SU644796A1

SU644796A1 - Способ очистки протеолитических ферментов

Info

Publication number: SU644796A1
Application number: SU762370306A
Authority: SU
Inventors: Валентин Михайлович Степанов; Галина Николаевна Руденская
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Priority date: 1976-06-09
Filing date: 1976-06-09
Publication date: 1979-01-30
Also published as: US4100028A; GB1536386A; SE432612B; SE7706668L

Description

Насто щее изобретение относитс к микробиологической промышленности, в ча-стности к области получени высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов , которые могут быть использованы в медицине, биохимии и пищевой промышленности .

Получение высокоочищенных ферментов основано на применении различных химических способов очистки. Дл этой цели успешно примен етс конообменна хроматографи , в частности дл очистки и выделени протеолитических ферментов - хроматографи на модифицированных силохромах 1. Однако этот метод недостаточно избирателен и не позвол ет решить некоторые технические задачи, например извлечение ферментов с высоким выходом непосредственно из смесей с низкой концентрацией активного фермента, содержащих большое количество неорганических и органических примесей (например, из культуральной жидкости).

В св зи С этим в насто щее врем наиболее перспективным дл избирательной очистки ферментов вл етс мотод аффинной хроматографии, основанный «а сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно св занным с нерастворимым носителем, что

позвол ет раздел ть ферменты на основе их биологической специфичности, а потому достигать более высокой степени очистки по сравнению с видами хроматографической техники.

В насто щее врем наиболее широко выделение ферментов биоспецифической хроматографией ведут с помощью биоспецифиче ских сорбентов, представл ющих собой нерастворимые носители, производные агарозы , активированные бромцианом и ковалентно св занные с лигандами - специфическиМИ дл данного класса ферментов веществами- аналогами субстрата 2, 3.

Известен способ очистки протеолитических ферментов путем биоспецифической сорбции 3.

Биоспецифический сорбент представл ет собой нерастворимый носитель на основе агарозы, в частности активнроваиную бромцианом сефароз) 4В, ковалентно св занную с лигандом - антибиотиком грамицидином С.

Сорбцию ферментов осуществл ют при рН 4,5 с помощью солевого буфера (1М раствор NaCl). При элюировании дл полноты десорбции к солевому буферу добавл етс органический растворитель. Выход ферментов по активности 78%, степень очистки 16 раз.

Данный способ обладает р дом недостатков , обусловленных использованием в качестве лиганда грамицидина С. Грамицидин С сравнительно малодоступен. Синтез сорбента на его основе сонр л ен с значительными трудност ми, св занными с низкой растворимостью лиганда, из-за чего реакцию грамицидина С с активированной бромцианом сефарозой 4В приходитс проводить в растворах с высоким содержанием диметилформамида, который частично разрушает структуру сефарозы. В ходе синтеза сорбента грамицидин С выпадает в осадок, что приводит к снижению выхода конечного продукта и затрудн ет очистку полученного вещества. Кроме того, область применени грамицидина С-сефарозы 4В ограничена некоторыми классами протеиназ и не включает практически важные сериновые протеиназы.

С целью упрощени процесса и повышени выхода ферментов высокой степени чистоты и активности описываетс способ очистки п-ротеолитических ферментов, заключающийс в биоспецифической сорбции растворенных ферментов на нерастворимом носителе:-производном агарозы, в частности сефарозе 4В, активированной бромцианом и ковалентно св занной с лигандом. Отличительным нризнаком данного способа вл етс использование в качестве лиганда антибиотика бацитрацина. Таким образом.

-ОН

+ ШВГ

-ОН

где R-NH2 - антибиотик бацитрацин..

Описываемый способ позвол ет очищать с выходом 75-95% различные протеолитические ферменты с увеличением активности в 2-500 раз в зависимости от чистоты исходного препарата.

Описываемый способ эффективен при извлечении ферментов непосредственно из культуральной жидкости, содержащей окрашенные примеси. С помощью бацитрацин-сефарозы 4В выдел етс бесцветный фермент, причем вследствие избирательности сорбента значительный эффект достигаетс в одностадийном процессе очистки. Кроме того, описываемый биоспецифический сорбент может быть применен дл работы с растворами в широком диапазоне рН (1,8-8,0), что дает возможность использовать его дл выделени протеолитических ферментов различных классов, включа карбоксильные, сериновые, тиоловые, металлопротеиназы и экзопептидазы.

