JPS6130528A - Lpf−haの精製方法 - Google Patents
Lpf−haの精製方法Info
- Publication number
- JPS6130528A JPS6130528A JP15094584A JP15094584A JPS6130528A JP S6130528 A JPS6130528 A JP S6130528A JP 15094584 A JP15094584 A JP 15094584A JP 15094584 A JP15094584 A JP 15094584A JP S6130528 A JPS6130528 A JP S6130528A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lpf
- gel
- cellulose sulfate
- cellulose
- specific conductivity
- Prior art date
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- Granted
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、百日せき菌が産生するLPF−HA(Leu
cocytosis promotingfactor
hemagglutinin)の精製方法、さらに詳
しくは、百日ぜき菌培養物から得られるLPF−HA含
有液を、セルロース硫酸エステルゲルに接触せしめ、L
PF−HAを吸着させた後、LPF−HAを該ゲルから
溶出することによりLPF−HAを精製する方法に関す
る。 彦!1ylJJl野 LPF−HAは、百日せき菌I相菌およびII相菌が産
生する活性物質であって、毒力(virulence)
を欠<III相菌やパラ百日せき菌・気管支敗血症菌は
産生しない。このLPF−HAは百日せき毒素とも称さ
れ、多様な生理活性を有する蛋白質であることが知られ
ている。その主な生理活性としては、白血球増多活性、
インシュリン分泌増強活性、ヒスタミン増感活性、赤血
球凝集活性等が知られており、なかでも、そのインシュ
リン′分泌増強活性にもとづいて、糖尿病の治療剤とし
ての応用が注目されている。
cocytosis promotingfactor
hemagglutinin)の精製方法、さらに詳
しくは、百日ぜき菌培養物から得られるLPF−HA含
有液を、セルロース硫酸エステルゲルに接触せしめ、L
PF−HAを吸着させた後、LPF−HAを該ゲルから
溶出することによりLPF−HAを精製する方法に関す
る。 彦!1ylJJl野 LPF−HAは、百日せき菌I相菌およびII相菌が産
生する活性物質であって、毒力(virulence)
を欠<III相菌やパラ百日せき菌・気管支敗血症菌は
産生しない。このLPF−HAは百日せき毒素とも称さ
れ、多様な生理活性を有する蛋白質であることが知られ
ている。その主な生理活性としては、白血球増多活性、
インシュリン分泌増強活性、ヒスタミン増感活性、赤血
球凝集活性等が知られており、なかでも、そのインシュ
リン′分泌増強活性にもとづいて、糖尿病の治療剤とし
ての応用が注目されている。
これらの生理活性とは別に、最近になって百日せぎ菌の
感染および発病の防御にL F’ F −1−I Aが
外わめて重要な役割を演じていることが明らかにされ、
百日せき菌感染防御抗原としても注目されるようになっ
た[Pittman、 M; Revieu+ ofI
nfectious D 1seases+ ↓
、 401−409 (1979)。
感染および発病の防御にL F’ F −1−I Aが
外わめて重要な役割を演じていることが明らかにされ、
百日せき菌感染防御抗原としても注目されるようになっ
た[Pittman、 M; Revieu+ ofI
nfectious D 1seases+ ↓
、 401−409 (1979)。
およびSat、o、 Y; Sem1nars in
InfectiousDiseases IV 、
BacLerial Vaccine、 38
0−385(1982) ]。
InfectiousDiseases IV 、
BacLerial Vaccine、 38
0−385(1982) ]。
したがって、L P F −1−T Aの生理活性を研
究するうえに、またその生理活性を利用した医薬品の製
造のために、さらには副作用のより少ない百日せきワク
チンを工業的に製造するために、L P F−HAを簡
単にかつ大量に単離精製する方法の開発が望まれている
。
究するうえに、またその生理活性を利用した医薬品の製
造のために、さらには副作用のより少ない百日せきワク
チンを工業的に製造するために、L P F−HAを簡
単にかつ大量に単離精製する方法の開発が望まれている
