JPS641448B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、百日せき菌が産生するLPF―HA
(Leucocytosis promoting factor
hemagglutinin)の精製方法、さらに詳しくは、
百日せき菌培養物から得られるLPF―HA含有液
を、架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルに接
触せしめ、LPF―HAを吸着させた後、LPF―
HAを該ゲルから溶出することによりLPF―HA
を精製する方法に関する。 産業上の利用分野 LPF―HAは、百日せき菌相菌および相菌
が産生する活性物質であつて、毒力(virulence)
を欠く相菌やパラ百日せき菌・気管支敗血症菌
は産生しない。このLPF―HAは百日せき毒素と
も称され、多様な生理活性を有する蛋白質である
ことが知られている。その主な生理活性として
は、白血球増多活性、インシユリン分泌増強活
性、ヒスタミン増感活性、赤血球凝集活性等が知
られており、なかでも、そのインシユリン分泌増
強活性にもとづいて、糖尿病の治療剤としての応
用が注目されている。 これらの生理活性とは別に、最近になつて百日
せき菌の感染および発病の防御にLPF―HAがき
わめて重要な役割を演じていることが明らかにさ
れ、百日せき菌感染防御抗原としても注目される
ようになつた[Pittman,M;Review of
Infectious Diseases,1,401〜409(1979),お
よびSato,Y;Seminars in Infectious
Diseases IV,Bactreial Vaccine,380〜385
(1982)]。 したがつて、LPF―HAの生理活性を研究する
うえに、またその生理活性を利用した医薬品の製
造のために、さらには副作用のより少ない百日せ
きワクチンを工業的に製造するために、LPF―
HAを簡単にかつ大量に単離精製する方法の開発
が望まれている。 従来技術 従来知られているLPF―HAの採取精製法で
は、百日せき菌培養物を硫安塩析し、ついで抽
出、透析したものを出発材料とし、これをイオン
交換クロマトグラフイー、ゲル過[Arai,
H;Biochimica et Biophysica Aeta,444,
765(1976)]、あるいは蔗糖濃度勾配遠心[Sato,
Y;Infect.Immun.6,897〜704,(1972)]など
によつて精製する方法が採用されている。しかし
ながら、このような方法では、高純度のLPF―
HAを得ることは難しく、またその収量も少な
い。 高純度のLPF―HAを比較的大量に得る方法と
して、百日せき菌培養上清液をハイドロキシアパ
タイトのカラムに通してLPF―HAを吸着させ、
洗浄、溶出後、コンカナバリンA―セフアロース
(ConA―Sepharose,フアルマシア社製)による
アフイニテイクロマトグラフイーで精製する方法
が提案されている。[Yajima,M;J,
Biochem83,295〜303(1978)]。しかしながら、
このコンカナバリンAをリガントとするアフイニ
テイクロマトグラフイーは、LPF―HAのみと親
和性を有するのではなく、糖類や糖脂質、さらに
他の糖蛋白質なども吸着するため、百日せき菌の
他の成分、たとえばF―HA(Filamentous―
Hemagglutinin)や菌体膜成分なども吸着し、所
望のLPF―HAを高純度で単離することが難し
く、優れたアフイニテイクロマトグラフイーとは
いえない。 最近、ヒトハプトグロビンがLPF―HAに特異
的に結合することが発見されて以来、上記の方法
におけるコンカナバリンAの代わりに、このヒト
ハプトグロビンをリガントとして用いるアフイニ
テイクロマトグラフイーでLPF―HAを精製する
方法が試みられている[Irons L;Biochimica
et Biophisica Acta,580,175〜185(1979)お
よびCowell,J;Seminars in Infectious
Diseases IV,Bacterial Vaccine,371〜379
(1982)]。このヒトハプトグロビンをリガントと
して用いる場合には、新たに肝炎ウイルス対策の
重要な問題が生じる。即ち、ヒトハプトグロビン
は人血液から採取されるため、肝炎ウイルス混入
の恐れがある。さらに他の未知の感染性因子混入
の懸念もなおざりにできないことであり、これは
動物血清を用いる場合も同様である。現在のとこ
ろ肝炎ウイルス等の混入をチエツクする絶対的な
方法はない。一方、かかる肝炎ウイルス等を不活
化するための手段として、60℃、10〜15時間加熱
