼの組合せによる過酸化水素の定量測定、ホモ
バニリン酸とパーオキシダーゼの組合せによる過
酸化水素の定量測定など種々の方法を用いてもよ
い。さらに、上記の種々の装置、方法において使
用される本発明の固定材は、粒状、フイラメント
状、膜状の種々の形状のものを用いればよいもの
である。 以上の如くして、アミノ基含有アクリロニトリ
ル系ポリマーからなる支持体と生物学的活性蛋白
質とを結合した固定材を使用することにより、良
好になし得るものである。さらにこの支持体に、
前記の生物学的活性蛋白質として、酵素以外の蛋
白質、、例えばホルモン、抗体などの支持体とし
て使用し得るものである。 次に、実施例および参考例を挙げて本発明を具
体的に述べるが、本発明は何んらこれらによつて
限定されるものではない。 また、以下の実施例、参考例において、生物学
的活性体として酵素を利用した際のその活性測定
法は、次に述べる方法を用いたものである。 （ペニシリンアシラーゼの力価測定法） (1) 酵素液の場合 酵素液0.5ml、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）
4.0ml、４（Ｗ／Ｖ）％PcGカリウム塩／0.1M
リン酸緩衝液（PH7.5）0.5mlよりなる反応液を
37℃、30分間反応せしめた後、これから0.5ml
をとり、0.05NNaOH／ml、20％酢酸２mlより
なる緩衝液３ml、0.5（Ｗ／Ｖ）％Ｐ―ジメチ
ルアミノベンズアルデヒド／メタノール溶液
0.5ml中に加え、室温下10分間反応させ、
415nmにおける吸光度を測定し、生成する６―
APA量を求める。 酵素活性は、１分間に１μモルの６―APA
を生成する活性を１単位（1U）とする。 (2) 固定化酵素の場合 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）4.5ml、４（Ｗ／
Ｖ）％PcGカリウム塩／0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）0.5mlよりなる溶液中にあらかじめ重
量を測定した固定化酵素を添加し、37℃、30分
間反応せしめる。以下上記酵素液の場合と同様
にして生成する６―APA量を求める。 （アシラーゼ活性測定法―１） アシラーゼ含有液0.25mlおよび基質たる７―
（４―カルボキシブタンアミド）―デスアセトキ
シセフアロスポラン酸の１％、0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.0）溶液0.25mlからなる系、またはアシ
ラーゼと支持体とを結合した固定材、上記と同一
の基質溶液2.0mlおよび0.1Mリン酸緩衝液2.0mlか
らなる系を、37℃、30分間反応せしめ、反応後生
成した７―アミノ―デスアセトキシセフアロスポ
ラン酸（７―ADCA）含有液0.5mlに、
0.05NNaOH1ml、2.0％酢酸２mlよりなる緩衝液
３ml、0.5％ｐ―ジメチルアミノベンズアルデヒ
ドメタノール溶液0.5mlを加え、室温下10分間反
応させ、その後415nmにおける吸光度を測定し、
７―ADCAの検量線より試料中の７―ADCA量を
算定するもので、100r／mlの７―ADCAを生成す
る力価を100uとする。 この測定法は、コマモナス・エス・ピー・SY
―77―１の生産するアシラーゼを利用した場合に
行なつたものである。 （アシラーゼ測定法―２） 上記のアシラーゼ測定法―１において、基質と
して１％７―フエニルアセトアミド―デスアセト
キシセフアロスポラン酸の0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）を用いて、上記のアシラーゼ測定法―１
と同様に行なつたもので、この測定法はバチル
ス・メガテリウム・Ｂ―400の生産するアシラー
ゼを利用した場合に行なつたものである。 （コリンオキシダーゼ活性測定法） コリンオキシダーゼ含有液５μ、またはコリ
ンオキシダーゼと支持体とを結合した固定材１〜
５mg、0.2Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）0.05ml、
３mg／ml４―アミノアンチピリン0.05ml、0.1％
フエノール0.10ml、2u／mgパーオキシダーゼ0.10
ml、0.1M塩化コリン0.10mlおよび蒸留水0.1mlか
らなる系を、37℃、５分間反応させた後、2.5ml
のエタノールを加えて反応を停止せしめ、次いで
480nmにおける吸光度を測定し、１分間に１μ
moleの過酸化水素を生成する活性を1uとする。
また該固定材の力価の算出は次式に従う。 力価（ｕ／ｇ）＝△４８０ｎｍ×０．３５×１０００
／反応時間（分）×固定材（mg） この測定法は、アースロバクター・グロビフオ
ーミス・Ｂ―0577の生産するコリンオキシダーゼ
を利用した場合に行なつたものである。 （ホスホリパーゼＤ活性測定法） ホスホリパーゼＤ有液0.05ml、0.2Mトリス塩
酸緩衝液（PH8.0）0.1ml、10mMレシチンエマル
ジヨン0.1ml、0.1M塩化カルシウム0.05ml、１％
トリトンＸ―100 0.1ml、水0.1mlよりなる系を37
℃、10分間反応せしめるか、またはホスホリパー
ゼＤと支持体とを結合した固定材１〜５mg、
0.2Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）0.15ml、10mM
レシチンエマルジヨン0.1ml、0.1M塩化カルシウ
ム0.05ml、１％トリトンＸ―100 0.1ml、水0.1ml
よりなる系を37℃、５分間反応せしめ、その後煮
沸して反応を停止し、次いで37℃に冷却し、これ
に、４―アミノアンチピリン（３mg／ml）0.1
ml、2u／mlパーオキシダーゼ0.1ml、0.1％フエノ
ール0.10％、12u／mlコリンオキシダーゼ0.1ml、
水0.1mlを加えて37℃、20分間反応せしめた後１
％トリトンＸ―100 ２mlを加え、500nmの吸光度
を求める。ホスホリパーゼD1uは１分間に１μ
moleのコリンを生成せしめる酵素活性である。
また、該固定材の力価の算出は次式に従う。 力価（ｕ／ｇ）＝△Ａ５００ｎｍ×０．０５×１００
０／反応時間（分） この測定法は、ホスホリパーゼＤを利用した場
合に行なつたものである。 さらに、上記の種々の酵素活性の測定法は、そ
の一例であつて、公知の他の測定法を用いてもよ
く、また適宜利用した酵素に適した測定法を用い
ればよい。また利用する酵素が本発明の固定材の
場合は、これを酵素電極となし、反応槽、計測部
分を付属せしめて装置となし、この反応槽に、利
用する酵素に対応する種々の試薬、試料または標
準液たる対応する基質を含有する溶液を、適宜な
組合せの系として使用し、上記の測定法に基く反
応を行なわせて測定してもよい。 参考例 １ 500ml容三つ口フラスコを約35℃の恒温水浴に
ひたし、約15分間窒素で置換せしめ、次いで、フ
ラスコ内に120mlの蒸留水を加え、さらにアルキ
ルスルホン酸ナトリウム2g、アクリロニトリル
80g、過硫酸ナトリウム0.1g、亜硫酸水酸ナトリ
ウム0.033gを加え、約３時間撹拌せしめて乳濁液
を得、次いでこれを約500mlの水に注ぎ、撹拌下
塩を加えて凝固せしめて生成物を析出し、これを
別、水洗し、通風乾燥してポリアクリロニトリ
ル（0.5％、30℃におけるジメチルホルムアミド
での対数粘度は約10.5である）を得た。次いでこ
のポリアクリロニトリル10gをジメチルホルムア
ミド150mlに溶解し、これを、20％ジメチルホル
ムアミド含有水浴中に、糸状に成形して、多孔質
構造を有するポリアクリロニトリル（アクリロニ
トリル90％以上）繊維（太さ20〜35ミクロン）を
得た。同様に、ポリアクリロニトリル10gを20％
ジメチルホルムアミド含有水浴中に、アトマイザ
ーカツプを用いて滴下して、多孔質構造を有する
ポリアクリロニトリル（アクリロニトリル90％以
上）粒状物（平均粒径100メツシユ）を得た。 この様にして得られたポリアクリロニトリルは
後述実施例の如く使用する。 実施例 １ 水素化リチウムアルミニウム2.5gを三つ口フラ
スコに加え、乾燥エーテル100mlを添加・撹拌
し、これに参考例１の如くして得られた多孔質構
造を有するポリアクリロニトリルの粒状物2gを
加えて50℃にて16時間加熱還流し、反応後氷冷
下、水を滴下して未反応の水素化リチウムアルミ
ニウムを分解せしめ、さらに1NHClを滴下して、
その分解物を溶解せしめ、次いでこれを別し
