DE3727707C2

DE3727707C2 -

Info

Publication number: DE3727707C2
Application number: DE3727707A
Authority: DE
Inventors: Soyao Moriguchi; Hiroshi Yokohama Kanagawa Jp Suzuki; Hiroko Tokio/Tokyo Jp Watanabe; Motoaki Satoh; Michio Sagamihara Kanagawa Jp Abe; Yasuo Tokio/Tokyo Jp Iwata
Original assignee: Showa Denko KK
Current assignee: Resonac Holdings Corp
Priority date: 1986-08-19
Filing date: 1987-08-19
Publication date: 1992-05-14
Also published as: GB2195344B; DE3727707A1; GB8719348D0; US4879340A; GB2195344A

Description

Adsorptionsmittel aus porösen Chitosan-Körnern und Adsorptionsverfahren unter Verwendung dieses Adsorptionsmittels.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Adsorptionsmittel aus porösen Körnern bzw. Kügelchen aus Chitosan und betrifft speziell ein Adsorptionsmittel aus porösen Körnern bzw. Kügelchen aus unvernetztem oder vernetztem Chitosan, an welches Protein A oder Lectin über eine Brückengruppe (Kombinationsgruppe), die eine Carboxylgruppe aufweist, gebunden ist.

Die Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zum Entfernen von Immunglobulin mit Hilfe eines Adsorptionsmittels, aus porösen Körnern von Chitosan und ein Verfahren, gemäß dem die Adsorption durch Affinitätschromatographie oder die Entfernung eines Inhibitors für die Aktivität von Interleukin-2 mit Hilfe eines Adsorptionsmittels aus porösen Körnern von unvernetztem oder vernetztem Chitosan an welches eine Carboxylgruppe gebunden ist, oder eines Adsorptionsmittels, aus porösen Körnern von unvernetztem oder vernetztem Chitosan an welches Protein A oder Lectin über eine Amidgruppe gebunden ist, durchgeführt wird.

Die Affinitätschromatographie ist eine chromatographische Methode, bei der die Trennung oder Reinigung durch Ausnutzen der Affinität zwischen einem Paar von Substanzen durchgeführt wird, die gegeneinander spezifische Wechselwirkungen ausüben. So ist beispielsweise die Affinitätschromatographie eine wertvolle Methode zur Reinigung einer biologischen Substanz aufgrund der Erkennung einer biologischen Eigenschaft der biologischen Substanz, d. h. einer spezifischen chemischen Struktur an dem Molekül.

Ein Adsorptionsmittel (d. h. Affinitätsgel) für die Affinitätschromatographie besteht beispielsweise aus einem aktiven Trägermaterial, welches erhalten wird, indem eine Brückengruppe (Kombinationsgruppe bzw. Spacer) an ein unlösliches Trägermaterial (Matrix) gebunden wird und ein Ligand an den Spacer gebunden wird. Der Adsorptionsvorgang erfolgt an einer Kombination aus diesem Liganden und einer gewählten Substanz, welche miteinander in Wechselwirkung treten.

Als Kombinationen aus Liganden und der zu adsorbierenden Substanz lassen sich folgende Paare erwähnen: Kombination aus einem Enzym und einem Substrat, Produkt, Inhibitor, Coenzym oder Effektor, eine Kombination aus einem Antigen und einem Antikörper, eine Kombination aus einem Rezeptor und einem Agonisten, ein Paar aus Nucleinsäure und einer Base, eine Kombination aus Lectin und einem Saccharid oder Glycoprotein, die Kombination aus einem Metallchelat und einem Protein, eine Kombination aus einer hydrophoben Gruppe und einem Protein, eine Kombination aus Wirts- und Gastsubstanz (host-guest combination) und eine Kombination aus Protein A und Immunglobulin G (IgG).

Bei der Trennung, Reinigung oder Analyse unter Anwendung der Affinitätschromatographie muß der aktive Träger, der Hauptbestandteil des Adsorptionsmittels für die Affinitätschromatographie ist, folgende Eigenschaften aufweisen. Er muß niedrige nichtspezifische Adsorption, hohe Porosität, leicht durchführbare Bindung des Liganden, große Bindekapazität und hohe chemische Beständigkeit zeigen, die bewirkt, daß das Trägermaterial stabil ist, und innerhalb breiter Bereiche des pH-Wertes der Salzkonzentration und der Temperatur keine Volumenänderung auftritt. Das Trägermaterial muß außerdem gute mechanische Festigkeit und Beständigkeit, gute Fließeigenschaften und hohe Beständigkeit gegenüber biologischer Verunreinigung besitzen.

Cellulose, Dextran, Polyacrylamid und Agarose, die üblicherweise als Substrat eines Adsorptionsmittels für die Affinitätschromatographie verwendet werden, besitzen nicht alle dieser erforderlichen Eigenschaften. Speziell wegen der Tatsache, daß sie weiche Gele mit geringer Härte darstellen, sind ihre Fließ- bzw. Gießeigenschaften und die Trenneigenschaften nicht zufriedenstellend. Darüber hinaus besitzen sie sehr kurze Lebensdauer.

Die in jüngerer Zeit verwendeten Siliciumdioxid-Körner haben zufriedenstellende Härte, da sie jedoch nicht unter alkalischen Bedingungen eingesetzt werden können, ist die Wahl der Trennbedingungen oder der Bedingungen des Eluierens und Waschens beträchtlich eingeschränkt.

