JPS6130528A - Ｌｐｆ−ｈａの精製方法 - Google Patents
Ｌｐｆ−ｈａの精製方法Info
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- JPS6130528A JPS6130528A JP15094584A JP15094584A JPS6130528A JP S6130528 A JPS6130528 A JP S6130528A JP 15094584 A JP15094584 A JP 15094584A JP 15094584 A JP15094584 A JP 15094584A JP S6130528 A JPS6130528 A JP S6130528A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、百日せき菌が産生するＬＰＦ−ＨＡ（Ｌｅｕ
ｃｏｃｙｔｏｓｉｓ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ
ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）の精製方法、さらに詳
しくは、百日ぜき菌培養物から得られるＬＰＦ−ＨＡ含
有液を、セルロース硫酸エステルゲルに接触せしめ、Ｌ
ＰＦ−ＨＡを吸着させた後、ＬＰＦ−ＨＡを該ゲルから
溶出することによりＬＰＦ−ＨＡを精製する方法に関す
る。 彦！１ｙｌＪＪｌ野 ＬＰＦ−ＨＡは、百日せき菌Ｉ相菌およびＩＩ相菌が産
生する活性物質であって、毒力（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）
を欠＜ＩＩＩ相菌やパラ百日せき菌・気管支敗血症菌は
産生しない。このＬＰＦ−ＨＡは百日せき毒素とも称さ
れ、多様な生理活性を有する蛋白質であることが知られ
ている。その主な生理活性としては、白血球増多活性、
インシュリン分泌増強活性、ヒスタミン増感活性、赤血
球凝集活性等が知られており、なかでも、そのインシュ
リン′分泌増強活性にもとづいて、糖尿病の治療剤とし
ての応用が注目されている。
ｃｏｃｙｔｏｓｉｓ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ
ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）の精製方法、さらに詳
しくは、百日ぜき菌培養物から得られるＬＰＦ−ＨＡ含
有液を、セルロース硫酸エステルゲルに接触せしめ、Ｌ
ＰＦ−ＨＡを吸着させた後、ＬＰＦ−ＨＡを該ゲルから
溶出することによりＬＰＦ−ＨＡを精製する方法に関す
る。 彦！１ｙｌＪＪｌ野 ＬＰＦ−ＨＡは、百日せき菌Ｉ相菌およびＩＩ相菌が産
生する活性物質であって、毒力（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）
を欠＜ＩＩＩ相菌やパラ百日せき菌・気管支敗血症菌は
産生しない。このＬＰＦ−ＨＡは百日せき毒素とも称さ
れ、多様な生理活性を有する蛋白質であることが知られ
ている。その主な生理活性としては、白血球増多活性、
インシュリン分泌増強活性、ヒスタミン増感活性、赤血
球凝集活性等が知られており、なかでも、そのインシュ
リン′分泌増強活性にもとづいて、糖尿病の治療剤とし
ての応用が注目されている。
これらの生理活性とは別に、最近になって百日せぎ菌の
感染および発病の防御にＬ Ｆ’ Ｆ −１−Ｉ Ａが
外わめて重要な役割を演じていることが明らかにされ、
百日せき菌感染防御抗原としても注目されるようになっ
た［Ｐｉｔｔｍａｎ、 Ｍ； Ｒｅｖｉｅｕ＋ ｏｆＩ
ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄ １ｓｅａｓｅｓ＋ ↓
、 ４０１−４０９ （１９７９）。
感染および発病の防御にＬ Ｆ’ Ｆ −１−Ｉ Ａが
外わめて重要な役割を演じていることが明らかにされ、
百日せき菌感染防御抗原としても注目されるようになっ
た［Ｐｉｔｔｍａｎ、 Ｍ； Ｒｅｖｉｅｕ＋ ｏｆＩ
ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄ １ｓｅａｓｅｓ＋ ↓
、 ４０１−４０９ （１９７９）。
およびＳａｔ、ｏ、 Ｙ； Ｓｅｍ１ｎａｒｓ ｉｎ
ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ ＩＶ 、
ＢａｃＬｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ、 ３８
０−３８５（１９８２） ］。
ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ ＩＶ 、
ＢａｃＬｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ、 ３８
０−３８５（１９８２） ］。
したがって、Ｌ Ｐ Ｆ −１−Ｔ Ａの生理活性を研
究するうえに、またその生理活性を利用した医薬品の製
造のために、さらには副作用のより少ない百日せきワク
チンを工業的に製造するために、Ｌ Ｐ Ｆ−ＨＡを簡
単にかつ大量に単離精製する方法の開発が望まれている
。
究するうえに、またその生理活性を利用した医薬品の製
造のために、さらには副作用のより少ない百日せきワク
チンを工業的に製造するために、Ｌ Ｐ Ｆ−ＨＡを簡
単にかつ大量に単離精製する方法の開発が望まれている
。
僅禾扶ぞ
従来知られているＬＰＦ−ＨＡの採取精製法では、百日
せき菌培養物を硫安塩析し、ついで抽出、透析したもの
を出発材料とし、これをイオン交換クロマトグラフィー
、デル濾過［Ａｒａｉ、 Ｈ：Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ＡｃＬａｙ ４４４．７
６５（１９７６） ］、あるいは蔗糖濃度勾配遠心［５
ａｔｏ。
せき菌培養物を硫安塩析し、ついで抽出、透析したもの
を出発材料とし、これをイオン交換クロマトグラフィー
、デル濾過［Ａｒａｉ、 Ｈ：Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ＡｃＬａｙ ４４４．７
６５（１９７６） ］、あるいは蔗糖濃度勾配遠心［５
ａｔｏ。
Ｙ； Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎ、 、 ６＋
８９７−７０４＋ （１，９７２）１などによっ
て精製する方法が採用されている。しかしながら、この
ような方法では、高純度のＬＰＦ−ＨＡを得ることは難
しく、またその収量も少ない。
８９７−７０４＋ （１，９７２）１などによっ
て精製する方法が採用されている。しかしながら、この
ような方法では、高純度のＬＰＦ−ＨＡを得ることは難
しく、またその収量も少ない。
高純度のＬ Ｐ Ｆ −ＨＡを比較的大量に得る方法と
して、百日せき菌培養上滑液をハイドロキシアパタイト
のカラムに通してＬＰＦ−ＨＡを吸着させ、洗浄、溶出
後、コンカナバリンＡ−セファロース（ＣｏｎＡ−８ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ、 ７フルマシア社製）によるアフイニ
ティクロマトグラフイーで精製する方法が提案されてい
る［Ｙａｊｉｍａ＋ Ｍ； 、ＬＢｉｏｃｈｅｍ ８
３．２９５−３（）３ （１９７８） ］。 しかしな
がら、このフンカナバリンＡをリカ′ントとすると７フ
イニテイクロマトグラフイーは、Ｌ Ｐ Ｆ−１−ｒ
Ａの４と親和性を有するのではなく、糖類や糖脂質、さ
らに他の糖蛋白質なども吸着するため、百１」せき菌の
池の成分、たとえばＦ−１１Ａ（Ｆｉｌａｍｃｎｌ、ｏ
ｕｓ −Ｈｅ＋ｎａｇｇｌｕｔ、１ｎｉｎ）や菌体膜成
分なども吸着し、所望のＬ Ｐ Ｆ −１−Ｉ Ａを高
純度で単離することか難しく、優れたアフィニティクロ
マトグラフィーとはいえない。
して、百日せき菌培養上滑液をハイドロキシアパタイト
のカラムに通してＬＰＦ−ＨＡを吸着させ、洗浄、溶出
後、コンカナバリンＡ−セファロース（ＣｏｎＡ−８ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ、 ７フルマシア社製）によるアフイニ
ティクロマトグラフイーで精製する方法が提案されてい
る［Ｙａｊｉｍａ＋ Ｍ； 、ＬＢｉｏｃｈｅｍ ８
３．２９５−３（）３ （１９７８） ］。 しかしな
がら、このフンカナバリンＡをリカ′ントとすると７フ
イニテイクロマトグラフイーは、Ｌ Ｐ Ｆ−１−ｒ
Ａの４と親和性を有するのではなく、糖類や糖脂質、さ
らに他の糖蛋白質なども吸着するため、百１」せき菌の