。
僅禾扶ぞ
従来知られているLPF−HAの採取精製法では、百日
せき菌培養物を硫安塩析し、ついで抽出、透析したもの
を出発材料とし、これをイオン交換クロマトグラフィー
、デル濾過[Arai、 H:Biochimica
et Biophysica AcLay 444.7
65(1976) ]、あるいは蔗糖濃度勾配遠心[5
ato。
せき菌培養物を硫安塩析し、ついで抽出、透析したもの
を出発材料とし、これをイオン交換クロマトグラフィー
、デル濾過[Arai、 H:Biochimica
et Biophysica AcLay 444.7
65(1976) ]、あるいは蔗糖濃度勾配遠心[5
ato。
Y; Infect、 Immun、 、 6+
897−704+ (1,972)1などによっ
て精製する方法が採用されている。しかしながら、この
ような方法では、高純度のLPF−HAを得ることは難
しく、またその収量も少ない。
897−704+ (1,972)1などによっ
て精製する方法が採用されている。しかしながら、この
ような方法では、高純度のLPF−HAを得ることは難
しく、またその収量も少ない。
高純度のL P F −HAを比較的大量に得る方法と
して、百日せき菌培養上滑液をハイドロキシアパタイト
のカラムに通してLPF−HAを吸着させ、洗浄、溶出
後、コンカナバリンA−セファロース(ConA−8e
pharose、 7フルマシア社製)によるアフイニ
ティクロマトグラフイーで精製する方法が提案されてい
る[Yajima+ M; 、LBiochem 8
3.295−3()3 (1978) ]。 しかしな
がら、このフンカナバリンAをリカ′ントとすると7フ
イニテイクロマトグラフイーは、L P F−1−r
Aの4と親和性を有するのではなく、糖類や糖脂質、さ
らに他の糖蛋白質なども吸着するため、百1」せき菌の
池の成分、たとえばF−11A(Filamcnl、o
us −He+nagglut、1nin)や菌体膜成
分なども吸着し、所望のL P F −1−I Aを高
純度で単離することか難しく、優れたアフィニティクロ
マトグラフィーとはいえない。
して、百日せき菌培養上滑液をハイドロキシアパタイト
のカラムに通してLPF−HAを吸着させ、洗浄、溶出
後、コンカナバリンA−セファロース(ConA−8e
pharose、 7フルマシア社製)によるアフイニ
ティクロマトグラフイーで精製する方法が提案されてい
る[Yajima+ M; 、LBiochem 8
3.295−3()3 (1978) ]。 しかしな
がら、このフンカナバリンAをリカ′ントとすると7フ
イニテイクロマトグラフイーは、L P F−1−r
Aの4と親和性を有するのではなく、糖類や糖脂質、さ
らに他の糖蛋白質なども吸着するため、百1」せき菌の
池の成分、たとえばF−11A(Filamcnl、o
us −He+nagglut、1nin)や菌体膜成
分なども吸着し、所望のL P F −1−I Aを高
純度で単離することか難しく、優れたアフィニティクロ
マトグラフィーとはいえない。
最近、ヒトハプトグロビンカ’ L P F −HAに
特異的に結合することが発見されて以来、−に記の方法
におけるフンカナバリンAの代わりに、このヒトハプト
グロビンをリガントとして用いるアフィニティクロマト
グラフィーでL P F −HAを精製する方法が試み
られている[ Irons L: Biochimic
a et Biol〕hisica Acta+ 58
0+ 175−185(1979)およびCou+el
l+ 、i:’ Sem1nars in 丁nfe
cL;0113 Diseases IV+ Bact
erial Vaccii+e+ 37]〜379 (
1982) 1゜このヒトハプトグロビンをリガントと
して用いる場合には、新たに肝炎ウィルス対策の重要な
問題が生じる。即ち、ヒトハプトグロビンは人血液から
採取されるため、肝炎ウィルス混入の恐れがある。さら
に他の未知の感染性因子混入の懸念もなおざりにできな
いことであり、これは動物血清を用いる場合も同様であ
る。現在のところ肝炎ウィルス等の混入をチェックする
絶対的な方法はない。一方、かかる肝炎ウィルス等を不
活化するための手段として、60℃、10〜15時間加
熱する方法が知られている。本発明者らは、そのような
加熱処理を行うと、ハプトグロビンのL P F −H
Aに対する親和性はほとんど喪失され、目的とする効果
がなくなってしまうという重大な欠陥があることを見出
した。
特異的に結合することが発見されて以来、−に記の方法
におけるフンカナバリンAの代わりに、このヒトハプト
グロビンをリガントとして用いるアフィニティクロマト
グラフィーでL P F −HAを精製する方法が試み
られている[ Irons L: Biochimic