Es ist bekannt, daß Protein A IgG oder Immun-Komplexe adsorbiert (Immunochemistry, Band 7, S. 124 bis 127), und es ist außerdem bekannt, daß ein Immun-Komplex als Blockierungsfaktor im Immunsystem wirkt. Es wird daher angenommen, daß die Adsorption des Immun-Komplexes durch ein Adsorptionsmittel, welches Protein A trägt, eine Aktivierung des Immunsystems bewirkt, jedoch ist die Einwirkung von Protein A auf Interleukin-2(IL-2)-Inhibitoren und Immunsuppressiva noch nicht vollständig aufgeklärt. In einer spezifischen und praktischen medizinischen Anwendung von Protein A hat man die Fixierung von Protein A an ein geeignetes Trägermaterial versucht. So wurde beispielsweise ein Adsorptionsmittel, welches durch Auftragen von Protein A auf die Oberfläche von Aktivkohle gebildet wurde, und ein Adsorptionsmittel, welches durch Einbetten von Protein A in eine Kollodium-Membran gebildet wurde (Engl. J. Med., 305, 1195, 1981), sowie ein Adsorptionsmittel, welches durch Fixierung von Protein A an ein Polysaccharid, wie Agarose oder Dextran, oder ein Kunststoffmaterial, wie Polystyrol, gebildet wurde, angegeben.

Bei diesen Adsorptionsmitteln treten jedoch die folgenden Schwierigkeiten auf:

(1) Die Menge des fixierten Proteins A ist gering und die Adsorptionskapazität ist daher niedrig.
(2) Die Fixierung von Protein A ist nicht stabil, und es besteht daher die Gefahr des Austretens von Protein A oder die Gefahr, daß schädliche Nebenwirkungen auf den menschlichen Organismus auftreten.
(3) Da das Trägermaterial schlechte Verträglichkeit gegenüber dem lebenden Organismus hat, wird bei Kontakt mit Körperflüssigkeiten, wie Blut, häufig eine Koagulation verursacht.
(4) Wenn ein Trägermaterial starke hydrophobe Eigenschaften zeigt, wie z. B. ein Trägermaterial aus Polystyrol, werden Albumin, Globulin und dergleichen nichtspezifisch adsorbiert, und die Kapazität für die selektive Adsorption von Protein A wird daher vermindert.

Wenn Protein A durch ionische Adsorption, physikalische Adsorption oder Einbetten fixiert wird, tritt ein Ablösen von Protein A auf, und es besteht die Gefahr, daß dieses schädliche Einwirkungen auf den menschlichen Organismus hat. Es ist daher erforderlich, eine Methode zu entwickeln, welche die quantitative und beständige Fixierung von Protein A an einem Trägermaterial ermöglicht. Andererseits besteht das Problem, daß dann, wenn das Trägermaterial als fremde Substanz in einem lebenden Organismus erkannt wird, an dem Trägermaterial Blut coaguliert wird oder die Bildung eines Antikörpers induziert wird. Dadurch wird der Kontakt mit dem Blut gehemmt und die Wirkung vermindert. Außerdem können Blutgerinnsel in die Blutgefäße einwandern und in Verengungen der Blutgefäße Thromben bilden. Es besteht daher die Möglichkeit, daß schwerwiegende und gefährliche Nebenwirkungen auf den lebenden Organismus eintreten.

Es ist daher die vorherrschende Aufgabe der Erfindung, ein Adsorptionsmittel für die Affinitätschromatographie zur Verfügung zu stellen, welches alle vorstehend erläuterten Eigenschaften besitzt, die für ein Adsorptionsmittel für die Affinitätschromatographie erforderlich sind.

Aufgabe der Erfindung ist es außerdem, ein Adsorptionsmittel zur Verfügung zu stellen, welches befähigt ist, einen IL-2-Inhibitor oder Immunglobulin selektiv zu adsorbieren, ohne daß störende Nebenwirkungen auftreten.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Adsorptionsmittel aus porösen Körnern aus unvernetztem oder vernetztem Chitosan, in dem Protein A oder Lectin durch covalente Bindung über eine Brückengruppe bzw. Kombinationsgruppe gebunden ist. Im Fall von unvernetztem Chitosan erfolgt die Bindung an die Aminogruppe des das Chitosan aufbauenden Glucosamins, während im Fall von vernetztem Chitosan die Bindung an die Aminogruppe des das Chitosan aufbauenden Glucosamins und an eine Aminogruppe eines Vernetzungsmittels erfolgt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Adsorption und Abtrennung bzw. Entfernung eines IL-2-Inhibitors zur Verfügung gestellt, welches unter Verwendung des vorstehenden Adsorptionsmittels welches aus porösen Körnern aus unvernetztem oder vernetztem Chitosan, an welches Protein A über eine Brückengruppe gebunden ist, durchgeführt wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Adsorption einer gewünschten Substanz durch Affinitätschromatographie unter Verwendung des vorstehend definierten Adsorptionsmittels aus porösen Körnern aus unvernetztem oder vernetztem Chitosan, an welches Protein A oder Lectin über eine Brückengruppe gebunden ist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Trägermaterial für die Chromatographie aus porösen Körnern von unvernetztem oder vernetztem Chitosan, in welchem eine ω-Carboxyalkanoylgruppe im Fall von unvernetztem Chitosan an die Aminogruppe des das Chitosan aufbauenden Glucosamins oder im Fall von vernetztem Chitosan an mindestens einen Teil der Aminogruppen des Glucosamins, welches das Chitosan aufbaut, und eine Aminogruppe eines Vernetzungsmittels gebunden ist, und wobei die verbleibenden nichtumgesetzten Aminogruppen acyliert sind, zur Verfügung gestellt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Adsorption von Immunglobulin mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Adsorptionsmittels aus porösen Körnern aus unvernetztem oder vernetztem Chitosan zur Verfügung gestellt.