池の成分、たとえばＦ−１１Ａ（Ｆｉｌａｍｃｎｌ、ｏ
ｕｓ −Ｈｅ＋ｎａｇｇｌｕｔ、１ｎｉｎ）や菌体膜成
分なども吸着し、所望のＬ Ｐ Ｆ −１−Ｉ Ａを高
純度で単離することか難しく、優れたアフィニティクロ
マトグラフィーとはいえない。
最近、ヒトハプトグロビンカ’ Ｌ Ｐ Ｆ −ＨＡに
特異的に結合することが発見されて以来、−に記の方法
におけるフンカナバリンＡの代わりに、このヒトハプト
グロビンをリガントとして用いるアフィニティクロマト
グラフィーでＬ Ｐ Ｆ −ＨＡを精製する方法が試み
られている［ Ｉｒｏｎｓ Ｌ： Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃ
ａ ｅｔ Ｂｉｏｌ〕ｈｉｓｉｃａ Ａｃｔａ＋ ５８
０＋ １７５−１８５（１９７９）およびＣｏｕ＋ｅｌ
ｌ＋ 、ｉ：’ Ｓｅｍ１ｎａｒｓ ｉｎ 丁ｎｆｅ
ｃＬ；０１１３ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ＩＶ＋ Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｉ＋ｅ＋ ３７］〜３７９ （
１９８２） １゜このヒトハプトグロビンをリガントと
して用いる場合には、新たに肝炎ウィルス対策の重要な
問題が生じる。即ち、ヒトハプトグロビンは人血液から
採取されるため、肝炎ウィルス混入の恐れがある。さら
に他の未知の感染性因子混入の懸念もなおざりにできな
いことであり、これは動物血清を用いる場合も同様であ
る。現在のところ肝炎ウィルス等の混入をチェックする
絶対的な方法はない。一方、かかる肝炎ウィルス等を不
活化するための手段として、６０℃、１０〜１５時間加
熱する方法が知られている。本発明者らは、そのような
加熱処理を行うと、ハプトグロビンのＬ Ｐ Ｆ −Ｈ
Ａに対する親和性はほとんど喪失され、目的とする効果
がなくなってしまうという重大な欠陥があることを見出
した。
特異的に結合することが発見されて以来、−に記の方法
におけるフンカナバリンＡの代わりに、このヒトハプト
グロビンをリガントとして用いるアフィニティクロマト
グラフィーでＬ Ｐ Ｆ −ＨＡを精製する方法が試み
られている［ Ｉｒｏｎｓ Ｌ： Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃ
ａ ｅｔ Ｂｉｏｌ〕ｈｉｓｉｃａ Ａｃｔａ＋ ５８
０＋ １７５−１８５（１９７９）およびＣｏｕ＋ｅｌ
ｌ＋ 、ｉ：’ Ｓｅｍ１ｎａｒｓ ｉｎ 丁ｎｆｅ
ｃＬ；０１１３ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ＩＶ＋ Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｉ＋ｅ＋ ３７］〜３７９ （
１９８２） １゜このヒトハプトグロビンをリガントと
して用いる場合には、新たに肝炎ウィルス対策の重要な
問題が生じる。即ち、ヒトハプトグロビンは人血液から
採取されるため、肝炎ウィルス混入の恐れがある。さら
に他の未知の感染性因子混入の懸念もなおざりにできな
いことであり、これは動物血清を用いる場合も同様であ
る。現在のところ肝炎ウィルス等の混入をチェックする
絶対的な方法はない。一方、かかる肝炎ウィルス等を不
活化するための手段として、６０℃、１０〜１５時間加
熱する方法が知られている。本発明者らは、そのような
加熱処理を行うと、ハプトグロビンのＬ Ｐ Ｆ −Ｈ
Ａに対する親和性はほとんど喪失され、目的とする効果
がなくなってしまうという重大な欠陥があることを見出
した。
また、前記のハイドロキシアパタイトゲルを用いる精製
法でも、ハイドロキシアパタイトが高価であるために、
Ｌ Ｐ Ｆ −ＨＡを工業的にかつ安価に採取するには
問題がある。
法でも、ハイドロキシアパタイトが高価であるために、
Ｌ Ｐ Ｆ −ＨＡを工業的にかつ安価に採取するには
問題がある。
発明の目的
本発明者らは、Ｌ Ｐ Ｆ −ＨＡの工業的な単離精製
法を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、百日せき菌
培養物から得られるＬ Ｐ Ｆ −ＨＡ含有液を、セル
ロース硫酸エステルデルに接触せしめ、Ｌ Ｐ Ｆ −
ＨＡを吸着させ、夾雑物質と分離した後該セルロース硫
酸エステルゲルから溶出することにより、高純度のＬ