て、アミノ化された該ポリアクリロニトリルを回
収し、次いで1NHCl、水、1NNaOH、水0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.5）の順で洗浄して薄黄色の多
孔質構造を有するアミノ化ポリアクリロニトリル
の粒状物（平均粒径100メツシユ）を得た。 同様に、上記の多孔質構造を有するポリアクリ
ロニトリルの粒状物の代りに、多孔質構造を有す
るポリアクリロニトリル繊維を用いて行なつた結
果、多孔質構造を有するアミノ化ポリアクリロニ
トリル繊維を得た。 実施例 ２ 水素化リチウムアルミニウム2gを乾燥エーテ
ル50mlに添加し、撹拌し、これに参考例１と同様
にして得られた多孔質構造を有するポリアクリロ
ニトリル系ポリマー（アクリロニトリル55部、ジ
ビニルペンゼン25部、ビニルエチルベンゼン20部
よりなるコポリマー）の粒状物3gを冷却下少量
づつ添加し、45℃で各々10分〜８時間加熱還流
し、次いで氷浴中、冷却撹拌下に２mlの水を添加
して未反応の水素化リチウムアルミニウムを分解
せしめ、さらに1NHClを添加した後その不溶物た
るアミノ基を有する該ポリマーを取し、これを
洗浄して多孔質構造を有するアミノ化ポリアクリ
ロニトリル系ポリマーの平均粒径100メツシユ、
湿重量9gを得た。 得られたアミノ化コポリマー粒状物の物理化学
的性質は次の通りである。 色；淡黄色、還元時間が長くなるに従い、黄色
味が強くなる。 粘度；不明（下記の溶媒に対して溶解しないた
め測定不可能） 溶媒に対する溶解性；DMSO、DMF、濃硝
酸、65％KSCN溶液（60℃）、クロロホルム、ア
セトニトリル、ピリジン、ニトロメタン、シクロ
ヘキサン、ジエチルエーテル、30％NaOH溶液の
各溶媒に不溶性。 アミノ基含量；実施例１に記載の塩酸測定法に
よりアミノ基含量を測定すると、各還元時間にお
ける支持体の推定アミノ基含量は次のとおりであ
る。 還元時間 アミノ基含量（消費塩酸量） 10分 545μＭ／支持体ｇ １時間 738 〃 ８時間 780 〃 また、この原料である多孔質構造を有するポリ
アクリロニトリル系ポリマー（アクリロニトリル
55部、ジビニルベンゼン25部、ビニルエチルベン
ゼン20部よりなるコポリマー）（対照）と、これ
を還元して得られた多孔質構造を有するアミノ化
コポリマーの粒状物（本発明）との、後述参考例
で得られる種々の酵素に対する結合能は次の通り
である。
【表】 また、結合能の測定は、本発明または対照50〜
100mgをＬ型試験管に加え、これに酵素含有緩衝
液を加えて、30℃、60分間撹拌した後、これを
取し、次いで0.5M食塩／0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）で洗浄し、次いで0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）で洗浄し、得られたものについて、上記の
活性測定法を用いて行なつたものである。 実施例 ３ 実施例２の如くして得られた多孔質構造を有す
るアミノ化ポリアクリロニトリルの粒状物9gを
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗浄した後、あら
かじめ氷冷した12.5％グルタルアルデヒド／ホウ
酸緩衝液（PH8.5）200mlに加えて０℃、20分間撹
拌し、このグルタルアルデヒド処理支持体を取
して0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で充分に洗浄し
て、これを、バチルス・メガテリウム・Ｂ―400
の生産するアシラーゼ酵素液（60u／ml）60ml中
に加えて４℃で一夜撹拌した。次いで、これを
取し、0.5M食塩／0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）、
次いで0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗浄して、
該粒状物とアシラーゼとを結合した固定材8.7g
（アシラーゼ活性324u／mg）を得た。 実施例 ４ 実施例３で得られたグルタルアルデヒド処理支
持体とアシラーゼとを結合した固定材をジヤケツ
ト付カラム（径1.2×８cm）に充填し、37℃にて
７―フエニルアセトアミド―デスアセトキシセフ
アロスポラン酸／0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）の
１％溶液をSV0.5で20日間連続的にチヤージし、
得られた反応液中の７―ADCA含量は、
0.05NNaOH1ml、20％酢酸２mlよりなる緩衝液、
0.5％ｐ―ジメチルアミノベンズアルデヒドメタ
ノール溶液0.5mlを用いて10分間反応後415nmに
て吸光度を測定する方法（PDAB法）にて測定
し、その７―ADCAの検量線より求められ、横軸
に、反応液量／カラム容量、およびチヤージ日
数、縦軸に７―ADCAの生成率をとつて示せば、
第２図に示す通りで、その結果、本発明の固定材
は著しく長期間使用し得るものであることが明ら
かである。 実施例 ５ 水素化リチウムアルミニウム3.8gを乾燥エーテ
ル120mlに加え、これに多孔質構造を有するポリ
アクリロニトリル（アクリロニトリル95％）繊維
2.5gを加え、45℃、24時間撹拌下還元せしめ、次
いでこれに、氷浴中、冷却撹拌下３mlの水を滴下
し、さらに1NHClを少量づつ滴下し、水素ガスの
発生が止つた時点にて、これを別し、多孔質構
造を有するアミノ化ポリアクリロニトリル繊維
12.5g（湿重量）を得た。 次いで、上記で得られた該繊維物600mg（湿重
量）を、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗浄し、
これを冷却した12.5％グルタルアルデヒド／ホウ
酸緩衝液（PH8.5）50ml中に加えて、０℃、20分
間撹拌した後これを取し、さらに0.1Mリン酸
緩衝液（PH7.5）で洗浄し、この洗浄物を、コマ
モナス・エス・ピー・SY―77―１の生産するア
シラーゼ酵素液８ml（129.7u／ml）中に加え、室
温下５分間撹拌した後、さらにこれに25％グルタ
ルアルデヒド10μを添加し、30℃、60分間撹拌
し続けた。その後これを取して、その固形物を
回収し、0.5M食塩／0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）
で洗浄し、さらに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で
洗浄して、該繊維物とアシラーゼとを結合した固
定材（アシラーゼ活性1.92u／mg）300mg（湿重
量）を得た。 さらに、この様にして得られた固定材4.5g（湿
重量）をジヤケツト付カラム（１×５cm、Ｖ＝４
ml）に充填し、これを0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）で洗浄し、次いでこれを9.92mg／mlの７―
（４―カルボキシブタンアミド）―セフアロスポ
ラン酸の0.1Mリン酸緩衝液をSV1.5にて連続的に
チヤージし、得られた７―アミノ―セフアロスポ
ラン酸（７―ACA）を含有する流出液は、
PDAB法を用いて、その７―ACAの検量線よ
り、その７―ACA含量が求められ、横軸に通液
量、縦軸に７―ACAの生成率である切断率とし
て示せば、第３図に示す通りであつて、本発明の
固定材は何んら、その酵素活性の劣化しないもの
で長期間良好に使用し得るものであつた。さら
に、上記の７―ACAを含有する流出液600ml（切
断率84.5％）を用い、これをPH3.2に調節した後
濃縮して約55mlとなし、次いでこれを４℃、１晩
放置して析出した７―ACA3.22g（純度86.3％）
を得た。 実施例 ６ 上記実施例５と同様にして得られた、多孔質構
造を有するアミノ化ポリアクリロニトリル繊維
0.6g（湿重量）を、氷冷した12.5％グルタルアル
デヒド／ホウ酸緩衝液（PH8.5）50ml中に加え、
０℃、20分間撹拌し、該フイラメント状物を取
し、これをホウ酸緩衝液（PH8.5）、次いで0.1M
リン酸緩衝液（PH7.5）にて洗浄後、さらにこれ
に、後述参考例にて得られたホスホリパーゼ
D20u／ml、およびコリンオキシダーゼ5u／mlを
含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）12mlを添加し、
０℃で一夜撹拌し、これを取し、0.5M食塩／
