JPS6119485A - プロテア−ゼ吸着体 - Google Patents
プロテア−ゼ吸着体Info
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- JPS6119485A JPS6119485A JP59138924A JP13892484A JPS6119485A JP S6119485 A JPS6119485 A JP S6119485A JP 59138924 A JP59138924 A JP 59138924A JP 13892484 A JP13892484 A JP 13892484A JP S6119485 A JPS6119485 A JP S6119485A
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- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
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- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明のプロテアーゼ吸着体はアフィニティークロマト
グラフィー用の吸着樹脂として利用でき、プロテアーゼ
の精製、特にＴＰＡ（テイッシュプラスミノーゲンアク
チペータ）の精製に有用である。
グラフィー用の吸着樹脂として利用でき、プロテアーゼ
の精製、特にＴＰＡ（テイッシュプラスミノーゲンアク
チペータ）の精製に有用である。
ＴＰＡ精製用のアフィニティークロマトグラフィー用の
吸着樹脂としてフィブリン−セファロース、プラスミン
−セファロースなトカ知うれている。
吸着樹脂としてフィブリン−セファロース、プラスミン
−セファロースなトカ知うれている。
〔発明が解決しようとする問題点〕 ・従来プロテアー
ゼ吸着体は種々知られているが、ＴＰＡの吸着効率、又
は脱離の容易性などにおいて必ずしも満足すべきものと
は言えない。
ゼ吸着体は種々知られているが、ＴＰＡの吸着効率、又
は脱離の容易性などにおいて必ずしも満足すべきものと
は言えない。
本発明者らはＴＰＡの精製につき種々検討した結果、ハ
リルーグリシル−アルギニナール（以下アルギニナール
誘導体という）をリガン 。
リルーグリシル−アルギニナール（以下アルギニナール
誘導体という）をリガン 。
ドとして水不溶性担体に結合させたものがＴＰＡを効果
的に吸着し、又ｐＨを操作するだけで容易に脱着するこ
とを見い出した。
的に吸着し、又ｐＨを操作するだけで容易に脱着するこ
とを見い出した。
本発明は上記知見に基づいて完成されたものである。
本発明のプロテアーゼ吸着体はリガンドとして用いるア
ルギニナール誘導体中のバリンのα−アミノ基が担体と
結合したものであり、Ｌ−ロイペプチンから大量に合成
しうるので、製造が容易であるという利点を有する。
ルギニナール誘導体中のバリンのα−アミノ基が担体と
結合したものであり、Ｌ−ロイペプチンから大量に合成
しうるので、製造が容易であるという利点を有する。
リガンド表して用いるバリル−グリシル−アルギニナー
ルとしてはＤ−バリル−グリシル−ＤＬ−アルギニナー
ルｓ Ｌ ／（リルーグリシル−ＤＬ−アルギニナー
ル、ＤＬ−バリル−グリシル−Ｄ Ｌ−アルギニナール
などがあげられる。
ルとしてはＤ−バリル−グリシル−ＤＬ−アルギニナー
ルｓ Ｌ ／（リルーグリシル−ＤＬ−アルギニナー
ル、ＤＬ−バリル−グリシル−Ｄ Ｌ−アルギニナール
などがあげられる。
本発明で使用される水不溶性担体としては、アルギニナ
ール誘導体中のバリンのα−アミノ基が結合しうろもの
であれば特に制限はなく、例えばメタクリル酸−ジビニ
ルベン論ン共重合体などの酸性イオン交換樹脂、カルボ
キシメチルセルロースなどの酸性基を有するセルロース
誘導体、セファロース、アガロース、デキストランなど
の高分子多糖体にカルボン酸基やスルホン酸基を導入し
たものなどがあげられるが、高分子多糖体が好ましい。
ール誘導体中のバリンのα−アミノ基が結合しうろもの
であれば特に制限はなく、例えばメタクリル酸−ジビニ
ルベン論ン共重合体などの酸性イオン交換樹脂、カルボ
キシメチルセルロースなどの酸性基を有するセルロース
誘導体、セファロース、アガロース、デキストランなど
の高分子多糖体にカルボン酸基やスルホン酸基を導入し