Способ осуществл етс следующим образом .

Раствор неочищенного фермента ввод т в конкакт с биоспецифическим сорбентом бапо изобретению, носителем ферментов служит биоспецифический сорбент «бацитрацин-сефароза 4В.

Антибиотик бацитрацин, используемый в качестве лиганда, представл ет собой природный циклододекапептид, содержап ий три D-аминокислоты. Он вл етс неконкурентным ингибитором р да протеиназ. Этим обусловлено специфическое взаимодействие описываемого сорбента с протеолитическими ферментами различных классов . Бацитрацин легко раствор етс в воде. Наличие в молекуле большого количества реакционноспособных групп дает возможность проводить синтез сорбента в м гких услови х с различными видами активированной сефарозы. В насто щее врем антибиотик бацитрацин вл етс дешевым и легко доступным препаратом, так как в

больших количествах выпускаетс промышленностью дл иснользовани в животноводстве .

В качестве нерастворимого носител иснользуетс агароза или ее производные, такие как различные виды сефарозы. Материал носител нерастворим в услови х использовани .

Сефарозу 4В активируют бромцианом, а затем активированна сефароза реагирует с антибиотиком бацитрацином по б-аминогруппе орнитина по следующей схеме

Л,

,- , 3

-0

цитрацин-сефарозой 4В, использу режим динамической или статической сорбции.. При этом происходит избирательное св зывание протеиназ с нерастворимым носителем . Затем сорбент со св занным белком промывают соответствующим буферным раствором. При этом происходит отделение примесей, в том числе и окрашенных.

В качестве элюентов используют растворы солей различной концентрации. В тех случа х, когда фермент св зываетс с сорбентом настолько прочно, что его не удаетс элюировать, примен растворы солей, к последним добавл ют органические растворители , способствующие более эффективной десорбции.

Очищенный фермент используют в виде раствора или высушивают лиофильно после обессоливани гель-фильтрацией или диализа .

В таблице приведены данные по очистке р да протеиназ на колонке с бацитрацинсефарозой (22 мл); в экспериментах исцользованы коммерческий препарат пепсина свиньи, препараты пепсина лошади и

«карбоксильной протеиназы «аваморина Asp. awamori и неочищенна культуральна жидкость Вас. subtilis, содержаща мутантные формы субтилизина. Количество нанесенного и элюированного белка (графы 2, 3, 7, 8) измерено в мг, а также в условных онтических единицах, т. е. в единицах оптической нлотности при 280 им. Активность

Очистка ферментов на бацитрацин-сефарозе 4В

ферментов (графы 4, 9) -измерена по скорости гидролиза гемоглобина. Степень чистоты ферментных препаратов характеризуетс удельной активностью (графы 5, 6, 10, 11, т. е. количеством единиц активности на количество белка, выраженное в мг (е. а./мг) или оптических единицах (е. а./о. е.).

В графах 12, 13 приведен выход по белку и по активности. Степень очистки (графа 14) определ етс отношением удельной активности исходного раствора фермента.

Пример 1. Получение бацитрацин-сефарозы 4В.

Дл синтеза использованы BrCN-активирова на сефароза 4В («Фармаци , Швеци ) и антибиотик бацитрацин (Serva). К 1 г сухой BrCN-активированной сефарозы 4В добавл ют дистиллированную воду дл набухани , а затем промывают на стекл нном фильтре 200 мл Ю м раствора НС1 в течение 15 мин дл удалени азида натри . Затем сефарозу 4В промывают водой до отрицательной реакции на С1 и помещают в 0,1 М раствор МаНСОз в 0,5 М растворе NaCl, рН 10. К подготовленной таким образом BrCN-активированной сефарозе 4В добавл ют раствор 100 мг (60 мкм) бацитрацина в 5 мл 0,1 М NaHCOs в 0,5 М растворе NaCl, рН 10. Реакцию провод т при комнатной температуре, поддержива рН реакционной смеси в пределах 9,5-10,5. Через 3 ч гель отфильтровывают и промывают раствором 0,1 М NaHCOa в 0,5 М растворе NaCl,pH 10, 0,1 М раствором NaHCOa, дистиллированной водой, а перед опытом - всеми элюирующими растворами. Содержание бацитрацина 2 мкмоль/мл влажного сорбента.

