KR890001927B1 - 섬유질 헤마글루티닌의 정제방법 - Google Patents

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Abstract

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Description

섬유질 헤마글루티닌의 정제방법
본 발명은 섬유질 헤마글루티닌(이후 "F-HA"로 약칭한다)의 개량된 정제방법에 관한 것이다. 더욱 특별하게는 보르데텔라(Bordetella) 속의 미생물 배양액을 셀룰로오즈 설페이트겔, 덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라미드겔, 또는 교차 결합 폴리사카라이드 설페이트겔과 접촉시켜 겔에 F-HA를 흡착시키고 겔로부터 F-HA를 용출 시킴으로써 고 정제 F-HA를 제조하는 방법에 관한 것이다.
보르데텔라 속의 미생물로는 각종 생물적 활성 물질을 생산하는 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보르데텔라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)가 있다. F-HA는 이들 생물적 활성 물질의 하나이며, 보르데텔라 속의 어떤 미생물도 F-HA를 생산할 수 있다.
최근, F-HA가 비. 페르투시스의 감염 및 그의 감염성 질병의 예방에 주용한 기능을 나타내며, 따라서 비.페르투시스 감염의 예방용 항원으로 유용하다는 것이 밝혀졌다 [Sato, Y. et al. ; Infect. Immun., 31, 1223~1231(1981), Seminars in Infectious Diseases Ⅳ, Bacterial Vaccine, 380~385(1982)]. 그외에도, 보르데텔라 속의 각종 미생물에 의해 제조된 모든 F-HA가 면역적으로 상이하지 않으며[Arai, H. et al. ; Infect. Immun., 32,(1), 243~250(1981)], 따라서, 각 F-HA는 보르데텔라 속의 모든 미생물에 대해 효과적인 백신용 성분으로서 일반적으로 이용될 수 있다는 것이 확인 되었다. 이런 관점에서, 생물적으로 활성인 F-HA를 간단하게 공업적으로 분리 및 정제하는 개량된 방법의 개발이 요구되고 있다.
비. 페르투시스 백양액의 상층액을 황산 암모늄으로 분획화하고, 생성물을 슈크로오즈 밀도 경사 원심 분리한후, 2번 겜 여과 함으로써 F-HA가 분리 및 정제될 수 있다. 는 것은 공지이다. [Sato, Y. et al. ; Infect. Immun., 9, 801(1974)]. 그러나, 이 방법은 여러 단계를 필요로 하기 때문에 매우 복잡하며, 목적하는 F-HA는 단지 저수율로 수득되기 때문에 이 방법은 공업적 규모로 사용될 수 없다.
또한 이온 교환 크로마토그래피 및 겔여과에 의해 비. 페르투시스 F-HA를 정제하는 것이 공지되어 있다. [Arai, H. et al ; Infect. Immun., 25, 460(1979)]. 그러나, 이 방법에 의하면 목적하는 F-HA가 단지 저수율로 수득되며, 불필요한 비. 페르투시스 내독소를 제거하는 것이 매우 곤란하기 때문에 이 방법은 실제로 이용될 수 없다.
다른 공지된 방법으로는 히드록시-인회석 흡착 크로마토그래피, 합토글로빈 친화성 크로마토그래피, 황산암모늄 분획화 및 겔 여과의 배합사용[Cowell, J.L. et al. ; Seminars in Infectious Disease Ⅳ, Bacterial Vaccine, 37, 1(1982)], 및 히드록시 인회석 흡착 크로마토그래피, 특이성 항체-친화성 크로마토그래피 및 슈크로오즈 밀도경사 초원심 분리의 배합사용 [Watanabe et al. ; J. of Bacteriology Japan, 38, 423(1983)]이 있다. 그러나 이들방법은 많은 단계가 필요하여 복잡하며, F-HA가 단지 저수율로 수득된다. 그외에서 사용된 히드록시 인회석이 고가이며, 친화성 크로마토그래피용 겔이 시판되지 않기 때문에 입수가 곤란하며, 겔의 재료 또한 고가이다. 이런 많은 결점 때문에, 상기의 방법은 공업적 규모로 F-HA를 제조하는데 부적합하다.
본 발명자들은 공업적 규모로 F-HA를 분리 및 정제하는 개량된 방법을 광범위하게 연구하고, 보르데텔라속의 미생물 배양액을 셀룰로오즈 설페이트 겔, 덱스트란설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드 겔, 또는 교차 결합된 폴리사카리이드 설페이트 겔과 접촉시켜 F-HA를 겔에 흡착시키고, 불필요한 오염물을 분리해낸 다음, 겔로부터 F-HA를 용출 시킴으로써 목적하는 고정제 F-HA가 수득될 수 있다는 것을 발견하였다.
