JPS641446B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、ボルデテラ属菌が産生する線維状赤
血球凝集素（Filamentous Hemagglutinin；以
下Ｆ−HAと略称する）の精製方法、さらに詳し
くは、ボルデテラ属菌培養物を、架橋ポリサツカ
ライド硫酸エステルのゲル誘導体に接触せしめ、
Ｆ−HAを吸着させた後、ゲルから溶出すること
により高純度Ｆ−HAを採取する方法に関する。 産業上の利用分野 ボルデテラ属に属する微生物としては、百日咳
菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌等があり、こ
れらは種々の生物学的活性物質を産生する。Ｆ−
HAはこれらの生物学的活性物質の中の１つであ
り、ボルデテラ属に属する菌は、いずれもＦ−
HAを産生する。 最近になつて百日咳菌Ｆ−HAが、百日咳菌の
感染および発病の防御において、きわめて重要な
る役割を演じていることが明らかにされ、百日咳
菌感染防御抗原として注目されるようになつた
［Sato、Ｙら；Infect.Immun.，31，1223〜1231
（1981）、およびSeminars in Infectious
Diseases IV，Bacterial Vaccine.，380〜385
（1982）］。またさらに、各ボルデテラ属菌のＦ−
HAが免疫学的に同一であることが確認され
［Arai，Ｈら；Infect.Immun.，32，(1)，243〜
250（1981）］、各Ｆ−HAがボルデテラ属菌に共通
のワクチンコンポーネントとなり得る可能性も示
されている。このようなことから、医療上有効な
生物学的活性物質であるＦ−HAを簡単にかつ大
量に単離精製する方法の開発が望まれている。 従来技術 従来知られているＦ−HAの採取精製法として
は、百日咳菌培養上清を硫安分画し、蔗糖密度勾
配遠心にかけ、さらにゲルろ過を２回くり返し百
日咳菌Ｆ−HAを得る方法がある［Sato，Ｙら；
Infect.Immun.，９，801（1974）］。しかしながら
この方法は、工程が多く複雑であり、しかもＦ−
HAの収率が低い等の欠点があり、工業的な精製
法としては採用し難い。 また同様に百日咳菌Ｆ−HAを精製した例とし
て、イオン交換クロマトグラフイー、ゲルろ過に
よる方法［Arai，Ｈら；Infect.Immun.，25，
460（1979）］があるが、この方法によれば、Ｆ−
HAの収率が低いうえに、百日咳菌内毒素の除去
が困難であり、実用には供し難い。 さらに別の例として、ハイドロキシアパタイト
吸着クロマトグラフイー、ハプトグロビアン・ア
フイニテイクロマトグラフイー、硫安分画、ゲル
ろ過を組合わせる方法［Cowell，J.L.ら；
Seminars in Infectious Diseases IV，
Bacterial Vaccine.，37，１（1982）］、およびハ
イドロキシアパタイト吸着クロマトグラフイー、
特異抗体・アフイニテイクロマトグラフイー、蔗
糖密度勾配超遠心分離を組合わせる方法［渡辺
ら；日本細菌学雑誌，38，423（1983）］があるが、
これらの方法は工程が非常に長く複雑であるうえ
に、Ｆ−HAの収率が低く、さらにハイドロキシ
アパタイトは高価であり、また上記において用い
られているアフイニテイクロマトグラフイゲルは
市販されておらず、これらの調製は非常に手間が
かかるうえに、原材料が非常に高価である。この
ような種々の欠点のため、上記方法もＦ−HAの
工業的で安価な採取方法とはなり得ない。 発明の目的 本発明者らは、Ｆ−HAの工業的な単離精製法
を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、ボルデ
テラ属菌培養物を、架橋ポリサツカライド硫酸エ
ステルのゲル誘導体に接触せしめ、Ｆ−HAを吸
着させ、夾雑物質と分離し、ゲルから溶出するこ
とにより、高純度のＦ−HAがきわめて簡単にし
かも非常に高い収率で得られることを発見し、本
発明を完成するに至つた。 すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な
生物学的活性物質であるＦ−HAを、工業的に簡
単でかつ大量に、きわめて高純度にまで精製する
方法を提供することにある。 発明の構成および効果 本発明は、ボルデテラ属菌培養物を、架橋ポリ
サツカライド硫酸エステルのゲル誘導体に接触せ
しめ、Ｆ−HAを吸着させた後、ゲルから溶出す
ることを特徴とするＦ−HAの精製方法である。 本発明において、出発材料であるボルデテラ属
菌培養物とは、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支