たものなどがあげられるが、高分子多糖体が好ましい。
これらの不溶性担体とアルギニナール誘導体を結合させ
るにはアルギニナール誘導体をジブチルアセタール化し
たものなどアルギニナール部のアルデヒド基が保護され
たアルギニナール誘導体に酸性基を活性化した上記の不
溶性担体と反応させ、その後アルデヒド基の保護基を除
去すればよい。
るにはアルギニナール誘導体をジブチルアセタール化し
たものなどアルギニナール部のアルデヒド基が保護され
たアルギニナール誘導体に酸性基を活性化した上記の不
溶性担体と反応させ、その後アルデヒド基の保護基を除
去すればよい。
不溶性担体中の酸性基の活性化方法としては公知の方法
、例えばアガロースに臭化シアンを作用させる方法、カ
ルボキシアルキル誘導体をスペーサーにもつアガロース
に水溶性カルボジイミドを作用させる方法、ＣＨ−セフ
ァロース（ファルマシア社製）に水溶性カルボジイミド
を作用させる方法などが使用できろ。
、例えばアガロースに臭化シアンを作用させる方法、カ
ルボキシアルキル誘導体をスペーサーにもつアガロース
に水溶性カルボジイミドを作用させる方法、ＣＨ−セフ
ァロース（ファルマシア社製）に水溶性カルボジイミド
を作用させる方法などが使用できろ。
アルデヒド基の保護されたアルギニナール調法
導体と活性化不奏性担体との反応は、例えば水溶性カル
ボジイミドを作用させる場合には、溶媒中、ｐＨ３〜７
、好ましくは４〜６、温度２５〜４５℃、好ましくは３
５〜４０℃で１０〜３０時間、好ましくは１５〜２５時
間反応させればよい。ここで用いる溶媒としてはｐＨ３
〜７を保持できる塩溶液若しくは緩衝液からなる０〜５
０％のジメチルホルムアミド溶液又はジオキサン溶液な
どがあげられる。
ボジイミドを作用させる場合には、溶媒中、ｐＨ３〜７
、好ましくは４〜６、温度２５〜４５℃、好ましくは３
５〜４０℃で１０〜３０時間、好ましくは１５〜２５時
間反応させればよい。ここで用いる溶媒としてはｐＨ３
〜７を保持できる塩溶液若しくは緩衝液からなる０〜５
０％のジメチルホルムアミド溶液又はジオキサン溶液な
どがあげられる。
得られた反応物からアルデヒド基の保護基を除去するに
はｐＨ１〜４、好ましくは２〜３の緩 １衝液中
、温度２０〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃、２４〜
１２０時間、好ましくは４８〜９６時間加水分解すれば
よい。ここで用いる緩衝液としては塩酸、リン酸などの
鉱酸及び酒石酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、酢酸など
の有機酸と、これらのナトリウム、カリウム塩などから
なる組成のものなどがあげられる。
はｐＨ１〜４、好ましくは２〜３の緩 １衝液中
、温度２０〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃、２４〜
１２０時間、好ましくは４８〜９６時間加水分解すれば
よい。ここで用いる緩衝液としては塩酸、リン酸などの
鉱酸及び酒石酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、酢酸など
の有機酸と、これらのナトリウム、カリウム塩などから
なる組成のものなどがあげられる。
以上のような方法によって得られたプロテアーゼ吸着体
を使用して例えばＴＰＡを得るには次のようにすればよ
い。
を使用して例えばＴＰＡを得るには次のようにすればよ
い。
先ず、該吸着体をカラムに充填してｐＨ５〜１０、好ま
しくはｐＨ６〜８とする。この場合イオン強度は特に制
限されないが、０．０２５〜０．５Ｍの緩衝液であらか
じめ平衝化しておくことが好ましい。ここで用いる緩衝
液としては、例えばリン酸ソーダーリン酸、リン酸カリ
ウム−リン酸、酢酸ソーダー酢酸、トリスヒドロキシア
ミノメタン−塩酸などがあげられる。
しくはｐＨ６〜８とする。この場合イオン強度は特に制
限されないが、０．０２５〜０．５Ｍの緩衝液であらか
じめ平衝化しておくことが好ましい。ここで用いる緩衝
液としては、例えばリン酸ソーダーリン酸、リン酸カリ
ウム−リン酸、酢酸ソーダー酢酸、トリスヒドロキシア
ミノメタン−塩酸などがあげられる。
その後ｐＨ５〜１０、好ましくは６−８に調整した粗Ｔ
ＰＡ水溶液を該吸着体、カラムに通して該吸着体にＴＰ
Ａを吸着させる。次いでＴＰＡを吸着した該吸着体を上
