JPS5834179B2 - 蛋白吸着体及び該蛋白吸着体を用いるウロキナ−ゼの精製方法 - Google Patents
蛋白吸着体及び該蛋白吸着体を用いるウロキナ−ゼの精製方法Info
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- JPS5834179B2 JPS5834179B2 JP7743878A JP7743878A JPS5834179B2 JP S5834179 B2 JPS5834179 B2 JP S5834179B2 JP 7743878 A JP7743878 A JP 7743878A JP 7743878 A JP7743878 A JP 7743878A JP S5834179 B2 JPS5834179 B2 JP S5834179B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般式
（式中、Ｘはジアルキルアミノ基又はアルキル置換四級
アンモニウム塩を示す。
アンモニウム塩を示す。
）で表わされるアニリン誘導体が水不溶性の担体に間隔
子を介して結合してなる尿中蛋白吸着用吸着体及び該吸
着体を用いるウロキナーゼの精製方法に関するものであ
る。
子を介して結合してなる尿中蛋白吸着用吸着体及び該吸
着体を用いるウロキナーゼの精製方法に関するものであ
る。
人ナロキナーゼは、人尿中に微量存在する酵素で、血栓
症治療薬、抗ガン剤併用薬として繁用されている。
症治療薬、抗ガン剤併用薬として繁用されている。
このウロキナーゼは静注薬として用いられることから、
高純度のものが要求されている。
高純度のものが要求されている。
近年、酵素の分画精製法として、長鎖メチレン基、芳香
族環等の疎水性基と酵素蛋白の疎水性領域との相互作用
を利用したハイドロホービッククロマトグラフィー（ｈ
ｙｄｒｏｈｏｂｉｃ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
）が注目されている。
族環等の疎水性基と酵素蛋白の疎水性領域との相互作用
を利用したハイドロホービッククロマトグラフィー（ｈ
ｙｄｒｏｈｏｂｉｃ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
）が注目されている。
本発明者らは、尿中蛋白の吸着体について研究を重ねて
来た結果、前記一般式（Ｉ）で表わされるアニリン誘導
体を水不溶性の担体に間隔子を介して結合した疎水性吸
着体が、尿中に含まれる種々の蛋白それぞれに対し異な
った親和性を有することを見出し、その親和性の差異を
巧みに用いることにより特定の蛋白を収率よく、高純度
で得る方法を完成した。
来た結果、前記一般式（Ｉ）で表わされるアニリン誘導
体を水不溶性の担体に間隔子を介して結合した疎水性吸
着体が、尿中に含まれる種々の蛋白それぞれに対し異な
った親和性を有することを見出し、その親和性の差異を
巧みに用いることにより特定の蛋白を収率よく、高純度
で得る方法を完成した。
本発明の方法は酵素の如き操作の如何によって失活し易
い蛋白を精製するのに優れた方法であり尿中に存在する
酵素の一つであるウロキナーゼの単離精製に用いて優れ
た結果が得られる。
い蛋白を精製するのに優れた方法であり尿中に存在する
酵素の一つであるウロキナーゼの単離精製に用いて優れ
た結果が得られる。
本発明で使用される担体としては、前記一般式（Ｉ）で
表わされる基を結合し得る水不溶性のものであればいず
れでもよく、例えば、アガロース、架橋化デキストラン
、セルロース類、寒天等の多糖類、ポリアクリルアマイ
ド等の高分子、その他ガラス粉末等が使用される。
表わされる基を結合し得る水不溶性のものであればいず
れでもよく、例えば、アガロース、架橋化デキストラン
、セルロース類、寒天等の多糖類、ポリアクリルアマイ
ド等の高分子、その他ガラス粉末等が使用される。
本発明の吸着体は、上記の担体に間隔子（スペーサー）
を介して前記一般式（Ｉ）で示されるアニリン誘導体を
通常の方法で結合させることによって得られる。
を介して前記一般式（Ｉ）で示されるアニリン誘導体を
通常の方法で結合させることによって得られる。
例えば、アガロースを担体とするときは、臭化シアンで
アガロースを活性化した後、般式（ＩＩ）−ＮＨ（ＣＨ
２）ｎＮＨｃＯｃＨ２ＣＨ，、Ｃ０ＯＨ又はＮＨ（ＣＨ
２）ｎＣＯＯＨで表わされる間隔子を結合させ、該間隔
子を介して前記のアニリン誘導体を結合させることによ
って得られる。
アガロースを活性化した後、般式（ＩＩ）−ＮＨ（ＣＨ
２）ｎＮＨｃＯｃＨ２ＣＨ，、Ｃ０ＯＨ又はＮＨ（ＣＨ
２）ｎＣＯＯＨで表わされる間隔子を結合させ、該間隔