그러므로, 본 발명의 목적은 생물적 활성이며 의학분야에 유용한 F-HA의 단순한 공업적 정제 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 보르데델라 미생물에 대한 백신용 성분으로 유용한 고정제 F-HA의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 및 기타의 목적 및 이점은 하기의 설명에 의해 명백해질 것이다.
본 발명의 F-HA의 정제 방법은 보르데텔라 속의 미생물 배양액을 셀룰로오즈 설페이트겔, 데스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카리이드 겔, 또는 교차 결합된 폴리사카라이드 설페이트겔로 처리하여 F-HA를 겔에 흡착시키고, 겔로부터 F-HA를 용출시키는 단계를 포함 한다.
보르데텔라 속의 미생물 배양액은 보르데텔라 페르투시스, 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키 셉티카와 같은 보르데텔라 속의 미생물 배양액이다. 바람직한 배양액은 다음과 같이 제조된 보르데텔라 페르투시스의 배양액이다 : 즉, 비. 페르투시스를 코헨-휠러 배지 또는 스테이너- 숄테 배지와 같은 공지의 배지에서 정치 배양, 진탕 배양 또는 교반 배양(이것은 진탕 배양, 통기 배양 및 통기교반 배양의 동의이다)과 같은 통상의 방법으로 배양한다. 배양 브로스를 원심분리하여 세포를 제거한 후, 또는 파쇄하고 원심분리한 후, 또는 통상의 정제 방법에 의해 부분 정제한 후 본 발명에 사용한다. 본 발명에 따라, 배양액의 상층액은 그 자체로 사용될 수 있다. 즉, 염석, 추출, 초원심 분리 등에 의해 미리 정제할 필요가 없으며, 상층액을 직접 셀룰로오즈 설페이트 겔, 덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드겔, 또는 교차 결합된 폴리사카라이드 설페이트 겔으로 크로마토그래피 할 수 있으므로 정제가 단순한 단계로 행해질 수 있다.
본 발명에서 셀룰로오즈 설페이트겔로 사용된 셀룰로오즈의 황산 에스테르는 셀룰로오즈, 바람직하게는 결정성 셀룰로오즈, 또는 결정성 부분 및 비결정성 부분을 갖는 셀룰로오즈를 설페이트화 함으로써 수득된다. 이렇게 수득된 셀룰로오즈의 황산 에스테르는 출발 물질의 원래 형태(바람직하게는 구형)를 잘 유지하며 수성 매질에 불용성이고, 우수한 물리적 안정성을 갖기 때문에 크로마토 그래피의 겔로 적당하다. 이들 출발 셀룰로오즈는 예를들면 시판되는 아비셀(아사히케미칼제. 일본). 설룰로핀 GC-15, GH-25, GC-100 또는 GC-200(치소사제, 일본)이다.
셀룰로오즈의 설페이트화는 공지의 방법. 예를들면 셀룰로오즈의 겔을 유기용매(예. 피리딘)중에서 클로로술폰산, 무수황산 또는 기타 설페이트화제로 처리 함으로써 수행될 수 있다.
덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드겔은 덱스트란 설페이트를 폴리사카라이드겔 유도체에 화학적으로 결합 시킴으로서 제조된다. 덱스트란 설페이트의 각종 생성물은 시판되고 있으며, 그중에서 생물적 목적에 일반적으로 사용되는 생성물이 바람직하다. 폴리사카리이드 겔 유도체는 폴리사카라이드(예. 아가로즈, 덱스트란, 셀룰로오즈 등)를 크로마토그래피용 담체로 사용하기에 적당한 특성을 부여하기 위해 결정화 정제처리, 3차원 교차 결합, 성형 등의 방법과 같이 통상적으로 처리 함으로써 제조된 겔 유도체이다. 이들 생성물 또한 시판되고 있으며, 예를들면 세파로즈(파마시아제, 스웨덴)와 같은 아가로즈겔, 세파덱스(파마시아제, 스웨덴)와 같은 텍스트란겔 및 아비셀(아사히 케미칼제, 일본)과 같은 셀룰로오즈겔이 있다. 텍스트란 설페이트와 폴리사카라이드의 화학적 결합은 각종방법, 예를들면 사아노브로마이드를 사용한 앤더슨 등의 방법(일본국 특허공개공보 제 114018/1977호) 또는 시아노브로마이드 및 리신(스페이서)을 사용한 방법[Bryan M. Turner et al. ; Biochimica et Biophysica, 659, 7-14(1981)]에 의해 수행될 수 있다. 덱스트란 설페이트-아가로즈겔의 한 생성물은 이미 덱스트란 설페이트-세파로즈 CL 4B(파마시아제)로 시판되고 있다.
