JPS6241691B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、百日せき菌が産生するLPF−HA
（Leucocytosis promoting factor
hemagglutinin）の精製方法、さらに詳しくは、
百日せき菌培養物から得られるLPF−HA含有液
を、セルロース硫酸エステルゲルに接触せしめ、
LPF−HAを吸着させた後、LPF−HAを該ゲル
から溶出することによりLPF−HAを精製する方
法に関する。 産業上の利用分野 LPF−HAは、百日せき菌相菌および相菌
が産生する活性物質であつて、毒力
（virulence）を欠く相菌やパラ百日せき菌・気
管支敗血症菌は産生しない。このLPF−HAは百
日せき毒素とも称され、多様な生理活性を有する
蛋白質であることが知られている。その主な生理
活性としては、白血球増多活性、インシユリン分
泌増強活性、ヒスタミン増感活性、赤血球凝集活
性等が知られており、なかでも、そのインシユリ
ン分泌増強活性にもとづいて、糖尿病の治療剤と
しての応用が注目されている。 これらの生理活性とは別に、最近になつて百日
せき菌の感染および発病の防御にLPF−HAがき
わめて重要な役割を演じていることが明らかにさ
れ、百日せき菌感染防御抗原としても注目される
ようになつた〔Pittman，Ｍ；Review of
Infectious Diseases，１，401〜409（1979）、お
よびSato，Ｙ；Seminars in Infectious
Diseases ，Bacterial Vaccine，380〜385
（1982）〕。 したがつて、LPF−HAの生理活性を研究する
うえに、またその生理活性を利用した医薬品の製
造のために、さらには副作用のより少ない百日せ
きワクチンを工業的に製造するために、LPF−
HAを簡単にかつ大量に単離精製する方法の開発
が望まれている。 従来技術 従来知られているLPF−HAの採取精製法で
は、百日せき菌培養物を硫安塩析し、ついで抽
出、透析したものを出発材料とし、これをイオン
交換クロマトグラフイー、ゲル過〔Arai，
Ｈ；Biochimica et Biophysica Acta，444，765
（1976）〕、あるいは蔗糖濃度勾配遠心〔Sato，
Ｙ；Infect.Immun.，６，897〜704，（1972）〕な
どによつて精製する方法が採用されている。しか
しながら、このような方法では、高純度のLPF−
HAを得ることは難しく、またその収量も少な
い。 高純度のLPF−HAを比較的大量に得る方法と
して、百日せき菌培養上清液をハイドロキシアパ
タイトのカラムに通してLPF−HAを吸着させ、
洗浄、溶出後、コンカナバリンＡ−セフアロース
（ConA−Sepharose，フアルマシア社製）による
アフイニテイクロマトグラフイーで精製する方法
が提案されている〔Yajima，Ｍ；Ｊ，Biochem
83，295〜303（1978）〕。しかしながら、このコ
ンカナバリンＡをリガントとするとアフイニテイ
クロマトグラフイーは、LPF−HAのみと親和性
を有するのではなく、糖類や糖脂質、さらに他の
糖蛋白質なども吸着するため、百日せき菌の他の
成分、たとえばＦ−HA（Filamentous−
Hemagglutinin）や菌体膜成分なども吸着し、所
望のLPF−HAを高純度で単離することが難し
く、優れたアフイニテイクロマトグラフイーとは
いえない。 最近、ヒトハプトグロビンがLPF−HAに特異
的に結合することが発見されて以来、上記の方法
におけるコンカナバリンＡの代わりに、このヒト
ハプトグロビンをリガントとして用いるアフイニ
テイクロマトグラフイーでLPF−HAを精製する
方法が試みられている〔Irons Ｌ；Biochi mica
et Biophisica Acta，580，175〜185（1979）お
よびCowell，ｊ；Seminars in Infectious
Diseases ，Bacterial Vaccine，371〜379
（1982）〕。このヒトハプトグロビンをリガントと
して用いる場合には、新たに肝炎ウイルス対策の
重要な問題が生じる。即ち、ヒトハプトグロビン
は人血液から採取されるため、肝炎ウイルス混入
の恐れがある。さらに他の未知の感染性因子混入
の懸念もなおざりにできないことであり、これは
動物血清を用いる場合も同様である。現在のとこ
ろ肝炎ウイルス等の混入をチエツクする絶対的な
方法はない。一方、かかる肝炎ウイルス等を不活
