JPS60218326A - 線維状赤血球凝集素の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ボルデテラ属菌が産生する線維状赤血球凝集
素（Ｆ　ｉｌａ＋ｎｅｎｔｏｕｓ　ＨｅｍａＢｌｕｔｉ
ｎｉｎ；以下Ｆ−ＨＡと略称する）の精製方法、さらに
詳しくは、ボルデテラ属菌培養物を、デキストラン硫酸
が化学的に結合されたポリサンカライドデル誘導体（以
下デキストラン硫酸−ポリサッカライドゲルと略称する
）に接触せしめ、Ｆ−ＨＡを吸着させた後、ゲルから溶
出することにより高純度Ｆ−ＨＡを採取する方法に関す
る。

ボルデテラ属に属する微生物としては、百日咳菌、パラ
百日咳菌、気管支敗血症菌等があり、これらは種々の生
物学的活性物質を産生ずる。Ｆ−ＨＡはこれらの生物学
的活性物質の中の１つであり、ボルデテラ属に属する菌
は、いずれもＦ−ＨＡを産生する。

最近になって百日咳菌Ｆ−ＨＡが、百日咳菌の感染およ
び発病の防御において、きわめて重要なる役割を演じて
いることが明らかにされ、百日咳菌感染防御抗原として
注目されるようになったＬＳａｔｏ、　Ｙら；　Ｉｎｆ
ｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　、　３　Ｌ　１２２３−１２３
１（１９８１）、およびＳｅｍ１ｎａｒｓ　１ｎＩｎｆ
ｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ＩＶ、　Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌＶａｃｃｉｎｅ、　、３８０−３８５（１９
８２）］、またさらに、各ボルデテラ属菌のＦ−ＨＡが
免疫学的に同一であることが確認され［Ａｒａｉ、　Ｈ
ら；Ｌｎｆｅｃｔ、ｌｍｌｌ１ｕｎ、　、３２．　（１
）、　２４３−２５０−（１９８１）］、各Ｆ−ＨＡが
ボルデテラ属菌に共通のワクチンコンポーネントとなり
得る可能性も示されている。　このようなことから、医
療上有効な生物学的活性物質であるＦ−ＨＡを簡単にか
つ大量に単離精製する方法の開発が望まれている。

従来知られているＦ−ＨＡの採取精製法としては、百日
咳菌培養上清を硫安分画し、蔗糖密度勾配遠心にかけ、
さらにゲルろ過を２回くり返し百日咳菌Ｆ−ＨＡを得る
方法がある［５ａｔｏｔＹら：Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕ
ｎ、　＋　９＋　８０１（１９７４月。しかしながらこ
の方法は、工程が多く複雑であり、しかもＦ−ＨＡの収
率が低い等の欠点があり、工業的な精製法としては採用
し難い。

また同様に百日咳菌Ｆ−ＨＡを精製した例として、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過による方法［Ａｒ
ａｉ、Ｈら；　ｆｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　＋　２５．
４６０（１９７９）］があるが、この方法によれば、Ｆ
−ＨＡの収率が低いうえに、百日咳菌内毒素の除去が困
難であり、実用には供し難い。

さらに別の例と１７て、ハイドロキシアパタイト吸着ク
ロマトグラフィー、ハブトグロビアン・アフイニティク
ロマトグラフイー、硫安分画、ゲルろ過を組合わせる方
法［Ｃｏｕ＋ｅｌｌ、Ｊ、　Ｌ、ら；Ｓｅｍ１ｎａｒｓ
　ｉｎ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　Ｉ
ＬＢａｃｔｅｒｉａｌ　Ｖａｃｃｉｎｅ、　、　３７　
ｒ　１　（１９８２）］、および八へドロキシアパタイ
ト吸着クロマ［グラフィー、特異抗体・アフイニティク
ロマトグラフイー。