교차 결합된 폴리사카라이드의 황산 에스테르는 에피클로로히드린, 디클로로히드린, 디브로모히드린, 에틸렌글리콜 비스에폭시프로필에테르와 같은 교차 결합제와 교차 결합된 덱스트란, 셀룰로오즈, 아가로즈와 같은 폴리사카라이드의 황산에스테르이다. 교차 결합된 폴리사카라이드는 시판되고 있으며, 예를들면 세파덱스 G-10, G-25, G-50 및 G-100(파마시아제, 스웨덴)와 같은 교차 결합된 덱스트란, 세파로즈 CL-2B, CL-4B 및 CL-6B(파마시아제)와 같은 교차 결합된 아가로즈, 및 셀룰로핀 GCL-25, GCI-90(치소사제, 일본)과 같은 교차 결합된 셀룰로오즈가 있다. 교차 결합된 폴리사카라이드의 설페이트화는 통상의 방법에 의해, 예를들면 교차 결합된 폴리사카라이드의 겔을 유기용매(예. 피리딘)중에서 클로로 술폰산, 무수황산 또는 기타 설페이트화제로 처리함으로써 수행될 수 있다.
이들 겔에 흡착된 보르데텔라 속의 미생물, 예 비. 페르투시스의 배양액으로부터 F-HA를 분리 및 정제하는 방법은 하기의 방법에 의해 수행된다.
셀룰로오즈 설페이트겔, 덱스트란 설페이트-폴리사카라이드겔 및 교차 결합된 폴리사카라이드 설페이트겔을 중성 pH(예. pH6~9), 약 5~25ms/cm의 비전도도를 갖는 적당한 완충액(예. 0.2M 염화나트륨이 첨가된 0.01M 인산 완충액)으로 미리 평형시키고, F-HA의 흡착을 위해 사용한다.
F-HA를 셀룰로오즈 설페이트겔 또는 기타 겔에 흡착시키고, F-HA가 흡착된 겔을 세척한 후, F-HA를 용출 시키는 정제 처리는 배치 방법 또는 컬럼 방법과 같은 공업적, 통상적으로 이용되는 방법에 의해 수행될 수 있다. 배치방법의 경우, 셀룰로오즈 설페이트 겔 또는 기타 겔을 비. 페르투시스의 배양 상충액에 가하고, 혼합물을 pH 6.0~9.0 및 0°~30℃의 온도에서 10~60 분간 천천히 교반 함으로써 F-HA를 겔에 흡착 시킨다. 상기의 방법에서 사용된 비. 페르투시스의 배양액은 보통 농축 또는 희석 시킴으로서 5.0~25.0ms/cm 범위의 비전도도로 유지 시킨다.
흡착 완결 후, 배양액-겔 혼합물을 필터에 가하고, 겔을 흡인에 의해 여과액으로부터 분리한다. 분리된 겔을 약 5~25ms/m의 비전도도 및 약 5.0~10.0의 pH를 갖는 적당한 완충액(예. 0.2M 염화나트륨을 가한 0.02M 맥일바인 완충액, 0.3M 염화나트륨을 가한 0.01M 인산 완충액, 0.3M 염화나트륨을 가한 0.01M 트리스-HCL 완충액 등)으로 흡인 세척한다. 흡착된 F-HA를 pH 약 5.0~10.0 및 약 25~130ms/cm의 비전도도(상기의 세척용 완충액 보다 큰 비전도도)를 갖는 적당한 완충액(예. 1.5M 염화나트륨을 가한 맥 일바인 완충액, 1.5M 염화나트륨을 가한 인산 완충액등)으로 용출 시킨다.
컬럼 방법의 경우, 처리될 출발용액, 세척용 완충액 및 용출 완충액은 상술한 배치 방법에 사용된 것과 동일하다. 용액의 통과 속도는 약 10ml/cm2/시간~500ml/cm2/시간의 범위로 조절한다.