a et Biol〕hisica Acta+ 58
0+ 175−185(1979)およびCou+el
l+ 、i:’ Sem1nars in 丁nfe
cL;0113 Diseases IV+ Bact
erial Vaccii+e+ 37]〜379 (
1982) 1゜このヒトハプトグロビンをリガントと
して用いる場合には、新たに肝炎ウィルス対策の重要な
問題が生じる。即ち、ヒトハプトグロビンは人血液から
採取されるため、肝炎ウィルス混入の恐れがある。さら
に他の未知の感染性因子混入の懸念もなおざりにできな
いことであり、これは動物血清を用いる場合も同様であ
る。現在のところ肝炎ウィルス等の混入をチェックする
絶対的な方法はない。一方、かかる肝炎ウィルス等を不
活化するための手段として、60℃、10〜15時間加
熱する方法が知られている。本発明者らは、そのような
加熱処理を行うと、ハプトグロビンのL P F −H
Aに対する親和性はほとんど喪失され、目的とする効果
がなくなってしまうという重大な欠陥があることを見出
した。
また、前記のハイドロキシアパタイトゲルを用いる精製
法でも、ハイドロキシアパタイトが高価であるために、
L P F −HAを工業的にかつ安価に採取するには
問題がある。
法でも、ハイドロキシアパタイトが高価であるために、
L P F −HAを工業的にかつ安価に採取するには
問題がある。
発明の目的
本発明者らは、L P F −HAの工業的な単離精製
法を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、百日せき菌
培養物から得られるL P F −HA含有液を、セル
ロース硫酸エステルデルに接触せしめ、L P F −
HAを吸着させ、夾雑物質と分離した後該セルロース硫
酸エステルゲルから溶出することにより、高純度のL
P F −HAがぎわめて簡単にしかも非常に高い収率
で得られることを発見し、本発明を完成するに至った。
法を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、百日せき菌
培養物から得られるL P F −HA含有液を、セル
ロース硫酸エステルデルに接触せしめ、L P F −
HAを吸着させ、夾雑物質と分離した後該セルロース硫
酸エステルゲルから溶出することにより、高純度のL
P F −HAがぎわめて簡単にしかも非常に高い収率
で得られることを発見し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な生物学的
活性物質であるL P F −HAを、工業的に簡単で
かつ大量に、きわめて高純度にまで精製する方法を提供
することにある。
活性物質であるL P F −HAを、工業的に簡単で
かつ大量に、きわめて高純度にまで精製する方法を提供
することにある。
発明の構成および効果
本発明は、百日せき菌培養物から得られるLPF−HA
含有1を、セルロース硫酸エステルゲルに接触せしめ、
LPF−HAを吸着させた後、該ゲルからLPF−HA
を溶出することを特徴とするLPF−HAの精製方法で
ある。
含有1を、セルロース硫酸エステルゲルに接触せしめ、
LPF−HAを吸着させた後、該ゲルからLPF−HA
を溶出することを特徴とするLPF−HAの精製方法で
ある。
本発明において出発材料として用いられる百日せト菌培
養物としては、百日ぜき■相菌を通常の培地、たとえば
コーエン・ウィラー培地や、ステナー・ショルテ培地な
どの液状培地にて、常法により静置培養または振盪培養
もしくは通気撹拌培養して得られる培養物である。この
培養物は、遠心分離により菌体を除去した培養上清、あ
るいは菌体破壊物遠心上清、あるいはこれらの部分精製
標品の形で本発明方法に供される。
養物としては、百日ぜき■相菌を通常の培地、たとえば
コーエン・ウィラー培地や、ステナー・ショルテ培地な
どの液状培地にて、常法により静置培養または振盪培養
もしくは通気撹拌培養して得られる培養物である。この
培養物は、遠心分離により菌体を除去した培養上清、あ
るいは菌体破壊物遠心上清、あるいはこれらの部分精製
標品の形で本発明方法に供される。
本発明で用いられるセルロース硫酸エステルデルとは、
セルロースを硫酸エステル化して得られるのであるが、
好ましくは結晶セルロースあるいは、結晶領域および非
結晶領域からなるセルロースを硫酸エステル化したもの
が良い。この場合、得られたセルロース硫酸エステルは
原料の形状を保持し、水性媒質に不溶性であり、物理的
安定性にすぐれ、クロマトグラフィー用ゲルとして好適
である。これらの原料セルロース類はすでに市販されて
おり例えば、セルロアフィンGC−15、同GH=25
、同c;c−i o o、同GC−200(チッソ社製
)、アビセル(旭化成工業社製)などがある。これらの