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗浄し、該繊維物
とホスホリパーゼＤおよびコリンオキシダーゼと
を結合した固定材（ホスホリパーゼＤ活性は
119u／ｇ、コリンオキシダーゼ活性17u／ｇ）を
得た。 次いで、この固定材を、第１―２図に示す如く
の、１〜７よりなる装置と組合せて使用した。即
ち、該固定材を１のカラム（径５×3.5cm）に充
填し、基質溶液として、トリトンＸ―1000.3％、
CaCl20.01Mを含む0.01Mトリスアミノメタン塩酸
緩衝液を流速20ml／ｈで試料注入口Ｂより流して
定常状態にした後、試料注入口B′より各種濃度の
リン脂質溶液を５μ注入する。リン脂質溶液を
注入することにより、１の固定材を含有するカラ
ム内にてホスホリパーゼＤおよびコリンオキシダ
ーゼによりリン脂質は酵素分解され、その際に溶
存している酵素は、コリンオキシダーゼによるコ
リン酸化の反応にて消費され、これを酵素電極３
を有する計測部分２（フローセル）にて測定し、
次いでこれをデイゾルブドオキシゲンメーター
（溶存酸素計）５を介して記録計６にて記録す
る。この様にして、リン脂質の濃度と生ずるピー
ク面積値からの検量線は第４図に示す通りであつ
た。またこの検量線をもととして、試料注入口Ｂ
より血清成分を注入することによつて、血液中の
リン脂質の定量を行なうものである。さらに、こ
の反応の例をレシチンを用いて示せば、次の反応
式に進行するものであつて、反応式中のO2とし
て示される酵素の消費を計測するものである。 さらに、レシチンを基質として1mM、2mM、
3mMの各濃度の溶液として、こを10μづつ注
入し、流速38ml／ｈ、チヤートスピード300mm／
ｈにて、その使用回数における、対応するピーク
面積値の変化を求めた結果、第５図に示す通りで
あつた。 以上の通り、この固定材を用いて測定するに当
つて、第４図からも明らかな通り、著しく正確な
値を与えるもので、さらに第５図からも明らかな
通り、種々の濃度においても、ほとんど安定した
状態にて使用し得る良好なものであつた。 実施例 ７ 参考例１の如くして得られたポリアクリロニト
リルを、同様に、ジメチルホルムアミドを用いて
溶解し、これを15％ジメチルホルムアミド含有水
溶中にて形成せしめ、次いで水洗し、通風乾燥
し、この多孔質構造を有するポリアクリロニトリ
ルの膜状物450mgを、水素化リチウムアルミニウ
ム700mg、エーテル30mlを用いて、18時間、同様
の手段にて加熱還流し、これを洗浄して多孔質構
造を有するアミノ化ポリアクリロニトリルの膜状
物520mg（湿重量）を得、次いでこの膜状物150mg
を12.5％グルタルアルデヒド／ホウ酸緩衝液（PH
8.5）40mlに加えて０℃、20分間撹拌した後別
し、これを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）にて洗浄
後、コリンオキシダーゼ（3.6u／mg）15mg含有
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）５mlに加えて30℃、
60分間撹拌し、次いでこれを取した後0.5M食
塩／0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）、さらに0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.5）にて洗浄して、該膜状物と
コリンオキシダーゼとを結合した固定材（コリン
オキシダーゼ活性3u／ｇ）を得た。 次いで、この固定材を５mm×５mm片に切り取
り、第１―３図に示す通りの装置を用いて、この
片を、その酵素電極３に付着し、これをナイロン
ネツトで覆い、計測部分２につけ、そえらを恒温
槽７にセツトした。次いで、この計測部分２に
0.01Mトリス緩衝液（PH8.0）１mlを注入口Ｂよ
り注入して溶存酸素値を安定せしめた後注入口Ｂ
より各濃度の塩化コリン溶液20μを注入して、
その結果を微分変換器を具備したメーター５（溶
存酸素計）を接して記録計６にて、塩化コリンの
濃度とその最大速度変化値（dto2）から、その検
量線を求めれば第６図に示す通りであり、また
0.016M塩化コリン20μを用いて、使用回数に
おけるその変化値を求めれば第７図に示す通りで
あつて、その結果、正確な測定値を示し、かつ安
定して使用し得る良好なものであつた。 実施例 ８ 実施例７と同様にして得られた多孔質構造を有
するアミノ化ポリアクリロニトリルの膜状物10mg
（湿重量）を、12.5％グルタルアルデヒド／ホウ
酸緩衝液（PH8.5）40mlに加え、０℃、20分間撹
拌して、取し、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）に
て洗浄後、グルコースオキシダーゼ（ベーリンガ
ー社製）（210u／mg）10mgを含有した0.1Mリン酸
緩衝液（PH7.5）５mlに加えて30℃、60分間撹拌
し、その後取して0.5M食塩／0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.5）にて洗浄し、さらに0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.5）にて洗浄して、該膜状物とグルコー
スオキシダーゼとを結合した固定材（グルコース
オキシダーゼ活性150u／ｇ）を得た。 次いで、この固定材を、５mm×５mmの片とな
し、実施例８と同様にして、その塩化コリンの代
りにグルコースを用いて行なつた。 その結果、その検量線は第８図、使用回数は第
９図に示す通りであつて、著しく正確、かつ安定
なものであつた。 実施例 ９ コリンオキシダーゼ160mg（3.6u／mg）を0.1M
リン酸緩衝液（PH7.5）５mlに溶解し、これに、
実施例５の如くして得られた95％アクリロニトリ
ルからなるポリアクリロニトリルを用いて得られ
た多孔質構造を有するアミノ化ポリアクリロニト
リル繊維100mg（湿重量）を加え、氷溶中で撹拌
し、次いでこれに１―エチル―３―（３―ジメチ
ルアミノプロピル）―カルボジイミド20μを加
え、1NHClでPHを7.5に調節し、、氷溶中で３時
間、さらに４℃で１夜撹拌した後、これを取
し、0.5M食塩／0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗
浄しさらに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗浄し
て、該フイラメント状物とコリンオキシダーゼと
を結合した固定材（コリンオキシダーゼ活性
5.6u／ｇ）を得た。 実施例 10 実施例９において、コリンオキシダーゼの代り
に、バチルス・メガテリウム・Ｂ―400の生産す
るアシラーゼ酵素液（96u／ml）５mlを用い、ま
た１―エチル―３―（３―ジメチルアミノプロピ
ル）―カルボジイミド40μを用いて、実施例10
と同様に行なつて、該フイラメント状物とアシラ
ーゼとを結合した固定材（アシラーゼ活性
264u／ｇ）を得た。 実施例 11 実施例２と同様にして得られた、多孔質構造を
有するアミノ化ポリアクリロニトリル系コポリマ
ーの粒状物（平均粒径100メツシユ）500mg（湿重
量）を、12.5％グルタルアルデヒド／ホウ酸緩衝
液（PH8.5）30ml中に加え、０℃、20分間撹拌し
た後取し、これを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）
にて充分洗浄し、次いでこれを0.5Mヘキサメチ
レンジアミン水溶液（PH9.5）30ml中に加えて、
４℃、24時間撹拌して取し、充分に水洗した。
さらに、これを12.5％グルタルアルデヒド／ホウ
酸緩衝液（PH8.5）で処理し、洗浄した後バチル
ス・メガテリウム・Ｂ―400の生産するアシラー
ゼ酵素液（72U／ml）５mlに加えて４℃、12時間
撹拌し、その後これを取し、0.5M食塩／0.1M
リン酸緩衝液（PH7.5）、さらに0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.5）にて洗浄して、該球状物とアシラー
ゼとを結合した固定材（アシラーゼ活性250U／
ｇ）440mg（湿重量）を得た。 実施例 12 グルコース２％、リン酸ノカリウム0.4％、硫
酸マグネシユーム0.1％、塩化カリウム0.05％、
硫酸第一鉄0.0025％、酵母エキス0.1％およびDL