상기의 정제 방법에 따라, 비. 페르투시스 배양 상층 액중의 F-HA를 특이하게 흡착 시킴으로써, F-HA의 정제도는 수십배가 되며, F-HA의 회수율은 90%이상 내지는 거의 100%가 된다. 그외에도, 정제된 F-HA는 0.9~1.5×105F-HA-Ab-ELISA 단위/mg 단백질[F-HA. ELISA 방법으로 측정, Sato, Y. et al. ; Infect Immun., 41, 313~320(1983)]의 높은 비활성을 가지며, 또한 폴리아클릴아미드 디스크 전기 영동 분석(pH 4.5)에서 단일 밴드를 형성한다. 더우기, 백신으로 사용될 수 있는 정도로 비. 페르투시스 내독소가 거의 완전히 제거된다.
상기의 정제 방법에 따라, 출발 비. 페르투시스의 배양액으로부터 매우 간단한 공정에 의해 고수율 및 고순도로 목적하는 F-HA를 분리할 수 있다. 그 외에도, 크로마토그래피 흡착제는 저가로 제조될 수 있으며, 또한 분해되지 않고 반복해서 사용될 수 있다. 따라서, 이 방법은 경제적인 면에서 매우 우수하다. 그러므로, 상기의 정제 방법은 고정제 F-HA를 제조하는 공업적 방법으로서 매우 우수하다. 필요하다면, 슈크로오즈 밀도경사 초원심분리, 이온 교환 크로마토그래피 등과 같은 공지의 정제 방법을 배합하여 사용할 수 있다.
이렇게 수득된 정제는 F-HA는 매우 순수하며, 어떤 다른 단백질, 지방, 당류 및 불필요한 내독소도 함유하지 않기 때문에 각종 시약, 의약 및 페르투시스 백신을 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 하기의 제법 및 실시예에 의해 상세히 설명되며, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
[제법 1]
피리딘(600ml)에 클로로술폰산(117g)을 0℃ 이하에서 적가한다. 적가후, 혼합물을 65~70℃로 가열한다. 혼합물에 결정성 셀룰로오즈겔(셀룰로핀 GC-15, 치소사제)(80g)을 가하고, 혼합물을 65~70℃에서 3시간동안 교반한다. 반응 후, 반응 혼합물을 냉각시키고, 10% 수산화나튼륨 수용액으로 중화 한다. 수득된 겔을 여과하여 분리하고, 0.01M 인산완충액-수성 염화나트륨 혼합물로 잘 세척하여 셀룰로오즈 설페이트겔을 수득한다.
[제법 2]
피리딘(600ml)에 클로로술폰산(117g)을 0℃ 이하에서 적가한다. 적가후, 혼합물을 65~70℃로 가열한다. 혼합물에 결정성 셀룰로오즈(크로마토그래피용 아비셀, 아사히 케미칼제)(80g)를 가하고, 혼합물을 65~70℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 후, 반응 혼합물을 냉각 시키고, 10% 수성수산화나트륨으로 중화한다. 수득된 겔을 여과에 의해 분리하고, 0.01M 인산 완충액-수성 염화나트륨 혼합물로 잘 세척하여 셀룰로오즈 설페이트겔을 수득한다.
[제법 3]
피리딘(500ml)에 클로로술폰산(82g)을 0~5℃에서 적가한다. 적가후, 혼합물을 65~70℃로 가열한다. 혼합물에 결정성 셀룰로오즈겔(셀룰로핀 GH-25, 치소사제)(80g)을 가하고, 혼합물을 65~70℃에서 4시간동안 교반한다. 반응 후, 반응 혼합물을 냉각 시키고, 10% 수성 수산환나트륨을 점차로 가하여 중화 시킨다. 수득된 겔을 여과하여 분리하고, 0.01M 인산 완충액-수성 염화나트륨 혼합물(pH 7.2)로 잘 세척하여 셀룰로오즈 설페이트겔을 수득한다.
[제법 4]
소듐 덱스트란 설페이트(5g)을 0.5M 수성 탄산나트륨(200ml)에 용해시키고, 여기에 0.5M 수성 탄산 나트륨에 의해 평형된 세파로즈 CL-4B(아가로즈겔, 파마시아, 스웨덴)(20ml)를 가한 후, 혼합물을 잘 교반한다. 혼합물에 증류수(100ml)에 녹인 시아노브로마이드(10g)용액을 교반하면서 가한다. 혼합물에 5M 수성 수산화나트륨을 가하여 pH 11로 유지하면서 15분간 유지 한다. 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반하면서 pH 치를 더 낮게 한다. 반응 후, 반응 혼합물을 유리 필터로 여과하고, 수득된 겔을 0.15M 염화나트륨을 가한 인산 완충액(pH7.2)으로 잘 세척하여 텍스트란 설페이트 아가로즈겔(20ml)을 수득한다.