ゲルを例えばピリジンなどの有機溶媒の存在下クロルス
ルホン酸、無水硫酸などを作用させることにより所望の
セルロース硫酸エステルゲルが得られる。
セルロースを硫酸エステル化して得られるのであるが、
好ましくは結晶セルロースあるいは、結晶領域および非
結晶領域からなるセルロースを硫酸エステル化したもの
が良い。この場合、得られたセルロース硫酸エステルは
原料の形状を保持し、水性媒質に不溶性であり、物理的
安定性にすぐれ、クロマトグラフィー用ゲルとして好適
である。これらの原料セルロース類はすでに市販されて
おり例えば、セルロアフィンGC−15、同GH=25
、同c;c−i o o、同GC−200(チッソ社製
)、アビセル(旭化成工業社製)などがある。これらの
ゲルを例えばピリジンなどの有機溶媒の存在下クロルス
ルホン酸、無水硫酸などを作用させることにより所望の
セルロース硫酸エステルゲルが得られる。
本発明において、セルロース硫酸エステルゲルを用いて
、百日せき菌が産生するL P F −HAを精製採取
するにあたっては、たとえば、次のような方法で行なわ
れる。
、百日せき菌が産生するL P F −HAを精製採取
するにあたっては、たとえば、次のような方法で行なわ
れる。
原材料液であるLPF−HA含有液は、百日せき菌培養
物の遠心上清を、蒸留水または緩衝液で比電導度が0.
5〜5.Oms/cmとなるように希釈した後、吸着操
作に付すこともできるが、この−上清中にはセルロース
硫酸エステルゲルに対して同じく親和性を有するF
HA(Filamentous−hemaggluti
nin)が含まれているため、あらかじめ、LPF−H
Aは吸着せ□ずF −HAを吸着する条件にて、セルロ
ース硫酸エステルゲルによるクロマトグラフィーを行な
い(比電導度5.0〜25.0is/cm、 pH5〜
9の緩衝液で平衡化されたセルロース硫酸エステルゲル
充填カラムに比電導度5゜0−25.Oms/cm、p
H5−9に調整した原材料液を通液する)、その素通り
画分であるところのF−HAを含ますI−P F−HA
を大量に含んだ両分を吸着繰作に付してもよい。
物の遠心上清を、蒸留水または緩衝液で比電導度が0.
5〜5.Oms/cmとなるように希釈した後、吸着操
作に付すこともできるが、この−上清中にはセルロース
硫酸エステルゲルに対して同じく親和性を有するF
HA(Filamentous−hemaggluti
nin)が含まれているため、あらかじめ、LPF−H
Aは吸着せ□ずF −HAを吸着する条件にて、セルロ
ース硫酸エステルゲルによるクロマトグラフィーを行な
い(比電導度5.0〜25.0is/cm、 pH5〜
9の緩衝液で平衡化されたセルロース硫酸エステルゲル
充填カラムに比電導度5゜0−25.Oms/cm、p
H5−9に調整した原材料液を通液する)、その素通り
画分であるところのF−HAを含ますI−P F−HA
を大量に含んだ両分を吸着繰作に付してもよい。
セルロース硫酸エステルゲルへのLPF−HAの吸着、
ゲルの洗浄、LPF−HAの溶出等一連の精製操作は、
バッチ法およびカラム法等の工業的に通常よく用いられ
る繰作方法で行なうことができるが、カラム法の方が繰
作が簡単であり好都合である。カラム法の場合、セルロ
ース硫酸エステルゲルをカラムに充填し、あらカルめ例
えば0゜02 M マツキルベン(Mcllvaine
’s)緩衝液(pH5,2)等の比電導度0 、5〜S
、 Oms/cmでpHが5.0〜9.0程度である
適当な緩衝液を通液して平衡化を行った後に、LPF−
HAの吸着繰作に移る。
ゲルの洗浄、LPF−HAの溶出等一連の精製操作は、
バッチ法およびカラム法等の工業的に通常よく用いられ
る繰作方法で行なうことができるが、カラム法の方が繰
作が簡単であり好都合である。カラム法の場合、セルロ
ース硫酸エステルゲルをカラムに充填し、あらカルめ例
えば0゜02 M マツキルベン(Mcllvaine
’s)緩衝液(pH5,2)等の比電導度0 、5〜S
、 Oms/cmでpHが5.0〜9.0程度である
適当な緩衝液を通液して平衡化を行った後に、LPF−
HAの吸着繰作に移る。
吸着に際しては、LPF−HAの含有液をpHが5.0
〜9.0、比電導度が0.5〜5.0になるように適宜
調整して、セルロース硫酸エステルデル充填カラムに通
液し、LPF−HAを吸着させる。この後、前述の平衡
化に用いたのと同様の緩衝液を通液し、ゲルを洗浄し、
夾雑物質を洗い出LPF−HAの溶出に際しては、pH
が5.0・〜9.0、比電導度が5.0以上である適当
な緩衝液を通渡し溶出を行なうが、好ましくは段階溶出
または塩濃度勾配溶出を行なう。′すなわ輻、原材料液
として百日せき菌培養液の遠心上清の希釈したものをそ
のまま用いる場合は、前述の吸着条件下において、LP
F−HAと同時にF−HAも吸着されてくるので、1.