蔗糖密度勾配超遠心を組合わせる方法［液送ら：日本細
菌学雑誌、３８，４２３（１９８３）］があるが、これ
らの方法は工程が非常に長く複雑であるうえに、Ｆ−Ｈ
Ａの収率が低く、さらにハイドロキシアパタイトは高価
であり、また上記において用いられているアフイニティ
クロマトグラ７ゲルは市販されておらず、これらの調製
は非常に手間力！かかるうえに、原材料が非常に高価で
ある。

このような種々の欠点のため、上記方法もＦ−ＨＡの工
業的で安価な採取方法とはなり得ない。

本発明者らは、Ｆ　−ＨＡの工業的な単離精製法を見い
出すべく、種々検討を重ねた結果、ボルデテラ属菌培養
物を、デキストラン硫酸−ポリサッカライドゲルに接触
せしめ、Ｆ−ＨＡを吸着させ、夾雑物質と分離し、ゲル
から溶出することにより、高純度のＦ−ＨＡがｂわめて
簡単にしかも非常に高い収率で得られることを発見し、
本発明を完成するに至った。

すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な生物学的
活性物質であるＦ−ＨＡを、工業的に簡単でかつ大量に
、きわめて高純度にまで精製する方法を提供することに
ある。

本発明は、ボルデテラ属菌培養物を、デキストラン硫酸
−ポリサッカライドゲルに接触せしめ、Ｆ−ＨＡを吸着
させた後、ゲルから溶出することを特徴とするＦ−ＨＡ
の精製方法である。

本発明において、出発材料であるボルデテラ属菌培養物
とは、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌の培養
物を含む。本発明において好ましい培養物は、百日咳菌
培養物であり、百日咳菌を通常の培地、たとえばコーエ
ン・ウィラー培地や、ステナー・ショルテ培地などの液
状培地にて、常法により静置培養または振盪培養もしく
は通気撹拌培養して得られる培養物である。この培養物
は、遠心分離により菌体を除去した培養上清、あるいは
菌体破壊物遠心上清、あるいはこれらの部分精製標品の
形で本発明方法に供される。本発明方法によれば、塩析
、抽出、超遠心等の前段部分精製処理をあえて行なう必
要はなく、培養上清等をそのままデキストラン硫酸−ポ
リサッカライドデル吸着クロマトグラフィーに付すこと
ができ、工程がきわめて簡単である。

本発明において用いられるデキストラン硫酸−ポリサッ
カライドゲルとは、デキストランの硫酸エステル化物を
ポリサッカライドデル誘導体に化学的に結合させたもの
である。このゲルを調製するにあたっては、デキストラ
ン硫酸は種々の製品がすでに市販されており、一般的に
生物関連用として用いられているものを使用することが
で終る。

一方ポリサッ力ライドゲル誘導体とは、アガロース、デ
キストラン、セルロース等のポリサッカライドに、クロ
マトグラフィー担体として用い得るように、通常の結晶
精製処理、三次元架橋処理。

形状成型処理等を施したゲル誘導体であり、これらもす
でに市販されており、例えばアガロースゲルとしてセフ
７０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅｙ　７フルｖシフ社製）
、デキストランデルとしてセファデックス（Ｓ　ｅｐｈ
ａｄｅｘ　、ファルマシア社製）、セルロースゲルとし
てアビセル（旭化成製）等がある。

デキストラン硫酸とポリサッカライドゲルとを化学的に
結合させるには種々の方法があるが、例えば臭化シアン
を用いるアンデルノンらの方法（特開昭５２−１１４０
１８号）や、臭化シアンを用い、スペーサーとしてリジ
ンを介して結合させる方法［Ｂｒｙａｎ　Ｍ、　Ｔｕｒ
ｎｅｒら；　Ｂｉｏｃｌ＋１ｍ１ｃａ　ｅｔＢｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、　６５９．　？−１４（１９８
１）］等の通常よく用いられる方法で行なえばよい。