Die Erfindung wird durch die Zeichnungen erläutert. In diesen Zeichnungen bedeutet

Fig. 1 ein Chromatogramm, welches die Ergebnisse der Analyse von menschlichem IgG unter Verwendung eines Adsorptionsmittels zeigt, welches Protein A an einem Träger aus porösen Körnern aus Chitosan umfaßt,

Fig. 2 ein Chromatogramm, das die Ergebnisse der Analyse von menschlichem Serum unter Verwendung eines Adsorptionsmittels aus porösen Körnern aus Chitosan das nicht-acylierte Aminogruppen enthält, zeigt;

Fig. 3 ein Chromatogramm, welches die Ergebnisse erläutert, die erhalten werden, wenn eine aus einem Elutionsmittel (1) adsorbierte und durch ein Elutionsmittel (2) eluierte Fraktion erneut an einer Adsorptionskolonne aus dem erfindungsgemäßen Adsorptionsmittel analysiert wird,

Fig. 4 und 5 die Ergebnisse, erhalten durch Prüfung und Auswertung der Elution von p-Nitrophenyl-α-D-galactopyranosid und p-Nitrophenyl-α-D-mannopyranosid mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Adsorptionsmittels welches Concanavalin A, gebunden an ein Trägermaterial, enthält;

Fig. 6 und 7 zeigen Diagramme, die durch Verfolgen der Adsorption und Elution von Ei-Albumin unter Verwendung eines Adsorptionsmittels, welches eine nicht-acylierte Aminogruppe aufweist, gemäß Vergleichsbeispiel 2 und eines Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung erhalten wurden;

Fig. 8 und 9 sind Photographien der Ergebnisse, die erhalten werden, wenn die Kapazität zur Adsorption von Immunglobulin aus menschlichem Plasma mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Adsorptionsmittels durch Immunelektrophorese bestimmt wird; und

Fig. 10 und 11 sind Photographien, welche die Ergebnisse zeigen, die erhalten werden, wenn die Kapazität zur Adsorption von Immunglobulin aus menschlichem Plasma mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Adsorptionsmittels durch Immundiffusion bestimmt wird.

Die Erfindung wird nachstehend anhand bevorzugter Ausführungsformen näher erläutert.

Die erfindungsgemäß eingesetzten porösen Körner aus Chitosan bestehen aus Polyglucosamin, welche durch Entacetylierung von Chitin erhalten wird, oder aus einem Vernetzungsprodukt eines solchen Polyglucosamins. Chitin ist der Bestandteil des Panzers von Krustentieren oder Insekten.

Das Vernetzungsprodukt zeigt überlegene chemische Eigenschaften, wie Säurebeständigkeit und mechanische Festigkeit, im Vergleich mit unvernetztem Chitosan.

Als Vernetzungsmittel werden vorzugsweise nachstehende Verbindungen eingesetzt:

Dicarbonsäuren und deren Halogenide, die durch die nachstehende Formel (I) dargestellt werden:

worin X ein Chlor- oder Bromatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet, Y eine Cyclohexylen-, Phenylen-, Methylphenylen- oder Dimethylphenylen-Gruppe darstellt, m für 0 oder 1 und n für 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 7 stehen,
Dialdehyde, dargestellt durch die folgende Formel (II):

worin Y, m und n die vorstehende Definition haben, und Diisocyanate, dargestellt durch die folgende Formel (III):

worin Y, m und n die vorstehende Definition haben.

Die Vernetzung erfolgt durch Umsetzung von Chitosan mit dem Vernetzungsmittel in einer Menge von 0,2 bis 2,0 Mol pro Mol der Glucosamingruppe des Chitosans in Gegenwart eines polaren Lösungsmittels, beispielsweise eines Alkohols, wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol, eines Ketons, wie von Aceton, oder eines Amids, wie von Dimethylformamid.

Die porösen Körner aus unvernetztem Chitosan weisen einen Anteil an Aminogruppen, bezogen auf Glucosamin, von mehreren µMol/g bis mehreren mMol/g auf, und die Körner aus vernetztem Chitosan besitzen Aminogruppen, bezogen auf Glucosamin, und Aminogruppen, bezogen auf das Vernetzungsmittel, in einer Gesamtmenge von mehreren µMol/g bis mehreren mMol/g.

Vorzugsweise beträgt der durchschnittliche Teilchendurchmesser der porösen Chitosan-Körner bzw. -Perlen 0,1 bis 3 mm, und die Gestalt dieser Körner ist kugelig.

Im Hinblick auf die gewünschte Oberfläche und Festigkeit des Adsorptionsmittels wird bevorzugt, daß die porösen Chitosan-Körner feine Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,05 bis 3 µm haben.

Die porösen Körner aus unvernetztem oder vernetztem Chitosan können als Adsorptionsmittel zum Entfernen bzw. Abtrennen von Immunoglobulin eingesetzt werden. Ein aus porösen Chitosan-Körnern bestehendes Adsorptionsmittel ist unschädlich gegenüber dem lebenden Organismus und besitzt Fähigkeit zur selektiven Adsorption von Immunglobulin aus Körperflüssigkeiten, und dieses Adsorptionsmittel zeigt gute Adsorptionskapazität pro Gewichtseinheit und verursacht nicht die Koagulation von Blut. Es ist daher ersichtlich, daß bei Anwendung dieses Adsorptionsmittels in einem äußeren Kreislauf einer Körperflüssigkeit zufriedenstellende Wirkungen für die Heilung von immunitätsbezogenen Krankheiten erzielt werden.

Die Aminogruppe des das Chitosan aufbauenden Glucosamins, im Fall von unvernetztem Chitosan, oder beide Aminogruppen, d. h., die Aminogruppe des das Chitosan aufbauenden Glucosamins und die Aminogruppe des Vernetzungsmittels, im Fall von vernetztem Chitosan können durch Umsetzung mit einem Alkandicarbonsäureanhydrid in eine Kombinationsgruppe, die eine Carboxylgruppe aufweist, umgewandelt werden.

Zu Alkandicarbonsäureanhydriden, die für diese Reaktion anwendbar sind, gehören solche mit 4 bis 16 Kohlenstoffatomen, wie Bernsteinsäureanhydrid, Glutarsäureanhydrid, Adipinsäureanhydrid, Pimelinsäureanhydrid, Korksäureanhydrid, Azelainsäureanhydrid, Sebacinsäureanhydrid, 1,10-Decandicarbonsäureanhydrid, 1,12-Dodecandicarbonsäureanhydrid und 1,14-Tetradecandicarbonsäureanhydrid.

Vorzugsweise beträgt die Menge der aus dem Alkandicarbonsäureanhydrid eingeführten Carboxylgruppe 0,01 bis 2,0 mMol/g der porösen Chitosankörner.