PF’−HAが溶出され、がっF−H,Aが溶出されな
い条件下で溶出する必要がある。この条件としては1)
H5〜9において比電導度5−1 +10ms/ca+
、好ましくは5050−6O/cmである適当な緩衝液
(例えば0.7M塩化ナトリウム添加0.02Mマツキ
ルベン緩衝液)を最初に通液し、LPF−HAを含む両
分を回収する。
〜9.0、比電導度が0.5〜5.0になるように適宜
調整して、セルロース硫酸エステルデル充填カラムに通
液し、LPF−HAを吸着させる。この後、前述の平衡
化に用いたのと同様の緩衝液を通液し、ゲルを洗浄し、
夾雑物質を洗い出LPF−HAの溶出に際しては、pH
が5.0・〜9.0、比電導度が5.0以上である適当
な緩衝液を通渡し溶出を行なうが、好ましくは段階溶出
または塩濃度勾配溶出を行なう。′すなわ輻、原材料液
として百日せき菌培養液の遠心上清の希釈したものをそ
のまま用いる場合は、前述の吸着条件下において、LP
F−HAと同時にF−HAも吸着されてくるので、1.
PF’−HAが溶出され、がっF−H,Aが溶出されな
い条件下で溶出する必要がある。この条件としては1)
H5〜9において比電導度5−1 +10ms/ca+
、好ましくは5050−6O/cmである適当な緩衝液
(例えば0.7M塩化ナトリウム添加0.02Mマツキ
ルベン緩衝液)を最初に通液し、LPF−HAを含む両
分を回収する。
この後に上述の溶出用緩衝液より比電導度の大なる(1
00−300ms/cm)緩衝液を通液し、F−HAそ
の他の不純成分を溶出させ、セルロース硫酸エステルデ
ルを平衡化再使用に供する。
00−300ms/cm)緩衝液を通液し、F−HAそ
の他の不純成分を溶出させ、セルロース硫酸エステルデ
ルを平衡化再使用に供する。
最も好ましくは、塩濃度勾配溶出を実施する。
原材料液として、あら劣化めF−HAを分離したL P
F −HA含有液を用いる場合においても、比電導度
が0.5→300m5/cmとなるような塩濃度勾配緩
衝液(例えば塩化す) IJウム0→4.OM塩濃度勾
配・(1,02Mマツキルベン緩衝液(pH5,2)を
用いて溶出を行ない、LPF−HA含有画分を分取すれ
ば、きわめて高純度のLPF−HAを得ることができる
。
F −HA含有液を用いる場合においても、比電導度
が0.5→300m5/cmとなるような塩濃度勾配緩
衝液(例えば塩化す) IJウム0→4.OM塩濃度勾
配・(1,02Mマツキルベン緩衝液(pH5,2)を
用いて溶出を行ない、LPF−HA含有画分を分取すれ
ば、きわめて高純度のLPF−HAを得ることができる
。
本発明の精製法によれば、LPF−HAの精製度は数十
倍に達し、しかもLPF−HAの回収率は90%以上1
00%近くに達する。得られる精製LPF−HAの比活
性は9X10喝LPEU/鴫蛋白質ときわめて高く、ポ
リアクリルアミ−ディスク電気泳動(pH4,5’)分
析において単一のバンドを形成し、百日せき菌内毒素が
ほぼ完全に除去される。
倍に達し、しかもLPF−HAの回収率は90%以上1
00%近くに達する。得られる精製LPF−HAの比活
性は9X10喝LPEU/鴫蛋白質ときわめて高く、ポ
リアクリルアミ−ディスク電気泳動(pH4,5’)分
析において単一のバンドを形成し、百日せき菌内毒素が
ほぼ完全に除去される。
上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料の百日せ
き菌培養物から所望のLPF−HAを高収率、高純度に
採取することかでb、その操作もきわめて簡単で、また
その精製用クロマトグラフィー吸着体は、安価に調製で
き、しかもくり返し使用しても劣化が全く無く、きわめ
て経済的にすぐれている。
き菌培養物から所望のLPF−HAを高収率、高純度に
採取することかでb、その操作もきわめて簡単で、また
その精製用クロマトグラフィー吸着体は、安価に調製で
き、しかもくり返し使用しても劣化が全く無く、きわめ
て経済的にすぐれている。
したがって、本発明方法は高純度1. F’ F −H
Aの工業的精製法としてきわめてすぐれた方法である。
Aの工業的精製法としてきわめてすぐれた方法である。
また本発明の方法は従来の技術である蔗糖密度勾配超遠
心分離法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー法等
と組合わせることも可能であり、その際は従来方法で得
られる結果に比して非常にすぐれた結果を得ることがで
きる。
心分離法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー法等
と組合わせることも可能であり、その際は従来方法で得
られる結果に比して非常にすぐれた結果を得ることがで
きる。
本発明の方法で得られるL P F −HAは高純度で
他の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素もほぼ
完全に除去されているため、その生物学的活性を利用し
た各種試薬、医薬品の調製、さらに百日せきワクチンの