Ｐ Ｆ −ＨＡがぎわめて簡単にしかも非常に高い収率
で得られることを発見し、本発明を完成するに至った。
法を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、百日せき菌
培養物から得られるＬ Ｐ Ｆ −ＨＡ含有液を、セル
ロース硫酸エステルデルに接触せしめ、Ｌ Ｐ Ｆ −
ＨＡを吸着させ、夾雑物質と分離した後該セルロース硫
酸エステルゲルから溶出することにより、高純度のＬ
Ｐ Ｆ −ＨＡがぎわめて簡単にしかも非常に高い収率
で得られることを発見し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な生物学的
活性物質であるＬ Ｐ Ｆ −ＨＡを、工業的に簡単で
かつ大量に、きわめて高純度にまで精製する方法を提供
することにある。
活性物質であるＬ Ｐ Ｆ −ＨＡを、工業的に簡単で
かつ大量に、きわめて高純度にまで精製する方法を提供
することにある。
発明の構成および効果
本発明は、百日せき菌培養物から得られるＬＰＦ−ＨＡ
含有１を、セルロース硫酸エステルゲルに接触せしめ、
ＬＰＦ−ＨＡを吸着させた後、該ゲルからＬＰＦ−ＨＡ
を溶出することを特徴とするＬＰＦ−ＨＡの精製方法で
ある。
含有１を、セルロース硫酸エステルゲルに接触せしめ、
ＬＰＦ−ＨＡを吸着させた後、該ゲルからＬＰＦ−ＨＡ
を溶出することを特徴とするＬＰＦ−ＨＡの精製方法で
ある。
本発明において出発材料として用いられる百日せト菌培
養物としては、百日ぜき■相菌を通常の培地、たとえば
コーエン・ウィラー培地や、ステナー・ショルテ培地な
どの液状培地にて、常法により静置培養または振盪培養
もしくは通気撹拌培養して得られる培養物である。この
培養物は、遠心分離により菌体を除去した培養上清、あ
るいは菌体破壊物遠心上清、あるいはこれらの部分精製
標品の形で本発明方法に供される。
養物としては、百日ぜき■相菌を通常の培地、たとえば
コーエン・ウィラー培地や、ステナー・ショルテ培地な
どの液状培地にて、常法により静置培養または振盪培養
もしくは通気撹拌培養して得られる培養物である。この
培養物は、遠心分離により菌体を除去した培養上清、あ
るいは菌体破壊物遠心上清、あるいはこれらの部分精製
標品の形で本発明方法に供される。
本発明で用いられるセルロース硫酸エステルデルとは、
セルロースを硫酸エステル化して得られるのであるが、
好ましくは結晶セルロースあるいは、結晶領域および非
結晶領域からなるセルロースを硫酸エステル化したもの
が良い。この場合、得られたセルロース硫酸エステルは
原料の形状を保持し、水性媒質に不溶性であり、物理的
安定性にすぐれ、クロマトグラフィー用ゲルとして好適
である。これらの原料セルロース類はすでに市販されて
おり例えば、セルロアフィンＧＣ−１５、同ＧＨ＝２５
、同ｃ；ｃ−ｉ ｏ ｏ、同ＧＣ−２００（チッソ社製
）、アビセル（旭化成工業社製）などがある。これらの
ゲルを例えばピリジンなどの有機溶媒の存在下クロルス
ルホン酸、無水硫酸などを作用させることにより所望の
セルロース硫酸エステルゲルが得られる。
セルロースを硫酸エステル化して得られるのであるが、
好ましくは結晶セルロースあるいは、結晶領域および非
結晶領域からなるセルロースを硫酸エステル化したもの
が良い。この場合、得られたセルロース硫酸エステルは
原料の形状を保持し、水性媒質に不溶性であり、物理的
安定性にすぐれ、クロマトグラフィー用ゲルとして好適
である。これらの原料セルロース類はすでに市販されて
おり例えば、セルロアフィンＧＣ−１５、同ＧＨ＝２５
、同ｃ；ｃ−ｉ ｏ ｏ、同ＧＣ−２００（チッソ社製
）、アビセル（旭化成工業社製）などがある。これらの
ゲルを例えばピリジンなどの有機溶媒の存在下クロルス
ルホン酸、無水硫酸などを作用させることにより所望の
セルロース硫酸エステルゲルが得られる。
本発明において、セルロース硫酸エステルゲルを用いて
、百日せき菌が産生するＬ Ｐ Ｆ −ＨＡを精製採取
するにあたっては、たとえば、次のような方法で行なわ
れる。
、百日せき菌が産生するＬ Ｐ Ｆ −ＨＡを精製採取
するにあたっては、たとえば、次のような方法で行なわ
れる。
原材料液であるＬＰＦ−ＨＡ含有液は、百日せき菌培養
物の遠心上清を、蒸留水または緩衝液で比電導度が０．
５〜５．Ｏｍｓ／ｃｍとなるように希釈した後、吸着操