[제법 5]
피리딘(200ml)에 클로로술폰산(11ml)을 0℃ 이하에서 적가한 후, 혼합물을 65~70℃로 가열한다. 혼합물에 에피클로로히드린-교차 결합 덱스트란(세파덱스 G-50, 파마시아제)(7.5g)을 가하고, 혼합물을 65~70℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 후, 반응 혼합물을 냉각 시키고, 수성 수산화나트륨으로 중화 시킨다. 수득된 겔을 여과하여 분리하고, 0.01M 인산 완충 식염 용액으로 잘 세척하여 교차 결합 덱스트란 설페이트를 수득한다.
[제법 6]
제법 5와 같은 방법으로 제조된 클로로술폰산 및 피리딘의 혼합물(210ml)에 교차 결합된 셀룰로오즈(셀룰로핀 GCL-25, 치소사제, 일본)(7.5g)을 가하고, 혼합물을 60~70℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 후, 반응 혼합물을 냉각 시키고, 수성 수산화나트륨으로 중화 시킨다. 수득된 겔을 여과하여 분리하고, 0.01M 인산 완충 식염 용액으로 잘 세척하여 교차 결합된 셀룰로오즈 설페이트(7.2g)을 수득한다.
[제법 7]
제법 5와 같은 방법으로 제조된 클로로술폰산 및 피리딘의 혼합물(210ml)에 피리딘을 함유한 교차 결합된 아가로즈(세파로즈 CL-6B, 파마시아) 30ml를 가하고, 혼합물을 60~70℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 후, 반응 혼합물을 냉각 시키고, 수성 수산화나트륨으로 중화시킨다. 수득된 겔을 여과하여 분리하고, 0.01M 인산 완충 식염 용액으로 잘 세척하여 교차 결합된 아가로즈 설페이트(23ml)을 수득한다.
[실시예 1]
제법 1과 같은 방법으로 수득된 셀룰로핀 GC-15 설페이트겔을 컬럼(16mmψ×100mm)에 패킹하고, 0.2M염화나트륨이 첨가된 0.01M 인산 완충액(pH8.0, 비전도도 : 약 17.5ms/cm)으로 평형 시킨다. 비. 페르투시스상Ⅰ 도하마 균주의 발효기 뱅양액의 상충액(비전도도 : 약 17.5ms/cm, pH8.0 ; 800ml)을 컬럼에 통과시킨다. 컬럼을 상기의 완충용액으로 잘 세척하여 오염물을 제거한 후, 흡착된 물질을 1.5M 염화나트륨을 가한 인산 완충용액(pH7.6)으로 용출 시켜 F-HA를 함유한 분획(30ml)을 수들한다.
배양 상충액, 통과된 분획, 정제된 F-HA를 함유한 분획의 분석 데이타를 표1에 나타낸다.
F-HA의 회수율은 90%이고, 정제도(정제된 F-HA 분획의 비활성/배양 상층액의 비활성)는 31배이다.
그외에도, 정제된 F-HA 분획의 LPF-HA 활성은 10ELISA 단위/ml 보다 작다 [Hapto-ELISA 방법, Sato Y. et al., Symposium on Toxins, proceeding of the 28th Symposium on Toxins, 141~144(1981)].
[표 1]
Figure kpo00001
(주) : (1) 켈달 방법에 의해 측정된 단백질 질소로 계산 할때 단백질 함량×6.25로 나타낸다.
(2) F-HA-ELISA 단위/mg 단백질로 나타낸다.
(3) 생물적 생성물의 최소 필요, 건강복지회, 일본, #287, 1981에 기재된 방법에 따라 수행된다. 여기서 시험시료는 단백질 함량이 6.25μg/ml가 될 때까지 희석된다.
[실시예 2]
제법 2와 같은 방법으로 수득된 아비셀 설페이트겔을 컬럼(12mmψ×10mm)에 패킹하고, 0.14M 염화나트륨을 가한 0.01M 인산 완충액(pH8.0)으로 평형 시킨다. 비. 페르투시스 상Ⅰ 도하마 균주의 발효기 배양 상층액(비전도도 : 약 10ms/cm, pH8.0 ; 400ml)을 컬럼에 통과 시킨다. 상기와 같은 완충용액으로 컬럼을 잘 세척하여 오염물을 제거한 후, 흡착된 물질을 1.5M 염화나트륨을 가한 인산 완충용액(pH7.6)으로 용출시켜 F-HA를 함유한 분획(30ml)을 수득한다.