する方法が知られている。本発明者らは、そのよ
うな加熱処理を行うと、ハプトグロビンのLPF
―HAに対する親和性はほとんど喪失され、目的
とする効果がなくなつてしまう重大な欠陥がある
ことを見出した。 また、前記のハイドロキシアパタイトゲルを用
いる精製法でも、ハイドロキシアパタイトが高価
であるために、LPF―HAを工業的にかつ安価に
採取するには問題がある。 発明の目的 本発明者らは、LPF―HAの工業的な単離精製
法を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、百日
せき菌培養物から得られるLPF―HA含有液を、
架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルに接触せ
しめ、LPE―HAを吸着させ、夾雑物質と分離し
た後該架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルか
ら溶出することにより、高純度のLPF―HAがき
わめて簡単にしかも非常に高い収率で得られるこ
とを発見し、本発明を完成するに至つた。 すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な
生物学的活性物質であるLPF―HAを、工業的に
簡単でかつ大量に、きわめて高純度にまで精製方
法を提供することにある。 発明の構成および効果 本発明は、百日せき菌培養物から得られる
LPF―HA含有液を、架橋ポリサツカライド硫酸
エステルゲルに接触せしめ、LPF―HAを吸着さ
せた後、該ゲルからLPF―HAを溶出することを
特徴とするLPF―HAの精製方法である。 本発明において出発材料として用いられる百日
せき菌培養物としては、百日せき相菌を通常の
培地、たとえばコーエン・ウイラー培地や、ステ
ナー・シヨルテ培地などの液状培地にて、常法に
より静置培養または振盪培養もしくは通気攪拌培
養して得られる培養物である。この培養物は、遠
心分離により菌体を除去した培養上清、あるいは
菌体破壊物遠心上清、あるいはこれらの部分精製
標品の形で本発明方法に供される。 本発明で用いられる架橋ポリサツカライド硫酸
エステルとは、デキストラン、セルロース類、ア
ガロースなどのポリサツカライドを、例えばエピ
クロルヒドリン、ジクロルヒドリン、ジブロムヒ
ドリン、エチレングリコールビスエポキシプロピ
ルエーテル等の架橋剤で架橋して得られる架橋ポ
リサツカライド硫酸エステル化して得られるもの
である。架橋ポリサツカライドはすでに市販され
ており、例えば架橋デキストランとしてセフアデ
ツクスG―10、G―25、G―50、G―100(フアル
マシア社製)などがあり、架橋アガロースとして
セフアローズCL―2B、CL―4B、CL―6B(フア
ルマシア社製)などがあり、架橋セルロースとし
てセルロフアインGCL―25、GCL―90(チツソ社
製)などがある。これらのゲルを例えばピリジン
などの有機溶媒の存在下クロルスルホン酸、無水
硫酸などを作用させることにより所望の架橋ポリ
サツカライド硫酸エステルゲルが得られる。 本発明において、架橋ポリサツカライド硫酸エ
ステルゲルを用いて、百日せき菌が産生する
LPF―HAを精製採取するにあたつては、たとえ
ば、次のような方法で行なわれる。 原材料液であるLPF―HA含有液は、百日せき
菌培養物の遠心上清を、蒸留水または緩衝液で比
電導度が0.5〜5.0ms/cmとなるように希釈した
後、吸着操作に付すこともできるが、この上清中
には架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルに対
して同じく親和性を有するF―HA(Filamentous
―hemagglutinin)が含まれているため、あらか
じめ、LPF―HAは吸着せずF―HAを吸着する
条件にて、架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲ
ルによるクロマトグラフイーを行ない(比電導度
5.0〜25.0ms/cm、PH5〜9の緩衝液で平衡化さ
れた架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲル充填
カラムに比電導度5.0〜25.0ms/cm、PH5〜9に
調整した原材料液を通液する)、その素通り画分
であるところのF―HAを含まずLPF―HAを大
量に含んだ画分を吸着操作に付してもよい。 架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルへの
LPF―HAの吸着、ゲルの洗浄、LPF―HAの溶
出等一連の精製操作は、バツチ法およびカラム法