記緩衝液で洗浄した後ｐＨ１〜４．好ましくはｐＨ２〜
３の酸溶液、水溶性塩溶液もしくは緩衝液でＴＰＡを溶
出させることにより高純度のＴＰＡ水溶液が得られる。
ＰＡ水溶液を該吸着体、カラムに通して該吸着体にＴＰ
Ａを吸着させる。次いでＴＰＡを吸着した該吸着体を上
記緩衝液で洗浄した後ｐＨ１〜４．好ましくはｐＨ２〜
３の酸溶液、水溶性塩溶液もしくは緩衝液でＴＰＡを溶
出させることにより高純度のＴＰＡ水溶液が得られる。
ここで使用する酸溶液としては例えばクエン酸、酒石酸
、乳酸、コハク酸、酢酸、リン酸、塩酸などの水溶液な
どがあげられる。水溶性塩溶液としては例えば塩化ナト
リウム−塩酸水溶液、塩化カリウム−塩酸水溶液、硫酸
ソーダー硫酸水溶液などがあげられる。又、緩衝液とし
てはリン酸ソーダーリン酸水溶液、リン酸カリウム−リ
ン酸水溶液、クエン酸エクエン酸ナトリウム水溶液、コ
ハク酸−ホウ砂、乳酸−乳酸ナトリウム、酢酸−酢酸ナ
トリウム、酒石酸−酒石酸ナトリウムなどがあげられる
。
、乳酸、コハク酸、酢酸、リン酸、塩酸などの水溶液な
どがあげられる。水溶性塩溶液としては例えば塩化ナト
リウム−塩酸水溶液、塩化カリウム−塩酸水溶液、硫酸
ソーダー硫酸水溶液などがあげられる。又、緩衝液とし
てはリン酸ソーダーリン酸水溶液、リン酸カリウム−リ
ン酸水溶液、クエン酸エクエン酸ナトリウム水溶液、コ
ハク酸−ホウ砂、乳酸−乳酸ナトリウム、酢酸−酢酸ナ
トリウム、酒石酸−酒石酸ナトリウムなどがあげられる
。
なお、本発明方法はカラム式のほか、バッチ式で行って
もよい。
もよい。
本発明の吸着体の製造に用いるアルデヒド基の保護され
たアルギニナール誘導体を製造するには例えば次のよう
にすればよい。すなわち、ロイペプチンを特開昭５５−
３７１８５号記載の方法でロイベプチンジブチルアセク
ールトシタ後、プロナーゼＥを作用させて得られるアル
ギニナールジブチルアセタールを原料とし、これＫＮ−
保護グリシンをペプチド化学で一般的に使用されている
方法、例えば １）酸ハライド法 ２）へ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノ
ール、ペンタクロロフェノールナトを用いる活性エステ
ル法 ３）ジシクロへキシルカルボジイミド、ジメチルアミノ
プロピルカルボジイミドなどを用いるカルボジイミド法 ４）ジフェニルリン酸アジド、Ｎ−エトキシカルボニル
−２−エトキシジヒドロキノリン、Ｎ−エチル−５−７
エニルイソオキサゾリウムー３′−スルホネート６−ク
ロロ−１−ｐ−クロロベンゼンスルホニルオキシペンソ
トリアゾールなどの縮合剤を用いる方法 ５）クロルギ酸エチル、クロルギ酸インブチルなどを用
いる混合酸無水物法 ６）アジド法 などの方法を利用して縮合する。ここで使用されるべ一
保護基としてはベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メト
キシベンジルオキシカルボニル基などの接触還元で除去
できる保護基があげられる。又、縮合に用いられる溶媒
は通常用いられる溶媒で特に差しつかえない。
たアルギニナール誘導体を製造するには例えば次のよう
にすればよい。すなわち、ロイペプチンを特開昭５５−
３７１８５号記載の方法でロイベプチンジブチルアセク
ールトシタ後、プロナーゼＥを作用させて得られるアル
ギニナールジブチルアセタールを原料とし、これＫＮ−
保護グリシンをペプチド化学で一般的に使用されている
方法、例えば １）酸ハライド法 ２）へ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノ
ール、ペンタクロロフェノールナトを用いる活性エステ
ル法 ３）ジシクロへキシルカルボジイミド、ジメチルアミノ
プロピルカルボジイミドなどを用いるカルボジイミド法 ４）ジフェニルリン酸アジド、Ｎ−エトキシカルボニル
−２−エトキシジヒドロキノリン、Ｎ−エチル−５−７
エニルイソオキサゾリウムー３′−スルホネート６−ク
ロロ−１−ｐ−クロロベンゼンスルホニルオキシペンソ
トリアゾールなどの縮合剤を用いる方法 ５）クロルギ酸エチル、クロルギ酸インブチルなどを用
いる混合酸無水物法 ６）アジド法 などの方法を利用して縮合する。ここで使用されるべ一
保護基としてはベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メト