Die Reaktionsbedingungen sind nicht besonders kritisch, im allgemeinen werden jedoch vorzugsweise die nachstehenden Bedingungen für die Reaktion ausgewählt.

Vorzugsweise beträgt das Gewichtsverhältnis (a)/(b) der porösen Chitosan-Körner (a) zu dem Alkandicarbonsäureanhydrid (b) 1/0,05 bis 1/10, stärker bevorzugt 1/0,1 bis 1/3, und die Reaktionstemperatur liegt vorzugsweise bei 0 bis 150°C, insbesondere bei Raumtemperatur bis 100°C. Die Reaktionsdauer beträgt vorzugsweise 1 bis 60 Stunden, insbesondere 1 bis 30 Stunden, und der Reaktionsdruck ist vorzugsweise Atmosphärendruck bis 10 bar (Atmosphären), insbesondere wird Atmosphärendruck angewendet.

Normalerweise wird Wasser als Reaktionslösungsmittel eingesetzt, es eignen sich jedoch auch Ether, wie Tetrahydrofuran und Dioxan, Carbonsäuren, wie Essigsäure, sowie Pyridin. Die Verwendung eines Katalysators ist nicht nötig, der pH-Wert der Reaktionsflüssigkeit kann jedoch durch Zugabe einer Säure, wie Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, oder einer Base, wie Natriumhydroxid oder Kaliumcarbonat, eingestellt werden.

Die Bedingungen für die Nachbehandlung nach der Reaktion sind nicht besonders kritisch. So kann die Nachbehandlung bzw. Aufbereitung mit Hilfe üblicher Methoden, wie durch Filtration und/oder Waschen erfolgen.

Die so erhaltenen porösen Chitosankörner, die Carboxylgruppen enthalten, werden weiterhin mit einem Monocarbonsäureanhydrid oder einem Acylhalogenid umgesetzt, um im wesentlichen sämtliche nicht umgesetzte Aminogruppen zu acylieren. Wenn keine Acylierung durchgeführt wird, kann wegen der Basizität der nicht umgesetzten Aminogruppe unspezifische Wechselwirkung auftreten, und es ist schwierig, den erfindungsgemäß angestrebten Zweck zu erreichen.

Die Bedingungen für diese Reaktion können die gleichen wie die Bedingungen für die vorstehend erwähnte Reaktion mit dem Alkandicarbonsäureanhydrid sein. Wenn jedoch ein Acylhalogenid als Acylierungsmittel verwendet wird, wird vorzugsweise kein Wasser, sondern ein anderes Lösungsmittel eingesetzt und wird vorzugsweise eine Base als Katalysator angewendet.

Zu erfindungsgemäß geeigneten Monocarbonsäureanhydriden gehören solche mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie Essigsäureanhydrid, Propionsäureanhydrid, Buttersäureanhydrid. Zu erfindungsgemäß geeigneten Acylhalogeniden gehören solche mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Acetylchlorid, Acetylbromid, Propionylchlorid, Butyrylchlorid.

Wenn eine Kombinationsgruppe, die eine Carboxylgruppe aufweist, in die unvernetzten oder vernetzten Chitosan-Körner eingeführt worden ist und danach die Acylierung in der vorstehend beschriebenen Weise durchgeführt wird, kann ein Ligand für die Affinitätschromatographie, wie Protein A oder Lectin, in einfacher Weise über diese Kombinationsgruppe mit einer Carboxylgruppe an das Chitosan covalent gebunden werden. Die erfindungsgemäßen porösen Chitosan-Körner sind daher äußerst wertvoll als wasserunlösliches aktives Trägermaterial für die Affinitätschromatographie.

Als Ligand, der durch covalente Bindung an die Carboxylgruppe gebunden wird, eignet sich Protein A und Lectin. Die Art des zu bindenden Lectins ist nicht besonders kritisch. So eignen sich beispielsweise pflanzliche Lectine, wie Concanavalin A, Lectin aus Indischer Lakritze, Weizenkeim- Lectin, Rizinussamen-Lectin, Soyabohnen-Lectin, Stechginstersamen- Lectin, Lectin aus roten Kidney-Bohnen, Spargelsamen- Lectin (Asparagusbohnen-Lectin), Bandeliabohnen- Lectin, Linsen-Lectin, Erbsen-Lectin und Erdnuß-Lectin, sowie tierische Lectine, wie Teufelskrabben(Meeresspinnen)- Lectin, Aal-Lectin und Schnecken-Lectin. Im Fall von Protein A als Ligand gehört zu geeigneten Substanzen Protein A, das aus der Zellwand eines Staphylococcus aureus erhalten wird oder Protein A, das durch Gentechnologie (Genetic engineering) aus Escherichia coli oder einer Hefe erhalten wird.

Protein A oder Lectin können durch Behandlung mit einem Kondensationsmittel, wie Dicyclohexylcarbodiimid oder 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid für sich oder in Kombination mit einem Kondensationsmittel wie N-Hydroxysuccinamid, in einem geeigneten Lösungsmittel covalent an die Carboxylgruppe gebunden werden. Als Lösungsmittel wird im allgemeinen Wasser eingesetzt. Erforderlichenfalls kann ein Phosphat- oder Acetat-Puffer verwendet werden oder kann ein anorganisches Salz, wie Natriumchlorid, zugesetzt werden.

Die Bedingungen für die Reaktion mit Protein A oder Lectin sind nicht besonders kritisch, im allgemeinen werden jedoch die nachstehenden Reaktionsbedingungen bevorzugt. Das Gewichtsverhältnis der erfindungsgemäßen porösen Chitosan- Körner, welche die gebundenen Carboxylgruppen enthalten, zu Protein A oder Lectin liegt vorzugsweise im Bereich von 1/0,03 bis 1/0,3, insbesondere von 1/0,05 bis 1/0,2, die Reaktionstemperatur beträgt vorzugsweise 0°C bis Raumtemperatur, insbesondere 4°C bis Raumtemperatur, und die Reaktionsdauer beträgt vorzugsweise 1 bis 72 Stunden, insbesondere 2 bis 12 Stunden.