等の工業的に通常よく用いられる操作方法で行な
うことができるが、カラム法の方が操作が簡単で
あり好都合である。カラム法の場合、架橋ポリサ
ツカライド硫酸エステルゲルをカラムに充填し、
あらかじめ例えば0.02Mマツキルベン
(Mcllvaine′s)緩衝液(PH5.2)等の比電導度0.5
〜5.0ms/cmでPHが5.0〜9.0程度である適当な緩
衝液を通液して平衡化を行つた後に、LPF―HA
の吸着操作に移る。 吸着に際しては、LPF―HAの含有液をPHが5.0
〜9.0、比電導度が0.5〜5.0になるように適宜調整
して、架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲル充
填カラムに通液し、LPF―HAを吸着させる。こ
の後、前述の平衡化に用いたのと同様の緩衝液を
通液し、ゲルを洗浄し、夾雑物質を洗い出す。 LPF―HAの溶出に際しては、PHが5.0〜9.0、
比電導度が5.0以上である適当な緩衝液を通液し
溶出を行なうが、好ましくは段階溶出または塩濃
度勾配溶出を行なう。すなわち、原材料液として
百日せき菌培養液の遠心上清の希釈したものをそ
のまま用いる場合は、前述の吸着条件下におい
て、LPF―HAと同時にF―HAも吸着されてく
るので、LPF―HAが溶出され、かつF―HAが
溶出されない条件下で溶出する必要がある。この
条件としてはPH5〜9において比電導度5〜
100ms/cm、好ましくは50〜60ms/cmである適
当な緩衝液(例えば0.7M塩化ナトリウム添加
0.02Mマツキルベン緩衝液)を最初に通液し、
LPF―HAを含む画分を回収する。この後に上述
の溶出用緩衝液より比電導度の大なる(100〜
300ms/cm)緩衝液を通液し、F―HAその他の
不純成分を溶出させ、架橋ポリサツカライド硫酸
エステルゲルを平衡化再使用に供する。 最も好ましくは、塩濃度勾配溶出を実施する。
原材料液として、あらかじめF―HAを分離した
LPF―HA含有液を用いる場合においても、比電
導度が0.5→300ms/cmとなるような塩濃度勾配
緩衝液(例えば塩化ナトリウム0→4.0M塩濃度
勾配・0.02Mマツキルベン緩衝液(PH5.2)を用
いて溶出を行ない、LPF―HA含有画分を分取す
れば、きわめて高純度のLPF―HAを得ることが
できる。 本発明の精製法によれば、LPF―HAの精製度
は数十倍に達し、しかもLPF―HAの回収率は90
%以上100%近くに達する。得られる精製LPF―
HAの比活性は9×104LPEU/mg蛋白質ときわめ
て高く、ポリアクリルアミドデイスク電気泳動
(PH4.5)分析において単一のバンドを形成し、百
日せき菌内毒素がほぼ完全に除去される。 上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料
の百日せき菌培養物から所望のLPF―HAを高収
率、高純度に採取することができ、その操作もき
わめて簡単で、またその精製用クロマトグラフイ
ー吸着体は、安価に調製でき、しかもくり返し使
用しても劣化が全く無く、きわめて経済的にすぐ
れている。 したがつて、本発明方法は高純度LPF―HAの
工業的精製法としてきわめてすぐれた方法であ
る。また本発明は従来の技術である蔗糖密度勾配
超遠心分離法、あるいはイオン交換クロマトグラ
フイー法等と組合わせることも可能であり、その
際は従来方法で得られる結果に比して非常にすぐ
れた結果を得ることができる。 本発明の方法で得られるLPF―HAは高純度で
他の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素
もほぼ完全に除去されているため、その生物学的
活性を利用した各種試薬、医薬品お調製、さらに
百日せきワクチンの調製に有用である。 実施例 以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに
具体的に説明する。 調製例 1 0℃以下の温度にてピリジン200mlにクロルス
ルホン酸11mlを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にエ
ピクロルヒドリン架橋デキストランであるセフア
デツクスG―50(フアルマシア社製)7.5gを加え、
攪拌下65〜70℃にて4時間保持する。反応終了
後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて中
和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝食
塩液で充分に洗浄して架橋デキストラン硫酸エス