キシベンジルオキシカルボニル基などの接触還元で除去
できる保護基があげられる。又、縮合に用いられる溶媒
は通常用いられる溶媒で特に差しつかえない。
その後接触還元を行ってＮ−保護基を除去し次いで得ら
れたグリシル−アルギニナールジブチルアセタールとＮ
−保護バリンを上記と同様な処理をしてＮ−保護−バリ
ル−グリシル−アルギニナールジブチルアセタールとし
、その後接触還元によりＮ−保護基を除去することによ
りアルデヒド基の保護されたアルギニナール誘導体が得
られる。
れたグリシル−アルギニナールジブチルアセタールとＮ
−保護バリンを上記と同様な処理をしてＮ−保護−バリ
ル−グリシル−アルギニナールジブチルアセタールとし
、その後接触還元によりＮ−保護基を除去することによ
りアルデヒド基の保護されたアルギニナール誘導体が得
られる。
接触還元は、メタノールなどの溶媒中、パラジウム黒な
どを用いて常法で行うことができる。
どを用いて常法で行うことができる。
さら−に加水分解は、メタノール、エタノール、アセト
ン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テトラヒ
ドロフラン、ジオキサンなどの水と混合する溶媒中０．
３規定〜０５規定程度の鉱酸、あるいは、クエン酸、シ
ュウ酸などの有機酸を用いて行えば良い。
ン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テトラヒ
ドロフラン、ジオキサンなどの水と混合する溶媒中０．
３規定〜０５規定程度の鉱酸、あるいは、クエン酸、シ
ュウ酸などの有機酸を用いて行えば良い。
次に本発明を実施例により具体的に説明する。
なお実施例における薄層クロマトグラフィー〇Ｒ，ｆ値
はすべてメルク社製薄層板、シリカゲル６０Ｆ２５４プ
レート０．２５１１１１１１を使用し、展開溶媒ｎ−ブ
タノール；酢酸ブチル：酢酸；水−４：２：１：１で展
開し、測定した。
はすべてメルク社製薄層板、シリカゲル６０Ｆ２５４プ
レート０．２５１１１１１１を使用し、展開溶媒ｎ−ブ
タノール；酢酸ブチル：酢酸；水−４：２：１：１で展
開し、測定した。
旋光度の測定は水銀ランプ５７８ ｎｍで行った。
また化合物の確認はツイールドブソープションマススペ
クトロメトリーで行った。
クトロメトリーで行った。
実施例１． Ｄ−バリル−グリシル−Ｄ、Ｌ−アルギ
ニナールセファロースの調製 り、Ｌ−アルギニナールジブチルアセタールＩＰをＮ、
Ｎ’ニジメチルホルムアミド３（Ｂｌに溶解し、トリエ
チルアミン４３４μｍを加えた。次いテ、Ｎ−ペンジル
オキシカルボニルーグリシンＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル１．１３Ｐを５回に分けて２時間で添加し
、室温で２０時間攪拌を行つた。溶媒を減圧で留去した
後、シリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィー
に附し、ブタノール；、酢酸ブチル：酢酸：水＝４：２
：１：１（ｖ／ｖ）で展開し、Ｒｆｏ、６の坂口試薬陽
性画分を減圧で濃縮し１．０４ψの粉末を得た。
ニナールセファロースの調製 り、Ｌ−アルギニナールジブチルアセタールＩＰをＮ、
Ｎ’ニジメチルホルムアミド３（Ｂｌに溶解し、トリエ
チルアミン４３４μｍを加えた。次いテ、Ｎ−ペンジル
オキシカルボニルーグリシンＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル１．１３Ｐを５回に分けて２時間で添加し
、室温で２０時間攪拌を行つた。溶媒を減圧で留去した
後、シリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィー
に附し、ブタノール；、酢酸ブチル：酢酸：水＝４：２
：１：１（ｖ／ｖ）で展開し、Ｒｆｏ、６の坂口試薬陽
性画分を減圧で濃縮し１．０４ψの粉末を得た。
シリカゲルＴＬＣ；几ｆ Ｏ，６（展開溶媒；同上）〔
α） ５７Ｂ −３”° （Ｃ＝’１．２．メタノール
）得られたＮ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−
Ｄ、Ｌ−アルギニナールジブチルアセタール６４４〜を
３ｃ）ｒｎｌのメタノールに溶解し、パラジウム黒を用
いて４時間接触還元を行った。反応終了後パラジウム黒
を除去し、溶媒を減圧で留去して、グリシル−Ｄ、Ｌ−