Die Bedingungen für die Nachbehandlung nach der Reaktion sind nicht besonders kritisch, und die Nachbehandlung erfolgt in geeigneter Weise durch übliche Methoden, wie Filtration und/oder Waschen.

Die Menge des gebundenen Proteins A oder Lectins beträgt im allgemeinen etwa 1 mg/g bis etwa 30 mg/g, bezogen auf die porösen Chitosan-Körner.

Das Adsorptionsmittel aus den porösen Chitosan-Körnern mit gebundenem Protein A oder Lectin ist wertvoll als Adsorptionsmittel für die Affinitätschromatographie. Das Adsorptionsmittel aus den porösen Chitosan-Körnern die gebundenes Protein A enthalten, ist außerdem wertvoll als Adsorptionsmittel zur Adsorption und Entfernung eines IL-2-Inhibitors.

Das erfindungsgemäße Adsorptionsmittel kann als Packung bzw. Füllung für die Affinitätschromatographie in gleicher Weise eingesetzt werden, wie übliche Adsorptionsmittel aus weichem Gel, und das erfindungsgemäße Adsorptionsmittel kann auch unter Druck angewendet werden, wenn es in eine druckfeste Kolonne eingefüllt ist. Daher kann bei Verwendung des erfindungsgemäßen Adsorptionsmittels die Betriebsdauer stark verkürzt und die Wirksamkeit der Trennung und Reinigung außerordentlich verbessert werden. Dieser Vorteil ist unerläßlich bei der Anwendung zur Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder bei der Anwendung in industriellen Trenn- und Reinigungsvorrichtungen.

Da in dem bevorzugten Adsorptions-Trägermaterial für die Chromatographie gemäß der Erfindung die nicht umgesetzten Aminogruppen der porösen Chitosan-Körner vollständig acyliert sind, wird bei Kontakt mit einem Protein oder dergleichen eine ionische unspezifische Adsorption verhindert, und die Selektivität für die Absorption der gewünschten Substanz über den Liganden wird äußerst stark erhöht. Darüber hinaus ist dieses Adsorptionsmittel gegenüber einem üblichen Adsorptionsmittel für die Affinitätschromatographie, dessen Liganden über Cyanogenbromid oder Glutaraldehyd gebunden sind, insofern überlegen, als das Austreten des Liganden während des Betriebes auf ein Minimum unterdrückt wird und dadurch, daß die Adsorptionskapazität des Liganden gegenüber der gewünschten Substanz erhöht und nichtspezifische Adsorption ausgeschaltet wird, da die Länge der Brückengruppe beliebig eingestellt werden kann.

Wenn darüber hinaus das erfindungsgemäße Adsorptionsmittel, welches Protein A an den Träger gebunden enthält, zur Entfernung eines IL-2-Inhibitors angewendet wird, kann eine ausreichende Menge von Protein A auf den Träger aufgetragen werden, ohne daß eine Verminderung der Aktivität von Protein A auftritt. Da außerdem Protein A während des Betriebes nicht austritt und eine nichtspezifische Adsorption verhindert wird, ist das Adsorptionsmittel sehr stabil und kann mit hoher Wirksamkeit eingesetzt werden.

Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher unter Bezugnahme auf typische Beispiele des Verfahrens zur Herstellung des Adsorptionsträgers für die Chromatographie erläutert. Diese Beispiele sollen jedoch nur zur Erläuterung, nicht zur Beschränkung der Erfindung dienen.

Beispiel 1

Eine Lösung von 1,0 g Glutarsäureanhydrid in 5 ml Wasser wurde zu 1,0 g mit Xylylendiisocyanat vernetzter poröser Chitosan-Körner mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,1 mm und einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,07 µm gegeben, und der pH-Wert wurde mit 4 n wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 6 eingestellt. Das Gemisch wurde 1 Tag lang bei Raumtemperatur geschüttelt, und die Kügelchen wurden dann durch Filtration gewonnen und mit 0,01 n wäßriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, 0,1 n Chlorwasserstoffsäure und danach mit Wasser gewaschen. Dann wurden 5 ml einer 0,2 m wäßrigen Lösung von Natriumacetat zu den Kügelchen zugesetzt, und außerdem wurde 0,5 g Essigsäureanhydrid zugefügt, und das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt, um die Acetylierung der verbleibenden Aminogruppen durchzuführen. Die Körner wurden dann durch Filtration gewonnen, mit einer großen Wassermenge gewaschen und getrocknet. Durch Colorimetrie unter Verwendung von Natriumtrinitrobenzol-sulfonat wurde bestätigt, daß die Körner keine Aminogruppen enthielten. Diese Körner (mit einem Gehalt an 0,35 mMol Carboxylgruppen pro Gramm der trockenen Körner (1,0 g) wurden mit wasserfreiem Dioxan gewaschen und dann in 4 ml wasserfreies Dioxan gegeben, wonach 80 mg N-Hydroxybernsteinsäureimid und 144 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugefügt wurden, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang geschüttelt. Die Körner wurden durch Filtration gewonnen und sofort mit 20 ml wasserfreiem Dioxan, 6 ml Methanol und danach mit 3 ml kaltem Wasser gewaschen.

Die Körner bzw. Kügelchen wurden zu 2 ml einer 0,01 m wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat, die 6 mg Protein A enthielt, zugefügt. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt und über Nacht bei 4°C stehengelassen. Die Körner wurden durch Filtration gewonnen und mit einer 1 m wäßrigen Natriumchlorid-Lösung und danach mit Wasser gewaschen, wonach die Körner in 2 ml einer 1 m Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben wurden und das Gemisch erneut 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt wurde. Dann wurden die Körner durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen.

Durch die zurückgewonnene Menge an nichtumgesetztem Protein A wurde bestätigt, daß in dem erhaltenen Adsorptionsmittel Protein A in einer Menge von 3,0 mg pro g der trockenen Körner aufgetragen war.