化するための手段として、60℃，10〜15時間加熱
する方法が知られている。本発明者らは、そのよ
うな加熱処理を行うと、ハプトグロビンのLPF−
HAに対する親和性はほとんど喪失され、目的と
する効果がなくなつてしまうという重大な欠陥が
あることを見出した。 また、前記のハイドロキシアパタイトゲルを用
いる精製法でも、ハイドロキシアパタイトが高価
であるために、LPF−HAを工業的にかつ安価に
採取するには問題がある。 発明の目的 本発明者らは、LPF−HAの工業的な単離精製
法を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、百日
せき菌培養物から得られるLPF−HA含有液を、
セルロース硫酸エステルゲルに接触せしめ、LPF
−HAを吸着させ、夾雑物質と分離した後該セル
ロース硫酸エステルゲルから溶出することによ
り、高純度のLPF−HAがきわめて簡単にしかも
非常に高い収率で得られることを発見し、本発明
を完成するに至つた。 すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な
生物学的活性物質であるLPF−HAを、工業的に
簡単でかつ大量に、きわめて高純度にまで精製す
る方法を提供することにある。 発明の構成および効果 本発明は、百日せき菌培養物から得られるLPF
−HA含有液を、セルロース硫酸エステルゲルに
接触せしめ、LPF−HAを吸着させた後、該ゲル
からLPF−HAを溶出することを特徴とするLPF
−HAの精製方法である。 本発明において出発材料として用いられる百日
せき菌培養物としては、百日せき相菌を通常の
培地、たとえばコーエン・ウイラー培地や、ステ
ナー・シヨルテ培地などの液状培地にて、常法に
より静置培養または振盪培養もしくは通気撹拌培
養して得られる培養物である。この培養物は、遠
心分離により菌体を除去した培養上清、あるいは
菌体破壊物遠心上清、あるいはこれらの部分精製
標品の形で本発明方法に供される。 本発明で用いられるセルロース硫酸エステルゲ
ルとは、セルロースを硫酸エステル化して得られ
るのであるが、好ましくは結晶セルロースあるい
は、結晶領域および非結晶領域からなるセルロー
スを硫酸エステル化したものが良い。この場合、
得られたセルロース硫酸エステルは原料の形状を
保持し、水性媒質に不溶性であり、物理的安定性
にすぐれ、クロマトグラフイー用ゲルとして好適
である。これらの原料セルロース類はすでに市販
されており例えば、セルロフアインGC−15、同
GH−25、同GC−100、同GC−200（チツソ社
製）、アビセル（旭化成工業社製）などがある。
これらのゲルを例えばピリジンなどの有機溶媒の
存在下クロルスルホン酸、無水硫酸などを作用さ
せることにより所望のセルロース硫酸エステルゲ
ルが得られる。 本発明において、セルロース硫酸エステルゲル
を用いて、百日せき菌が産生するLPF−HAを精
製採取するにあたつては、たとえば、次のような
方法で行なわれる。 原材料液であるLPF−HA含有液は、百日せき
菌培養物の遠心上清を、蒸留水または緩衝液で比
電導度が0.5〜5.0ms／cmとなるように希釈した
後、吸着操作に付すこともできるが、この上清中
にはセルロース硫酸エステルゲルに対して同じく
親和性を有するＦ−HA（Filamentous−
hemagglutinin）が含まれているため、あらかじ
め、LPF−HAは吸着せずＦ−HAを吸着する条
件にて、セルロース硫酸エステルゲルによるクロ
マトグラフイーを行ない（比電導度5.0〜
25.0ms／cm、PH５〜９の緩衝液で平衡化された
セルロース硫酸エステルゲル充填カラムに比電導
度5.0〜25.0ms／cm、PH５〜９に調整した原材料
液を通液する）、その素通り画分であるところの
Ｆ−HAを含まずLPF−HAを大量に含んだ画分
を吸着操作に付してもよい。 セルロース硫酸エステルゲルへのLPF−HAの
吸着、ゲルの洗浄、LPF−HAの溶出等一連の精
製操作は、バツチ法およびカラム法等の工業的に
通常よく用いられる操作方法で行なうことができ
るが、カラム法の方が操作が簡単であり好都合で
ある。カラム法の場合、セルロース硫酸エステル
ゲルをカラムに充填し、あらかじめ例えば0.02M
マツキルベン（Mcllvaine′s）緩衝液（PH5.2）等
の比電導度0.5〜5.0ms／cmでPHが5.0〜9.0程度で
ある適当な緩衝液を通液して平衡化を行つた後
に、LPF−HAの吸着操作に移る。 吸着に際しては、LPF−HAの含有液をPHが5.0