テルゲルを得る。 調製例 2 前記調製例1と同様にして調製したピリジン―
クロルスルホン酸混液210mlに、架橋セルロース
ゲルであるセルロフアインGCL―25(チツソ社
製)の乾燥物7.5gを加え、65〜70℃にて4時間反
応させる。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリウ
ム水溶液を加えて中和する。ゲルを過分離し、
0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄して架橋セ
ルロース硫酸エステルゲル7.2gを得る。 調製例 3 前記調製例1と同様にして調製したピリジン―
クロルスルホン酸混液210mlに、架橋アガロース
ゲルであるセフアロースCL―6B(フアルマシア
社製)のピリジン包含体30mlを加え、65〜70℃に
て4時間反応させる。反応終了後、冷却し、水酸
化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲルを
過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄
して架橋アガロース硫酸エステルゲル23mlを得
る。 実施例 1 前記調製例1と同様にして調製した架橋セルロ
ース硫酸エステルゲル5mlをカラム(40mmφ×
200mm)に充填し、これに蒸留水200mlを通液す
る。このカラムに百日せき相菌東浜株静置培養
液の遠心上清100mlを蒸留水で7倍希釈した液
(比電導度約3.0ms/cm)、を通液する。約200ml
の0.02Mマツキルベン緩衝液(PH5.2)をカラム
に通液し、ゲルを洗浄した後、0.02M塩化ナトリ
ウム添加マツキルベン緩衝液(比電導度約
2.0ms/cm、PH5.2)50mlを用い、塩化ナトリウム
0→4.0Mの塩濃度勾配にて溶出を行ない、約1
mlずつ分画して分取した後、LPF―HAを含有す
る画分約6mlをプールする。 原材料液および精製LPF―HA画分の分析結果
および実験成績を第1表に示す。
(Leucocytosis promoting factor
hemagglutinin)の精製方法、さらに詳しくは、
百日せき菌培養物から得られるLPF―HA含有液
を、架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルに接
触せしめ、LPF―HAを吸着させた後、LPF―
HAを該ゲルから溶出することによりLPF―HA
を精製する方法に関する。 産業上の利用分野 LPF―HAは、百日せき菌相菌および相菌
が産生する活性物質であつて、毒力(virulence)
を欠く相菌やパラ百日せき菌・気管支敗血症菌
は産生しない。このLPF―HAは百日せき毒素と
も称され、多様な生理活性を有する蛋白質である
ことが知られている。その主な生理活性として
は、白血球増多活性、インシユリン分泌増強活
性、ヒスタミン増感活性、赤血球凝集活性等が知
られており、なかでも、そのインシユリン分泌増
強活性にもとづいて、糖尿病の治療剤としての応
用が注目されている。 これらの生理活性とは別に、最近になつて百日
せき菌の感染および発病の防御にLPF―HAがき
わめて重要な役割を演じていることが明らかにさ
れ、百日せき菌感染防御抗原としても注目される
ようになつた[Pittman,M;Review of
Infectious Diseases,1,401〜409(1979),お
よびSato,Y;Seminars in Infectious
Diseases IV,Bactreial Vaccine,380〜385
(1982)]。 したがつて、LPF―HAの生理活性を研究する
うえに、またその生理活性を利用した医薬品の製
造のために、さらには副作用のより少ない百日せ
きワクチンを工業的に製造するために、LPF―
HAを簡単にかつ大量に単離精製する方法の開発
が望まれている。 従来技術 従来知られているLPF―HAの採取精製法で
は、百日せき菌培養物を硫安塩析し、ついで抽
出、透析したものを出発材料とし、これをイオン
交換クロマトグラフイー、ゲル過[Arai,
H;Biochimica et Biophysica Aeta,444,
765(1976)]、あるいは蔗糖濃度勾配遠心[Sato,
Y;Infect.Immun.6,897〜704,(1972)]など
によつて精製する方法が採用されている。しかし
ながら、このような方法では、高純度のLPF―
HAを得ることは難しく、またその収量も少な
い。 高純度のLPF―HAを比較的大量に得る方法と
して、百日せき菌培養上清液をハイドロキシアパ
タイトのカラムに通してLPF―HAを吸着させ、