調製に有用である。
他の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素もほぼ
完全に除去されているため、その生物学的活性を利用し
た各種試薬、医薬品の調製、さらに百日せきワクチンの
調製に有用である。
ヌ蒸例
以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。
説明する。
調製例1
0℃以下の温度にてピリジン600J にクロルスル
ホン酸117gを滴下し、混合する。滴下終了後、混液
を加熱し、65〜70 ”Cに昇温する。
ホン酸117gを滴下し、混合する。滴下終了後、混液
を加熱し、65〜70 ”Cに昇温する。
この中にセルロファインGC−15(チッソ社製)81
)gを加え、撹拌下65〜70℃にて3時間反応させる
。反応終了後、冷却し、10%水酸化ナトリウム水溶液
を加えて中和する。ゲルを濾過分離し、0 、 (11
M +7ン酸緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫
酸エステルゲルを得る。
)gを加え、撹拌下65〜70℃にて3時間反応させる
。反応終了後、冷却し、10%水酸化ナトリウム水溶液
を加えて中和する。ゲルを濾過分離し、0 、 (11
M +7ン酸緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫
酸エステルゲルを得る。
調製例2
0 ’C以下の温度にてピリジン600−にクロルスル
ホン酸117gを滴下し、混合する。滴下終了後、混液
を加熱し、65〜70℃に昇温する。
ホン酸117gを滴下し、混合する。滴下終了後、混液
を加熱し、65〜70℃に昇温する。
この中に結晶セルロースであるクロマトグラフィー用ア
ビセル(旭化成工業社製)80gを加え、撹拌下65〜
70℃にて4時間保持する。反応終了後、冷却し、10
%水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ケ′ルを
濾過分離し、0.OIMリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄
してセルロース硫酸エステルゲルを得る。
ビセル(旭化成工業社製)80gを加え、撹拌下65〜
70℃にて4時間保持する。反応終了後、冷却し、10
%水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ケ′ルを
濾過分離し、0.OIMリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄
してセルロース硫酸エステルゲルを得る。
実施例1
前記調製例1と同様にして調製したセルロファインGC
−15の硫酸エステルゲルをカラム(40+nmφX2
00mm)に充填し、これに蒸留水1.()l)を通液
する。このカラムに百日せ%I相菌東浜株静置培養液の
遠心上清5 +’、) Oll1lを蒸留水で10倍希
釈した液(比電導度的1 、5 ms/co+)、を通
液する。約5(10mlの0.02Mマツキルベン緩衝
液(pH5,2)をカラムに通液し、ゲルを洗浄した後
、0.02M塩化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液(
比電導度的2.On+s/Cm、pH5,2)2000
輸1を用い、塩化ナトリウム0→4.OMの塩濃度勾配
にて溶出を行ない、約20m1ずつ分画して分取した後
、LPF−HAを含有する両分的130m1をプールす
る。
−15の硫酸エステルゲルをカラム(40+nmφX2
00mm)に充填し、これに蒸留水1.()l)を通液
する。このカラムに百日せ%I相菌東浜株静置培養液の
遠心上清5 +’、) Oll1lを蒸留水で10倍希
釈した液(比電導度的1 、5 ms/co+)、を通
液する。約5(10mlの0.02Mマツキルベン緩衝
液(pH5,2)をカラムに通液し、ゲルを洗浄した後
、0.02M塩化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液(
比電導度的2.On+s/Cm、pH5,2)2000
輸1を用い、塩化ナトリウム0→4.OMの塩濃度勾配
にて溶出を行ない、約20m1ずつ分画して分取した後
、LPF−HAを含有する両分的130m1をプールす
る。
原材料液および精製LPF−’HA画分の分析結果およ
び実験成績を第1表に示す。
び実験成績を第1表に示す。
第1表
1)LPF−HAのin vitroテスト:ハプト−
ELISA法[佐原ら、第28回毒素シンポジウム予稿
集141−144(1981)を参照1によるLPF−
HAの単位 2)キルブール法蛋白窒素測定値X6.25により蛋白
質含量として表示 3) 6.25μg蛋白質/m lの含量に希釈後、
生物学的製剤基準(薬発287号、1981)に準じて
不活化して実施した。
ELISA法[佐原ら、第28回毒素シンポジウム予稿
集141−144(1981)を参照1によるLPF−