子を介して前記のアニリン誘導体を結合させることによ
って得られる。
前記一般式（ｎ）で示した間隔子としては通常ｎが３〜
１０のものが使用される。
１０のものが使用される。
本発明の方法を実施するには、本発明に係わる吸着体を
カラムに填め、これに人尿に由来する粗ウロキナーゼ含
有液を流下する等の方法により充分吸着体と接触させる
。
カラムに填め、これに人尿に由来する粗ウロキナーゼ含
有液を流下する等の方法により充分吸着体と接触させる
。
この場合、粗ウロキナーゼ含有液の塩濃度を０．２％（
食塩濃度で約０．０３ｍｏｌ）以下にしてウロキナーゼ
を吸着させた後、０．１〜２Ｍの食塩又は他の無機塩溶
液を用いてウロキナーゼを分別溶離させても、また予め
粗ウロキナーゼ含有液の塩濃度を好ましい濃度に調整し
てから吸着体と接触させて不要の蛋白のみを吸着除去し
、ウロキナーゼを通過させて精製してもよい。
食塩濃度で約０．０３ｍｏｌ）以下にしてウロキナーゼ
を吸着させた後、０．１〜２Ｍの食塩又は他の無機塩溶
液を用いてウロキナーゼを分別溶離させても、また予め
粗ウロキナーゼ含有液の塩濃度を好ましい濃度に調整し
てから吸着体と接触させて不要の蛋白のみを吸着除去し
、ウロキナーゼを通過させて精製してもよい。
通常、後者の方法が採用される。
即ち、ウロキナーゼが吸着体に吸着しない為に必要な塩
濃度で、吸着体にウロキナーゼよりも強い親和性を持つ
蛋白が吸着するのを妨げない塩濃度例えば０．２５〜２
Ｍ、のウロキナーゼ含有液を吸着体カラムに流下させ、
ウロキナーゼを含む通過液からウロキナーゼを回収する
。
濃度で、吸着体にウロキナーゼよりも強い親和性を持つ
蛋白が吸着するのを妨げない塩濃度例えば０．２５〜２
Ｍ、のウロキナーゼ含有液を吸着体カラムに流下させ、
ウロキナーゼを含む通過液からウロキナーゼを回収する
。
どちらの方法を採る場合もウロキナーゼ含有液の州は特
に狭い範囲に限定する必要はないが、目的とする酵素が
失活し難い−を選択することが良く、田５．５〜１０、
好ましくは田６〜８．５である。
に狭い範囲に限定する必要はないが、目的とする酵素が
失活し難い−を選択することが良く、田５．５〜１０、
好ましくは田６〜８．５である。
上述の如くして得られた精製ウロキナーゼ含有液を限外
濾過等の方法で脱塩濃縮した後凍結乾燥することにより
高純度のウロキナーゼ粉末を得ることが出来る。
濾過等の方法で脱塩濃縮した後凍結乾燥することにより
高純度のウロキナーゼ粉末を得ることが出来る。
本発明者らは、更に、本発明の蛋白吸着体を用いたウロ
キナーゼの精製法の有利な使用方法について研究した結
果、クロルアニリンが間隔子を介してアガロース等の水
不溶性担体に結合した吸着体即ち、一般式 （式中、ｍは５〜１２の整数を示す。
キナーゼの精製法の有利な使用方法について研究した結
果、クロルアニリンが間隔子を介してアガロース等の水
不溶性担体に結合した吸着体即ち、一般式 （式中、ｍは５〜１２の整数を示す。
）で表わされる基が水不溶性の担体に結合した吸着体と
本発明の吸着体と組み合わせた場合、効率よく、精製効
果を一段と高めることができることを見い出した。
本発明の吸着体と組み合わせた場合、効率よく、精製効
果を一段と高めることができることを見い出した。
該クロルアニリンをリガンドとするウロキナーゼ吸着体
は、本発明の蛋白吸着体と同様、常法により製造するこ
とができる。
は、本発明の蛋白吸着体と同様、常法により製造するこ
とができる。
この方法を実施するにあたっては、粗ウロキナーゼ含有
液を、塩濃度０．０５〜０．５ Ｍ 、 ｐＨ７〜８
．５で、本発明の蛋白吸着体を充填したカラムを通過さ
せ、流出した液を前記のクロルアニリンをリガンドとす
るウロキナーゼ吸着体を充填したカラムに通しウロキナ
ーゼを吸着させる。
液を、塩濃度０．０５〜０．５ Ｍ 、 ｐＨ７〜８
．５で、本発明の蛋白吸着体を充填したカラムを通過さ
せ、流出した液を前記のクロルアニリンをリガンドとす
るウロキナーゼ吸着体を充填したカラムに通しウロキナ
ーゼを吸着させる。
上記塩濃度及び−の緩衝液でカラムを洗浄した後、塩濃
度０．５Ｍ以下、ｐＨ４〜６の溶離液をウロキナーゼを
吸着したカラムに流し、ウロキナーゼを溶出させる。
度０．５Ｍ以下、ｐＨ４〜６の溶離液をウロキナーゼを
吸着したカラムに流し、ウロキナーゼを溶出させる。
溶出した精製ウロキナーゼ含有液を常法によって処理す
ると高純度のウロキナーゼ粉末が得られる。
ると高純度のウロキナーゼ粉末が得られる。
このクロルアニリンをリガンドとするウロキナーゼ吸着
体と同様に弱酸性陽イオン交換樹脂を用いることもでき
る。
体と同様に弱酸性陽イオン交換樹脂を用いることもでき
る。
以下製造例を挙げ本発明の吸着体の製造方法について更
