JPS6348451A - クロマトグラフイ−用吸着担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 童呈上二肌里分互 本発明は、アフィニティークロマトグラフィーに利用す
ることのできるクロマトグラフィー用吸着担体に関する
。

孤米公困王 クロマトグラフィー技術の１つとして、アフィニティー
クロマトグラフィーは互いに特異的に相互作用を及ぼし
合う物質対の親和性を利用して分離・精製を行なうもの
であり、例えば生体物質をその生物学的特性即ち分子上
のある特定の化学構造を識別して精製する場合に有用で
ある。

アフィニティークロマトグラフィー用吸着担体（アフィ
ニティーゲル）は、例えば不溶性の担体（マトリックス
）に結合基（スペーサー）を結合させて得られる活性支
持体の前記スペーサーにリガンドを結合させたものであ
り、このリガンドと互いに相互作用を及ぼし合う物質の
組合せを選択して吸着操作を行なう。

リガンドの１つとして、プロティンＡは５ｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓの細胞壁から得られる蛋
白質であるが免疫グロブリンに対して強い吸着を示す性
質を有する為、プロティンＡをリガンドとして結合させ
たアフィニティークロマトグラフィーは免疫機構の関係
した研究の手段として有用なものと考えられている。

例えばプロティンＡをリガンドとし、ＩｇＧを吸着目的
物質とするようなアフィニティーク口マトグラフィーに
よる分離・精製や分析において、前記アフィニティーク
ロマトグラフィー用吸着担体の主構成分である活性支持
体に望まれる性質としては、非特異的吸着が少ないこと
、高い多孔性を有すること、リガンドの結合が容易であ
り固定化可能容量が大きいこと、化学的に安定でｐＨ域
、塩濃度、温度の広範な条件下で十分安定であり体積変
化がないこと、十分な機械的強度と安定性を有し流動特
性が良いこと、生物学的汚染に耐えること、などが挙げ
られる。

従来よりアフィニティークロマトグラフィー用吸着担体
の基材として用いられているセルロース、デキストラン
、ポリアクリルアミド、アガロース等は、必ずしもこれ
ら望まれる性質を具有していない。とりわけ、硬さが不
足した所謂ソフトゲルであるため流動特性が悪く、分離
特性が良くないという重大な欠点を有し、また寿命も短
い。

更に、近年用いられているシリカビーズは、硬さの点で
は満足できるものの、アルカリ性条件下では使用できな
いため、分離条件や溶出・洗浄の条件の選択に大きな制
約が加わるという問題点を有していた。

■が１　しようとする問題点 本発明の目的は、前記従来のクロマトグラフィー用吸着
担体の欠点を克服して、アフィニティークロマトグラフ
ィー用吸着担体に望まれる前述した諸性質を十全に具有
するクロマトグラフィー用吸着担体を提供することにあ
る。

四　占を”するための 本発明によって上記目的を達成し得るクロマトグラフィ
ー用吸着担体が提供される。

即ち、本発明は、キトサン多孔性ビーズであって、該キ
トサンを構成するグルコサミンに基くアミノ基に、また
はキトサン多孔性ビーズを架橋処理したものであって、
該キトサンを構成するグルコサミンに基くアミノ基及び
／または架橋処理剤に基くアミノ基に結合基を介して共
有結合により結合したプロティンＡを含有するキトサン
多孔性ビーズから成ることを特徴とするクロマトグラフ
ィー用吸着担体に関する。

以下、本発明のクロマトグラフィー用吸着担体について
説明する。

本発明に係るキトサン多孔性ビーズは、甲殻類や昆虫類
などの甲皮に含まれるキチンを脱アセチル化処理して得
られるポリグルコサミンより成るものであり、耐酸性を
持たせる為、二官能性試薬、例えばジカルボン酸および
その誘導体、ジアルデヒド、ジイソシアナート等を用い
て架橋処理を施したものも製造されており、例えば粒径
０．１〜３、Ｑｍ、孔径５００〜３０００人の多孔性ビ
ーズとして入手が可能である。このキトサン多孔性ビー
ズは、一般に数μ〜数１０μモル当量／ｇのグルコサミ
ンに基くアミノ基または架橋処理を施したものについて
は架橋処理剤に基くものも含めてアミノ基を有しており
、これらのアミノ基はアルカンジカルボン酸無水物を作
用させることにより、カルボキシル基を有する活性支持
基に変換することができる。