배양 상층액, 통과된 분획, 정제된 F-HA를 함유한 분획의 분석 데이타는 표 2에 나타낸다.
F-HA의 회수율은 91%이며, 정제도는 11배이다.
[표 2]
Figure kpo00002
(주) : 주 (1), (2) 및 (3)은 표 1에서와 같다.
[실시예 3]
제법 3과 같은 방법으로 수득된 셀룰로핀 GH-25 설페이트겔을 컬럼(16mmψ×100mm)에 패킹하고, 0.2M 염화나트륨을 가한 0.01M 인산 완충액(pH8.0)으로 평형 시킨다. 비. 페르투시스 상Ⅰ 도하마 균주의 발효기 배양액의 상층액(비전도도 : 약 17.5ms/cm, pH8.0 ; 800ml)을 컬럼에 통과 시킨다. 상기와 같은 완충용액으로 컬럼을 잘 세척하여 오염물을 제거한 후, 흡착된 물질을 1.5M 염화나트륨을 가한 인산 완충용액(pH7.6)으로 용출시켜 F-HA를 함유한 분획(30ml)을 수득한다.
배양 상층액, 통과된 분획 및 정제된 F-HA를 함유한 분획의 분석 데이타는 표 3에 나타낸다.
F-HA의 회수율은 94%이고, 정제도는 30배이다. 생물적 생성물의 최소 필요 "페르투시스 백신"(Notification of the Pharmaceutical Affairs Bureau, Ministry of Health and Welfare, Japan #287, 1981)에 기재된 방법에 따라 정제된 생성물을 생쥐 체중-감소 독성 시험, 생쥐 백혈구-증가 독성 시험, 열-불안정 독성으로부터의 유리 시험, 및 생쥐 히스타민 민감 독성 시험한다. 그 결과, 모든 시험에서 정제된 생성물은 대조군(생리 식염수 사용)과 같았으며, 이것은 어떤 부작용도 없다는 것을 나타낸다.
[표 3]
Figure kpo00003
(주) : 주 (1), (2) 및 (3)은 표 1에서와 같다.
[실시예 4]
제법 4와 같은 방법으로 수득된 덱스트란 설페이트 아가로즈겔을 컬럼(16mmψ×100mm)에 패킹하고, 0.2M 염화 나트륨을 가한 0.01M 인산 완충액(pH8.0, 비전도도 : 약 17.5ms/cm)으로 평형 시킨다. 비. 페르투시스 상Ⅰ 도하마 균주의 발효기 배양액의 상층액(비전도도 : 약 17.5ms/cm, pH8.0 ; 800ml)을 컬럼에 통과 시킨다. 상기와 같은 완충용액으로 컬럼을 잘 세척하고, 0.20M 염화나트륨을 가한 인산 완충액(pH8.0, 비전도도 : 약 17.5ms/cm)으로 세척하여 오염물을 제거한 후, 흡착된 물질을 1.5M 염화나트륨을 가한 인산 완충용액(pH7.8, 비전도도 : 약 120ms/cm)으로 용출시켜 F-HA를 함유한 분획(29ml)을 수득한다.
배양 상층액, 통과된 분획, 및 정제된 F-HA를 함유한 분획의 분석 데이타는 표 4에 나타낸다.
F-HA의 회수율은 91%이며, 정제도는 13배이다. 그외에도, 정제된 F-HA 분획의 LPF-HA 활성은 10Hp.-ELISA단위/ml 보다 작다 [Hapto-ELISA 방법에 의해 측정, Sato Y. et al., Symposium on Toxins, proceeding of the 28th Symposium on Toxins, 141~144(1981)].
[표 4]
Figure kpo00004
(주) : 주 (1), (2) 및 (3)은 표 1에서와 같다.
[실시예 5]
제4와 같은 방법으로 수득된 덱스트란 설페이트-아가로즈겔(200ml)를 0.2M 염화나트륨을 가한 0.01M 인산 완충액(pH8.0)에 침지 시키고, 반복 경사 분리에 의해 평형 시킨다. 실시예 4에서 사용된 것과 같은 비. 페르투시스 상Ⅰ 도하마 균주의 발효기 배양액의 상층액(비전도도 : 약 17.5ms/cm, pH8.0, 8l)에 겔을 가하고, 혼합물을 4℃에서 약 2시간 동안 교반한다. 혼합물을 유리 필터(70mmψ×150)로 여과하여 겔을 분리한다. 유리 필터의 겔에 0.20M 염화나트륨을 가한 인산 완충액(pH8.0)을붓고 천천히 흡인시키므로써 세척한다. 1.5M 염화나트륨을 가한 인산완충액(pH7.8, 300ml)를 겔에 붓고, 혼합물을 약 15분간 천천히 교반 한 후, 흡인 시켜 정제된 F-HA 분획(300ml)을 수득한다.