Beispiel 2

Ein Adsorptionsmittel, welches Protein A in einer Menge von 3,5 mg pro Gramm der trockenen Körner aufgetragen enthielt, wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Abänderung, daß mit Hexamethylendiisocyanat vernetzte poröse Chitosan-Körner mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,07 µm anstelle der in Beispiel 1 eingesetzten vernetzten porösen Chitosankörner verwendet wurden.

Beispiel 3

An jedem der in Beispielen 1 und 2 hergestellten Adsorptionsmittel in Form von vernetzten Chitosankörnern mit aufgetragenem Protein A wurde die Adsorptionskapazität für einen IL-2-Inhibitor in folgender Weise geprüft.

Zu 0,1 g der Körner wurde 0,4 ml einer wäßrigen Lösung gegeben, die 5 Gew.-% IL-2 enthielt, und das Gemisch wurde 60 min lang bei 37°C inkubiert. Das Produkt wurde 2 bis 5 min lang der Trennung mit Hilfe einer Zentrifuge bei 2000×g unterworfen, und die überstehende Flüssigkeit wurde durch ein Bakterien-Abscheidungsfilter einer Maschenweite von 0,22 µm gegossen. Dann wurde 0,05 ml der erhaltenen Flüssigkeit zu 0,05 ml einer Kultursuspension von IL-2-abhängigen Zellen NKC-7 gegeben, die 2×10⁶ Zellen pro ml und 10% fetales Rinderserum enthielt, und die Inkubation wurde 24 Stunden bei 37°C in einem Inkubator, der 5% CO₂ enthielt, durchgeführt. 4 Stunden vor dem Abbruch der Reaktion erfolgte die Aufnahme durch radioaktive Markierung durch Zugabe von 0,025 ml pro ³H-Thymidin einer Konzentration von 25 µc/ml und CPM wurde mit Hilfe eines β-Strahlungs- Zählgerätes gemessen. Das Adsorptionsverhältnis (%) wurde nach folgender Gleichung berechnet:

Anmerkung: Der Kontrollwert wurde in gleicher Weise wie vorstehend erwähnt bestimmt, mit der Abänderung, daß die Körner nicht eingesetzt wurden.

Die so bestimmten Adsorptionsverhältnisse (%) der in Beispielen 1 und 2 erhaltenen Adsorptionsmittel betrugen -42,9% bzw. -33,8%. Zum Vergleich betragen die Adsorptionsverhältnisse (%) der in Beispielen 1 und 2 verwendeten Chitosan-Körner +13,5% bzw. +12,2%.

Beispiel 4

Ein Adsorptionsmittel in Form von vernetzten Chitosan-Körnern mit gebundenem Protein A wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Abänderung, daß die Menge des Proteins A in 10 mg abgeändert wurde. Durch die zurückgewonnene Menge an nichtumgesetztem Protein A wurde bestätigt, daß 6,0 mg Protein A pro Gramm der trockenen Körner aufgetragen worden waren.

Das so hergestellte Adsorptionsmittel wurde in eine Kolonne aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Länge von 50 mm gepackt, und menschliches IgG wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie analysiert, wobei das in Fig. 1 gezeigte Chromatogramm erhalten wurde. Die Analysebedingungen waren wie folgt:

Elutionsmittel (1): 0,01 m Natriumacetat/Chlorwasserstoffsäure- Puffer (pH 7,0);
Elutionsmittel (2): 0,01 m Natriumacetat/Chlorwasserstoffsäure- Puffer (pH 3,0);
Elutionsrate: 0,5 ml/min;
Detektor: Ultraviolettspektrophotometer, 280 nm.

Vergleichsbeispiel 1

Unter Verwendung der Chitosan-Körner mit nichtacylierter Aminogruppe, die als Zwischenprodukt in dem Verfahren zur Herstellung des Adsorptionsmittels gemäß Beispiel 1 erhalten worden waren, als Adsorptionsmittel wurde menschliches Serum anstelle von menschlichem IgG nach der in Beispiel 4 beschriebenen Methode analysiert. Dabei wurde das in Fig. 2 gezeigte Chromatogramm erhalten. Wenn die durch Elutionsmittel (2) eluierte Fraktion erneut mit Hilfe der in Beispiel 4 beschriebenen Kolonne analysiert wurde, wurde ein Peak der durch Elutionsmittel (1) eluierten Fraktion beobachtet (Fig. 3). Es scheint, daß dieser Peak auf das Protein zurückzuführen war, welches durch ionische Bindung unspezifisch an die freie Aminogruppe gebunden war.

Beispiel 5

Ein Adsorptionsmittel wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt mit der Abänderung, daß Concanavalin A anstelle von Protein A nach der folgenden Verfahrensweise aufgetragen wurde.

Die Körner, die gemäß Beispiel 1 unmittelbar vor der Behandlung mit der Protein-A-Lösung erhalten worden waren, wurden zu einer Lösung von 30 mg Concanavalin A und 40 mg Methyl-α-mannopyranosid in 2 ml Wasser, die 0,1 mmolar Calciumchlorid, 0,1 mmolar Manganchlorid und 0,01 mmolar Natriumhydrogencarbonat enthielt, gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und über Nacht bei 4°C stehengelassen. Die Körner wurden durch Filtration gewonnen, mit einer 1 m wäßrigen Natriumchloridlösung und danach mit Wasser gewaschen und zu 2 ml einer 1 m Tris- Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Körner wurden durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Durch die Menge des wiedergewonnenen nichtumgesetzten Concanavalins A wurde bestätigt, daß Concanavalin A in einer Menge von 15 mg pro Gramm der trockenen Körner auf diese aufgetragen war.

Das so erhaltene Adsorptionsmittel wurde in eine Kolonne aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Länge von 50 mm gepackt und p-Nitrophenyl-α-D-galactopyranosid (Verbindung 1) und p-Nitrophenyl-α-D-mannopyranosid (Verbindung 2) wurden durch Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Verbindung
Retentionskapazität (ml)
1
9 ml (Fig. 4)
2	15 ml (Fig. 5)

Diese Analyse wurde unter den folgenden Bedingungen vorgenommen:

Elutionsmittel: 0,02 m Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung mit einem Gehalt an 0,5 m Natriumchlorid, 0,5 mmolar Calciumchlorid und 0,5 mmolar Manganchlorid (pH 7,4);
Elutionsrate: 1,0 ml/min;
Detektor: Ultraviolettspektrophotometer, 260 nm.

