DE2061009A1 - Verfahren zur Fixierung von Polymeren - Google Patents

Verfahren zur Fixierung von Polymeren

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DE2061009A1 DE19702061009 DE2061009A DE2061009A1 DE 2061009 A1 DE2061009 A1 DE 2061009A1 DE 19702061009 DE19702061009 DE 19702061009 DE 2061009 A DE2061009 A DE 2061009A DE 2061009 A1 DE2061009 A1 DE 2061009A1
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Description

PATENTANWÄLTE
Dip!.-Ing.
Exploaterings Aktiebolaget T.B.F., 'WPkChOm-Dr-RUFi= Di?l.-lng. J. BEIER
*· -"-: iW..._..— 7 Stuttgart-1, Neckarstraße 50
Uppsala, Schweden
A 1-
Verfahren zur Fixierung von Polymeren
Während der letzten Jahre hat das Interesse für die chemischen Methoden zur Fixierung "biologisch "bedeutender Moleküle an in Wasser unlösliche palmere Träger sehr zugenommen. Die synthetisierten Produkte eignen sich für das Studium der physikalischen und chemischen Wechselwirkung des fixierten Moleküls mit den zuhörigen komplementären Molekülarten. Unlöslich gemachte biologische Aktivitäten und Affinitäten können ebenfalls leichter behandelt, reguliert und kombiniert und dadurch bedeutend besser ausgenutzt werden.
Man hat eine grosse Anzahl organisch-chemischer Verfahren zur herstellung eines Derivats aus Peptiden und Proteinen sowie unlöslichen Trägern entwickelt. Mehrere dieser Verfahren führen zu Produkten mit annehmbarer Aktivität und Affinität, die Herstellungs-Methoden sind jedoch oftmals kompliziert und wirken sich ungünstig auf den Matrix-Teil aus. Die physikalisch-mechanischen Eigenschaften der iConjugatsysteme sind daher des öfteren für z.B. eine Anwendung im Bett-Eeaktor ungeeignet. Allerdings sind derart synthetisierte Produkte in biochemischen und medizinischen Forschungslaboratorien, sowie in gewissen Umfang auch bei klinischen Routineanalysen angewandt worden. Auch werden gewisse Produkte, feste Enzyme, industriell hergestellt, und eine gesteigerte Anwendung von festen Enzymen in industriellen Produktionsstufen führt weitgehende Entwicklungsmöglichkeiten mit sich.
Die Arbeit, die der Erfindung zugrunde liegt, hatte das Ziel, Proteine kovalent an Polymere, insbesondere Polysaccharidpolymere,
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zu fixieren. In der Praxis anwendbare Wasserunlösliche Enzyme wurden auf zwei Wegen synthetisiert, teils nach einem Verfahren, an dem Isothiocyanatstrukturen beteiligt sind, teils nach einem Verfahren, in dem die Matrix mit Cyanhaliden aktiviert wird. Derart hergestellte spezifische Adsorbenten haben den an sie gestellten "Forderungen für sowohl analytische als auch präparative Anwendung entsprochen.
Bei der Entwicklung der Pixierungsreaktionen für Proteine und andere biologisch aktive Moleküle wurden folgende Forderungen gestellt:
\ 1) Es gibt nunmehr eine Anzahl chromatographischer Tronnungsmedia für klassische, biochemische Separationen (Carboxymethylcellulose, Agarosepartikel und quergebundenes Dextran), die mit geeigneten, allgemeinen und speziellen mechanischen und physikalischen Eigenschaften für Arbeiten mit biologischen Systemen ausgerüstet worden sind. Das Wesentliche herbei ist, dass sie als gepackte Betten angewandt werden können. Da man viel Information über die chromatographischen Eigenschaften biologischer Substanzen in derartigen Betten gesammelt hat, ist eine Ueberlagerung spezifischer biologischer Aktivität oder Affinität gerade auf solche Matrixen erstrebenswert. Enthält der polymere Träger geeignete funktionelle Gruppen, kann ein Teil davon zum Fixieren
fc angewandt werden; andernfalls müssen diese schonend eingeführt werden. Eine extensive Querbindung und die Einführung grösserer Mengen protonisierbarer Gruppen soll vermieden werden.