배양 상층액, 통과된 분획, 및 정제된 F-HA를 함유한 분획의 분석 데이타는 표 5에 나타낸다.
F-HA의 회수율은 83%이고, 정제도는 19배이다.
[표 5]
Figure kpo00005
(주) : 주 (1), (2) 및 (3)은 표 1에서와 같다.
[실시예 6]
덱스트란 설페이트-세파로즈 CL 4B 겔(파마시아제)을 컬럼(50mmψ×100mm)에 패킹하고, 0.2M 염화나트륨을 가한 0.01M 인산 완충액(pH8.0)으로 평형 시킨다.
비. 페르투시스 상Ⅰ 도하마 균주의 발효기 배양액의 상층액(비전도도 : 17.5ms/cm, pH8.0 ; 8l)을 컬럼에 통과 시킨다. 컬럼을 상기와 같은 완충용액으로 잘 세척하여 오염물을 제거한 후, 흡착된 물질을 1.5M 염화나트륨을 가한 인산 완충용액(pH7.6)으로 용출시켜 F-HA를 함유한 분획(580ml)을 수득한다.
배양 상층액, 통과된 분획, 및 정제된 F-HA를 함유한 분획의 분석 데이타는 표 6에 나타낸다.
F-HA의 회수율은 93%이고, 정제도는 약 50배이다.
생물적 생성물의 최소필요, "페르투시스 백신"(Notification of the Pharmaceutical Affairs Bureau, Ministry of Health and Welfare, Japan #287, 1981)에 기재된 방법에 따라, 정제된 생성물을 생쥐의 체중감소 독성시험, 생쥐의 백혈구 증가 독성시험, 열분안정 독소로부터의 유리시험, 및 생쥐의 히스타민 민감독성 시험한다. 그 결과, 모든 시험에서, 정제된 생성물은 대조군(생리식염수를 사용)과 같았으며, 이것은 어떤 부작용도 관찰되지 않는 다는 것을 나타낸다.
[표 6]
Figure kpo00006
(주) : 주 (1), (2) 및 (3)은 표 1에서와 같다.
[실시예 7]
제법 5와 같은 방법으로 수득된 세파덱스 G-50 설페이트겔을 컬럼 (16mmψ×100mm)에 패킹하고, 0.2M 염화나트륨을 가한 0.01M 인산 완충액(pH8.0, 비전도도 : 약 17.5ms/cm)으로 평형 시킨다. 비. 페르투시스 상Ⅰ 도하마 균주의 발효기 배양액의 상층액(비전도도 : 약 17.5ms/cm, pH7.6 ; 800ml)을 컬럼에 통과 시킨다. 상기와 같은 완충용액으로 세척하여 오염물을 제거 한 후, 흡착된 물질을 1.5M 염화나트륨을 가한 인산완충용액(pH7.6)으로 용출시켜 F-HA를 함유한 분획(30ml)을 수득한다.
배양 상층액, 통과된 분획, 및 정제된 F-HA를 함유한 분획의 분석 데이타는 표 7에 나타낸다.
F-HA의 회수율은 94%이며, 정제도는 35배 이다. 그외에도, 정제된 F-HA 분획의 LPF-HA 활성은 10Hp.-ELISA 단위/ml 보다 작다
[표 7]
Figure kpo00007
(주) : 주 (1), (2) 및 (3)은 표 1에서와 같다.
[실시예 8]
제법 6과 같은 방법으로 수득된 셀룰로핀 GCL-25설페이트겔을 컬럼(16mmψ×100mm)에 패킹하고, 0.14M 염화나트륨을 가한 0.01M 인산 완충액(pH8.0)으로 평형시킨다. 실시예 7에서 사용된 것과 같은 비. 페르투시스 상Ⅰ 도하마 균주의 발효기 배양액의 상층액(비전도도 : 약 10ms/cm, pH8.0 ; 800ml)을 컬럼에 통과 시킨다. 컬럼을 상기와 같은 완충액으로 세척하여 오염물을 제거 한 후, 흡착된 물질을 1.5M 염화나트륨을 가한 인산 완충용액(pH7.6)으로 용출시켜 F-HA를 함유한 분획(30ml)을 수득한다.