に詳細に説明する。
に詳細に説明する。
製造例 １
セファロース４Ｂ（アガロースをビーズ状にしたもの）
（スウェーデン国、ファルマシア ファインケミカル社
製）１００ｍｌをｐＨ１１において臭化シアンｌｏｇで
１０分間活性化し、次いでｐＨ９，５でε−アミノカプ
ロン酸１．３ｇと４℃で２００時間反応せてセファロー
ス−ε−アミノカプロン酸結合体を合成した。
（スウェーデン国、ファルマシア ファインケミカル社
製）１００ｍｌをｐＨ１１において臭化シアンｌｏｇで
１０分間活性化し、次いでｐＨ９，５でε−アミノカプ
ロン酸１．３ｇと４℃で２００時間反応せてセファロー
ス−ε−アミノカプロン酸結合体を合成した。
この結合体１０ｍＡ’をＮ、Ｎジエチル−Ｐ−フェニレ
ンジアミノ１００１ｎ９を溶かした４０％ジメチルホル
ムアミド水溶液２５ｒｎＩ！中に懸濁させ、−を４．８
に調整しながら攪拌下に縮合剤１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩４００
■を加え、室温下で１８時間反応させた。
ンジアミノ１００１ｎ９を溶かした４０％ジメチルホル
ムアミド水溶液２５ｒｎＩ！中に懸濁させ、−を４．８
に調整しながら攪拌下に縮合剤１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩４００
■を加え、室温下で１８時間反応させた。
反応終了後、４０％ジメチルホルムアミド水溶液、０．
０１Ｎ塩酸、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、０．１ Ｍ
ト＋Ｊス緩衝液（ｐＨ８，０）、１Ｍ塩化ナトリウム水
溶液及び０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５
，０）各１００ｖｔｌで洗浄した後０．ＩＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，５，０，３Ｍ塩化ナトリウム含有） ２５
０ｍｌで洗浄して吸着体（前記一般式におけるＸがジエ
チルアミノ）を得た。
０１Ｎ塩酸、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、０．１ Ｍ
ト＋Ｊス緩衝液（ｐＨ８，０）、１Ｍ塩化ナトリウム水
溶液及び０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５
，０）各１００ｖｔｌで洗浄した後０．ＩＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，５，０，３Ｍ塩化ナトリウム含有） ２５
０ｍｌで洗浄して吸着体（前記一般式におけるＸがジエ
チルアミノ）を得た。
製造例 ２
製造例１に述べた吸着体カラム１０ｍ１に４０％ジメチ
ルホルムアミド水溶液２５ｄ及びヨウ化エチル１．０ｇ
を加え、密栓して５０℃で２０時間攪拌した。
ルホルムアミド水溶液２５ｄ及びヨウ化エチル１．０ｇ
を加え、密栓して５０℃で２０時間攪拌した。
次いで水酸化ナトリウム水溶液でｐｌ−１１０に調整し
室温下で５時間保持した。
室温下で５時間保持した。
反応終了後４０％ジメチルホルムアミド水溶液、０．０
１Ｎ塩酸、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、０．１ Ｍ ト
ＩＪス緩衝液（ｐＨ８，０）、１Ｍ塩化ナトリウム水溶
液及び０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，
０）各１００ｒｎｌで洗浄した後、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７−５ｙＯ９３Ｍ塩化ナトリウム含有）２５０
ｍｌで洗浄して吸着体（前記一般式におけるＸがトリエ
チルアンモニウム）を得た。
１Ｎ塩酸、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、０．１ Ｍ ト
ＩＪス緩衝液（ｐＨ８，０）、１Ｍ塩化ナトリウム水溶
液及び０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，
０）各１００ｒｎｌで洗浄した後、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７−５ｙＯ９３Ｍ塩化ナトリウム含有）２５０
ｍｌで洗浄して吸着体（前記一般式におけるＸがトリエ
チルアンモニウム）を得た。
次に実施例を挙げて本発明の精製方法についてさらに詳
細に説明する。
細に説明する。
実施例 １