2) Die Kopplungsmethode muss Reaktionen enthalten, die im Wassersystem unter milden Bedingungen rasch verlaufen, sodass die biologische Aktivität nicht nennens*fert verschlechert wird. Im allgemeinen ist eine Veränderung der Spezifität nicht erwünscht.
Die obengenannte Halogencyan-Methode entspricht grundsätzlich diesen Ansprüchen. Die Kopplung von Protein verläuft allerdings mit geringer Ausbeute bei Kopplungs-pH-Werten unter 7 und vollzieht sich über Aminogruppen. Oft ist allerdings eine Kopplung
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biologisch, wichtiger Moleküle über andere funktionelle Gruppen als Aminogruppen Voraussetzung, da nicht alle biologisch aktiven Substanzen Aminogruppen enthalten. Die Fixierung über CarboxylatLone ist besonders interessant.
Die vorliegende Erfindung befasst sich mit einem Verfahren zur Herstellung von polymeren Produkten mit einem Molekulargewicht von über 1000, vorzugsweise von Adsorptionsmaterial und polymergebundenen ("festen", "unlöslichen") Enzymen, durch Zusammenfügung über kovalente Bindungen von zwei oder mehr Stoffen, von denen wenigstens der eine ein als Träger dienendes Polymer - Trägerpolymer - ist. Die Erfindung wird dadurch gekennzeichnet, dass jeder der obigen Stoffe mindestens eine der folgenden, funktioneilen Gruppen enhält: Isonitril, Aldehyd oder Keton, Anion, primäres oder sekundäres amin; dass die Umsetzung in einem Reaktionsgemisch der obigen Substanzen geschiet, eventuell unter Zusatz von weiteren Substanzen, sodass alle fraglichen funktioneilen Gruppen zu Beginn der Reaktion gleichzeitig anwesend sind.
Die Erfindung gründet sich auf die Neigung der Isonitrile, mit geeigneten Paaren funktioneller Gruppen in einer oc^Addition zu reagieren. Die funktionellen Gruppen können zudem so gewählt werden, dass das Additionsprodukt zur einer stabilen, chemischen Struktur umgelagert wird. Substanzen, die derartige funktionelle Gruppen enthalten, können daher mit Hilfe von Isonitril zu stabilen Konjugaten gekoppelt werden. IHir den polymeren Träger kann mindestens eine der Reaktionsstrukturen gewählt werden. Eine bekannte und mögliche, mit Isonitrilen ablaufende Reaktionsvariante ist die ügi-Reaktion, die aus primär einer sogenannten α-Addition eines Immoniumions und eines Anions an ein Isonitril und sekundär einer konsekutiven Umlagerungsreaktion zu einem stabilen Endprodukt besteht.