배양 상층액, 통과된 분획, 및 정제된 F-HA를 함유한 분획의 분석 데이타는 표 8에 나타낸다.
F-HA의 회수율은 87%이고, 정제도는 26배 이다.
[표 8]
Figure kpo00008
(주) : 주 (1), (2) 및 (3)은 표 1에서와 같다.
[실시예 9]
제법 7과 같은 방법으로 수득된 세파로즈 CL-6B설페이트겔을 컬럼(16mmψ×100mm)에 패킹하고, 0.2M 염화나트륨을 가한 0.01M 인산 완충액(pH8.0)으로 평형시킨다. 실시예 7에서 사용된 것과 같은 비. 페르투시스 상Ⅰ 도하마 균주의 발효기 배양액의 상층액(비전도도 : 약 17.5ms/cm, pH8.0 ; 800ml)을 컬럼에 통과 시킨다. 컬럼을 상기와 같은 완충용액으로 칼럼을 잘 세척하여 오염물을 제거 한 후, 흡착된 물질을 1.5M 염화나트륨을 가한 인산 완충용액(pH7.6)으로 용출시켜 F-HA를 함유한 분획(28ml)을 수득한다.
배양 상층액, 통과된 분획, 및 정제된 F-HA를 함유한 분획의 분석 데이타는 표 9에 나타낸다.
F-HA의 회수율은 84%이고, 정제도는 33배 이다. 그외에도 LPE-HA 활성은 10Hp.-ELISA 단위/ml 보다 작다.
생물적 생성물의 최소필요, "페르투시스 백신"(Notification of the Pharmaceutical Affairs Bureau, Ministry of Health and Welfare, Japan #287, 1981)에 기재된 방법에 따라, 정제된 생성물을 생쥐의 체중 감소 독성 시험, 생쥐 백혈구 증가 독성 시험, 열분안정 독소로부터의 유리시험, 및 생쥐의 히스타민 민감 독성 시험을 한다. 그 결과, 모든 시험에서, 정제된 생성물은 대조군(생리식염수를 사용)와 같았으며, 이것은 어떤 부작용도 관찰되지 않는다는 것을 의미한다.
[표 9]
Figure kpo00009
(주) : 주 (1), (2) 및 (3)은 표 1에서와 같다.

Claims (12)

  1. F-HA-함유 용액을 셀룰로오즈 설페이트겔, 덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드겔 및 교차 결합된 폴리사카리이드 설페이트겔의 군에서 선택된 겔과 접촉시켜 F-HA를 흡착시키고, 흡착된 F-HA를 겔로부터 용출 시킴을 특징으로 하는, 보르데텔라 속의 미생물에 의해 제조된 섬유질 헤마글루티닌(F-HA)의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 셀룰로오즈 설페이트겔, 덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드겔 및 교차 결합된 폴리사카라이드 설페이트겔로부터 선택된 겔을 pH6.9~9.0 및 비전도도 5.0~25.0ms/cm인 완충액으로 처리함으로써 미리 평형시키고, F-HA를 흡착 시키는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 읍착을 pH6.0~8.0, 온도 0°~30℃ 및 비전도도 25.0~130ms/cm의 조건하게 수행하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 겔로부터 F-HA의 용출을 pH5.0~10.0 및 비전도도 25.0~130ms/cm의 완충액으로 세척하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, F-HA가 흡착된 겔을 용출 시키기 전에 pH5.0~10.0 및 비전도도 5.0~25.0ms/cm의 완충액으로 세척하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 출발 F-HA-함유 용액이 보르데텔라 페르투시스의 배양 상층액인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 셀룰로오즈 설페이트가 결정성 셀룰로오즈 및 결정성 부분 및 비결정성 부분을 갖는 셀룰로오즈로부터 선택된 셀룰로오즈의 황산 에스테르인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드겔이 덱스트란 설페이트-아가로즈겔, 덱스트란 설페이트-덱스트란겔 및 덱스트란설페이트-셀룰로오즈겔인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 교차 결합된 폴리사카라이드 설페이트가 교차 결합된 덱스트란 설페이트, 교차 결합된 아가로즈 설페이트 및 교차 결합된 셀룰로오즈 설페이트의 군에서 선택된 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 교차 결합된 덱스트란 설페이트가 에피클로로히드린-교차 결합된 덱스트란 설페이트인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 교차 결합된 아가로즈 설페이트가 에피클로로히드린-교차 결합된 아가로즈 설페이트인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 교차 결합된 셀룰로오즈 설페이트가 에피클로로히드린-교차 결합된 셀룰로오즈 설페이트인 방법.
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