アルギニナールジブチルアセタールの粉末３９０ηを得
た。
α） ５７Ｂ −３”° （Ｃ＝’１．２．メタノール
）得られたＮ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−
Ｄ、Ｌ−アルギニナールジブチルアセタール６４４〜を
３ｃ）ｒｎｌのメタノールに溶解し、パラジウム黒を用
いて４時間接触還元を行った。反応終了後パラジウム黒
を除去し、溶媒を減圧で留去して、グリシル−Ｄ、Ｌ−
アルギニナールジブチルアセタールの粉末３９０ηを得
た。
シリカゲ＃ＴＬＣ； Ｒｆ Ｏ，２（同 上 ）上記調
製したグリシル−Ｄ、Ｌ−アルギニナールジブチルアセ
タール３８０ηをＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドＩｏｎ
ｌに溶解し、トリエチルアミン１４０μＩを加えた。次
いでヘーペンジルオキシ力ルボニル”Ｄ−バリンＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル４１８ｍｇを５回に分
けて２時間で添加し、室温で２０時間攪拌を行った。溶
媒を減圧で留去した後、シリカゲルを担体としだカラム
クロマトグラフィーに附し、上記展開溶媒で展開し几ｆ
Ｏ１７の坂口試薬陽性画分を減圧で濃縮し、２１２〜の
粉末を得た。
製したグリシル−Ｄ、Ｌ−アルギニナールジブチルアセ
タール３８０ηをＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドＩｏｎ
ｌに溶解し、トリエチルアミン１４０μＩを加えた。次
いでヘーペンジルオキシ力ルボニル”Ｄ−バリンＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル４１８ｍｇを５回に分
けて２時間で添加し、室温で２０時間攪拌を行った。溶
媒を減圧で留去した後、シリカゲルを担体としだカラム
クロマトグラフィーに附し、上記展開溶媒で展開し几ｆ
Ｏ１７の坂口試薬陽性画分を減圧で濃縮し、２１２〜の
粉末を得た。
〔α〕５ザ：０° （’Ｃ＝０．７ 、酢酸）ＦＤ−Ｍ
Ｓ ；ｍ／ｚ＝５７９ （Ｍ＋、Ｈ）＋得うしたＮ−ベ
ンジルオキシカルボニル−Ｄ−バリルーグリシルーＤ、
Ｌ−アルギニナールジブチルアセクール１３２■を１ｏ
ｍｌのメタノールに溶解し、パラジウム黒を用いて、４
時間接触還元を行った。反応終了後、パラジウム黒を除
去し、溶媒を減圧で留去してＤ−バリル−グリシル−Ｄ
、Ｌ−アルギニナールジブチルアセタールの粉末を１３
８ｍｇ得た。
Ｓ ；ｍ／ｚ＝５７９ （Ｍ＋、Ｈ）＋得うしたＮ−ベ
ンジルオキシカルボニル−Ｄ−バリルーグリシルーＤ、
Ｌ−アルギニナールジブチルアセクール１３２■を１ｏ
ｍｌのメタノールに溶解し、パラジウム黒を用いて、４
時間接触還元を行った。反応終了後、パラジウム黒を除
去し、溶媒を減圧で留去してＤ−バリル−グリシル−Ｄ
、Ｌ−アルギニナールジブチルアセタールの粉末を１３
８ｍｇ得た。
〔α：］ ５Ｈ： ３．９°（Ｃ＝１．５’、メタノ
ール）得うした粉末１００〜を０．１モルモルホリノエ
クンスルホン酸１００ｍ６およびジオキサン１００ｍ１
ｔ））混液に懸濁させ、次いでＣＨ−セファロース０４
Ｂ （ファルマシア社製）７ｏｍｌに加え、 ｐＨを
５に調整した。次いで３７℃の水浴上で攪拌しながら、
全量３ｇ−の水溶性カルボジイミドを５回に分けて２時
間で添加し、さらに２０時間攪拌した。
ール）得うした粉末１００〜を０．１モルモルホリノエ
クンスルホン酸１００ｍ６およびジオキサン１００ｍ１
ｔ））混液に懸濁させ、次いでＣＨ−セファロース０４
Ｂ （ファルマシア社製）７ｏｍｌに加え、 ｐＨを
５に調整した。次いで３７℃の水浴上で攪拌しながら、
全量３ｇ−の水溶性カルボジイミドを５回に分けて２時
間で添加し、さらに２０時間攪拌した。
樹脂をグラスフィルターにうつし、充分に水で洗滌後、
３００Ｍの０．２モルクエン酸ソーダ溶液ｐＨ２，５で
４０°Ｃ１６０時間浸漬させた。次いで緩衝液を除去し
水洗を行い標記樹脂７ｏｍｌを得た。
３００Ｍの０．２モルクエン酸ソーダ溶液ｐＨ２，５で
４０°Ｃ１６０時間浸漬させた。次いで緩衝液を除去し
水洗を行い標記樹脂７ｏｍｌを得た。
ｌＡｉ例２． Ｌ−ハリルーグリシル−Ｄ、Ｌ −ア
ルギニナールセファロースノ調製 実施例１と同様にグリシル−Ｄ、Ｌ−アルギニナールジ