Die Ugi-Reaktion mit einem Aldehyd ist dann folgendermassen:
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Aldehyd R-CHO + H3N-R' Amin H+I ΐΟΗ~
[R-CH=HH-R' 4—} R-CH-HH-R'J
Anion"
R'"CO(
Isonitril R"SaO <—*R"-N=C α-Addition (Primär-Reaktion)
R"-If=C
R R' Endprodukt R" -NH-CO-CH-N-CO-R'"
Mit einem Keton sieht die Ugi-Reaktion so aus:
CH-IH -R'
' I
I I
0- CO-R"
Sekundär Reaktion
Keton
N^=O + H2N-I
Amin
H'
Isonitril
Endprodukt
ICH"
R-CH-NH-R'J Ar>i art
R"'COO
+ (3 α-Addition (Primär-Reaiction)
(3 _N=üf—> R " -N=C-R"-N=C
O-CO-R'
R'
R"-NH-CO-CR R2-N-CO-R'
Sekundär-Reaktion
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Bei einer allgemeinen Ausführung nach der Erfindung gilt folgendes für die Reaktanten: 1) Aldehyd- bzw. Ketongruppen erhält man von Aldehyden bzw. Ketonen,die der Reaktionslösung zugesetzt wurden, oder aus nichtlöslichen aldehyd- bzw. ketonhaltigen Polymeren, 2) das Immoniumion erhält man aus einer Aldehyd- bzw. Ketonfunktion wie oben, sowie aus der Aminogruppe von Peptiden oder Proteinen oder der Aminogruppe in Aminopolymeren, 3) das Anion, vorzugsweise ein Carboxylat-Ion, erhält man von Proteinen oder Carboxylatpolymeren. Bei diesen Ausführungsbeispielen erhält man als stabile Endprodukte der TJgi-Eeaktion Strukturen der Formel -KH-CO-CH(R)-Im'- oder der Formel -HH-OO-GR^-BE'-. Die sekundäre TJmlagerungsreaktion führt von komplexen Protolyse- -Gleichgewichten zu einer stabilen Peptidkonfiguration und ermöglicht dadurch die praktische Anwendung der Reaktion.
Dieser Prozess geschiet also mit vier funktioneilen Gruppen, -NH2, -CHO bzw. > C = 0, -COO" und -NC. Das Protein trägt normalerweise Amino- und Carboxylgruppen. Da das Polymer frei gewählt wird, kann es folgende Funktionen tragen: -MI«, -CHO bzw. ■> CO, -GOO"" oder -HC, oder zwei oder mehrere dieser Funktionen. Aminopolymere, Aldehydpolymere und Carboxylpolymere wurden eingehend untersucht, und die Resultate mit Synthesen von Isonitrilpolymeren haben sich als vielversprechend gezeigt.
Als Beispiel für einige der Möglichkeiten, wo die TJgi-Reaktion zur chemischen Fixierung von Proteinen an unlösliche Träger benutzt wurde, werden in Tabelle 1 einige Resultate aufgeführt, wo Chymotrypsin an eine Reihe verschiedener Polymere unter Anwendung von Dimethylamin-Propyl-Isonitril als Fixierungsvermittler fixiert wurde.
Ie
Fixierung von Chymotrypsin an verschiedene polymere (Träger Beisgiel A A1 Ko££lung_an_Aldehyd£ol2mere
Unterschiedliche Mengen Chymotrypsin wurden chemisch mit Isonitril an eine Reihe verschiedener Polymere fixiert. Die
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Reaktions-Suspension aus 50 mg Polymer und 2 ml Wasser wurde mit unterschiedlichen Mengen Isonitril und Acetaldehyd versetzt. Beim Fixieren an Aldehydpolymere wurde Acetaldehyd ausgelassen. Die Fixierung geschah bei pH 6,5 mit Hilfe eines pH-stats.
Die katalytische Aktivität wurde gegen eine 10 mM Lösung von N-Acetyl-L-Tyrosinäthylester und gegen Casein bestimmt; die Werte gehen aus der Tabelle hervor.
Die Menge des fixierten Enzyms wurde in der Aminosäureanalyse bestimmt. Die katalytische Aktivität der Produkte gegen Acetyl- v -L-Tyrosinäthylester wurde im pH-stat beim apparenten pH-Optimum des Produktes gemessen. Die Aktivität wurde auch mit der Aktivität einer entsprechenden Menge freien Enzyms bei dessen pE-Optimum verglichen. Das so gewonnene Verhältnis wurde relative Aktivität genannt und in % angegeben. Normalerweise erhält man pH-Optimumverschiebungen der Enzymaktivität, die auf der Akkumulierung der bei der Ester-Hydrolyse freigesetzten Protone im Matrix-Skelett beruhen. Die Versuchsbedingungen bei der Kopplungsreaktion sind wie aus der Tabelle hervorgeht sehr schonend gewesen.