HAの単位 2)キルブール法蛋白窒素測定値X6.25により蛋白
質含量として表示 3) 6.25μg蛋白質/m lの含量に希釈後、
生物学的製剤基準(薬発287号、1981)に準じて
不活化して実施した。
実施例2
調製例1と同様にして得ちれるセルロース硫酸エステル
ゲル2.Olを各1fずつ2本のカラム(80鰭φX2
00+u)に充填する。一方のカラムを0.2M塩化ナ
トリウム添加0,01Mリン酸緩衝液(pH7,2、比
電導度2 LOeis/c@)を通液して平衡化させ、
他方のカラムには蒸留水を通液する。
ゲル2.Olを各1fずつ2本のカラム(80鰭φX2
00+u)に充填する。一方のカラムを0.2M塩化ナ
トリウム添加0,01Mリン酸緩衝液(pH7,2、比
電導度2 LOeis/c@)を通液して平衡化させ、
他方のカラムには蒸留水を通液する。
百日ぜき■相菌束浜株の通気撹拌培養上清20゜ORを
、上記リン酸緩衝液で平衡化したカラムに通液し、その
素通り画dおよび0.2M塩化ナトリウム添加0.OI
MIJン酸緩衝液(比電導度21゜0LOs/cm)に
よる洗浄画分のうち、L P F −HAを含有する両
分(21,J)を集めてプールする。
、上記リン酸緩衝液で平衡化したカラムに通液し、その
素通り画dおよび0.2M塩化ナトリウム添加0.OI
MIJン酸緩衝液(比電導度21゜0LOs/cm)に
よる洗浄画分のうち、L P F −HAを含有する両
分(21,J)を集めてプールする。
このプール画分を蒸留水で希釈し、比電導度的1゜5m
s/cn+に調整したのち、上記蒸留水を通液したカラ
ムに通す。約20.eの0.02Mマツキルベン緩衝液
(比電導度2 、 Oms/ cm、pH5,2)を通
液して洗浄した後、0.02Mマツキルベン緩衝液(p
H5、2)10ρを用い、塩化ナトリウム0→3.0M
の塩濃度勾配で溶出を行ない、LPF−HAを含有する
両分1.II!を得る。
s/cn+に調整したのち、上記蒸留水を通液したカラ
ムに通す。約20.eの0.02Mマツキルベン緩衝液
(比電導度2 、 Oms/ cm、pH5,2)を通
液して洗浄した後、0.02Mマツキルベン緩衝液(p
H5、2)10ρを用い、塩化ナトリウム0→3.0M
の塩濃度勾配で溶出を行ない、LPF−HAを含有する
両分1.II!を得る。
原材料液および精製LPF−HA画分の分析結果および
実験成績を第2表に示す。
実験成績を第2表に示す。
また、LPF−HAのセルロース硫酸エステルゲルから
の溶出液のクロマトグラムを第1図に示す。第1図にお
け−る横軸は分取量的100slの分画番号で、縦軸は
その両分の波長280nmでの吸光値A210と比電導
度(−s/cm)、ハプト−ELTSA法によるLPF
−HA含量(LPEU/+el)およびニワトリ血球凝
集試験[5ato、 Y、 et al、+Infec
t、 Immun、、 7. 929’(1973
)] lこよるHA価(HAU/ml)をプロットした
ものである。
の溶出液のクロマトグラムを第1図に示す。第1図にお
け−る横軸は分取量的100slの分画番号で、縦軸は
その両分の波長280nmでの吸光値A210と比電導
度(−s/cm)、ハプト−ELTSA法によるLPF
−HA含量(LPEU/+el)およびニワトリ血球凝
集試験[5ato、 Y、 et al、+Infec
t、 Immun、、 7. 929’(1973
)] lこよるHA価(HAU/ml)をプロットした
ものである。
第2表
1)、 2)、 3) 第1表に同じ
第1図は、本発明方法によりLPF−HA含有液を精製
処理した場合の各溶出画分と、吸光値、比電導度、L
P F −HA含量およびHA価の関係を示したグラフ
である。
処理した場合の各溶出画分と、吸光値、比電導度、L
P F −HA含量およびHA価の関係を示したグラフ
である。
Claims (5)
- (1)百日せき菌が産生するLPF−HAを精製取得す
るに際し、該LPF−HA含有液を、セルロース硫酸エ
ステルのゲルに接触せしめ、LPF−HAを吸着させて
不純物と分離した後、該セルロース硫酸エステルゲルよ
りLPF−HAを溶出することを特徴とするLPF−H
Aの精製方法。 - (2)セルロース硫酸エステルゲルが結晶セルロースま
たは結晶領域および非結晶領域からなるセルロースの硫
酸エステルゲルである前記第(1)項記載の方法。 - (3)該吸着処理を、pH5.0〜9.0、温度0〜3
0℃、比電導度0.5〜5.0ms/cmの条件下に行
なう前記第(1)項または第(2)項記載の方法。 - (4)LPF−HAを吸着したゲルからの溶出を、比電
導度5.0〜100.0ms/cmの緩衝液を用いて行
なう前記第(1)〜(3)項のいずれか1つの方法。 - (5)該溶出処理に先だって、吸着ゲルを、比電導度0
.5〜5.0ms/cmの緩衝液で洗浄する前記第(4
)項記載の方法。
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15094584A JPS6130528A (ja) | 1984-07-19 | 1984-07-19 | Lpf−haの精製方法 |