敗血症菌の培養物を含む。本発明において好まし
い培養物は、百日咳菌培養物であり、百日咳菌を
通常の培地、たとえばコーエン・ウイラー培地
や、ステナー・シヨルテ培地などの液状培地に
て、常法により静置培養または振盪培養もしくは
通気攪拌培養して得られる培養物である。この培
養物は、遠心分離により菌体を除去した培養上
清、あるいは菌体破壊物遠心上清、あるいはこれ
らの部分精製標品の形で本発明方法に供される。
本発明方法によれば、塩析、抽出、超遠心分離等
の前段部分精製処理をあえて行なう必要はなく、
培養上清等をそのままポリサツカライド硫酸エス
テルゲル吸着クロマトグラフイーに付すことがで
き、工程がきわめて簡単である。 本発明で用いられる架橋ポリサツカライド硫酸
エステルとは、デキストラン、セルロース類、ア
ガロースなどのポリサツカライドを、例えばエピ
クロルヒドリン、ジクロルヒドリン、ジブロムヒ
ドリン、エチレングリコールビスエポキシプロピ
ルエーテル等の加橋剤で加橋して得られる架橋ポ
リサツカライドを硫酸エステル化して得られるも
のである。架橋ポリサツカライドはすでに市販さ
れており例えば、架橋デキストランとしてセフア
デツクスＧ−10、Ｇ−25、Ｇ−50、Ｇ−100（フア
ルマシア社製）などがあり、架橋アガロースとし
てセフアローズCL−2B，CL−4B，CL−6B（フ
アルマシア社製）などがあり、架橋セルロースと
してセルロフアインGCL−25、GGL−90（チツソ
社製）などがある。これらのゲルを例えばピリジ
ンなどの有機溶媒の存在下クロルスルホン酸、無
水硫酸などを作用させることにより所望の架橋ポ
リサツカライド硫酸エステルが得られる。 本発明において、架橋ポリサツカライド硫酸エ
ステルゲルを用いて、ボルデテラ属菌培養物中の
Ｆ−HAを精製採取するにあたつては、次のよう
な方法で行なわれる。 架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルは、あ
らかじめ例えば0.2M塩化ナトリウム添加0.01M
リン酸緩衝液等の、中性付近のPH値（PH６〜９）
であり、比電導度５〜25ｍｓ／cm程度の適当な緩
衝液を用いて平衡化を行なつた後に、Ｆ−HAの
吸着操作に供する。 架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルへのＦ
−HAの吸着、ゲルの洗浄、Ｆ−HAの溶出等一
連の精製操作は、バツチ法およびカラム法等の工
業的に通常よく用いられる操作方法で行なう。バ
ツチ法で行なう場合は、ボルデテラ属菌培養物中
に架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルを投入
し、PH6.0〜9.0程度の範囲において０〜30℃程度
の温度にて10〜60分程度緩く攪拌してＦ−HAを
吸着させる。この際、ボルデテラ属菌培養物の比
電導度が5.0〜25.0ｍｓ／cm程度となるように、
適宜濃縮または希釈して吸着操作に付す。 吸着終了後、培養物−ゲル混合液をろ過器上に
充填し、吸引ろ過してゲルとロ液を分離する。分
離したゲルを、比電導度５〜25ｍｓ／cm程度で、
PHが5.0〜10.0程度である適当な緩衝液例えば、
0.2M塩化ナトリウム添加0.02Mマツキルベン
（Mc Ilvaine′s）緩衝液、0.3M塩化ナトリウム添
加0.01Mリン酸緩衝液あるいは0.3M塩化ナトリ
ウム添加0.01Mトリス塩酸緩衝液等を注ぎ吸引し
て洗浄する。 この後、PHが5.0〜10.0程度で、比電導度が25
〜130ｍｓ／cm程度である（上記洗浄用緩衝液の
比電導度より大）適当な緩衝液、例えば1.5M塩
化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液、1.5M塩
化ナトリウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着し
ているＦ−HAを溶出する。 カラム法にて本発明方法を実施する場合は原材
料液、洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバツ
チ法の場合と同様でよく、これらの通液速度は、
10ml／cm2／Hr〜500ml／cm2／Hr程度に調整して
行なうとよい。 本発明の精製法によれば、百日咳菌培養物中の
Ｆ−HAの特異的吸着能にすぐれ、Ｆ−HAの精
製度は数十倍に達し、しかもＦ−HAの回収率は
90％以上100％近くに達する。得られる精製Ｆ−
HAの比活性は４〜８×104HAユニツト／mg蛋白
質ときわめて高く、ポリアクリルアミドデイスク
電気泳動（PH4.5）分析において単一のバンドを
形成し、百日咳菌内毒素がほぼ完全に除去され