製造例１で得られた吸着体をカラムに填め、セライト（
商品名）を吸着剤として人尿から得た粗ウロキナーゼ溶
液３０ｒｒＬｌ（ウロキナーゼ５Ｘ１０’国際単位含有
、比活性５，０００国際単位７噂蛋白）を流下させ、続
いて１５０ｍ７の０．３ＭＮａＣＡ’を含む０．１ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，５）を流下した。
商品名）を吸着剤として人尿から得た粗ウロキナーゼ溶
液３０ｒｒＬｌ（ウロキナーゼ５Ｘ１０’国際単位含有
、比活性５，０００国際単位７噂蛋白）を流下させ、続
いて１５０ｍ７の０．３ＭＮａＣＡ’を含む０．１ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，５）を流下した。
最後に６Ｍ尿素水溶液を流下した。
流出液の吸光度（２８０ｎｍ）及びウロキナーゼ活性は
第１図に示す。
第１図に示す。
０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液分画を集めメンブレンフィ
ルターで脱塩濃縮後凍結乾燥を行い精製ウロキナーゼ粉
末を得た。
ルターで脱塩濃縮後凍結乾燥を行い精製ウロキナーゼ粉
末を得た。
ウロキナーゼ回収率９６％、比活性２７，０００国際単
位／■蛋白であった。
位／■蛋白であった。
実施例 ２
Ｎ、Ｎ−ジエチル−Ｐ−フェニレンジアミンの代りにＮ
、Ｎ−ジメチル−Ｐ−フェニレンジアミンを使用し製造
例１に記載した方法で吸着体を合或し、実施例１と同様
の条件で粗ウロキナーゼ溶液を処理し精製ウロキナーゼ
粉末を得た。
、Ｎ−ジメチル−Ｐ−フェニレンジアミンを使用し製造
例１に記載した方法で吸着体を合或し、実施例１と同様
の条件で粗ウロキナーゼ溶液を処理し精製ウロキナーゼ
粉末を得た。
回収率９３％、比活性２６，０００国際単位／■蛋白で
あった。
あった。
実施例 ３
製造例２で得られた吸着体をカラムに詰め、以下実施例
１と同様の条件で粗ウロキナーゼ溶液を処理し、精製ウ
ロキナーゼ粉末を得た。
１と同様の条件で粗ウロキナーゼ溶液を処理し、精製ウ
ロキナーゼ粉末を得た。
回収率９５％、比活性２８，０００国際単位／■蛋白で
あった。
あった。
実施例 ４
Ｎ、Ｎ−ジエチル−Ｐ−フェニレンジアミンの代りにＮ
、Ｎ−ジ−ｎ−ブチル−Ｐ−フェニレンジアミンを使用
し製造例１に記載した方法で吸着体を合或し、（１００
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＩ″１７．５）２５０ｍｌで洗浄
した。
、Ｎ−ジ−ｎ−ブチル−Ｐ−フェニレンジアミンを使用
し製造例１に記載した方法で吸着体を合或し、（１００
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＩ″１７．５）２５０ｍｌで洗浄
した。
かくして得られた吸着体をカラムに填め、セライトを吸
着体として人尿から得た粗ウロキナーゼ（ＩＸＩＯ’国
際単位含有、比活性５，０００国際単位／ｒｎ９蛋白質
）を２０ｍ１の０．００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５
）に溶かした液を流下させ、次いで２０１１Ｌｌの０．
００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）、４０−の０．２
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５ＭＩＪン酸緩衝液（
ｐＨ７，５）、４０ｍＡ！の０．４ Ｍ塩化ナトリウム
を含む０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）、６０ｒｒ
Ｌｌの０．３ Ｍ塩化ナトリウムを含む０，１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ４，０）、更に３０ｍ１の６Ｍ尿素水溶液（
ｐＨ４，０）の順に流下した。
着体として人尿から得た粗ウロキナーゼ（ＩＸＩＯ’国
際単位含有、比活性５，０００国際単位／ｒｎ９蛋白質
）を２０ｍ１の０．００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５
）に溶かした液を流下させ、次いで２０１１Ｌｌの０．
００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）、４０−の０．２
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５ＭＩＪン酸緩衝液（
ｐＨ７，５）、４０ｍＡ！の０．４ Ｍ塩化ナトリウム