KR1019850005097A KR890001003B1 (ko) | 1984-07-19 | 1985-07-16 | Lpf-ha의 정제방법 |
AU45093/85A AU571713B2 (en) | 1984-07-19 | 1985-07-17 | Method of purification of lpf-ha from bordetella pertussis |
CA000487035A CA1239104A (en) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Method for the purification of lpf-ha |
EP85108983A EP0170162B1 (en) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Method for the purification of leukocytosis-promoting factor haemagglutinin |
DE8585108983T DE3577658D1 (de) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Verfahren zur reinigung vom leukocytosis-foerderungsfaktor haemagglutinin. |
AT85108983T ATE52694T1 (de) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Verfahren zur reinigung vom leukocytosisf¯rderungsfaktor haemagglutinin. |
US07/122,576 US4885359A (en) | 1984-07-19 | 1987-11-16 | Method for the purification of LPF-HA |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15094584A JPS6130528A (ja) | 1984-07-19 | 1984-07-19 | Lpf−haの精製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6130528A true JPS6130528A (ja) | 1986-02-12 |
JPS6241691B2 JPS6241691B2 (ja) | 1987-09-04 |
Family
ID=15507848
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP15094584A Granted JPS6130528A (ja) | 1984-07-19 | 1984-07-19 | Lpf−haの精製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6130528A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2010250465B2 (en) * | 2009-05-19 | 2014-07-10 | Chikusui Canycom, Inc. | Cutting blade mounting and removal structure for mower |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63269485A (ja) * | 1987-04-27 | 1988-11-07 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 厨房装置 |
-
1984
- 1984-07-19 JP JP15094584A patent/JPS6130528A/ja active Granted
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---|---|---|---|---|
AU2010250465B2 (en) * | 2009-05-19 | 2014-07-10 | Chikusui Canycom, Inc. | Cutting blade mounting and removal structure for mower |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6241691B2 (ja) | 1987-09-04 |
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Legal Events
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