反応の溶媒としては通常水が用いられるが、その他テト
ラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類、酢酸な
どのカルボン酸類、ピリジンなども用いられる。また、
特に触媒は用いないでもよいが、塩酸、硫酸などの酸や
、水酸化ナトリウムや炭酸カリウムなどのアルカリの添
加により反応液のｐＨを調整することもできる。

反応に用いられるアルカンジカルボン酸無水物としては
、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水
物、ピメリン酸無水物、スペリン酸無水物、アゼライン
酸無水物、セバシン酸無水物、１．１０−デカンジカル
ボン酸無水物、１，１２−ドデカンジカルボン酸無水物
、１，１４−テトラデカンジカルボン酸無水物などを例
示することができる。

反応条件については必ずしも制限はないが、−般に次の
ような条件を選択して反応を行なうのが好ましい。

キトサン多孔質ビーズの重量（ａｌとアルカンジカルボ
ン酸無水物の重量（′ｂ）の比； ａ：ｂ＝１：０．０５〜１０、 より好ましくは、 ａ　：　ｂ＝１　：０．１〜３、 反応温度：０〜１５０℃、より好ましくは室温〜１００
℃ 反応時間：１〜６０時間、より好ましくは１〜３０時間
、 反応圧カニ常圧〜ＩＱａｔ＋ｗ、より好ましくは常圧。

反応後の後処理についても特別な要件は無く、濾別、洗
浄等通常行なわれている方法にて適宜実施される。

以上により得られたカルボキシル基を有するキトサン多
孔質ビーズは、次いでモノカルボン酸無水物またはハロ
ゲン化アシルを作用させることにより、残余のアミノ基
をアシル化することができる。

このときの反応の条件は、前述のアルカンジカルボン酸
無水物の場合と同様にして行うことができるが、アシル
化剤としてハロゲン化アシルを用いる場合は溶媒として
は水以外のものを用いた方がよく、また触媒としてはア
ルカリが好ましい。

反応に用いられるモノカルボン酸無水物とじては、無水
酢酸、無水プロピオン酸、無水酪酸などが例示され、ま
たハロゲン化アシルとしては、塩化アセチル、臭化アセ
チル、塩化プロピオニル、塩化ブチリルなどを例示する
ことができる。

カルボキシル基にプロティンＡを共有結合させるに際し
ては、適宜縮合剤や反応試薬などを用いて適当な溶媒下
で行なうことができる。縮合剤や反応試薬としては、例
えばＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、ジシクロへキシル
カルボ”ジイミド、または１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド等々を例示するこ
とができる。また溶媒としては通常水が用いられるが必
要に応じてリン酸や酢Ｍ緩衝液として用いることもでき
、また塩化ナトリウムなどの無機塩類を添加して用いる
ことも可能である。

プロティンＡとの反応条件については必ずしも制限は無
いが、一般に次のような範囲で行なうことが適当である
。

カルボキシル基を結合させた本発明に係るキトサン多孔
質ビーズとプロティンＡの重量比＝１：０．０３〜０．
３、好ましくは１：０．０５〜０．２；反応温度：０℃
〜室温、好ましくは４℃〜室温；反応時間：１ニア２時
間、好ましくは２〜１２時間。

反応後の後処理についても特別な要件は無く、濾別、洗
浄等通常行なわれている方法にて適宜実施される。

発１υ九果 本発明により提供されるクロマトグラフィー用吸着担体
は、前述のアフィニティークロマトグラフィー用吸着担
体として望まれる性質を具備する基剤を用い、これに適
当な結合基を介してプロティンＡを共有結合させたもの
である為、本発明の吸着担体を用いることにより、従来
のフットゲルを用いた吸着担体と同じようなアフィニテ
ィークロマトグラフィー用充填剤として使用できるばか
りでなく、特に耐圧カラムに充填し、加圧下でも充分使
用することができるということは、作業時間を大巾に短
縮させる為、従って分離精製の能率を大きく向上させ得
るという最大の利点が得られるものであり、この利点が
例えば高速液体クロマトグラフィーへの応用や工業用の
分離精製設備への応用を計るには不可欠であることは言
を俟たない。

また、本発明により提供されるクロマトグラフィー用吸
着）旦体は、キトサン多孔質ビーズの有するアミノ基を
完全にアシル化することにより、例えば蛋白質等と接触
する際のイオン的な非特異的吸着をも排除している為、
リガンドと吸着目的物質の選択性を更に高めたものとす
ることができる。