を含む０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）、６０ｒｒ
Ｌｌの０．３ Ｍ塩化ナトリウムを含む０，１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ４，０）、更に３０ｍ１の６Ｍ尿素水溶液（
ｐＨ４，０）の順に流下した。
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４，０）によって溶離されたウロキナーゼ活性分画を
集め、メンブレンフィルターで脱塩濃縮後凍結乾燥を行
い精製ウロキナーゼ粉末を得た。
Ｈ４，０）によって溶離されたウロキナーゼ活性分画を
集め、メンブレンフィルターで脱塩濃縮後凍結乾燥を行
い精製ウロキナーゼ粉末を得た。
ウロキナーゼ回収率９４％、比活性３５．０００国際単
位／■蛋白質であった。
位／■蛋白質であった。
応用例 １
セファロース４Ｂ１００ｍｌをｐＨ１１において臭化シ
アン１０ｇで１０分間活性化し、次いでｐＨ９，５でヘ
キサメチレンジアミン５ｇを加え４℃で２００時間反応
せた。
アン１０ｇで１０分間活性化し、次いでｐＨ９，５でヘ
キサメチレンジアミン５ｇを加え４℃で２００時間反応
せた。
反応物を水洗した後、１００ｍ１の水に懸濁させ無水コ
ハク酸１０ｇを加え、水酸化ナトリウム溶液でｐｉ−１
６，０に維持しながら７時間反応させた後、１１の水で
洗浄した。
ハク酸１０ｇを加え、水酸化ナトリウム溶液でｐｉ−１
６，０に維持しながら７時間反応させた後、１１の水で
洗浄した。
かくして得られたサクシニルジアミノへキシルセファロ
ースの１０７７１１を４０％ジメチルホルムアミド水溶
液２５ｍ１に懸濁させ、３−クロルアニリン１３０■を
加え、−を４．８に調整し、攪拌下に１−エチル−３（
３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩４
００■を加え室温下で１８時間反応させた。
ースの１０７７１１を４０％ジメチルホルムアミド水溶
液２５ｍ１に懸濁させ、３−クロルアニリン１３０■を
加え、−を４．８に調整し、攪拌下に１−エチル−３（
３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩４
００■を加え室温下で１８時間反応させた。
反応終了後ゲル体は４０％ジメチルホルムアミド水溶液
、０．０１Ｎ塩酸、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、０．１
Ｍ ｌ−リス緩衝液（ｐＨ８，０）、１Ｍ塩化ナトリ
ウム水溶液及び０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）各１
００ｍ１で洗浄し、３−クロルアニリンをリガンドとす
るウロキナーゼ吸着体を得た。
、０．０１Ｎ塩酸、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、０．１
Ｍ ｌ−リス緩衝液（ｐＨ８，０）、１Ｍ塩化ナトリ
ウム水溶液及び０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）各１
００ｍ１で洗浄し、３−クロルアニリンをリガンドとす
るウロキナーゼ吸着体を得た。
応用例 ２
製造例１の吸着体１０ＴＩＬｌをカラム（以下Ａカラム
と略称する）に充填し、別に応用例１のウロキナーゼ吸
着体１０ＷＬｌをカラム（以下Ｂカラムと略称する）に
充填した。
と略称する）に充填し、別に応用例１のウロキナーゼ吸
着体１０ＷＬｌをカラム（以下Ｂカラムと略称する）に
充填した。
カラム直径０．９２ ｃｍ、長さ１５傭であった。
各カラムを発熱物質を含まない水で洗浄した。
セライトを吸着剤として人尿から得た粗ウロキナーゼ（
ウロキナーゼ１．５Ｘ１０６国際単位含有、比活性７，
０００国際単位／１ｖ蛋白）を発熱性物質を含まない（
以下の試薬及び器具類は全て同じ）０．３Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ＰＨ７，５）
５０ｍｌに溶解し、毎時１０ＴＬｌの流速でＡカラム
に通した。
ウロキナーゼ１．５Ｘ１０６国際単位含有、比活性７，
０００国際単位／１ｖ蛋白）を発熱性物質を含まない（
以下の試薬及び器具類は全て同じ）０．３Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ＰＨ７，５）
５０ｍｌに溶解し、毎時１０ＴＬｌの流速でＡカラム
に通した。
Ａカラムの流出液は直ちにＢカラムに通した。
粗ウロキナーゼ液を通し終ったら、０．３Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５） ２０