Пример 2. Очистка карбоксильной протеиназы из Asp. awamori на бацитрацинсефарозе 4В.

0,1 М ацетатный буферный раствор с рН 5,0, содержащий неочищенную протеиназу С удельной активностью 3,9 е. а./мг, пропускают через хроматографическую колонку, заполненную бацитрацин-сефарозой 4В. Затем сорбент промывают исходным буфером, активный фермент элюируют 1 м NaCl в том же буфере. Удельна активность аваморина в элюате 30 е. м./мг, выход по активности составл ет 73%.

Пример 3. Очистка пепсина лошади на бацитрацин-сефарозе 4В.

0,1 М ацетатный буферный раствор с рН 1,8-5,6, целесообразно 5,0, содержащий желудочный сок или .неочищенный пепсин лошади с удельной активностью 6,3 е. а./мг, пропускают через хроматографическую колонку , заполненную бацитрацин-сефарозой 4В. Затем сорбент промывают последовательно исходным буфером, 1 М NaCl в том же буфере и 25%-иым изопропанолом в 1 М NaCl, рП 5,0. Собирают изопропанольтом же буфере и 25%-ным изопропанольную фракцию элюата, содержащую активный белок. Удельна активность пепсина в указанной фракции, определенна по методу Ансона, составл ет 46 е. а./о. е. После обессоливани на Сефадексе Г-25 раствор лиофнлизируют. Получают фермент с удельной активностью 60 ед/мг. Выход по активности составл ет 72,6%Пример 4. Очистка субтилизина на бацитрацин-сефарозе 4В.

Культуральна жидкость Вас. subtilis А-50 с рН около 8,0 и удельной активностью 0,018 по синтетическому субстрату - л-нитроанилиду карбобензокси-Ь-аланил-Ьаланил-Ь-лейцина перемешивают в течение 30 мин с бацитрацин-сефарозой 4В, затем сорбент осторожно отфильтровывают н

стекл йном фильтре и промывают 0,1 М фосфатным буферным {заствором с рН 6,0- 8,0, Целесообразно 6,0-6,5, и 1 М NaCl в том же буфере. При этом отдел ютс окрашенные и другие примеси. Промытый сорбент перенос т в хроматографическую колонку; Активный фермент элюируют 25%«ым изопропанолом в 1 М раствора NaCl, рН 7,0. Получают субтилизин с удельной активностью 2,5. Выход по активности 86%.

Claims

1. Способ очистки протеолитических ферментов путем биоспецифической сорбции растворенных ферментов на .нерастворимом носителе - произвоДнбм агарозы, активированном бромцианом И ковалентно св занном с лигандом, с последующим элюированием сорбированных ферментов солевыми буферами, отличающийс тем, что, с целью упрощени процесса и повышени выхода ферментов высокой степени чистоты и активности, в качестве носител используют биоспецифический сорбент бацитрацинсефарозу 4В, содержащий в качестве лиганда антибиотик бацитрацин.

2.Способ по п. 1, отличающийс тем, что элюирование фермента производ т с помощью ор-галических растворителей на солевых буферах.

3.Способ по пп. 1 и 2, отличающийс тем, что карбоксильные протеиназы сорбируютс на носителе при рН исходного раствора 1,8-5,6, а элюируютс при использовании буфера с рН 5,0.

4.Способ по пп. 1 и 2, отличающийс тем, что сериновые протеиназы, например субтилнзин, сорбируютс на носителе при рН исходного раствора 6-7,5, а элюируютс при использовании буфера рН 7-7,5.

Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

1.Авторское свидетельство СССР № 551339, кл. С 07G 7/00, 09.09.75.

2.Патент США № 3904478, кл. 195-63, опубл. 09.09.75.

3.Степанов В. М., Лавренойа Г. И., Адли К., Гончар М. В., Баландина Г. Н., Славинска М. М., Стронгин А. Я. Биоспецйфическа хроматографи химозина. «Биохими , 1976, т. 41, вып. 2, 294 (прототип).