Die angewendeten polymeren Träger wurden auf folgende Weise erhalten: CM-Sephadex^ist ein kommerzielles Produkt der Pharma- Ψ cia Fine Chemicals, Uppsala, und besteht aus epichlorhydrin- -quergebundenem, mit Carboxymethylgruppen substituiertem Dextran. CM-Agarose wurde hergestellt durch Behandlung von 4 %-igen Agarosegel mit Chloressigsäure.
Agarose-Lysin-Äthylester wurde synthetisiert, indem man 4· %-ige Agarose mit Bromcyan bei pH 11 behandelte und danach Lysin- -Ithylester in einer 0,5-M Natriumbicarbonatlösung fixierte.
Aminoäthylpolyacrylamid wurde durch Behandlung von quergebundenen Polyacrylamid mit Ä'thylendiamin erhalten. 1 g Polyacrylamid wurde mit 15 ml Äthylendiamin 3 Minuten bei 9O0C derivatisiert. Danach
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wurde das Produkt mit einer 0,1 M Kochsalzlösung gewaschen. Das benutzte quer gebundene Polyacrylamid wurde bei Bio-Rad Lab.-, Richmond, Calif, (Biogel P300), gekauft.
(S)
Enzacryl Mr^ ist ein mit aromatischen Aminogruppen subtituiertes quer gebundene s Polyacrylamid-Polymer, das von Koch-Light Lab· Ltd., Colnbrook, Buckinghamshire, England, geführt wird.
Aldehyd-Agarose erhielt man durch Perjodatoxydation bei pH J mit 0,05 M oder bei pH 5 mit'0,1 M Perjodat. Als Agarose-Gel wurde Sepharose 4 B-^ von Pharmacia Pine Ohem., Uppsala, benutzt.
Polymethylmetacrylat ("Plexiglas") in lorm von Peilspänen wurde mit 2 N Natronlauge 24 Stunden bei 5O°C teilhydrolysiert und danach mit 1O~^ M Salzsäure gewaschen.
Schafwolle wurde mit Aceton und 1 N Natronlauge gewaschen.
Epichlorin-quergebundene Agarose wurde mit einem Gemisch aus 12 ml Dimethylsulfoxid und 5 ml Essigsäureanhydrid bei 400C 90 Minuten oxydiert. Zum Abschluss wurde auf einem Glasfilter mit Wasser gewaschen.
50 mg des auf diese Weise erhaltenen, Keto-Gruppen tragenden, Polymers, wurden mit 15 mg Chymotrypsin und 10 yul 3-Dimethylaminopropylisonitril bei pH 6,5 6 Stunden bei Zimmertemperatur reagieren gelassen. Nach extensivem Waschen erhielt man ein Produkt, das 40 mg Chymotrypsin pro Gramm Polymer-Konaugat enthielt Die relative Aktivität des gebundenen Enzyms gegen N-Acetyl-L- -tyrosinäthylester in einer 15 mM Lösung wurde wie oben bestimmt Sie betrug 46 % der Aktivität des freien Enzyms; gegen Casein war sie 40 %.
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von Cortison_an_CM-Seghadex_.
Cortison ist ein eine Ketogruppe enthaltendes Steroid mit Hormoneigenschaften.
CM-Sephadex. , (carboxymethyl-substituiertes quergebundenes Dextran) von Pharmacia IPine Cham., Uppsala, wurde in einer Lösung aus 0,25 ml Äthanol und 1,75 ml Wasser suspendiert; 25 /& 3-Dimethylaminopropylisonitril und 2OyU- Butylamin sowie schliesslich 10 mg Cortison wurden zugesetzt, und 24 Stunden bei pH 6,5 und Zimmertemperatur reagieren gelassen. Nach extensivem Waschen erhielt man ein Produkt, das 15 mg Cortison pro Gramm Polymer-Konjugat enthielt.
'S)
Enzacryl ist ein Amino-Polymer aus quergebundenem Polyacrylamid von den Koch-Light Laboratories Ltd., Colnbrook, Buckinghamshire, England.