Vergleichsbeispiel 2

Unter Verwendung von Chitosan-Körnern mit nichtacylierten Aminogruppen als Adsorptionsmittel, die als Zwischenprodukt in dem Verfahren zur Herstellung des Adsorptions-Trägermaterials in Beispiel 5 erhalten wurden, wurde Eialbumin nach der in Beispiel 5 beschriebenen Methode unter folgenden Bedingungen analysiert.

Elutionsmittel (A): 0,01 m Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0);
Elutionsmittel (B): Elutionsmittel (A) plus 0,05 m α-Methylglucosid;
Elutionsrate: 1,0 ml/min;
Detektor: Ultraviolett-Spektrophotometer, 280 nm.

Bei Verwendung von Elutionsmittel (A) wurde der größte Teil des Eialbumins adsorbiert, und wenn Elutionsmittel (A) durch Elutionsmittel (B) ersetzt wurde, wurde ein Teil des adsorbierten Eialbumins eluiert, jedoch ein beträchtlicher Teil verblieb adsorbiert (Fig. 6).

Danach wurde das Eialbumin in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben, jedoch unter Verwendung des in Beispiel 5 hergestellten Adsorptionsmittels analysiert. Der größte Teil der durch Elutionsmittel (A) adsorbierten Eialbumins wurde durch Elutionsmittel (B) eluiert (vgl. Fig. 7). Wenn die gleiche Menge an Eialbumin analysiert wurde, so zeigte sich eine ausgeprägte Differenz zwischen den eluierten Mengen in Fig. 6 und 7, was wahrscheinlich auf den Einfluß der nichtacylierten Aminogruppen zurückzuführen ist.

Beispiel 6

Ein Adsorptions-Trägermaterial, in welchem Weizenkeim-Lectin in einer Menge von 3,2 mg pro Gramm der trockenen Körner aufgetragen war, wurde nach der in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrensweise hergestellt, mit der Abänderung, daß eine Lösung von 5,0 mg Weizenkeim-Lectin und 10 mg N-Acetyl-α-glucosamin in 3 ml Wasser, welches 0,05 m Kaliumphosphat, 0,15 m Natriumchlorid und 0,01 m Natriumhydrogencarbonat enthielt, anstelle der in Beispiel 5 verwendeten Lösung von 30 ml Concanavalin A verwendet wurde.

Beispiel 7

In dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren zur Herstellung des Adsorptionsmittels wurde 1,0 g der mit Glutarsäureanhydrid umgesetzten und mit Essigsäureanhydrid umgesetzten Körner (der Carboxylgruppengehalt betrug 0,35 mMol pro Gramm der trockenen Körner) mit wasserfreiem Dioxan gewaschen und danach in 4 ml wasserfreies Dioxan gegeben, und weiterhin wurden 80 mg N-Hydroxysuccinimid und 144 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Das gebildete Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Dann wurden die Körner durch Filtration gewonnen und sofort mit 20 ml wasserfreiem Dioxan, 6 ml Methanol und schließlich mit 3 ml kaltem Wasser gewaschen. Die Körner wurden dann zu einer Lösung von 30 mg Concanavalin A und 40 mg Methyl-α-mannopyranosid in 2 ml Wasser, die 0,1 mMolar Calciumchlorid, 0,1 mMolar Manganchlorid und 0,01 m Natriumhydrogencarbonat enthielt, gegeben. Das gebildete Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und über Nacht bei 4°C stehengelassen. Die Körner wurden durch Filtration gewonnen, mit einer 1 m wäßrigen Lösung von Natriumchlorid und danach mit Wasser gewaschen und zu 2 ml einer 1 m Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Dann wurden die Körner durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Durch die wiedergewonnene Menge an nichtumgesetztem Concanavalin A wurde bestätigt, daß Concanavalin A an das Adsorptionsmittel in einer Menge von 15 mg pro Gramm der trockenen Körner gebunden war.

Beispiel 8

Eine Lösung von 0,1 g Bernsteinsäureanhydrid in 5 ml Dioxan wurde zu 1,0 g poröser Körner aus mit Hexamethylendiisocyanat vernetztem Chitosan mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,3 mm und einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,07 µm gegeben, und außerdem wurde 0,1 g Pyridin zugesetzt. Das gebildete Gemisch wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Körner wurden durch Filtration gewonnen und mit Dioxan gewaschen, wonach eine Lösung von 0,5 g Acetylchlorid in 5 ml Dioxan zu den Körnern zugefügt wurde. Danach wurde dem Gemisch außerdem 0,5 g Triethylamin zugesetzt, und das gebildete Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Körner wurden durch Filtration gewonnen, mit Wasser gewaschen und schließlich mit einer großen Menge an Dioxan gewaschen und getrocknet. Durch Colorimetrie unter Verwendung von Natriumtrinitrobenzolsulfonat wurde bestätigt, daß die Körner keine Aminogruppen mehr enthielten. Die Menge der durch Neutralisationstitration bestimmten Carbonsäuregruppen betrug 0,80 mMol pro Gramm der trockenen Körner.

Unter Verwendung dieser Körner wurde ein Adsorptionsmittel, welches Protein A in einer Menge von 6,0 mg pro Gramm der trockenen Körner aufgetragen enthielt, in der in Beispiel 7 beschriebenen Weise hergestellt, mit der Abänderung, daß eine Lösung von 10 mg Protein A in 2 ml Wasser mit einem Gehalt an 0,01 m Natriumhydrogencarbonat anstelle der in Beispiel 7 eingesetzten Lösung von 30 mg Concanavalin A verwendet wurde.