る。 上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料
の百日咳菌培養物から所望のＦ−HAを高収率、
高純度に採取することができ、その操作もきわめ
て簡単で、またその精製用クロマトグラフイー吸
着体は、安価に調製でき、しかもくり返し使用に
おける劣化が全く無く、きわめて経済的にすぐれ
ている。 したがつて、本発明方法は高純度Ｆ−HAの工
業的精製法としてきわめてすぐれた方法である。
また本発明の方法は従来の技術である蔗糖密度勾
配遠心分離法、あるいはイオン交換クロマトグラ
フイー法等と組合わせることも可能であり、その
際は従来方法で得られる結果に比して非常にすぐ
れた効果を得ることができる。 本発明の方法で得られるＦ−HAは高純度で他
の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素も
ほぼ完全に除去されているため、その生物学的活
性を利用した各種試薬、医薬品の調製、さらに百
日咳菌ワクチンの調製に有用である。 実施例 以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに
具体的に説明する。 調製例 １ ０℃以下の温度にてピリジン200mlにクロルス
ルホン酸11mlを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にエ
ピクロルヒドリン架橋デキストランであるセフア
デツクスＧ−50（フアルマシア社製）7.5ｇを加
え、攪拌下65〜70℃にて４時間保持する。反応終
了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて
中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝
食塩液で充分に洗浄して架橋デキストラン硫酸エ
ステルを得る。 調製例 ２ 前記調製例１と同様にして調製したピリジン−
クロルスルホン酸混液210mlに架橋セルロースゲ
ルであるセルロフアインGCL−25（チツソ社製）
の乾燥物7.5ｇを加え、65〜70℃にて４時間反応
させる。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリウム
水溶液を加えて中和する。ゲルを過分離し、
0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄して架橋セ
ルロース硫酸エステル7.2ｇを得る。 調製例 ３ 前記調製例１と同様にして調整したピリジン−
クロルスルホン酸混液210mlに、架橋アガロース
ゲルであるセフアロースCL−6B（フアルマシア
社製）のピリジン包含体30mlを加え、65〜70℃に
て４時間反応させる。反応終了後、冷却し、水酸
化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲルを
過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄
して架橋アガロース硫酸エステル23mlを得る。 実施例 １ 前記調製例１と同様にして調製したセフアデツ
クスＧ−50の硫酸エステル化物をカラム（16mmφ
×100mm）に充填し、これに0.2M塩化ナトリウム
添加0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0、比電導度約17.5
ｍｓ／cm）を通液して平衡化する。このカラムに
百日咳Ｉ相菌東浜株静置培養上清800mlを希釈し
て、比電導度約17.5ｍｓ／cm、PH8.0に合わせた
液を通液する。通液後、上記緩衝液にて洗浄し、
夾雑物質を洗い出す。ついで、1.5M塩化ナトリ
ウム添加リン酸緩衝液（PH7.6）で溶出し、Ｆ−
HAを含む画分30mlを得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第１表に記す。 Ｆ−HAの回収率は93.8％で、精製度（精製Ｆ
−HA画分の比活性／培養上清の比活性）は34倍
に達した。精製Ｆ−HA画分のLPF−HA活性は、
ハプトELISA法［佐藤ら、第28回毒素シンポジ
ウム予稿集141（1981）］による分析で10ELISAユ
ニツト／ml以下であつた。
血球凝集素（Filamentous Hemagglutinin；以
下Ｆ−HAと略称する）の精製方法、さらに詳し
くは、ボルデテラ属菌培養物を、架橋ポリサツカ
ライド硫酸エステルのゲル誘導体に接触せしめ、
Ｆ−HAを吸着させた後、ゲルから溶出すること
により高純度Ｆ−HAを採取する方法に関する。 産業上の利用分野 ボルデテラ属に属する微生物としては、百日咳
菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌等があり、こ
れらは種々の生物学的活性物質を産生する。Ｆ−
HAはこれらの生物学的活性物質の中の１つであ
り、ボルデテラ属に属する菌は、いずれもＦ−
HAを産生する。 最近になつて百日咳菌Ｆ−HAが、百日咳菌の
感染および発病の防御において、きわめて重要な
る役割を演じていることが明らかにされ、百日咳
菌感染防御抗原として注目されるようになつた
［Sato、Ｙら；Infect.Immun.，31，1223〜1231
（1981）、およびSeminars in Infectious
Diseases IV，Bacterial Vaccine.，380〜385
（1982）］。またさらに、各ボルデテラ属菌のＦ−
HAが免疫学的に同一であることが確認され
［Arai，Ｈら；Infect.Immun.，32，(1)，243〜
250（1981）］、各Ｆ−HAがボルデテラ属菌に共通
のワクチンコンポーネントとなり得る可能性も示
されている。このようなことから、医療上有効な
生物学的活性物質であるＦ−HAを簡単にかつ大
量に単離精製する方法の開発が望まれている。 従来技術 従来知られているＦ−HAの採取精製法として
は、百日咳菌培養上清を硫安分画し、蔗糖密度勾
配遠心にかけ、さらにゲルろ過を２回くり返し百
日咳菌Ｆ−HAを得る方法がある［Sato，Ｙら；
Infect.Immun.，９，801（1974）］。しかしながら
この方法は、工程が多く複雑であり、しかもＦ−
HAの収率が低い等の欠点があり、工業的な精製
法としては採用し難い。 また同様に百日咳菌Ｆ−HAを精製した例とし
て、イオン交換クロマトグラフイー、ゲルろ過に
よる方法［Arai，Ｈら；Infect.Immun.，25，
460（1979）］があるが、この方法によれば、Ｆ−
HAの収率が低いうえに、百日咳菌内毒素の除去
が困難であり、実用には供し難い。 さらに別の例として、ハイドロキシアパタイト
吸着クロマトグラフイー、ハプトグロビアン・ア
フイニテイクロマトグラフイー、硫安分画、ゲル
ろ過を組合わせる方法［Cowell，J.L.ら；
Seminars in Infectious Diseases IV，
Bacterial Vaccine.，37，１（1982）］、およびハ
イドロキシアパタイト吸着クロマトグラフイー、
特異抗体・アフイニテイクロマトグラフイー、蔗
糖密度勾配超遠心分離を組合わせる方法［渡辺
ら；日本細菌学雑誌，38，423（1983）］があるが、
これらの方法は工程が非常に長く複雑であるうえ
に、Ｆ−HAの収率が低く、さらにハイドロキシ
アパタイトは高価であり、また上記において用い
られているアフイニテイクロマトグラフイゲルは
市販されておらず、これらの調製は非常に手間が
かかるうえに、原材料が非常に高価である。この
ような種々の欠点のため、上記方法もＦ−HAの
工業的で安価な採取方法とはなり得ない。 発明の目的 本発明者らは、Ｆ−HAの工業的な単離精製法
を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、ボルデ
テラ属菌培養物を、架橋ポリサツカライド硫酸エ
ステルのゲル誘導体に接触せしめ、Ｆ−HAを吸
着させ、夾雑物質と分離し、ゲルから溶出するこ
とにより、高純度のＦ−HAがきわめて簡単にし
かも非常に高い収率で得られることを発見し、本
発明を完成するに至つた。 すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な
生物学的活性物質であるＦ−HAを、工業的に簡
単でかつ大量に、きわめて高純度にまで精製する
方法を提供することにある。 発明の構成および効果 本発明は、ボルデテラ属菌培養物を、架橋ポリ
サツカライド硫酸エステルのゲル誘導体に接触せ
しめ、Ｆ−HAを吸着させた後、ゲルから溶出す
ることを特徴とするＦ−HAの精製方法である。 本発明において、出発材料であるボルデテラ属
菌培養物とは、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支
敗血症菌の培養物を含む。本発明において好まし
い培養物は、百日咳菌培養物であり、百日咳菌を
通常の培地、たとえばコーエン・ウイラー培地
や、ステナー・シヨルテ培地などの液状培地に
て、常法により静置培養または振盪培養もしくは
通気攪拌培養して得られる培養物である。この培
養物は、遠心分離により菌体を除去した培養上
清、あるいは菌体破壊物遠心上清、あるいはこれ
らの部分精製標品の形で本発明方法に供される。
本発明方法によれば、塩析、抽出、超遠心分離等
の前段部分精製処理をあえて行なう必要はなく、
培養上清等をそのままポリサツカライド硫酸エス