洗浄、溶出後、コンカナバリンA―セフアロース
(ConA―Sepharose,フアルマシア社製)による
アフイニテイクロマトグラフイーで精製する方法
が提案されている。[Yajima,M;J,
Biochem83,295〜303(1978)]。しかしながら、
このコンカナバリンAをリガントとするアフイニ
テイクロマトグラフイーは、LPF―HAのみと親
和性を有するのではなく、糖類や糖脂質、さらに
他の糖蛋白質なども吸着するため、百日せき菌の
他の成分、たとえばF―HA(Filamentous―
Hemagglutinin)や菌体膜成分なども吸着し、所
望のLPF―HAを高純度で単離することが難し
く、優れたアフイニテイクロマトグラフイーとは
いえない。 最近、ヒトハプトグロビンがLPF―HAに特異
的に結合することが発見されて以来、上記の方法
におけるコンカナバリンAの代わりに、このヒト
ハプトグロビンをリガントとして用いるアフイニ
テイクロマトグラフイーでLPF―HAを精製する
方法が試みられている[Irons L;Biochimica
et Biophisica Acta,580,175〜185(1979)お
よびCowell,J;Seminars in Infectious
Diseases IV,Bacterial Vaccine,371〜379
(1982)]。このヒトハプトグロビンをリガントと
して用いる場合には、新たに肝炎ウイルス対策の
重要な問題が生じる。即ち、ヒトハプトグロビン
は人血液から採取されるため、肝炎ウイルス混入
の恐れがある。さらに他の未知の感染性因子混入
の懸念もなおざりにできないことであり、これは
動物血清を用いる場合も同様である。現在のとこ
ろ肝炎ウイルス等の混入をチエツクする絶対的な
方法はない。一方、かかる肝炎ウイルス等を不活
化するための手段として、60℃、10〜15時間加熱
する方法が知られている。本発明者らは、そのよ
うな加熱処理を行うと、ハプトグロビンのLPF
―HAに対する親和性はほとんど喪失され、目的
とする効果がなくなつてしまう重大な欠陥がある
ことを見出した。 また、前記のハイドロキシアパタイトゲルを用
いる精製法でも、ハイドロキシアパタイトが高価
であるために、LPF―HAを工業的にかつ安価に
採取するには問題がある。 発明の目的 本発明者らは、LPF―HAの工業的な単離精製
法を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、百日
せき菌培養物から得られるLPF―HA含有液を、
架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルに接触せ
しめ、LPE―HAを吸着させ、夾雑物質と分離し
た後該架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルか
ら溶出することにより、高純度のLPF―HAがき
わめて簡単にしかも非常に高い収率で得られるこ
とを発見し、本発明を完成するに至つた。 すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な
生物学的活性物質であるLPF―HAを、工業的に
簡単でかつ大量に、きわめて高純度にまで精製方
法を提供することにある。 発明の構成および効果 本発明は、百日せき菌培養物から得られる
LPF―HA含有液を、架橋ポリサツカライド硫酸
エステルゲルに接触せしめ、LPF―HAを吸着さ
せた後、該ゲルからLPF―HAを溶出することを
特徴とするLPF―HAの精製方法である。 本発明において出発材料として用いられる百日
せき菌培養物としては、百日せき相菌を通常の
培地、たとえばコーエン・ウイラー培地や、ステ
ナー・シヨルテ培地などの液状培地にて、常法に
より静置培養または振盪培養もしくは通気攪拌培
養して得られる培養物である。この培養物は、遠
心分離により菌体を除去した培養上清、あるいは
菌体破壊物遠心上清、あるいはこれらの部分精製
標品の形で本発明方法に供される。 本発明で用いられる架橋ポリサツカライド硫酸
エステルとは、デキストラン、セルロース類、ア
ガロースなどのポリサツカライドを、例えばエピ
クロルヒドリン、ジクロルヒドリン、ジブロムヒ
ドリン、エチレングリコールビスエポキシプロピ
ルエーテル等の架橋剤で架橋して得られる架橋ポ
リサツカライド硫酸エステル化して得られるもの
である。架橋ポリサツカライドはすでに市販され
ており、例えば架橋デキストランとしてセフアデ
ツクスG―10、G―25、G―50、G―100(フアル
マシア社製)などがあり、架橋アガロースとして
セフアローズCL―2B、CL―4B、CL―6B(フア
ルマシア社製)などがあり、架橋セルロースとし