―メチオニン0.3％よりなる培地20（PH6.0）を
30容ジヤーフアーメンターに加えて120℃、20
分間にて滅菌した後、トリゴノプシス・バリアビ
リス（Trigonopsis variabilis）CBS4095を接種
し、30℃、48時間培養して培養物約20を得、こ
れを過して、湿潤菌体約400gを得た。次いで
この菌体を、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）800ml
に分散し、さらにこれにグラスビーズ（径0.25〜
0.30mm）1000gを加えて、充分に破砕せしめた
後、15000rpm.20分間冷却遠心分離して、その上
清液（Ｄ―アミノ酸酸化酵素活性15000U／ml）
1000mlを得、これをカーボワツクス（平均分子量
約20000）にて処理して、Ｄ―アミノ酸酸化酵素
の濃縮液（145000U／ml）100mlを得た。 次いでこの濃縮液10mlに、対照として多孔質構
造を有するポリアクリロニトリル（アクリロニト
リル95％）繊維、本発明として実施例５と同様に
して得られた多孔質構造を有するアミノ化ポリア
クリロニトリル繊維を、各々1gを、Ｌ型試験管
中に加えて、30℃、60分間撹拌し、次いでこれを
取し、水浄して、各々の繊維物に対する該酵素
の結合を、その酵素活性を測定して調べた結果、
対照のポリアクリロニトリル繊維物ではそのＤ―
アミノ酸酸化酵素活性は7.5U／mg（結合率0.5
％）であつて、これに対して本発明のアミノ化ポ
リアクリロニトリル繊維物のＤ―アミノ酸酸化酵
素は276U／mg（結合率19.0％）であり、著しく
良好な固定材が得れたものである。 また、このＤ―アミノ酸酸化酵素の活性測定法
としては、酵素液0.5ml、0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）1.0mlまたは酵素を結合した材（例えば本発
明の上記固定材）、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）
1.5mlと、呈色剤（５mg０―ジアニシジンを１ml
エタノールに溶解し、その0.3mlを0.1Mリン酸緩
衝液10mlに加え、さらにこれにパーオキシダーゼ
8U／mgを２mg加えて調整した）0.5mlおよび２％
アラニン水溶液0.5mlの系を37℃、15分間反応せ
しめ、その後これに50％トリクロロ酢酸0.5mlを
加えて反応を停止せしめ、さらにエタノール2.0
mlを加えて10000rpm、５分間遠心分離して、そ
の上清液を回収し、これを400nmにて吸光度を測
定し、反応15分間における吸光度0.100を変化せ
しめる酵素力価を100Uとする。 実施例 13 多孔質構造を有するポリアクリロニトリル（ア
クリロニトリル90％以上）繊維1.5gを、水素化リ
チウムアルミニウム1.5gを含む乾燥エーテル120
ml中に加え、50℃の油浴中、21時間加熱還流し、
次いでこれを取し、洗浄（エーテル、少量の
水、1NHCl、水、1NNaOH、水、0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.5の順）して、多孔質構造を有するア
ミノ化ポリアクリロニトリル繊維7g（湿重量）
を得た。 次いで、この繊維物を、冷却した12.5％グルタ
ルアルデヒド／ホウ酸緩衝液（PH8.5）240ml中に
加え、０℃、20分間撹拌し、これを取した後ホ
ウ酸緩衝液（PH8.5）、0.1M―リン酸緩衝液（PH
7.5）の順で洗浄し、これを、バチルス・メガテ
リウム・Ｂ―400の生産するアシラーゼ酵素液
（60U／ml）113mlに加えて室温下４時間撹拌し、
さらに５℃で一夜放置し、これを取した（液
中のアシラーゼ活性は認められなかつた）。さら
にこれを0.5M食塩／0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）、および0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で洗浄
し、該繊維物とアシラーゼとを結合した固定材
（584U／ｇ）6.8g（湿重量）を得た。 さらに、得られた固定材を、第１０図に示す製
造装置に使用する。即ち第１０図において、上記
の固定材をジヤケツト付カラム（径1.6×６cm）
９に充填し、これを37℃に保ち、マグネチツクス
ターラー１０の上に50ml容貯蓄槽１１を氷浴にて
冷却するための500ml容冷却槽１２を設け、この
冷却された貯蓄槽１１内にベンジルペニシリンカ
リウム塩4.455gを0.02Mリン酸緩衝液（PH7.5）に
加えて、1NNaOHでPH8.0に調節した溶液50mlを
入れ、この溶液を37℃の熱交換用ジヤケツト１３
を通してカラム９に、流速21ml／分にて流し、カ
ラム９の通過液はポンプ１４により貯蓄槽１１に
循環され、さらにこの貯蓄槽１１にPHメーター１
５を設けて、4NNaOHを用いて、カラム１の通過
液の流入によるPHの変動をPH7.8〜8.2に調節す
る。この溶液の循環を３時間続け、その後、貯蓄
槽１１の溶液およびカラム９の洗浄液約10mlを回
収、併合し、これにアセトン30mlを加え、6NHCl
にてPH4.2に調節し、５℃、一夜放置し、生ずる
沈澱物を取し、アセトンで洗浄し、乾燥して６
―アミノペニシラン酸2.16g（純度96％）を得
た。 さらに、上記操作を10回繰り返した結果、得ら
れた６―アミノペニシラン酸の収量に低下はみら
れなかつた。 実施例 14〜16 ○イ 500ml容三つ口フラスコに窒素導入管、撹拌
機、還流コンデンサーを取り付け、フラスコを
約40℃の恒温水浴にひたし、15分間窒素で置換
した。次いで、このフラスコ内に、1gのアル
キルスルホン酸ナトリウムを溶解した120mlの
蒸留水を加えて撹拌し、さらに禁止剤を除いた
70gのアクリロニトリルと10gのスチレンを加
えて乳化し、その後これに過硫酸カリウム0.1g
を加えて20〜22時間重合せしめて、0.1〜1.0μ
の粒径を有する乳濁液を得、これを500mlの水
に注ぎ、撹拌しながら食塩を加えて凝固させ、
この生成物たるアクリロニトリル―スチレンコ
ポリマーを取し、水洗、乾燥し、さらに減圧
して未反応の該モノマーを除去し、ジメチルホ
ルムアミドにおける極限粘度1.3の該コポリマ
ーを得、さらにこのコポリマー10gを200mlの
ジメチルホルムアミドに溶解し、これをアトマ
イザーカツプを用いて20％アセトン水浴50中
に液滴状に滴下して、含水状の多孔質構造の球
状物（径0.5〜１mm）を得た。 ○ロ 上記○イと同一の装置を用いて、2gのトリト
ン（Triton）と720（ローム・アンド・ハス社
製）と2gのテルギトール（Tergitol）（ユニオ
ン・カーバイド社製）とを溶解した蒸留水300
mlに、0.2gの過硫酸カリウムを加えて撹拌し、
さらにあらかじめ禁止剤を除いた80gのアクリ
ロニトリルと20gの蒸留したアクリル酸メチル
を加えて40〜50℃に加熱して重合せしめ、約30
分後に還流温度90℃になるように重合せしめ、
反応後その懸濁液を15〜20分間水蒸気蒸留し
て、未反応の該モノマーを除去し、その後、○イ
と同様にして、塩析、通風乾燥して、ジメチル
ホルムアミド中の極限粘度1.2を有するアクリ
ロニトリル―アクリル酸メチルコポリマーを得
た。次いでこのコポリマー10gをジメチルスル
ホキサイド100mlに溶解して、アトマイザーカ
ツプを用いて液滴状に、20％ジメチルスルホキ
サイド水浴中に滴下して、該コポリマーの含水
ゲル状の多孔質構造を有する球状物（径0.5〜
１mm）を得た。 ○ハ 上記の○イのスチレンの代りに、ジビニルベン
ゼン10gを用いて、○イと同様に行なつて、アク
リロニトリル―ジビニルベンゼンコポリマーの
含水ゲル状の多孔質構造の球状物（径0.5〜１
mm）を得た。 上記○イ、○ロ、○ハで得られたコポリマーの多孔質
構造を有する球状物各々2gを用いて、各々以下
の通りの還元を行なつた。即ち、水素化リチウム
アルミニウム25gを三つ口フラスコに加え、乾燥
エーテル100mlを添加して撹拌し、これに上記コ
ポリマー2gを加え、50℃の恒温にて、16時間加
熱還流し、反応後氷浴中で、水、1NHClで処理
し、さらに1NHCl、水、1NHaOH、水、0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.5）の順で洗浄して、多孔質構
造を有するアミノ化アクリロニトリル系コポリマ
ーの粒状物を得た。さらに、上記の各々の多孔質
構造を有するアミノ化アクリロニトリル系ポリマ