テルゲル吸着クロマトグラフイーに付すことがで
き、工程がきわめて簡単である。 本発明で用いられる架橋ポリサツカライド硫酸
エステルとは、デキストラン、セルロース類、ア
ガロースなどのポリサツカライドを、例えばエピ
クロルヒドリン、ジクロルヒドリン、ジブロムヒ
ドリン、エチレングリコールビスエポキシプロピ
ルエーテル等の加橋剤で加橋して得られる架橋ポ
リサツカライドを硫酸エステル化して得られるも
のである。架橋ポリサツカライドはすでに市販さ
れており例えば、架橋デキストランとしてセフア
デツクスＧ−10、Ｇ−25、Ｇ−50、Ｇ−100（フア
ルマシア社製）などがあり、架橋アガロースとし
てセフアローズCL−2B，CL−4B，CL−6B（フ
アルマシア社製）などがあり、架橋セルロースと
してセルロフアインGCL−25、GGL−90（チツソ
社製）などがある。これらのゲルを例えばピリジ
ンなどの有機溶媒の存在下クロルスルホン酸、無
水硫酸などを作用させることにより所望の架橋ポ
リサツカライド硫酸エステルが得られる。 本発明において、架橋ポリサツカライド硫酸エ
ステルゲルを用いて、ボルデテラ属菌培養物中の
Ｆ−HAを精製採取するにあたつては、次のよう
な方法で行なわれる。 架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルは、あ
らかじめ例えば0.2M塩化ナトリウム添加0.01M
リン酸緩衝液等の、中性付近のPH値（PH６〜９）
であり、比電導度５〜25ｍｓ／cm程度の適当な緩
衝液を用いて平衡化を行なつた後に、Ｆ−HAの
吸着操作に供する。 架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルへのＦ
−HAの吸着、ゲルの洗浄、Ｆ−HAの溶出等一
連の精製操作は、バツチ法およびカラム法等の工
業的に通常よく用いられる操作方法で行なう。バ
ツチ法で行なう場合は、ボルデテラ属菌培養物中
に架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルを投入
し、PH6.0〜9.0程度の範囲において０〜30℃程度
の温度にて10〜60分程度緩く攪拌してＦ−HAを
吸着させる。この際、ボルデテラ属菌培養物の比
電導度が5.0〜25.0ｍｓ／cm程度となるように、
適宜濃縮または希釈して吸着操作に付す。 吸着終了後、培養物−ゲル混合液をろ過器上に
充填し、吸引ろ過してゲルとロ液を分離する。分
離したゲルを、比電導度５〜25ｍｓ／cm程度で、
PHが5.0〜10.0程度である適当な緩衝液例えば、
0.2M塩化ナトリウム添加0.02Mマツキルベン
（Mc Ilvaine′s）緩衝液、0.3M塩化ナトリウム添
加0.01Mリン酸緩衝液あるいは0.3M塩化ナトリ
ウム添加0.01Mトリス塩酸緩衝液等を注ぎ吸引し
て洗浄する。 この後、PHが5.0〜10.0程度で、比電導度が25
〜130ｍｓ／cm程度である（上記洗浄用緩衝液の
比電導度より大）適当な緩衝液、例えば1.5M塩
化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液、1.5M塩
化ナトリウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着し
ているＦ−HAを溶出する。 カラム法にて本発明方法を実施する場合は原材
料液、洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバツ
チ法の場合と同様でよく、これらの通液速度は、
10ml／cm2／Hr〜500ml／cm2／Hr程度に調整して
行なうとよい。 本発明の精製法によれば、百日咳菌培養物中の
Ｆ−HAの特異的吸着能にすぐれ、Ｆ−HAの精
製度は数十倍に達し、しかもＦ−HAの回収率は
90％以上100％近くに達する。得られる精製Ｆ−
HAの比活性は４〜８×104HAユニツト／mg蛋白
質ときわめて高く、ポリアクリルアミドデイスク
電気泳動（PH4.5）分析において単一のバンドを
形成し、百日咳菌内毒素がほぼ完全に除去され
る。 上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料
の百日咳菌培養物から所望のＦ−HAを高収率、
高純度に採取することができ、その操作もきわめ
て簡単で、またその精製用クロマトグラフイー吸
着体は、安価に調製でき、しかもくり返し使用に
おける劣化が全く無く、きわめて経済的にすぐれ
ている。 したがつて、本発明方法は高純度Ｆ−HAの工
業的精製法としてきわめてすぐれた方法である。
また本発明の方法は従来の技術である蔗糖密度勾
配遠心分離法、あるいはイオン交換クロマトグラ