てセルロフアインGCL―25、GCL―90(チツソ社
製)などがある。これらのゲルを例えばピリジン
などの有機溶媒の存在下クロルスルホン酸、無水
硫酸などを作用させることにより所望の架橋ポリ
サツカライド硫酸エステルゲルが得られる。 本発明において、架橋ポリサツカライド硫酸エ
ステルゲルを用いて、百日せき菌が産生する
LPF―HAを精製採取するにあたつては、たとえ
ば、次のような方法で行なわれる。 原材料液であるLPF―HA含有液は、百日せき
菌培養物の遠心上清を、蒸留水または緩衝液で比
電導度が0.5〜5.0ms/cmとなるように希釈した
後、吸着操作に付すこともできるが、この上清中
には架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルに対
して同じく親和性を有するF―HA(Filamentous
―hemagglutinin)が含まれているため、あらか
じめ、LPF―HAは吸着せずF―HAを吸着する
条件にて、架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲ
ルによるクロマトグラフイーを行ない(比電導度
5.0〜25.0ms/cm、PH5〜9の緩衝液で平衡化さ
れた架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲル充填
カラムに比電導度5.0〜25.0ms/cm、PH5〜9に
調整した原材料液を通液する)、その素通り画分
であるところのF―HAを含まずLPF―HAを大
量に含んだ画分を吸着操作に付してもよい。 架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルへの
LPF―HAの吸着、ゲルの洗浄、LPF―HAの溶
出等一連の精製操作は、バツチ法およびカラム法
等の工業的に通常よく用いられる操作方法で行な
うことができるが、カラム法の方が操作が簡単で
あり好都合である。カラム法の場合、架橋ポリサ
ツカライド硫酸エステルゲルをカラムに充填し、
あらかじめ例えば0.02Mマツキルベン
(Mcllvaine′s)緩衝液(PH5.2)等の比電導度0.5
〜5.0ms/cmでPHが5.0〜9.0程度である適当な緩
衝液を通液して平衡化を行つた後に、LPF―HA
の吸着操作に移る。 吸着に際しては、LPF―HAの含有液をPHが5.0
〜9.0、比電導度が0.5〜5.0になるように適宜調整
して、架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲル充
填カラムに通液し、LPF―HAを吸着させる。こ
の後、前述の平衡化に用いたのと同様の緩衝液を
通液し、ゲルを洗浄し、夾雑物質を洗い出す。 LPF―HAの溶出に際しては、PHが5.0〜9.0、
比電導度が5.0以上である適当な緩衝液を通液し
溶出を行なうが、好ましくは段階溶出または塩濃
度勾配溶出を行なう。すなわち、原材料液として
百日せき菌培養液の遠心上清の希釈したものをそ
のまま用いる場合は、前述の吸着条件下におい
て、LPF―HAと同時にF―HAも吸着されてく
るので、LPF―HAが溶出され、かつF―HAが
溶出されない条件下で溶出する必要がある。この
条件としてはPH5〜9において比電導度5〜
100ms/cm、好ましくは50〜60ms/cmである適
当な緩衝液(例えば0.7M塩化ナトリウム添加
0.02Mマツキルベン緩衝液)を最初に通液し、
LPF―HAを含む画分を回収する。この後に上述
の溶出用緩衝液より比電導度の大なる(100〜
300ms/cm)緩衝液を通液し、F―HAその他の
不純成分を溶出させ、架橋ポリサツカライド硫酸
エステルゲルを平衡化再使用に供する。 最も好ましくは、塩濃度勾配溶出を実施する。
原材料液として、あらかじめF―HAを分離した
LPF―HA含有液を用いる場合においても、比電
導度が0.5→300ms/cmとなるような塩濃度勾配
緩衝液(例えば塩化ナトリウム0→4.0M塩濃度
勾配・0.02Mマツキルベン緩衝液(PH5.2)を用
いて溶出を行ない、LPF―HA含有画分を分取す
れば、きわめて高純度のLPF―HAを得ることが
できる。 本発明の精製法によれば、LPF―HAの精製度
は数十倍に達し、しかもLPF―HAの回収率は90
%以上100%近くに達する。得られる精製LPF―
HAの比活性は9×104LPEU/mg蛋白質ときわめ
て高く、ポリアクリルアミドデイスク電気泳動
(PH4.5)分析において単一のバンドを形成し、百
日せき菌内毒素がほぼ完全に除去される。 上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料