ーの粒状物300mg（湿重量）を、氷冷した12.5％
グルタルアルデヒド／ホウ酸緩衝液（PH8.5）50
mlに加えて０℃、20分間撹拌し、次いでこれを
取し、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）にて洗浄後、
これをＬ型試験管に入れたバチルス・メガテリウ
ム・Ｂ―400の生産するアシラーゼ酵素液
（72U／ml）３ml中に加え、30℃、60分間撹拌
し、その後これを取し、0.5M食塩／0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.5）、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）
で洗浄して、各々目的とするアシラーゼと結合し
た固定材を得た。 さらに、実施例１で得られた多孔質構造を有す
るアミノ化ポリアクリロニトリルの粒状物を用い
て、上記と同様にして、アシラーゼを結合せしめ
て固定材を得た。 その結果、○イにおいて得られたコポリマーを使
用した場合の固定材におけるアシラーゼ活性は
162U／ｇ、○ロにおいて得られたコポリマーを使
用した場合の固定材におけるアシラーゼ活性は
218U／ｇ、○ハにおいて得られたコポリマーを使
用した場合の固定材のアシラーゼ活性は192U／
ｇ、および実施例２における多孔質構造を有する
アミノ化ポリアクリロニトリルの粒状物を使用し
た場合の固定材のアシラーゼ活性は252U／ｇで
あつた。 実施例 17 実施例１と同様にして得られた、多孔質構造を
有するポリアクリロニトリルの粒状物1.5gを、ア
セトン25mlに浸け、トリチルアミン１mlを加え、
さらにこれに無水コハク酸1gのアセトン溶液12
mlを約５分にて滴下して６時間撹拌し続け、反応
後これを取し、水洗し、1NHClで洗浄した後水
洗し乾燥した。次いでこの反応生成物1gを、塩
化カルシウム管を付した50ml容三角フラスコに加
え、ジオキサン３ml、さらにＮ―ヒドロキシスク
シンイミド1gを添加し、氷冷し、これに撹拌
下、Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミド
1gを溶解したジオキサン２mlを約10分にて滴下
し、10℃で一夜撹拌した。反応後、これを取
し、その20倍量のジオキサンを用いてデカンテー
シヨンによる洗浄を行ない、不溶物を除去し、さ
らにジオキサンで洗浄し、これを減圧乾燥し、次
いでこの活性エステルを有する反応生成物物30mg
を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で充分膨潤せし
め、取した後これをバルチス・メガテリウム・
Ｂ―400の生産するアシラーゼ酵素液（7.2U／
ml）５mlに添加し、氷浴中にてPH7.5で４時間撹
拌し、反応後取し、0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）で洗浄した後、1Mグリシン／0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.5）中にて室温下60分撹拌して未反応
の活性エステル基を除去し、次いでこれを取し
て、その固体相を0.5M食塩／0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）で洗浄し、さらに0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）で洗浄して、該粒状物とアシラーゼとを
結合した固定材（177.6U／ｇ）840mg（湿重量）
を得た。 実施例 18 多孔質構造を有するアミノ化ポリアクリロニト
リル繊維の製造 水素化リチウムアルミニウム1.5gに乾燥ジエチ
ルエーテル120mlを加え、これに実施例１で得た
多孔質構造を有するポリアクリロニトリル（アク
リロニトリル90％以上）繊維1.5gを加え、還流冷
却管を取り付け、50℃の油浴中で10分〜30時間加
熱還流する。反応後、繊維を取り出し、乾燥ジエ
チルエーテルで洗浄した後、1N塩酸、水、1N水
酸化ナトリウム水溶液、水の順で充分に洗浄して
多孔質構造を有するアミノ化ポリアクリロニトリ
ル繊維（太さ20〜35ミクロン）を得る。未反応の
水素化リチウムは少量の水を滴下して分解する。 得られたアミノ化ポリアクリロニトリル繊維の
物理化学的性質は次の通りである。 色；ポリアクリロニトリルよりもやゝ黄色味を
帯びている。還元時間が長くなるに従い黄色味が
強くなる。 粘度；不明（下記の溶媒に対して溶解しないた
め測定不可能） 溶媒に対する溶解性；
【表】 各還元時間で得たアミノ化ポリアクリロニトリ
ル繊維30mgをDMF5ml中に入れ、60℃で３分間加
熱処理した後、繊維を取、水洗いして乾燥時の
重量を測定すると次の結果が得られた。 還元時間 重量減少率 ５分 31.3％ １時間 29.0％ ５時間 27.0％ ２，４，６―トリニトロベンゼンスルホン酸ソ
ーダに対する呈色性；ポリアクリロニトリル繊維
は呈色しないが、アミノ化ポリアクリロニトリル
繊維は黄色に呈色し、アミノ基を有することが確
認された。 アミノ基含量； 得られた支持体の固定化蛋白質、推定アミノ基
含有量につき次の試験方法により求めた結果を第
１表ないし第３表に示す。 (i) 固定化蛋白質 上記で得た各反応時間における支持体18mgを
12.5％グルタルアルデヒド／ホウ酸緩衝液（PH
8.5）10ml中に加え、０℃で20分間撹拌する。
繊維を過し、ホウ酸緩衝液（PH8.5）、0.1M
リン酸緩衝液（PH7.5）で充分に洗浄した後、
直ちに0.3％牛血清アルブミンまたは、バチル
ス・メガテリウムＢ―400のペニシリンアシラ
ーゼ（140U／mg）／0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）２ml中に加え、30℃で１時間振盪した
後、過し、母液中に残存する牛血清アルブミ
ン含量およびペニシリンアシラーゼをLowry法
〔O.H.Lowry、J.Biol.Chem.193、265（1951）〕
で測定し、牛血清アルブミンまたはペニシリン
アシラーゼの該支持体への結合量を求めた。 また、該支持体をグルタルアルデヒド処理せ
ずに直接牛血清アルブミン溶液またはペニシリ
ンアシラーゼ溶液中に入れ、30℃で１時間振盪
した後、上記と同様にして牛血清アルブミンま
たはペニシリンアシラーゼの該支持体への吸着
量を求めた。 (ii) アミノ酸結合による推定アミノ基含有量 上記で得た各反応時間における支持体18mgを
前記(i)と同様にして12.5％グルタルアルデヒド
溶液で処理した後、これを0.3％濃度のグルタ
ミン酸（Glu）、スレオニン（Thr）、１―アミ
ノデスアセトキンセフアロスポラン酸（７―
ADCA）の各アミノ酸／0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）２ml中に加え、30℃で１時間振盪す
る。反応混合物を取し、上澄液のアミノ酸含
量をアミノ酸自動分析機にて定量し、該支持体
中のアミノ基含有量をアミノ酸結合容量として
求めた。尚本試験を実施するに当つて、使用ア
ミノ酸が該支持体に対して吸着特性のないこと
をアミノ酸の代りにアミノ酸ヒドラチドを用い
る試験により確認した。またアミノ酸として７
―ADCAを使用した場合は、上澄液中の７―
ADCA含量は高速液体クロマトグラフイーを用
い254nmの紫外部吸収値から求め、該支持体の
７―ADCA結合容量を求める。 (iii) 滴定による推定アミノ基含有量 各還元時間における支持体80mgを2mM塩酸
15ml、蒸留水30mlと共に１時間撹拌する。過剰
の塩酸を2mM水酸化ナトリウム水溶液で滴定
し、試料支持体中のアミノ基含量を塩酸塩とし
て消費した塩酸量として求める。 (iv) 試験結果
【表】
【表】
【表】 酵素（ペニシリンアシラーゼ）吸着量； 前項(i)において、バチルス・メガテリウムＢ―
400（FERM―P400）の生産するペニシリンアシ
ラーゼについて、その結合量を求める代りに、前
記のペニシリンアシラーゼ活性測定法によりペニ
シリンアシラーゼ活性を求めた。その結果は次の
通りである。
【表】 実施例 19 実施例１と同様にして得られた多孔質構造を有
るアミノ化ポリアクリロニトリル繊維1.0g（湿重
量）を氷冷した12.5％グルタルアルデヒド／ホウ
酸緩衝液（PHPH8.5）50mlに加え、０℃、20分間
撹拌し、該フイラメント状物を取した。これを