フイー法等と組合わせることも可能であり、その
際は従来方法で得られる結果に比して非常にすぐ
れた効果を得ることができる。 本発明の方法で得られるＦ−HAは高純度で他
の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素も
ほぼ完全に除去されているため、その生物学的活
性を利用した各種試薬、医薬品の調製、さらに百
日咳菌ワクチンの調製に有用である。 実施例 以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに
具体的に説明する。 調製例 １ ０℃以下の温度にてピリジン200mlにクロルス
ルホン酸11mlを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にエ
ピクロルヒドリン架橋デキストランであるセフア
デツクスＧ−50（フアルマシア社製）7.5ｇを加
え、攪拌下65〜70℃にて４時間保持する。反応終
了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて
中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝
食塩液で充分に洗浄して架橋デキストラン硫酸エ
ステルを得る。 調製例 ２ 前記調製例１と同様にして調製したピリジン−
クロルスルホン酸混液210mlに架橋セルロースゲ
ルであるセルロフアインGCL−25（チツソ社製）
の乾燥物7.5ｇを加え、65〜70℃にて４時間反応
させる。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリウム
水溶液を加えて中和する。ゲルを過分離し、
0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄して架橋セ
ルロース硫酸エステル7.2ｇを得る。 調製例 ３ 前記調製例１と同様にして調整したピリジン−
クロルスルホン酸混液210mlに、架橋アガロース
ゲルであるセフアロースCL−6B（フアルマシア
社製）のピリジン包含体30mlを加え、65〜70℃に
て４時間反応させる。反応終了後、冷却し、水酸
化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲルを
過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄
して架橋アガロース硫酸エステル23mlを得る。 実施例 １ 前記調製例１と同様にして調製したセフアデツ
クスＧ−50の硫酸エステル化物をカラム（16mmφ
×100mm）に充填し、これに0.2M塩化ナトリウム
添加0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0、比電導度約17.5
ｍｓ／cm）を通液して平衡化する。このカラムに
百日咳Ｉ相菌東浜株静置培養上清800mlを希釈し
て、比電導度約17.5ｍｓ／cm、PH8.0に合わせた
液を通液する。通液後、上記緩衝液にて洗浄し、
夾雑物質を洗い出す。ついで、1.5M塩化ナトリ
ウム添加リン酸緩衝液（PH7.6）で溶出し、Ｆ−
HAを含む画分30mlを得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第１表に記す。 Ｆ−HAの回収率は93.8％で、精製度（精製Ｆ
−HA画分の比活性／培養上清の比活性）は34倍
に達した。精製Ｆ−HA画分のLPF−HA活性は、
ハプトELISA法［佐藤ら、第28回毒素シンポジ
ウム予稿集141（1981）］による分析で10ELISAユ
ニツト／ml以下であつた。
【表】
実施例 ２
調製例２と同様にして得られたセルロフアイン
GCL−25の硫酸エステル化物をカラム（16mmφ
×100mm）に充填し、これに0.14M塩化ナトリウ
ム添加0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）を通液して
平衡化する。このカラムに、実施例１で用いたも
のと同一ロツトの百日咳Ｉ相菌東浜株フアーメン
ター培養上清800mlを、比電導度約10ｍｓ／cmに
希釈し、PH8.0に合わせた液を通液する。通液終
了後、上記緩衝液で洗浄し、ついで、1.5M塩化
ナトリウム添加リン酸緩衝液（PH7.6）で溶出し
て精製Ｆ−HA含有画分30mlを得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第２表に記す。 Ｆ−HAの回収率は75％で、精製度は23倍に達
した。
GCL−25の硫酸エステル化物をカラム（16mmφ
×100mm）に充填し、これに0.14M塩化ナトリウ