の百日せき菌培養物から所望のLPF―HAを高収
率、高純度に採取することができ、その操作もき
わめて簡単で、またその精製用クロマトグラフイ
ー吸着体は、安価に調製でき、しかもくり返し使
用しても劣化が全く無く、きわめて経済的にすぐ
れている。 したがつて、本発明方法は高純度LPF―HAの
工業的精製法としてきわめてすぐれた方法であ
る。また本発明は従来の技術である蔗糖密度勾配
超遠心分離法、あるいはイオン交換クロマトグラ
フイー法等と組合わせることも可能であり、その
際は従来方法で得られる結果に比して非常にすぐ
れた結果を得ることができる。 本発明の方法で得られるLPF―HAは高純度で
他の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素
もほぼ完全に除去されているため、その生物学的
活性を利用した各種試薬、医薬品お調製、さらに
百日せきワクチンの調製に有用である。 実施例 以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに
具体的に説明する。 調製例 1 0℃以下の温度にてピリジン200mlにクロルス
ルホン酸11mlを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にエ
ピクロルヒドリン架橋デキストランであるセフア
デツクスG―50(フアルマシア社製)7.5gを加え、
攪拌下65〜70℃にて4時間保持する。反応終了
後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて中
和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝食
塩液で充分に洗浄して架橋デキストラン硫酸エス
テルゲルを得る。 調製例 2 前記調製例1と同様にして調製したピリジン―
クロルスルホン酸混液210mlに、架橋セルロース
ゲルであるセルロフアインGCL―25(チツソ社
製)の乾燥物7.5gを加え、65〜70℃にて4時間反
応させる。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリウ
ム水溶液を加えて中和する。ゲルを過分離し、
0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄して架橋セ
ルロース硫酸エステルゲル7.2gを得る。 調製例 3 前記調製例1と同様にして調製したピリジン―
クロルスルホン酸混液210mlに、架橋アガロース
ゲルであるセフアロースCL―6B(フアルマシア
社製)のピリジン包含体30mlを加え、65〜70℃に
て4時間反応させる。反応終了後、冷却し、水酸
化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲルを
過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄
して架橋アガロース硫酸エステルゲル23mlを得
る。 実施例 1 前記調製例1と同様にして調製した架橋セルロ
ース硫酸エステルゲル5mlをカラム(40mmφ×
200mm)に充填し、これに蒸留水200mlを通液す
る。このカラムに百日せき相菌東浜株静置培養
液の遠心上清100mlを蒸留水で7倍希釈した液
(比電導度約3.0ms/cm)、を通液する。約200ml
の0.02Mマツキルベン緩衝液(PH5.2)をカラム
に通液し、ゲルを洗浄した後、0.02M塩化ナトリ
ウム添加マツキルベン緩衝液(比電導度約
2.0ms/cm、PH5.2)50mlを用い、塩化ナトリウム
0→4.0Mの塩濃度勾配にて溶出を行ない、約1
mlずつ分画して分取した後、LPF―HAを含有す
る画分約6mlをプールする。 原材料液および精製LPF―HA画分の分析結果
および実験成績を第1表に示す。
【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 百日せき菌が産生するLPF―HAを精製取得
するに際し、該LPF―HA含有液を、架橋ポリサ
ツカライド硫酸エステルゲルに接触せしめ、
LPF―HAを吸着させて不純物と分離した後、該
架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルより
LPF―HAを溶出することを特徴とするLPF―
HAの精製方法。 2 架橋ポリサツカライド硫酸エステルが架橋セ
ルロース硫酸エステル、架橋アガロース硫酸エス
テルおよび架橋デキストラン硫酸エステルから選
ばれる1種である前記第1項記載の方法。 3 架橋セルロース硫酸エステルがエピクロルヒ