ホウ酸緩衝液（PH8.5）、次いで0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.5）で洗浄後、グルコースオキシダーゼ
（210U／mg）15mgを含有した0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）30mlに加えて、30℃、60分間撹拌し、次
いでこれを取し、0.5M食塩／0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.5）し、さらに0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）にて洗浄して、該フイラメント状物とグル
コースオキシダーゼとを結合した固定材（グルコ
ースオキシダーゼ活性60U／ｇ）を得た。 次いでこの固定材を用いて実施例６と同様の装
置たる第１―２図に示す如くの装置を用いて実施
した。即ち、この固定材約50mgを径2.8×15mmの
カラムに充填して１のカラムとなして第１―２図
の通りの装置にセツトした。また基質溶液とし
て、実施例６のトリトンＸ―100 0.3％
CaCl20.01Mを含む0.01Mトリスアシノメタン塩酸
緩衝液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用
い、またレシチン溶液10μの代りにグルコース
溶液２μを用いて流速20ml／分の条牛件にて行
ない、以下同様に行つて、記録計６に記録された
ピークの高さとグルコース溶液からの濃度からグ
ルコースの検量線を求めた。 その結果、第１１図に示す通りであつた。 また上記の検量線の測定と同様にして、400
mg／dlのグルコース溶液５μを用いて約３ケ月
間、注入回数650回の連続使用（カラム温度は常
に37℃に保つた）を行つて、その応答性（保存性
および持続性）を求めた。その結果、第１２図に
示す通りであつて、３ケ月後の長期間、多回数の
使用においても、最初と変らない値を示し、また
酵素活性も充分に保持されていたものであつた。 さらに上記検量録の測定と同様にて、人血清試
料33.3μを用い、自動注入装置（１時間60検体
の割合で注入）を用いて５時間連続測定を行つ
た。その結果、第１３図に示す通り、血清試料に
おいても長期間安定に使用し得たものであつた。
また任意の使用回数（ｎ＝20）での変動係数
（CV）はいずれも2.0以下であつた。 さらにまた、上記と同様にして、23種の人血清
試料を用いて測定し、別法（オルトアシノビフエ
ニール比色法）にて測定して、その相関を求め
た。 その結果、相関係数は0.9967、回帰式はｙ＝
0.9855χ−1.8272であり、極めて良好なもので、
また相関図は第１４図に示す通りであつた。 実施例 20 上記実施例６と同様にして得られたグルタルア
ルデヒドにて処理した繊維0.5g（湿重量）に、コ
リンオキシダーゼ5U／mlを含む0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.5）15mlを加え、30℃、60分間撹拌し、
これを取し、0.5M食塩／0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）、次いで0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）
で洗浄し、取した。次いでこれに、ホスホリパ
ーゼD40U／mlを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）
15mlを加えて30℃、60分間撹拌した。その後これ
を取し、0.5M食塩／0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）で洗浄して、該フイラメント状物とホスホ
リパーゼＤおよびコリンオキシダーゼとを結合し
た固定材（ホスホリパーゼＤ活性65.3U／ｇ、コ
リンオキシダーゼ活性45.8U／ｇ）を得た。また
この固定材を用いて、実施例６と同様の装置を用
いて検量線を求めた結果、実施例６と同様の結果
であつた。 さらに、実施例６と同様にして人血清試料を用
いて繰り返し使用した。即ち１のカラム（径2.8
×30mm）に上記を充填し、これを第１―２図の通
りにセツトし、流速60ml／ｈの条件にて、同一人
血清33.3μを自動注入装置（１時間60検体の割
合で注入）し、その使用回数における対応するピ
ークの高さを求めた。その結果第１５図に示す通
りであつた。 また、上記と同様の装置を用い、18種の人血清
試料を用いて血清のリン脂質の含有量を求め、ま
た別法（市販品；酵素法）にて同一検体について
測定して、その相関を求めた（なお、測定値はレ
シチンを基質とする検量線より算出した）。 その結果、相関係数γ＝0.9820 回帰式 ｙ＝0.7661χ＋13.9251 であり、その相関図は第１６図に示す通りであつ
た。 参考例 ２ バチルス・メガテリウムＢ―400の生産するア
シラーゼ ポリペプトン１％、肉エキス１％、食塩0.5％
を含む培地（PH7.0）100mlを500ml容三角フラス
コに分注し、120℃、20分間滅菌後、バチルス・
メガテリウム・Ｂ―400（FERM―ｐNo.748）を
接種し、30℃、48時間振盪培養し、培養後、菌体
を除去して得られる液をPH7.5に調節し、セラ
イト（Johns Manville Sales社製 No.560）1gを
加えて約30分間撹拌し、セライトを取する。得
られたセライト約20U／ｇの活性を有していた。
この様にして得たセライト800gを水に懸濁し、
これをカラム（径9.5×80cm）に充填し、24％硫
酸アンモニウム／0.1Mトリスヒドロキシアミノ
メタン溶液（PH8.5）でSV0.5の条件下溶出せし
め、280nmの吸収を有する画分210ml（30.0U／
ml）を得た。次いでこの溶出液120mlを、バイオ
ゲル（Biogel）―Ｐ―10（50〜100メツシユ）を
充填し、0.1Mリン酸緩衝液、撹拌（PH7.5）で等
張としたカラム（径3.2×41cm）にチヤージして
ゲル過し、その280nmの吸収を有し、塩の混入
しない画分120mlを得（21.6U／ml）、さらにこの
溶液を透析チユーブに充填し、30％カーボワツク
ス（平均分子量約20000）／0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）１中で24mlまで濃縮した後さらに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）中で一晩透析して、
バチルス・メガテリウム・Ｂ―400の生産するア
シラーゼ濃縮液23mlを得た（120U／ml）。 参考例 ３ コマモナス・エス・ピー・SY―77―１の生産
するアシラーゼ ペプチン１％、肉エキス0.5％、食塩0.3％を含
む培地（PH7.0）500mlを５容三角フラスコに分
注し、15分間滅菌した後、コマモナス・エス・ピ
ー・SY―77―１（FERM―ｐNo.2410）を接種
し、30℃、24時間振盪培養し、この培養液を、カ
ゼイン２％、酵母エキス0.05％、コーン・スチー
プ・リカー0.4％、グルタミン酸ナトリウム0.5
％、グルタール酸0.1％を含む培地（PH9.0）10
を20容ジヤーフアーメンターに分注し、130
℃、30分間滅菌した培地に加え、30℃、３日間通
気100％／min、撹拌300rpmの条件にて培養し、
培養後この培養物を冷却下遠心分離して集菌して
湿潤菌体約100g得、これを0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）500mlに懸濁し、これに界面活性剤カチ
オンFB（商品名：日本油脂社製）25mlを加え室
温下１時間撹拌し、菌体残渣を冷却下遠心分離し
て上液約500mlを得、同様にして得られた４バツ
チ分を併合して約2000mlを得た（60U／ml）。次
いで得られた溶液1170mlにアンバーライトXAD
―７（ローム・アンド・ハス社製）90gを加え、
室温で30分間撹拌し、過し、得られた液1150
ml（46600U／ml）をカラム（径3.4×26cm）に入
れ、これに多孔質構造を有するポリアクリロニト
リル繊維30gを気泡の混入なしに充填した後、該
カラム内の液を流出し、水洗した後、0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）で溶出（150ml／ｈ）し、その