ム添加0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）を通液して
平衡化する。このカラムに、実施例１で用いたも
のと同一ロツトの百日咳Ｉ相菌東浜株フアーメン
ター培養上清800mlを、比電導度約10ｍｓ／cmに
希釈し、PH8.0に合わせた液を通液する。通液終
了後、上記緩衝液で洗浄し、ついで、1.5M塩化
ナトリウム添加リン酸緩衝液（PH7.6）で溶出し
て精製Ｆ−HA含有画分30mlを得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第２表に記す。 Ｆ−HAの回収率は75％で、精製度は23倍に達
した。
【表】
実施例 ３
調製例３と同様にして得られたセフアロース
CL−6Bの硫酸エステル化物をカラム（16mmφ×
100mm）に充填し、これに0.2M塩化ナトリウム添
加0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）を通液し平衡化
する。このカラムに実施例１で用いたものと同一
ロツドの百日咳Ｉ相菌東浜株フアーメンター培養
上清800mlを希釈して比電導度約17.5ｍｓ／cm、
およびPHを8.0に調整した液を通液する。通液終
了後、上記緩衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出
す。ついで1.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝
液（PH7.6）で溶出し、Ｆ−HAを含む画分28mlを
得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第３表に記す。 Ｆ−HAの回収率は87.5％で、精製度は33倍に
達した。またLPF−HA活性は10ELISAユニツ
ト／ml以下であつた。 本精製品を用いて生物学的製剤基準「百日ぜき
ワクチン」（薬発第287号、1981を参照）に準じ、
マウス体重減少試験、マウス白血球増加試験、易
熱性毒素否定試験およびマウスヒスタミン増感試
験を実施したが、いずれも、生理食塩水を接種し
た対照群と同様であり、副作用は認められなかつ
た。
CL−6Bの硫酸エステル化物をカラム（16mmφ×
100mm）に充填し、これに0.2M塩化ナトリウム添
加0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）を通液し平衡化
する。このカラムに実施例１で用いたものと同一
ロツドの百日咳Ｉ相菌東浜株フアーメンター培養
上清800mlを希釈して比電導度約17.5ｍｓ／cm、
およびPHを8.0に調整した液を通液する。通液終
了後、上記緩衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出
す。ついで1.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝
液（PH7.6）で溶出し、Ｆ−HAを含む画分28mlを
得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第３表に記す。 Ｆ−HAの回収率は87.5％で、精製度は33倍に
達した。またLPF−HA活性は10ELISAユニツ
ト／ml以下であつた。 本精製品を用いて生物学的製剤基準「百日ぜき
ワクチン」（薬発第287号、1981を参照）に準じ、
マウス体重減少試験、マウス白血球増加試験、易
熱性毒素否定試験およびマウスヒスタミン増感試
験を実施したが、いずれも、生理食塩水を接種し
た対照群と同様であり、副作用は認められなかつ
た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ボルデテラ属菌が産生する線維状赤血球凝集
素を精製取得するに際し、該線維状赤血球凝集素
含有液を、架橋ポリサツカライド硫酸エステルの
ゲル誘導体に接触せしめ、線維状赤血球凝集素を
吸着させた後、吸着した線維状赤血球凝集素をゲ
ルから溶出することを特徴とする線維状赤血球凝
集素の精製方法。 ２ 架橋ポリサツカライド硫酸エステルが架橋デ
キストラン硫酸エステルおよび架橋アガロース硫
酸エステルおよび架橋セルロース硫酸エステルか
ら選ばれる１種である前記第１項記載の方法。 ３ 架橋デキストラン硫酸エステルがエピクロル
ヒドリン架橋デキストラン硫酸エステルである前
記第２項記載の方法。 ４ 架橋アガロース硫酸エステルがエピクロルヒ
ドリン架橋アガロース硫酸エステルである前記第
２項記載の方法。 ５ 架橋セルロース硫酸エステルがエピクロルヒ
ドリン架橋セルロース硫酸エステルである前記第
２項記載の方法。 ６ 該ポリサツカライド硫酸エステルのゲル誘導