50 g Enzacryl^ wurde in einem Gemisch aus 1 ml Äthanol und 1 ml Wasser suspendiert. Es wurden 25 /ä. 3-Dimethylaminopropylisonitril und 75 mg Natriumacetat-Trihydrat, sowie schliesslich 10 mg Cortison zugesetzt, wonach man das Gemisch 24- Stunden bei pH 6,5 und Zimmertemperatur reagieren liess. Nach ausgiebjgemWaschen * erhielt man ein Produkt mit 15 mg Cortison pro Gramm Polymer- -Konjugat.
Natriumazid.
Durch Polymerisation einer Mischung aus Acrylamid, N,N'-Methylen- -bisacrylamid und Acrolein, Pressen der gebildeten Gelmasse durch ein feinmaschiges Netz und anschliessendes Waschen wurde ein partikulares, reduzierendes Gel erhalten.
Eine ge schwellte Gelmenge, ungefähr einem Gramm Trockengewicht
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entsprechend, wurde mit 10 mg Ocytocin in einer 0,1 H Natrium-. azid-Lösung "bei pH 6,5 zur Reaktion gebracht. Nach ausgxebigem Waschen wurde der Kopplungsgrad des Ocytocin zu 3 mg pro Gramm Konjugat bestimmt.
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Fixierung von Chymotrypsin an polymere Träger mit Isonitril. Katalytische Eigenschaften der Konjugate.
Träger
Funktionelle
Gruppe des
Trägers
mg Chymotrypsin pro
mg Träger
in der Reaktionsmiechung
Menge Isonitril und zusätzliches Reagens
Reaktions zeit Stunden
Menge fixiertes Chymotrypsin mg/g Konjugat
Aktivität gegen
ATEK
Kasein
CM-Sephadex C-50
CM-Sephadex C-50
CM-Sephadex C-50
CM-Sephadex C-50
CM-Agarose
Polymethylmetacrylat
(tei!hydrolysiert)
Quergebundenes Aminoäthylpolyacrylamid
Enzacryl AA
Agerose-lysinäthyleeter
Perjodatoxidierte
Sepharose kB
(oxid, bei pH 3)
Perjodatoxidierte
Sepharose kh
(oxid, bei pH 5)
-OCH-COOH
-OCH-COOH
-OCH2-COOH
-OCH2-COOH
-OCH2-COOH
-COOH
aliph. -NH,
arora. -NH
aliph. -NH
> C = O
C = O
Epichlorhydrin-quergebundene Agaroee oxid. > C=O mit Dimethyleulfoxid + Acetanhydrid
Schafwolle
-NH2 und -COOH
20
35 50 35
10
35
20
25
35
25 + Acetaldehyd 25 25 + Acetaldehyd 25 25 + Acetaldehyd 25 125 + Acetaldehyd 125 25 + Acetaldehyd 25 25 + Acetaldehyd 25 25 + Acetaldehyd £5
25 + Acetaldehyd 25 25 + Acetaldehyd 25
25
25
10
25 + Acetaldehyd 25
1 1
6 6
6 6
55 175 3^5 395 60
15
17
13 0
10 0
7 0
VJl 0
10 VJl
0,8^CtMoI 0
min/mg
10		 5
25 2-3
50 20
6o
80-90
10/fcMol min/mg
Ί0-60
Das nach, dieser Erfindung hergestellte Polymermaterial hat grosse Vorteile gegenüber bisher bekannten für den gleichen Zweck benutzten Polymeren. Die funktionell en Gruppen können, da sie spezifisch koppeln, an bestimmten Stellen in der Matrix angebracht werden, anstelle der oft inhomogenen Verteilung, die beim sukzessiven Anbringen der Gruppen ensteht. Hierdurch erhält man eine viel gleichmässigere Trennungsaktivität. Durch den quergebundenen Aufbau kann die Matrix ferner den Uebergang von nahezu flüssigem und zum harten, festen Material kontinuierlich decken. Die Möglichkeit besteht natürlich auch, mit in Wasser oder anderen Flüssigkeiten löslichen !Trägern zu arbeiten.