〜9.0、比電導度が0.5〜5.0になるように適宜調整
して、セルロース硫酸エステルゲル充填カラムに
通液し、LPF−HAを吸着させる。この後、前述
の平衡化に用いたのと同様の緩衝液を通液し、ゲ
ルを洗浄し、夾雑物質を洗い出す。 LPF−HAの溶出に際しては、PHが5.0〜9.0、
比電導度が5.0以上である適当な緩衝液を通液し
溶出を行なうが、好ましくは段階溶出または塩濃
度勾配溶出を行なう。すなわち、原材料液として
百日せき菌培養液の遠心上清の希釈したものをそ
のまま用いる場合は、前述の吸着条件下におい
て、LPF−HAと同時にＦ−HAも吸着されてく
るので、LPF−HAが溶出され、かつＦ−HAが
溶出されない条件下で溶出する必要がある。この
条件としてはPH５〜９において比電導度５〜
100ms／cm、好ましくは50〜60ms／cmである適
当な緩衝液（例えば0.7M塩化ナトリウム添加
0.02Mマツキルベン緩衝液）を最初に通液し、
LPF−HAを含む画分を回収する。この後に上述
の溶出用緩衝液より比電導度の大なる（100〜
300ms／cm）緩衝液を通液し、Ｆ−HAその他の
不純成分を溶出させ、セルロース硫酸エステルゲ
ルを平衡化再使用に供する。 最も好ましくは、塩濃度勾配溶出を実施する。
原材料液として、あらかじめＦ−HAを分離した
LPF−HA含有液を用いる場合においても、比電
導度が0.5→300ms／cmとなるような塩濃度勾配
緩衝液（例えば塩化ナトリウム０→4.0M塩濃度
勾配・0.02Mマツキルベン緩衝液（PH5.2）を用
いて溶出を行ない、LPF−HA含有画分を分取す
れば、きわめて高純度のLPF−HAを得ることが
できる。 本発明の精製法によれば、LPF−HAの精製度
は数十倍に達し、しかもLPF−HAの回収率は90
％以上100％近くに達する。得られる精製LPF−
HAの比活性は９×10⁴LPEU／mg蛋白質ときわめ
て高く、ポリアクリルアミドデイスク電気泳動
（PH4.5）分析において単一のバンドを形成し、百
日せき菌内毒素がほぼ完全に除去される。 上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料
の百日せき菌培養物から所望のLPF−HAを高収
率、高純度に採取することができ、その操作もき
わめて簡単で、またその精製用クロマトグラフイ
ー吸着体は、安価に調製でき、しかもくり返し使
用しても劣化が全く無く、きわめて経済的にすぐ
れている。 したがつて、本発明方法は高純度LPF−HAの
工業的精製法としてきわめてすぐれた方法であ
る。また本発明の方法は従来の技術である蔗糖密
度勾配超遠心分離法、あるいはイオン交換クロマ
トグラフイー法等と組合わせることも可能であ
り、その際は従来方法で得られる結果に比して非
常にすぐれた結果を得ることができる。 本発明の方法で得られるLPF−HAは高純度で
他の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素
もほぼ完全に除去されているため、その生物学的
活性を利用した各種試薬、医薬品の調製、さらに
百日せきワクチンの調製に有用である。 実施例 以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに
具体的に説明する。 調製例 １ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117ｇを滴下し、混合する。滴下終了
後、混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中
にセルロフアインGC−15（チツソ社製）80ｇを
加え、撹拌下65〜70℃にて３時間反応させる。反
応終了後、冷却し、10％水酸化ナトリウム水溶液
を加えて中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリ
ン酸緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸
エステルゲルを得る。 調製例 ２ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117ｇを滴下し、混合する。滴下終了
後、混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中
に結晶セルロースであるクロマトグラフイー用ア
ビセル（旭化成工業社製）80ｇを加え、撹拌下65