体を、PH6.9〜9.0、比電導度5.0〜25.0ｍｓ／cmの
緩衝液であらかじめ処理して平衡化したのち吸着
処理に付す、前記第１〜５項のいずれか１つの方
法。 ７ 該吸着処理を、PH6.0〜8.0、温度０〜30℃、
比電導度5.0〜25.0ｍｓ／cmの条件下に行なう前
記第１〜６項のいずれか１つの方法。 ８ 線維状赤血球凝集素のゲルからの溶出を、PH
5.0〜10.0、比電導度25.0〜130ｍｓ／cmの緩衝液
を用いて行なう前記第１〜７項のいずれか１つの
方法。 ９ 該溶出処理に先だつて、吸着ゲルを、PH5.0
〜10.0、比電導度5.0〜25.0ｍｓ／cmの緩衝液で洗
浄する前記第８項の方法。 １０ 該線維状赤血球凝集素含有液が百日咳菌培
養物である前記第１〜９項のいずれか１つの方
法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59084778A JPS60226822A (ja) | 1984-04-25 | 1984-04-25 | 線維状赤血球凝集素の精製方法 |
| US06/722,381 US4563303A (en) | 1984-04-14 | 1985-04-12 | Method for purification of filamentous hemagglutinin |
| AU41223/85A AU571078B2 (en) | 1984-04-14 | 1985-04-12 | Purification of filamentous hemagglutinin |
| CA000479022A CA1237998A (en) | 1984-04-14 | 1985-04-12 | Method for purification of filamentous hemagglutinin |
| KR1019850002492A KR890001927B1 (ko) | 1984-04-14 | 1985-04-13 | 섬유질 헤마글루티닌의 정제방법 |
| EP85104545A EP0159003B1 (en) | 1984-04-14 | 1985-04-15 | Method for purification of filamentous hemagglutinin |
| DE8585104545T DE3576173D1 (de) | 1984-04-14 | 1985-04-15 | Verfahren zur reinigung von faserartigem haemoglobin. |
| AT85104545T ATE50600T1 (de) | 1984-04-14 | 1985-04-15 | Verfahren zur reinigung von faserartigem haemoglobin. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59084778A JPS60226822A (ja) | 1984-04-25 | 1984-04-25 | 線維状赤血球凝集素の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60226822A JPS60226822A (ja) | 1985-11-12 |
| JPS641446B2 true JPS641446B2 (ja) | 1989-01-11 |
Family
ID=13840140
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59084778A Granted JPS60226822A (ja) | 1984-04-14 | 1984-04-25 | 線維状赤血球凝集素の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60226822A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1337859C (en) * | 1987-04-24 | 1996-01-02 | Masashi Chazono | Method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine |
-
1984
- 1984-04-25 JP JP59084778A patent/JPS60226822A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60226822A (ja) | 1985-11-12 |
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