Beispiel 9

Zu 10 ml menschlichem Plasma wurde 1 ml eines feuchten Adsorptionsmittels aus (A) mit Hexamethylendiisocyanat vernetzten porösen Chitosan-Körnern mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,1 mm und einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,07 µm oder (B) porösen Körnern von mit Xylylendiisocyanat vernetztem Chitosan mit dem gleichen durchschnittlichen Teilchendurchmesser und Porendurchmesser gegeben und die Inkubation wurde bei 4°C bzw. 37°C während einer Stunde durchgeführt, wonach die Körner durch Zentrifugation gewonnen wurden. Die Körner wurden dreimal mit 1 ml Kochsalzlösung gewaschen und mit dem Überstand kombiniert. Die Veränderung der Werte für Gesamtprotein (T.P.), Albumin (Alb), Gesamtcholesterin (T.Cho.), IgG, IgA und IgM wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeits- Chromatographie gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Beispiel 10

Die in Beispiel 9 erhaltenen Körner (B) wurden in dem in Tabelle 3 gezeigten Mischungsverhältnis mit menschlichem Plasma vermischt, und die Inkubation wurde 30 Minuten lang bei 37°C durchgeführt. Der durch Zentrifugation gewonnene Überstand wurde durch Immunelektrophorese im Hinblick auf die spezifischen Adsorptionscharakteristika untersucht. Die Kapazität zur Adsorption von Immunglobulin in menschlichem Plasma, die durch Immunelektrophorese bestimmt wurde, ist in den Photographien in Fig. 8 und 9 gezeigt. Es wurde bestätigt, daß die Körner, im Vergleich mit der Kontrollprobe, den Globulinbereich spezifisch adsorbierten.

Tabelle 3

Beispiel 11

Die IgG-Adsorptionsverhältnisse der in Beispiel 10 beschriebenen Proben wurden durch Prüfung mit der Immundiffusionsmethode bestimmt. Die Kapazität zur Adsorption von Immunglobulin aus menschlichem Plasma, die durch Immundiffusion bestimmt wurde, ist in den Photographien in Fig. 10 und 11 sowie in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Claims

1. Adsorptionsmittel aus porösen Körnern aus unvernetztem oder vernetztem Chitosan, dadurch gekennzeichnet, daß Protein A oder Lectin über eine Brückengruppe covalent an das unvernetzte oder vernetzte Chitosan gebunden ist, wobei es im Fall von unvernetztem Chitosan an die Aminogruppe des das Chitosan aufbauenden Glucosamins und im Fall von vernetztem Chitosan an eine Aminogruppe des das Chitosan aufbauenden Glucosamins und an eine Aminogruppe eines Vernetzungsmittels gebunden ist.

2. Adsorptionsmittel für die Chromatographie, aus porösen Körnern aus unvernetztem oder vernetztem Chitosan, dadurch gekennzeichnet, daß im Fall von unvernetztem Chitosan eine ω-Carboxyalkanoylgruppe an mindestens einen Teil der Aminogruppen des das Chitosan aufbauenden Glucosamins gebunden ist und im Fall von vernetztem Chitosan eine ω-Carboxyalkanoylgruppe an mindestens einen Teil der Aminogruppen des das Chitosan aufbauenden Glucosamins und der Aminogruppen des Vernetzungsmittels gebunden ist und die verbleibenden Aminogruppen acyliert sind.

3. Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das vernetzte Chitosan durch Vernetzen von unvernetztem Chitosan mit einem Vernetzungsmittel erhalten wurde, das aus der Gruppe der nachstehenden Verbindungen ausgewählt ist: Dicarbonsäuren und deren Halogenide, die durch die nachstehende Formel (I) dargestellt werden: worin X ein Chlor- oder Bromatom oder eine Hydroxylgruppe, Y eine Cyclohexylen-, Phenylen-, Methylphenylen- oder Dimethylphenylengruppe bedeuten, m für 0 oder 1 und n für 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 7 stehen,
Dialdehyde, dargestellt durch die Formel (II): worin Y, m und n die vorstehende Definition haben, und Diisocyanate, dargestellt durch die folgende Formel (III): worin Y, m und n die vorstehende Definition haben.

4. Adsorptionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die porösen Chitosan-Körner einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,1 bis 3 mm haben.

5. Adsorptionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die porösen Chitosan-Körner Poren mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,05 bis 3 µm haben.

6. Adsorptionsmittel nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Brückengruppe eine Kombinationsgruppe darstellt, in welche durch Reaktion mit einem Alkandicarbonsäureanhydrid mit 4 bis 16 Kohlenstoffatomen eine Carboxylgruppe eingeführt worden ist.

7. Adsorptionsmittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil der Carboxylgruppen 0,01 bis 2,0 mMol pro g der porösen Chitosan-Körner beträgt.

8. Adsorptionsmittel nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß alle Aminogruppen, mit Ausnahme der Aminogruppen, an welche Protein A oder Lectin über die die Carboxylgruppe aufweisende Kombinationsgruppe gebunden ist, mit einer Acylgruppe, die 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, acyliert sind.

8. Adsorptionsmittel nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des covalent gebundenen Proteins A oder Lectins 1 bis 30 mg pro g der porösen Chitosan-Körner beträgt.

10. Adsorptionsmittel nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil der ω-Carboxyalkanoylgruppen 0,01 bis 2,0 mMol pro g der porösen Chitosan-Körner beträgt.

10. Verfahren zur Adsorption und Entfernung eines Interleukin-2-Inhibitors unter Verwendung eines Adsorptionsmittels nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 9, in welchem Protein A über eine Brückengruppe kovalent an das unvernetzte oder vernetzte Chitosan gebunden ist.

12. Verfahren zur Adsorption einer gewünschten Substanz durch Affinitätschromatographie unter Verwendung des Adsorptionsmittels nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 9.

13. Verfahren zur Adsorption und Entfernung von Immunoglobulin unter Verwendung des Adsorptionsmittels nach einem der Ansprüche 3 bis 5.

14. Verwendung des Adsoprtionsmittels gemäß den Ansprüchen 2 bis 5 und 10 als Trägermaterial für die Chromatographie.