更に、特に、キトサン多孔質ビーズに対し、やはり前記
の如く結合剤を介して化学的に中性で安定な共有結合を
介してプロティンＡを結合させた吸着担体は、例えば、
一般に用いられている臭化シアンやグルタルアルデヒド
を介したアフィニティークロマトグラフィー用吸着担体
などに比して、使用時のリガンドの脱落が無く、また結
合基の長さを任意に調整することが可能である為、リガ
ンドの目的物質に対する吸着能が優れており、更に非特
異的吸着も少ないこと等も併せて本発明により提供され
るクロマトグラフィー用吸着担体の効果は大きい。

叉施史 以下に、本発明のクロマトグラフィー用吸着担体の製造
法について代表的な例を示し、更に具体的に説明する。

但し、これらは説明の為の単なる例示であって、本発明
はこれらに何ら制限されないのは言うまでもない。

実施例１ 粒径０．　Ｉ　Ｎのキトサン多孔性ビーズ（商品名ショ
ウデックスキトバール、芳香族架橋品）に無水グルタル
酸を反応させた後、残アミノ基をアセチル化して得たビ
ーズ（カルボキシル基：乾燥ゲル１ｇ当り０．３５ミリ
モル）１．０ｇを無水ジオキサンで充分洗浄した後、無
水ジオキサン４ｍＡ中に加え、更にＮ−ヒドロキシコハ
ク酸イミド８０ｍｇ及びジシクロへキシルカルボジイミ
ド１４４ｍｇを加えて室温で２時間振盪した。次いでビ
ーズを濾取し無水ジオキサン２０ｔａｌ、メタノール６
　ｍ　ｌ　ｓ冷水３ｍｆｆの順で素早（洗浄した。この
ビーズをプロティンＡｌｏＩＩＩｇの０．０１モル炭酸
水素ナトリウムの水２１１における溶液に加え室温で２
時間振盪後、４℃で１夜放置した。ビーズを濾取し１モ
ル塩化ナトリウム水溶液及び水で洗浄した後、１モルト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　　２ｒｇｌに加え室
温で１時間振盪した後、再びビーズを濾取して水洗した
。

こうして得られた吸着担体は乾燥ビーズ１ｇ当りプロテ
ィンＡを６．　Ｏｔａｇ担持させていることが未反応に
よる回収プロティンＡの量か°ら確かめられた。

試験例１ 実施例で得られた吸着担体を８φＸ５Ｑｗｍのステンレ
ス製カラムに充填し、高速液体クロマトグラフ装置を用
いてヒ）ＩｇＧを分析したところ、図１のようなりロマ
トダラムが得られた。分析条件：溶離液００．０１モル
酢酸ソーダ／塩酸緩衝液ｐＨ７，０、溶離液００．０１
モル酢酸ソーダ／塩酸緩衝液ｐＨ３，０、溶離速度０．
５　ｒｍ　Ｉｌ　／ｍｉｎ　、検出器紫外分光光度計２
８０ｎｍ 試験例２ アシル化されていないアミノ基を含む吸着体を用い試験
例１と同様な方法でヒトＩｇＧの代りにヒト血清を分析
したところ、図２のようなりロマトグラムが得られた。

次いで溶離液■で溶出された分画を再度試験例１のカラ
ムで分析したところ（図３）、溶離液■で溶出されるピ
ークがあった。

これは遊離のアミノ基と非特異的にイオン結合していた
タンパク賞に依るものと思われる。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明によるプロティンＡ吸着体を用いてヒトＩ
ｇＧを分析したものである。 図２はヒト血清をアシル化されていないアミノ基を含む
吸着体で分析したクロマトグラムである。 図３は図２で溶離液■で吸着され溶離液■で溶出された
分画を再度本発明のカラムで分析したクロマトグラムで
ある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. キトサン多孔性ビーズであって、該キトサンを構成する
   グルコサミンに基くアミノ基に、またはキトサン多孔性
   ビーズを架橋処理したものであって、該キトサンを構成
   するグルコサミンに基くアミノ基及び／または架橋処理
   剤に基アミノ基に結合基を介して共有結合により結合し
   たプロテインＡを含有するキトサン多孔性ビーズから成
   ることを特徴とするクロマトグラフィー用吸着担体。