なお、デキストラン硫酸−アｉｆυ−スプルについては
すでに市販されており、例えばデキストラ　１”（ ン硫酸−セファロースＣＬ４Ｂ、（ファルマシア社製）
がある。

本発明において、デキストラン硫酸−ポリサッカライド
ゲルを用いて、ボルデテラ属菌培養物中のＦ−ＨＡを精
製採取するにあたっては、次のような方法で行なわれる
。

デキストラン硫酸−ポリサッカライドゲルは、あらカル
め例えば０．２Ｍ塩化ナトリウム添加０゜０１　Ｍ　＋
７ン酸緩衝液等の、中性付近のｒｔＨ値（ｐＨ６〜９）
であり、比電導度５−２５　ｍｓ／ｃｍ程度の適当な緩
衝液を用いて平衡化を行なった後に、Ｆ−ＨＡの吸着操
作に供する。

デキストラン硫酸−ポリサッカライドゲルへのＦ−ＨＡ
の吸着、ゲルの洗浄、Ｆ−ＨＡの溶出等一連の精製操作
は、バッチ法およびカラム法等の工業的に通常よく用い
られる繰作方法で行なう。

バッチ法で行なう場合は、ボルデテラ属菌培養物中にデ
キストラン硫酸−ポリサ・ンカライドデルを投入し、ｐ
Ｈ６，０〜９．０程度の範囲において０〜３０℃程度の
温度にて１０〜６０分程度緩く撹拌してＦ−ＨＡを吸着
させる。この際、ボルデテラ属菌培養物の比電導度が５
〜２５ｍ５／ｃｍ程度となるように、適宜濃縮または希
釈して吸着操作に付す。

吸着終了後、培養物−ゲル混合液をろ過器上に充填し、
吸引ろ過してゲルとう液を分離する。分離したゲルを、
比電導度５〜２５ｍ５／ｃｍ程度で、ｐＨが５．０〜１
０．０程度である適当な緩衝液例えば、０．２Ｍ塩化ナ
トリウム添加０．０２Ｍマツキルベン（Ｍｅ　Ｉ　１ｖ
ａｉｎｅ″Ｓ）緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウム添加０
，０１Ｍリン酸緩衝液あるいは０゜３Ｍ塩化ナトリウム
添加０．ＯｌＭ）リス塩酸緩衝液等を注ぎ吸引して洗浄
する。

この後、ｐＨが５．０〜１０．０程度で、比電導度が２
５〜１３０ｍｓ／ａｍ程度である（上記洗浄用緩衝液の
比電導度上り大）適当な緩衝液、例えば１．５Ｍ塩化ナ
トリウム添加マツキルベン緩衝液、１．５Ｍ塩化す）　
＋７ウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着しているＦ−
ＨＡを溶出する。

カラム法にて本発明方法を実施する場合は原材料液、洗
浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバッチ法の場合と同
様でよく、これらの通液速度は、１０ｍ１／ｃｍ２／Ｈ
ｒ〜５００ｍ１／ｃｍ２／Ｈｒ程度に調整して行なうと
よい。

本発明の精製法によれば、デキストラン硫酸−ポリサッ
カライドゲルは、百日咳菌培養物中のＦ−ＨＡの特異的
吸着能にすぐれ、Ｆ−ＨＡの精製度は数十倍に達し、し
かもＦ−ＨＡの回収率は９０％以上１００％近くに達す
る。得られる精製Ｆ−ＨＡの比活性は４〜８×１０４Ｈ
Ａユニット／ｍｇ蛋白質とｂわめて高く、ポリアクリル
アミドディスク電気泳動（ｐＨ４，５）分析において単
１のバンドを形成し、百日咳菌内毒素がほぼ完全に除去
される。

上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料の百日咳
菌培養物から所望のＦ−ＨＡを高収率、高純度に採取す
ることかでと、その繰作もきわめて簡単で、またその精
製用クロマトグラフィー吸着体は、安価に調製でき、し
かもくり返し使用における劣化が全く無く、ぎわめて経
済的にすぐれている。

したがって、本発明方法は高純度Ｆ−ＨＡの工業的精製
法としてきわめてすぐれた方法である。

また本発明の方法は従来の技術である蔗糖密度勾配超遠
心分離法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー法等
と組合わせることも可能であり、その際は従来方法で得
られる結果に比して非常にすぐれた結果を得ることがで
きる。