ブチルアセタール３８１ｍｇと、Ｎ−ベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−バリンヘーヒドロキシスクシンイミドエ
ステル４１７＃＋９、トリエチルアミン１５０μｍを用
いｌＯｍＡ’のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中で反応
を行い、実施例１と同様の処理をして、１９９ｍ９のへ
一ベンジルオキシカルボニルーＬ 、＜リルーグリシ
ルーＤ山−アルギニナー 市ルジブチルアセタール
の粉末を得た。
ルギニナールセファロースノ調製 実施例１と同様にグリシル−Ｄ、Ｌ−アルギニナールジ
ブチルアセタール３８１ｍｇと、Ｎ−ベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−バリンヘーヒドロキシスクシンイミドエ
ステル４１７＃＋９、トリエチルアミン１５０μｍを用
いｌＯｍＡ’のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中で反応
を行い、実施例１と同様の処理をして、１９９ｍ９のへ
一ベンジルオキシカルボニルーＬ 、＜リルーグリシ
ルーＤ山−アルギニナー 市ルジブチルアセタール
の粉末を得た。
シリカゲルＴＬＣ； ＲＪ Ｏ，７（同 上 ）〔α
）ｓ： ３．９°（Ｃ＝１．４．メタノール）得られ
た粉末を実施例１と同様に接触還元を行いＬ−バリルＬ
グリシルーＤ、Ｌ−アルギニナールジブチルアセタール
１１５ｒｎｇを得た。
）ｓ： ３．９°（Ｃ＝１．４．メタノール）得られ
た粉末を実施例１と同様に接触還元を行いＬ−バリルＬ
グリシルーＤ、Ｌ−アルギニナールジブチルアセタール
１１５ｒｎｇを得た。
得られた粉末１００ｍｇを用い、実施例１と同様の処理
を行い７０ｒｎｌの標記樹脂を得た。
を行い７０ｒｎｌの標記樹脂を得た。
参考例 Ｄ、Ｌ−アルギニナールジブチルアセタール塩
酸塩の調製 特開昭５５−３７１８５に記載した方法で得られたロイ
ペプチンジブチルアセタール塩酸塩２５Ｐを０．０２モ
ル塩化カルシウムおよび０．０２モル塩化マンガンを含
ｔｒ Ｏ，１モルＮ−エチルモルホリンー塩酸緩衝液（
ｐＨ８，０，１０００ｍ／＋）に懸濁させ次イでプロナ
ーゼＥを１．２５Ｐ添加して３７℃で７２時間攪拌を行
った。反応液をダイヤイオンＨＰ２０■（５００ｍＡ’
）Ｋ通導し、水洗後５０％エタノールで溶出を行い坂口
試薬陽性画分を分取してアルギニナールジブチルアセタ
ール塩酸塩４８２を得た。
酸塩の調製 特開昭５５−３７１８５に記載した方法で得られたロイ
ペプチンジブチルアセタール塩酸塩２５Ｐを０．０２モ
ル塩化カルシウムおよび０．０２モル塩化マンガンを含
ｔｒ Ｏ，１モルＮ−エチルモルホリンー塩酸緩衝液（
ｐＨ８，０，１０００ｍ／＋）に懸濁させ次イでプロナ
ーゼＥを１．２５Ｐ添加して３７℃で７２時間攪拌を行
った。反応液をダイヤイオンＨＰ２０■（５００ｍＡ’
）Ｋ通導し、水洗後５０％エタノールで溶出を行い坂口
試薬陽性画分を分取してアルギニナールジブチルアセタ
ール塩酸塩４８２を得た。
次の実験例から明らかなように本発明の吸着体を利用し
てＴＰＡを精製すると、その比活性の上昇率及び収率と
も良好で、本発明の吸着体はＴＰＡなとのグロテアーゼ
の精製用吸着体としてすぐれたものである。
てＴＰＡを精製すると、その比活性の上昇率及び収率と
も良好で、本発明の吸着体はＴＰＡなとのグロテアーゼ
の精製用吸着体としてすぐれたものである。
実験例 ＴＰＡの精製試験
実施例１に１より調製したＴ、ＰＡ吸着体１ ｍｌをカ
ラムに充填し、２％食塩を含むｐＨ７，０の０，０５モ
ル、リン酸ソーダ緩衝液で充分に緩衝化を行った。
ラムに充填し、２％食塩を含むｐＨ７，０の０，０５モ
ル、リン酸ソーダ緩衝液で充分に緩衝化を行った。
その後７０４単位／ ｍｌのＴＰＡ溶液をカラ、ムに通
過させ、該吸着体にＴＰＡを吸着させた。次いで上記緩
衝液１０ｍ１でカラムを洗滌した後、０．２モルのクエ
ン酸を用いてカラムに吸着したＴＰＡを脱着せしめ、５
００単位の精製ＴＰＡを得た。
過させ、該吸着体にＴＰＡを吸着させた。次いで上記緩
衝液１０ｍ１でカラムを洗滌した後、０．２モルのクエ
ン酸を用いてカラムに吸着したＴＰＡを脱着せしめ、５
００単位の精製ＴＰＡを得た。
（収率７１％）。このものは比活性が５５倍に上昇して
いた。
いた。