ドリン架橋セルロース硫酸エステルである前記第
2項記載の方法。 4 架橋アガロース硫酸エステルがエピクロルヒ
ドリン架橋アガロース硫酸エステルである前記第
2項記載の方法。 5 架橋デキストラン硫酸エステルがエピクロル
ヒドリン架橋デキストラン硫酸エステルである前
記第2項記載の方法。 6 該吸着処理を、温度0〜30℃、比電導度0.5
〜5.0ms/cmの条件下に行なう前記第1項または
第2項記載の方法。 7 LPF―HAを吸着したゲルからの溶出を、比
電導度5.0〜100.0ms/cmの緩衝液を用いて行なう
前記第1〜6項のいずれか1つの方法。 8 該溶出処理に先だつて、吸着ゲルを、比電導
度0.5〜5.0ms/cmの緩衝液で洗浄する前記第7項
記載の方法。
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59175710A JPS6153224A (ja) | 1984-08-22 | 1984-08-22 | Lpf−haの精製方法 |
KR1019850005097A KR890001003B1 (ko) | 1984-07-19 | 1985-07-16 | Lpf-ha의 정제방법 |
AU45093/85A AU571713B2 (en) | 1984-07-19 | 1985-07-17 | Method of purification of lpf-ha from bordetella pertussis |
CA000487035A CA1239104A (en) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Method for the purification of lpf-ha |
EP85108983A EP0170162B1 (en) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Method for the purification of leukocytosis-promoting factor haemagglutinin |
DE8585108983T DE3577658D1 (de) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Verfahren zur reinigung vom leukocytosis-foerderungsfaktor haemagglutinin. |
AT85108983T ATE52694T1 (de) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Verfahren zur reinigung vom leukocytosisf¯rderungsfaktor haemagglutinin. |
US07/122,576 US4885359A (en) | 1984-07-19 | 1987-11-16 | Method for the purification of LPF-HA |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59175710A JPS6153224A (ja) | 1984-08-22 | 1984-08-22 | Lpf−haの精製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6153224A JPS6153224A (ja) | 1986-03-17 |
JPS641448B2 true JPS641448B2 (ja) | 1989-01-11 |
Family
ID=16000882
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59175710A Granted JPS6153224A (ja) | 1984-07-19 | 1984-08-22 | Lpf−haの精製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6153224A (ja) |
-
1984
- 1984-08-22 JP JP59175710A patent/JPS6153224A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6153224A (ja) | 1986-03-17 |
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EXPY | Cancellation because of completion of term |