〜70℃にて４時間保持する。反応終了後、冷却
し、10％水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和す
る。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液
で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを
得る。 実施例 １ 前記調製例１と同様にして調製したセルロフア
インGC−15の硫酸エステルゲルをカラム（40mm
φ×200mm）に充填し、これに蒸留水1.0）を通
液する。このカラムに百日せき相菌東浜株静置
培養液の遠心上清500mlを蒸留水で10倍希釈した
液（比電導度約1.5ms／cm）、を通液する。約500
mlの0.02Mマツキルベン緩衝液（PH5.2）をカラ
ムに通液し、ゲルを洗浄した後、0.02M塩化ナト
リウム添加マツキルベン緩衝液（比電導度約
2.0ms／cm、PH5.2）2000mlを用い、塩化ナトリウ
ム０→4.0Mの塩濃度勾配にて溶出を行ない、約
20mlずつ分画して分取した後、LPF−HAを含有
する画分約130mlをプールする。 原材料液および精製LPF−HA画分の分析結果
および実験成績を第１表に示す。

【表】 実施例 ２ 調製例１と同様にして得られるセルロース硫酸
エステルゲル2.0を各１ずつ２本のカラム
（80mmφ×200mm）に充填する。一方のカラムを
0.2M塩化ナトリウム添加0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.2、比電導度21.0ms／cm）を通液して平衡化さ
せ、他方のカラムには蒸留水を通液する。 百日せき相菌東浜株の通気撹拌培養上清20.0
を、上記リン酸緩衝液で平衡化したカラムに通
液し、その素通り画分および0.2M塩化ナトリウ
ム添加0.01Mリン酸緩衝液（比電導度21.0ms／
cm）による洗浄画分のうち、LPF−HAを含有す
る画分（21.0）を集めてプールする。このプー
ル画分を蒸留水で希釈し、比電導度約1.5ms／cm
に調整したのち、上記蒸留水を通液したカラムに
通す。約20の0.02Mマツキルベン緩衝液（比電
導度2.0ms／cm、PH5.2）を通液して洗浄した後、
0.02Mマツキルベン緩衝液（PH5.2）10を用
い、塩化ナトリウム０→3.0Mの塩濃度勾配で溶
出を行ない、LPF−HAを含有する画分1.1を得
る。 原材料液および精製LPF−HA画分の分析結果
および実験成績を第２表に示す。 また、LPF−HAのセルロース硫酸エステルゲ
ルからの溶出液のクロマトグラムを第１図に示
す。第１図における横軸は分取量約100mlの分画
番号で、縦軸はその画分の波長280nmでの吸光値
A₂₈₀と比電導度（ms／cm）、ハプトーELISA法に
よるLPF−HA含量（LPEU／wl）およびニワト
リ血球凝集試験〔Sato，Y.et al.，Infect.Immun.
，７，929（1973）〕によるHA価（HAU／ml）を
プロツトしたものである。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法によりLPF−HA含有液
を精製処理した場合の各溶出画分と、吸光値、比
電導度、LPF−HA含量およびHA価の関係を示
したグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 百日せき菌が産生するLPF−HAを精製取得
   するに際し、該LPF−HA含有液を、セルロース
   硫酸エステルのゲルに接触せしめ、LPF−HAを
   吸着させて不純物と分離した後、該セルロース硫
   酸エステルゲルよりLPF−HAを溶出することを
   特徴とするLPF−HAの精製方法。 ２ セルロース硫酸エステルゲルが結晶セルロー
   スまたは結晶領域および非結晶領域からなるセル
   ロースの硫酸エステルゲルである前記第１項記載
   の方法。 ３ 該吸着処理を、PH5.0〜9.0、温度０〜30℃、
   比電導度0.5〜5.0ms／cmの条件下に行なう前記第
   １項または第２項記載の方法。 ４ LPF−HAを吸着したゲルからの溶出を、比
   電導度5.0〜100.0ms／cmの緩衝液を用いて行なう
   前記第１〜３項のいずれか１つの方法。 ５ 該溶出処理に先だつて、吸着ゲルを、比電導
   度0.5〜5.0ms／cmの緩衝液で洗浄する前記第４項
   記載の方法。