Das in der Erfindung beschriebene Polymermaterial ist besonders effektiv bei enzymatisehen Reaktionen im Bett und in Suspensionen, sowie bei der Trennung verschiedener biochemisch wirkender Stoffe, z.B. Enzyme, Hormone, inhibitoren oder Stimulatoren methabolischer Prozesse.
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Claims (18)

  1. Exgloaterings_Aktiebolaget_T_:_B:LP. ,
    Uppsala, Schweden
    Patentansprüche
    .-" J
    /1. / Verfahren zur Herstellung von polymeren Produkten mit einem
    —Molekulargewicht grosser als 1000, vorzugsweise von Adsorptionsmaterial und polymer gebundenen ("festen", "unlöslichen") Enzymen, durch Kopplung mit kovalenter Bindung von zwei oder mehreren Bestandteilen, von denen wenigstens der eine Teil ein als Träger auftretender Polymer ist, also ein Trägerpolymer, dadurch g e t kennzeichnet, dass jede der obigen Substanzen wenigstens eine der folgenden funktioneilen Gruppen enthält: Isonitril, Aldehyd bzw. Keton, Anion, primäres oder sekundäres Amin, dass die Umsetzung in einem Reaktionsgemisch geschieht, das die obigen Substanzen enthält, ev. komplettiert mit weiteren Substanzen, sodass alle fraglichen funktioneilen Gruppen zu Beginn der Reaktion anwesend sind.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Anion ein Carboxylation und das Amin ein primäres Amin ist.
  3. 3· . Verfahren nach Anspruoh 1 oder 2, dadurch g e k e η η - ψ zeichnet, dass sich die Reaktion in einer Vasserlösung vollzieht.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in einem Lösungsmittelgemisch geschieht, wo Wasser die eine Lösungsmittelkomponente ist.
  5. 5· Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägerpolymer hydrophil ist.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile Polymer ein Polysaccharid oder ein Polysaccharidderivat ist.
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  7. 7· Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeic h net, dass das Polysaccharid Agarose oder ein Agarοsederivat ist.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 5 > dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid Cellulose oder ein Cellulosederivat' ist.
  9. 9· Verfahren nach Anspruch 5? dadurch gekennzeichn et, dass das Polysaccharid Dextran oder ein Dextranderivat, z.B. SephadeXjist.
  10. 1.0, Verfahren nach Anspruch 5? dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile Polymer ein Polyacrylsäureester ist.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile Polymer ein Polyacrylamidderivat ist.
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile Polymer quergebundener Polyvinylalkohol oder ein hydrolysiertes Copolymerisat eines Polyvinylacetats und einer anderen ungesättigten Verbindung, z.B. Styren, ist.
  13. 13. Anwendung des Kopplungsproduktes nach Anspruch 1 "bis 12, dadurch g e k e n-'n zeichnet, dass man die gebundenen Gruppen so wählt, dass sie spezifisch Substanzen adsorbieren, wie beispielsweise ein spezifischer Inhibitor-Enzym-Komplex.
  14. 14-. Anwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Kopplungsprodukt zur Trennung und Analyse von Enzymen und Enzyminhibitoren angewandt wird.
  15. 15. Anwendung des Kopplungsproduktes nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass man mit Hilfe desselben Antigene und Antikörper trennt und analysiert.
  16. 16. Anwendung des Kopplungsproduktes nach Anspruch 1-12,
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    dadurch gekennzeichnet, dass man mit demselben Blutgruppensubstanzen reinigt.
  17. 17· Anwendung des Kopplungsprodukts nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass es als polymergebundenes Enzym angewendet wird.
  18. 18. Anwendung des Kopplungsproduktes nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass das polymerfixierte Enzym nicht löslich ist.
    19· Anwendung des Kopplungsproduktes nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass dasselbe als pharmakologisch wirksame Substanz angewandt wird.
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