本発明の方法で得られるＦ−ＨＡは高純度で他の蛋白質
、脂質、糖類等を含まず、また内毒素もほぼ完全に除去
されているため、その生物学的活性吻斗利用した各種試
薬、医薬品の調製、さらに百日咳菌ワクチンの調製に有
用である。

以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。

調製例１ デキストラン硫酸ナトリウム塩５ｇを２００ｍ１の０．
５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、この溶液に、０．
５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液で平衡化させたセファ０−ス
ＣＬ−４−Ｂ　（，７フルマシア・ファインケミカルズ
社製）２０ｍｌを入れゆるやかに撹拌する。撹拌下に、
１００ｍ１の蒸留水に１０ｇの臭化シアンを溶解した液
を加える。反応液に５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加
しつつｐＨを１１に１５分間保持する。その後、ｐＨを
下降するに任せ、室温にて撹拌下１７時間保持する。

反応終了後、グラスフィルター上でろ過し、ゲルを０．
１５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）
で充分に洗浄して、デキストラン硫酸−アガロースゲル
２０ｍ１を得る。

実施例１ 前記調製例１と同梯にして調製したデキストラン硫酸ア
ガロースゲルをカラム（１６＋ｅｍφ×１００１１１１
１１）に充填し、これに２Ｍ塩化ナトリウム添加０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０、比電導度的１７　、５
　＋ｎｓ／ｃｍ）を通渡して平衡化する。このカラムに
百日咳Ｉ相菌東浜株静置培養上清８００ｍｌを希釈して
、比電導度的１７　、５＋ｏｓ／ａｍ　、　ｐＨ８。

０に合わせた液を通液する。通液後、上記緩衝液を通液
してゲルを洗浄し、さらに０．２０Ｍ塩化ナトリウム添
加リン酸緩衝液（ｐＨ８，０、比電導度的１７　、５　
ｌｌ１ｓ／ｃ＋ｎ）を通渡し、夾雑物質を洗ぃ出す。

ついで、１．５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，８、比電導度的１２０ｍｓ／ｃ＋＋＋）で溶出し
、Ｆ−ＨＡを含む両分２９ＩＯ１を得た。

培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−ＨＡ画分の分
析結果を第１表に記す。

Ｆ−ＨＡの回収率は９０％で、精製度（精製Ｆ−ＨＡ画
分の比活性／培養上清の比活性）は１３倍に達した。精
製Ｆ−ＨＡ画分のＬＰＦ−ＨＡ活性は、ハブ）　ＥＬＩ
ＳＡ法［佐藤ら、第２８回毒素シンポジウム予稿集１４
１（１９８１））による分析で１０ＥＬＩＳΔユニツ）
／ｍｌ以下であった。

第１表 １）Ｆ−ＨＡ血球凝集試験［５ａｔｏ、　Ｙ、ｅｔ　ａ
ｔ、Ｉｎｆｅｃｔ。

■關ｕｌＬｖ　７＋９２９（１９７３）］２）キルダー
ル法蛋白窒素測定値Ｘ６，２５により蛋白質含量として
表示 ３）’ＨＡ価／蛋白質含量 ４）５）６．２５μｇ蛋白質／ｎ＋　Ｉの含量に希釈後
、生物学的製剤基準（薬発２８７号、１９８１）に準じ
て実施した。

実施例２ 調製例１と同様にして得られた硫酸デキストラン−アガ
ロースゲル２００ｍ１を０．２Ｍ塩化ナトリウム添加０
．ＯＩＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）に浸漬し、デカ
ンテーションをくり返して平衡化する。このゲルを、実
施例１で用いたものと同一の百日咳菌培養上清８１を希
釈し、比電導度的１７゜５　ｌｌ１ｓ／ｃｍＳｐＨ８、
０に合わせた液に投入し、４℃で約２時間撹拌する。