活性画分124mlを得た（169U／ml）。 参考例 ４ アースロバクター・グロビフオーミス・Ｂ―
0577の生産するコリンオキシダーゼ コリン1.0％、KCl0.5％、K2HP20.1％、
MgSO4・7H2O.05％、酵母エキス0.25％、フイシ
ユ・ソルブル1.0％、デスホームCA220 0.1％を
含む培地（PH7.2）100mlを500ml容三角フラスコ
に分注し、120℃、20分間滅菌した後、これにア
ースロバクター・グロビフオーミス・Ｂ―0577
（FERM―ＰNo.3518）を接種し、30℃、24時間培
養し、これを上記と同一組成を有する培養液10
を有してなる滅菌後の30容ジヤーフアーメンタ
ーに移植し、30℃、２日間、200rpm、20／
minの滅菌空気の条件下通気撹拌培養し、得られ
る培養液を遠心分離して集菌し、この菌体を
0.01Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）、2mMEDTA、
１％KClよりなる溶液１にて洗浄した後、この
菌体を１の0.1Mリン酸緩衝液、2mMEDTA、
１％KClよりなる溶液に懸濁し、さらにこれにリ
ゾチーム（長瀬産業社製、塩化リゾチーム）200
mgを加え、37℃、30分間撹拌し、次いでこれを
5000rpm、15分間遠心分離し、得られる上清液
（全活性998U、全蛋白質量7680mg、比活性
0.13U／mg）にアセトン１を加えて析出する不
純物を除去し、さらにこれにアセトンを加えてア
セトン濃度65％となして、5000rpm、15分間遠心
分離して沈澱物を回収し、得られる沈澱物（全活
性900U、全蛋白質量580mg、比活性1.55U／mg）
を40mlの0.01Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）、
2mMEDTA、１％KClよりなる溶液に溶解し、そ
の不溶部分は遠心除去し、次いでこれに60mlの飽
和硫安溶液を加え、15分間撹拌した後、
12000rpmにて15分間遠心分離を行ない、沈澱物
（全活性825U、全蛋白質量300mg、比活性275U／
mg）を得た。次いで、これを15mlの0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.0）、2mMEDTAよりなる溶液に溶解
し、これを流速30ml／ｈにてセフアデツクスＧ―
25（フアルマシア社製）を充填したカラムにチヤ
ージして脱塩した後、得られた溶液を、PH7.0で
緩衝化したDEAE―セルロースカラム（径2.0×
7.0cm）にチヤージして吸着せしめ、さらに0.2M
〜0.5MのKClのイオン強度勾配を用いて溶出せし
めて、約0.4MKCl濃度での溶出画分を回収して活
性画分172mlを得た（条件：流速1.4ml／min、１
フラクシヨン６ml）。さらにこの活性画分をセル
ロースアセテートの透析膜膜にて、5mMリン酸
緩衝液、2mMEDTAよりなる溶液を用いて７時
間透析し、次いでこの透析液を凍結乾燥し、さら
にこれを10mlの0.01Mトリス塩酸緩衝液（PH
8.0）、2mMEDTA、、１％KClよりなる溶液に溶
解した後、セフアデツクスＧ―200を充填カラム
（径2.8×9.5cm）を用いて、流速0.18ml／min、１
フラクシヨン６mlの条件下クロマトグラフイーを
行ない、そのフラクシヨンNo.42〜48の活性画分を
回収し、凍結乾燥し、さらにこのクロマトグラフ
イーの操作を行なつて、コリンオキシダーゼ（全
蛋白質量55.9mg、比活性6.80U／mg）を得た。 参考例 ５ ストレプトマイセス・クロモフスカス・Ａ―
0848（Streptomyces chromofuscus Ａ―0848）
の生産するホスホリパーゼＤ ペプトン２％、ラクトース２％、食塩0.1％、
K2HPO40.05％、MgSO4・7H2O0.05％、デスホー
ムBC―51Y0.5％を含む培地100mlを500ml容三角
フラスコに分注し、120℃、20分間滅菌した後、
ストレプトマイセス・フロモフスカス・Ａ―0848
（FERM―ＰNo.3519）を接種し、26℃、３日間培
養し、これを上記と同一組成よりなる培地20を
有する30容ジヤーフアーメンターに移植し、26
℃、２日間、300rpm、20／minの条件下通気
撹拌培養して培養液（0.5U／ml）を得、これを
遠心分離して液約18を得た。次いでこれを減
圧濃縮して約３とし、これにアセトン2.4を
加えて、生じた沈澱物を遠心除去し、その上清液
にさらにアセトン２を加えて生じた沈澱物を回
収し、これを水500mlに加えて不溶物を除去し、
さらにアセトン330mlを加えて沈澱物を回収し、
これを200mlの水に溶解せしめ、この溶液に飽和
硫酸アンモニウム溶液200mlを加え、生じた沈澱
物を回収し、これを50mlの水に溶解し、セフアデ
ツクスＧ―25を用いて脱塩した後凍結乾燥してホ
スホリパーゼＤ粉末（5U／mg）700mgを得た。
【図面の簡単な説明】
第１―１図、第１―２図および第１―３図は、
定量装置を示すもので、１は本発明の固定材また
はそれを充填したカラム、２は計測部分、３は電
極、４は排出口、５はメーター、６は記録計、７
は恒温槽、８はPHメーター、第１０はマグネチツ
クスターラー、試料Ａ、試料Ｂ、試料B′はともに
試料などの注入口を示すもので、第２図は、バチ
ルス・メガテリウム・Ｂ―400の生産するアシラ
ーゼを結合した固定材を用いて、横軸に反応液
量／カラム容量およびチヤージ日数、縦軸に７―
ADCAの生成率をもつて示した図であり、第３図
はコマモナス・エス・ピー・SY―77―１の生産
するアシラーゼを結合した固定材を用いて、横軸
に通液量、縦軸に切断率（７―ACAの生成率）
をもつて示した図であり、第４図はホスホリパー
ゼＤおよびコリンオキシダーゼを結合した固定材
を用いて、横軸にその基質量、縦軸に酵素反応に
よつて記録計にて記録されたピーク面積値をもつ
て示した検量線の図であり、第５図は、ホスホリ
パーゼＤおよびコリンオキシダーゼを結合した固
定材の使用回数における酵素の安定性を示したも
のであり、第６図はコリンオキシダーゼを結合し
た固定材を用いて、横軸に基質たる塩化コリンの
量、縦軸にその記録計にて記録された最大速度変
化値をもつて示した検量線の図であり、第７図は
コリンオキシダーゼを結合した固定材の使用回数
における酵素の安定性を示したものであり、第８
図はグルコースオキシダーゼを結合した固定材を
用いて、横軸に基質たるグルコース量、縦軸にそ
の記録計にて記録された最大速度変化値をもつて
示した検量線の図であり、第９図はグルコースオ
キシダーゼを結合した固定材の使用回数における
酵素の安定性を示したものであり、第１０図は固
定材を用いてなる製造装置を示すもので、その９
は固定材を充填するカラム、１０はマグネチツク
スターラー、１１は貯蓄槽、１２は冷却槽、１３
は熱交換用ジヤケツト、１４はポンプ、１５はPH
メーターを示し、第１１図はグルコースオキシダ
ーゼを結合した固定材を用いて、横軸に基質たる
グルコースの量、縦軸にその記録計にて記載され
た溶存酸素減少率（％）をもつて示した検量線の
図であり、第１２図はグルコースオキシダーゼを
結合した固定材の応答性を求めた図であり、第１
３図はグルコースオキシダーゼを結合した固定材
の人血清試料における使用回数による安定性を
示、第１４図はグルコースオキシダーゼを結合し
た固定材を用いてなる別法との相関図を示し、そ
の横軸は別法、その縦軸は本発明を示すものであ
り、第１５図はホスホリパーゼＤおよびコリンオ
キシダーゼとを結合した固定材の人血清試料にお
ける使用回数による安定性を示し、第１６図はホ
スホリパーゼＤおよびコリンオキシダーゼとを結
合した固定材を用いてなる別法との相関図を示
し、その横軸は別法、その縦軸は本発明を示すも
のである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 多孔質構造を有するアクリロニトリル系ポリ
    マーのニトリル基を部分的に還元して得られた多
    孔質構造を有する水不溶性のアミノ基含有アクリ
    ロニトリル系ポリマーからなる支持体と生物学的
    活性蛋白質を物理的吸着または共有結合した固定
    材。 ２ 多孔質構造が平均孔径40〜9000Åの範囲にあ
    る多数の孔を有する構造である特許請求の範囲第
    １項記載の固定材。 ３ アミノ基含有アクリロニトリル系ポリマーが
    繊維状、粒状、膜状または中空系状成形物である
    特許請求の範囲第１項または第２項記載の固定