０ｍｌをＡカラムに通した。
ウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５） ２０
０ｍｌをＡカラムに通した。
この流出液も直ちにＢカラムに通した。
次にＢカラムに０．３Ｍ塩化すＩ−ＩＪウムを含む０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５） ７０ｍｌを通した。
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５） ７０ｍｌを通した。
更に、Ｂカラムに０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０） １００ｒ７１１．次い
で６Ｍ尿素水溶液を通した。
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０） １００ｒ７１１．次い
で６Ｍ尿素水溶液を通した。
流出液の吸光度（２８０ｎｍ）及びウロキナーゼ活性を
第２図に示す。
第２図に示す。
ウロキナーゼ活性分画を集めダイヤフローフィルター（
アミコン社製）で透析濃縮した後凍結乾燥を行い精製ウ
ロキナーゼ粉末を得た。
アミコン社製）で透析濃縮した後凍結乾燥を行い精製ウ
ロキナーゼ粉末を得た。
ウロキナーゼ回収率８３％、比活性１２４，０００国際
単位／■蛋白質であり発熱物質の含有量は限度以下であ
った。
単位／■蛋白質であり発熱物質の含有量は限度以下であ
った。
応用例 ３
応用例２のＢカラムの代りに弱酸性陽イオン交換樹脂ダ
イヤイオンＷＫＩＯ（商品名）を充填したカラムを用い
、応用例２と同様に粗ウロキナーゼ含有液を処理し、精
製ウロキナーゼ粉末を得た。
イヤイオンＷＫＩＯ（商品名）を充填したカラムを用い
、応用例２と同様に粗ウロキナーゼ含有液を処理し、精
製ウロキナーゼ粉末を得た。
ウロキナーゼ回収率７５％、比活性９４，０００国際単
位／■蛋白質であった。
位／■蛋白質であった。
第１図及び第２図はそれぞれ実施例１及び応用例２にお
ける流出液の吸光度（２８０ｎｍ）とウロキナーゼ活性
とを示す。
ける流出液の吸光度（２８０ｎｍ）とウロキナーゼ活性
とを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １一般式 （式中、Ｘはジアルキルアミノ基又はアルキル置換四級
アンモニウムを示す。 ）で表わされるアニリン誘導体が水不溶性の担体に間隔
子を介して結合してなる尿中蛋白吸着用吸着体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7743878A JPS5834179B2 (ja) | 1978-06-28 | 1978-06-28 | 蛋白吸着体及び該蛋白吸着体を用いるウロキナ−ゼの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7743878A JPS5834179B2 (ja) | 1978-06-28 | 1978-06-28 | 蛋白吸着体及び該蛋白吸着体を用いるウロキナ−ゼの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS557005A JPS557005A (en) | 1980-01-18 |
| JPS5834179B2 true JPS5834179B2 (ja) | 1983-07-25 |
Family
ID=13634016
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7743878A Expired JPS5834179B2 (ja) | 1978-06-28 | 1978-06-28 | 蛋白吸着体及び該蛋白吸着体を用いるウロキナ−ゼの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5834179B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6223473Y2 (ja) * | 1981-06-12 | 1987-06-15 |
-
1978
- 1978-06-28 JP JP7743878A patent/JPS5834179B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS557005A (en) | 1980-01-18 |
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