ついで、この混合液をグラスフィルター（７０ｍｍφＸ
１５０）にかけゲルを濾過分離する。グラスフィルター
上のゲルに０．２０Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液
（ｐＨ８，０）を注ぎ、緩やかに吸引してゲルを洗浄す
る。つぎに、１．５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液
（ｐＨ７，８）３００＋＋＋１を注ぎ、約１５分間緩く
撹拌後、吸引して精製Ｆ−ＨＡ画分３００＋＋＋ｌを得
る。

培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−ＨＡ両分の分
析結果を第２表に記す。　Ｉ Ｐ−ＨＡの回収率は７５％で、精製度は約１８倍に達し
た。

第　２　表 １）！　２）ｌ　３１Ｌ　４）＋　５）　第１表に同じ
実施例３ デキストラン硫酸−セ７アロースＣＬ４Ｂ（ファルマシ
ア社製）をカラム（５０ｎ＋ｍφ×１００ａｌＩ１１）
に充填し、これに０．２Ｍ塩化す）　ＩＪウム添加０．
ＯＩＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）を通渡し平衡化す
る。このカラムに百日咳Ｉ相菌東浜株ファーメンター培
養上清８ｋを希釈して比電導度的１７．５ｍｓ／ｃｍ、
およびｐＨを８．０に調整した液を通液する。通液終了
後、上記緩衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出す。

ついで１．５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（ｐＨ
７，６）で溶出し、Ｆ−ＨＡを含む画分５８０ｎ＋Ｉを
得た。

培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ　−ＨＡ画分の
分析結果を第３表に記す。

Ｆ−ＨＡの回収率は９０％で、精製度は約５０倍に達し
た。またＬＰＦ−ＨＡ活性はｌ０ＥＬＩＳＡユニツ）　
／＋ｎ　Ｉ以下であった。

本精製品を用いて生物学的製剤基準「百日ぜぎワクチン
」（薬発第２８７号、１９８１を参照）に準じ、マウス
体重減少試験、マウス白血球増加試験、易熱性毒素否定
試験およびマウスヒスタミン増感試験を実施したが、い
ずれも、生理食塩水を接種した対照群と同等であり、副
作用は認められなかった。

第　３　表

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ボルデテラ属菌培養物から線維状赤血球凝集素を
   精製取得するに際し、ボルデテラ属菌培養物を、デキス
   トラン硫酸が化学的に結合されたポリサッカライドデル
   誘導体に接触せしめ、線維状赤血球凝集素を吸着させた
   後、ゲルから溶出することを特徴とする線維状赤血球凝
   集素の精製方法。
2. （２）該デキストラン硫酸が化学的に結合されたポリサ
   ッカライドゲル誘導体が、デキストラン硫酸−アがロー
   スゲル、デキストラン硫酸−デキストランデルおよびデ
   キストラン硫酸−セルロースゲルから選ばれる前記第（
   １）項の方法。
3. （３）該デキストラン硫酸が化学的に結合されたポリサ
   ッカライドデル誘導体を、ｐＨ６，９〜９゜０、比電導
   度５．０〜２５　、０　＋ｏｓ／ｃａｎの緩衝液であら
   かじめ処理して平衡化したのち吸着処理に付す、前記第
   （１）または（２）項の方法。
4. （４）該吸着処理を、ｐＨ６，０〜８．０、温度０〜３
   ０℃、比電導度５．０〜２５．０仔ｓ／ｃｎ＋の条件下
   に行なう前記第（１）〜（３）項いずれか１つの方法。
5. （５）線維状赤血球凝集素のゲルからの溶出を、ｐＨ５
   ，０〜１０．０．比電導度２５．０〜１３０ｍ５／ｃ＋
   Ωの緩衝液を用いて行なう前記第（１）〜（４）項いず
   れか１つの方法。
6. （６）該溶出処理に先だって、吸着ゲルを、ｐｌ＋５．
   ０−１０．０、比電導度５，０−２５．０＋＋＋ｓ／ｃ
   ｍの緩衝液で洗浄する前記第（５）項の方法。
7. （７）該ボルデテラ属菌培養物が百日咳菌培養物である
   前記第（１）〜（６）項いずれが１つである方法。