    材。 ４ アミノ基含有アクリロニトリル系ポリマーが
    実質的に水溶性にならないまでの量のアミノ基を
    有するアクリロニトリル系ポリマーである特許請
    求の範囲第１項または第３項記載の固定材。 ５ アミノ基がアミノ基含有アクリロニトリル系
    ポリマーｇ当たり20〜1000μＭの範囲で含有する
    特許請求の範囲第４項記載の固定材。 ６ アクリロニトリル系ポリマーがアクリロニト
    リル系モノマーのポリマーまたはこれとエチレン
    性二重結合を含む他のコモノマーとのコポリマー
    である特許請求の範囲第１項記載の固定材。 ７ アクリロニトリル系ポリマーがアクリロニト
    リル、メタアクリロニトリル、α―クロロアクリ
    ロニトリルまたはシンナムニトリルである特許請
    求の範囲第６項記載の固定材。 ８ コモノマーがスチレン系モノマー、アクリル
    酸エステル系モノマー、共役ジエン、ハロゲン化
    オレフイン、ビニルエーテル系モノマー、ビニル
    ケトン系モノマー、ビニルエステル系モノマー、
    アミド系ビニルモノマー、塩基性モノマーまたは
    多官能性モノマーである特許請求の範囲第６項記
    載の固定材。 ９ アクリロニトリル系ポリマーが、多孔質構造
    を有し、アクリロニトリル90％以上からなるポリ
    アクリロニトリルの繊維状、粒状、膜状または中
    空系状成形物である特許請求の範囲第６項記載の
    固定材。 １０ アクリロニトリル系ポリマーが、多孔質構
    造を有し、アクリロニトリル、ジビニルベンゼン
    およびビニルエチルベンゼンよりなるコポリマー
    の繊維状、粒状、膜状または中空系状成形物であ
    る特許請求の範囲第６項記載の固定材。 １１ 生物学的活性蛋白質が酵素である特許請求
    の範囲第１項記載の固定材。 １２ 多孔質構造を有するアクリロニトリル系ポ
    リマーのニトリル基を部分的に還元して得られた
    多孔質構造を有する水不溶性のアミノ基含有アク
    リロニトリル系ポリマーからなる支持体と生物学
    的活性蛋白質とを不活性媒体中で物理的吸着また
    は共有結合させることを特徴とする固定材の製
    法。 １３ 多孔質構造が平均孔径40〜9000Åの範囲に
    ある多数の孔を有する構造である特許請求の範囲
    第１２項記載の製法。 １４ アミノ基含有アクリロニトリル系ポリマー
    が繊維状、粒状、膜状または中空系状成形物であ
    る特許請求の範囲第１２項または第１３項記載の
    製法。 １５ アミノ基含有アクリロニトリル系ポリマー
    が実質的に水溶性にならないまでの量のアミノ基
    を有するアクリロニトリル系ポリマーである特許
    請求の範囲第１２項または第１４項記載の製法。 １６ アミノ基がアミノ基含有アクリロニトリル
    系ポリマーｇ当たり20〜1000μＭの範囲で含有す
    る特許請求の範囲第１５項記載の製法。 １７ アクリロニトリル系ポリマーがアクリロニ
    トリル系モノマーのポリマーまたはこれとエチレ
    ン性二重結合を含む他のコモノマーとのコポリマ
    ーである特許請求の範囲第１２項記載の製法。 １８ アクリロニトリル系ポリマーがアクリロニ
    トリル、メタアクリロニトリル、α―クロロアク
    リロニトリルまたはシンナムニトリルである特許
    請求の範囲第１７項記載の製法。 １９ コモノマーがスチレン系モノマー、アクリ
    ル酸エステル系モノマー、共役ジエン、ハロゲン
    化オレフイン、ビニルエーテル系モノマー、ビニ
    ルケトン系モノマー、ビニルエステル系モノマ
    ー、アミド系ビニルモノマー、塩基性モノマーま
    たは多官能性モノマーである特許請求の範囲第１
    ７項記載の製法。 ２０ アクリロニトリル系ポリマーが、多孔質構
    造を有し、アクリロニトリル90％以上からなるポ
    リアクリロニトリルの繊維状、粒状、膜状または
    中空系状成形物である特許請求の範囲第１７項記
    載の製法。 ２１ アクリロニトリル系ポリマーが、多孔質構
    造を有し、アクリロニトリル、ジビニルベンゼン
    およびビニルエチルベンゼンよりなるコポリマー
    の繊維状、粒状、膜状または中空系状成形物であ
    る特許請求の範囲第１７項記載の製法。 ２２ 生物学的活性蛋白質が酵素である特許請求
    の範囲第１２項記載の製法。 ２３ 共有結合を架橋化剤または縮合剤を用いて
    直接またはスペーサーを介して行う特許請求の範
    囲第１２項記載の製法。 ２４ 架橋化剤がグルタルアルデヒド、クロトン
    アルデヒド、アクロレイン、ヘキサメチレンジイ
    ソシアネート、ヘキサメチレンイソチオシアネー
    ト、トルエンジイソシアネート、キシレンジイソ
    シアネート、ジメチルアジピイミデート、ジメチ
    ルスベリイミデート、ジメチル―３，3′―ジチオ
    ビスプロピオンイミデートまたは無水コハク酸で
    ある特許請求の範囲第２３項記載の製法。 ２５ 縮合剤が１―エチル―３―（３―ジメチル
    アミノプロピル）―カルボジイミドである特許請
    求の範囲第２３項記載の製法。 ２６ スペーサーがアルキレンジアミンである特
    許請求の範囲第２３項記載の製法。 ２７ 多孔質構造を有するアクリロニトリル系ポ
    リマーのニトリル基を部分的に還元して得られた
    多孔質構造を有する水不溶性のアミノ基含有アク
    リロニトリル系ポリマーからなる支持体と生物学
    的活性蛋白質とを物理的吸着または共有結合させ
    た固定材を含有する系と該生物学的活性蛋白質に
    より作用を受ける物質を含有する系とを反応さ
    せ、該生物学的活性蛋白質により作用を受けた物
    質の変化を測定することを特徴とする固定材を用
    いた測定方法。 ２８ 多孔質構造が平均孔径40〜9000Åの範囲に
    ある多数の孔を有する構造である特許請求の範囲
    第２７項記載の方法。 ２９ アミノ基含有アクリロニトリル系ポリマー
    が繊維状、粒状、膜状または中空系状成形物であ
    る特許請求の範囲第２７項または第２８項記載の
    方法。 ３０ アミノ基含有アクリロニトリル系ポリマー
    が実質的に水溶性にならないまでの量のアミノ基
    を有するアクリロニトリル系ポリマーである特許
    請求の範囲第２７項または第２９項記載の方法。 ３１ アミノ基がアミノ基含有アクリロニトリル
    系ポリマーｇ当たり20〜1000μＭの範囲で含有す
    る特許請求の範囲第３０項記載の方法。 ３２ アクリロニトリル系ポリマーがアクリロニ
    トリル系モノマーのポリマーまたはこれとエチレ
    ン性二重結合を含む他のコモノマーとのコポリマ
    ーである特許請求の範囲第２７項記載の方法。 ３３ アクリロニトリル系ポリマーがアクリロニ
    トリル、メタアクリロニトリル、α―クロロアク
    リロニトリルまたはシンナムニトリルである特許
    請求の範囲第３２項記載の方法。 ３４ コモノマーがスチレン系モノマー、アクリ
    ル酸エステル系モノマー、共役ジエン、ハロゲン
    化オレフイン、ビニルエーテル系モノマー、ビニ
    ルケトン系モノマー、ビニルエステル系モノマ
    ー、アミド系ビニルモノマー、塩基性モノマーま
    たは多官能性モノマーである特許請求の範囲第３
    ２項記載の方法。 ３５ アクリロニトリル系ポリマーが、多孔質構
    造を有し、アクリロニトリル90％以上からなるポ
    リアクリロニトリルの繊維状、粒状、膜状または
    中空系状成形物である特許請求の範囲第３２項記
    載の方法。 ３６ アクリロニトリル系ポリマーが、多孔質構
    造を有し、アクリロニトリル、ジビニルベンゼン
    およびビニルエチルベンゼンよりなるコポリマー
    の繊維状、粒状、膜状または中空系状成形物であ
    る特許請求の範囲第３２項記載の方法。 ３７ 生物学的活性蛋白質が酵素である特許請求
    の範囲第２７項記載の方法。 ３８ 該生物学的活性蛋白質が酵素であり、該生
    物学的活性蛋白質の作用を受ける物質が該酵素の
    基質である特許請求の範囲第２７項ないし第３７
    項のいずれかの記載の方法。
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