Claims (1)
- バリル−グリシル−アルギニナールを水不溶性担体に結
合させたプロテアーゼ吸着体
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59138924A JPS6119485A (ja) | 1984-07-06 | 1984-07-06 | プロテア−ゼ吸着体 |
| US06/749,713 US4708944A (en) | 1984-07-06 | 1985-06-28 | Protease adsorbent and process for purifying TPA utilizing the same |
| DE8585108201T DE3580526D1 (de) | 1984-07-06 | 1985-07-02 | Sorbentmittel fuer protease und verfaren zum reinigen von gewebeplasminogenaktivator mit demselben. |
| EP85108201A EP0167152B1 (en) | 1984-07-06 | 1985-07-02 | Protease adsorbent and process for purifying tpa utilizing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59138924A JPS6119485A (ja) | 1984-07-06 | 1984-07-06 | プロテア−ゼ吸着体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6119485A true JPS6119485A (ja) | 1986-01-28 |
| JPH0362389B2 JPH0362389B2 (ja) | 1991-09-25 |
Family
ID=15233313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59138924A Granted JPS6119485A (ja) | 1984-07-06 | 1984-07-06 | プロテア−ゼ吸着体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4708944A (ja) |
| EP (1) | EP0167152B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6119485A (ja) |
| DE (1) | DE3580526D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0628601U (ja) * | 1992-09-02 | 1994-04-15 | 京都度器株式会社 | 巻 尺 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3827415A1 (de) * | 1988-08-12 | 1990-02-15 | Behringwerke Ag | Peptidderivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| US5676947A (en) * | 1989-02-07 | 1997-10-14 | Boehringer Manneheim Gmbh | Method for treating thromboembolic conditions using thrombolytically active proteins |
| US5227297A (en) * | 1990-04-17 | 1993-07-13 | Smithkline Beecham Corporation | Affinity purification ligands |
| US5141862A (en) * | 1990-04-17 | 1992-08-25 | Smithkline Beecham Corporation | Method of purifying tpa or plasminogen activator using a tripeptide of the formula: -X-Y-argininal wherein X and Y are selected from the group consisting of pro,phe,trp and tyr |
| AU715608B2 (en) * | 1996-03-20 | 2000-02-03 | Morphosys Ag | Purification of tissue plasminogen activator (tPA) |
| US20090123109A1 (en) | 2007-11-09 | 2009-05-14 | Lxdata Inc | Temperature sensor using an optical fiber |
| BR112021023457A2 (pt) * | 2019-07-01 | 2022-01-25 | Basf Se | Composto, uso do composto, composição, e, métodos para preparar a composição e um composto |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3947352A (en) * | 1974-05-31 | 1976-03-30 | Pedro Cuatrecasas | Polysaccharide matrices for use as adsorbents in affinity chromatography techniques |
| CH627783A5 (en) * | 1978-01-01 | 1982-01-29 | Fabre Sa Pierre | Process for the production of a plasminogen activator |
| SU1028679A1 (ru) * | 1981-06-17 | 1983-07-15 | Ордена Ленина институт элементоорганических соединений им.А.Н.Несмеянова | Нитрофенилдисульфидное производное сшитой агарозы в качестве хемосорбента дл изучени белок-белкового взаимодействи и способ его получени |
| US4525465A (en) * | 1983-10-07 | 1985-06-25 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Water-insoluble biospecific absorbent containing argininal derivative |
-
1984
- 1984-07-06 JP JP59138924A patent/JPS6119485A/ja active Granted
-
1985
- 1985-06-28 US US06/749,713 patent/US4708944A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-07-02 DE DE8585108201T patent/DE3580526D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-02 EP EP85108201A patent/EP0167152B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0628601U (ja) * | 1992-09-02 | 1994-04-15 | 京都度器株式会社 | 巻 尺 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0167152A3 (en) | 1986-12-30 |
| JPH0362389B2 (ja) | 1991-09-25 |
| DE3580526D1 (de) | 1990-12-20 |
| EP0167152B1 (en) | 1990-11-14 |
| US4708944A (en) | 1987-11-24 |
| EP0167152A2 (en) | 1986-01-08 |
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