作に付すこともできるが、この−上清中にはセルロース
硫酸エステルゲルに対して同じく親和性を有するＦ
ＨＡ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ−ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉ
ｎｉｎ）が含まれているため、あらかじめ、ＬＰＦ−Ｈ
Ａは吸着せ□ずＦ −ＨＡを吸着する条件にて、セルロ
ース硫酸エステルゲルによるクロマトグラフィーを行な
い（比電導度５．０〜２５．０ｉｓ／ｃｍ、 ｐＨ５〜
９の緩衝液で平衡化されたセルロース硫酸エステルゲル
充填カラムに比電導度５゜０−２５．Ｏｍｓ／ｃｍ、ｐ
Ｈ５−９に調整した原材料液を通液する）、その素通り
画分であるところのＦ−ＨＡを含ますＩ−Ｐ Ｆ−ＨＡ
を大量に含んだ両分を吸着繰作に付してもよい。
物の遠心上清を、蒸留水または緩衝液で比電導度が０．
５〜５．Ｏｍｓ／ｃｍとなるように希釈した後、吸着操
作に付すこともできるが、この−上清中にはセルロース
硫酸エステルゲルに対して同じく親和性を有するＦ
ＨＡ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ−ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉ
ｎｉｎ）が含まれているため、あらかじめ、ＬＰＦ−Ｈ
Ａは吸着せ□ずＦ −ＨＡを吸着する条件にて、セルロ
ース硫酸エステルゲルによるクロマトグラフィーを行な
い（比電導度５．０〜２５．０ｉｓ／ｃｍ、 ｐＨ５〜
９の緩衝液で平衡化されたセルロース硫酸エステルゲル
充填カラムに比電導度５゜０−２５．Ｏｍｓ／ｃｍ、ｐ
Ｈ５−９に調整した原材料液を通液する）、その素通り
画分であるところのＦ−ＨＡを含ますＩ−Ｐ Ｆ−ＨＡ
を大量に含んだ両分を吸着繰作に付してもよい。
セルロース硫酸エステルゲルへのＬＰＦ−ＨＡの吸着、
ゲルの洗浄、ＬＰＦ−ＨＡの溶出等一連の精製操作は、
バッチ法およびカラム法等の工業的に通常よく用いられ
る繰作方法で行なうことができるが、カラム法の方が繰
作が簡単であり好都合である。カラム法の場合、セルロ
ース硫酸エステルゲルをカラムに充填し、あらカルめ例
えば０゜０２ Ｍ マツキルベン（Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ
’ｓ）緩衝液（ｐＨ５，２）等の比電導度０ 、５〜Ｓ
、 Ｏｍｓ／ｃｍでｐＨが５．０〜９．０程度である
適当な緩衝液を通液して平衡化を行った後に、ＬＰＦ−
ＨＡの吸着繰作に移る。
ゲルの洗浄、ＬＰＦ−ＨＡの溶出等一連の精製操作は、
バッチ法およびカラム法等の工業的に通常よく用いられ
る繰作方法で行なうことができるが、カラム法の方が繰
作が簡単であり好都合である。カラム法の場合、セルロ
ース硫酸エステルゲルをカラムに充填し、あらカルめ例
えば０゜０２ Ｍ マツキルベン（Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ
’ｓ）緩衝液（ｐＨ５，２）等の比電導度０ 、５〜Ｓ
、 Ｏｍｓ／ｃｍでｐＨが５．０〜９．０程度である
適当な緩衝液を通液して平衡化を行った後に、ＬＰＦ−
ＨＡの吸着繰作に移る。
吸着に際しては、ＬＰＦ−ＨＡの含有液をｐＨが５．０
〜９．０、比電導度が０．５〜５．０になるように適宜
調整して、セルロース硫酸エステルデル充填カラムに通
液し、ＬＰＦ−ＨＡを吸着させる。この後、前述の平衡
化に用いたのと同様の緩衝液を通液し、ゲルを洗浄し、
夾雑物質を洗い出ＬＰＦ−ＨＡの溶出に際しては、ｐＨ
が５．０・〜９．０、比電導度が５．０以上である適当
な緩衝液を通渡し溶出を行なうが、好ましくは段階溶出
または塩濃度勾配溶出を行なう。′すなわ輻、原材料液
として百日せき菌培養液の遠心上清の希釈したものをそ
のまま用いる場合は、前述の吸着条件下において、ＬＰ
Ｆ−ＨＡと同時にＦ−ＨＡも吸着されてくるので、１．
ＰＦ’−ＨＡが溶出され、がっＦ−Ｈ，Ａが溶出されな
い条件下で溶出する必要がある。この条件としては１）
Ｈ５〜９において比電導度５−１ ＋１０ｍｓ／ｃａ＋
、好ましくは５０５０−６Ｏ／ｃｍである適当な緩衝液
（例えば０．７Ｍ塩化ナトリウム添加０．０２Ｍマツキ
ルベン緩衝液）を最初に通液し、ＬＰＦ−ＨＡを含む両
分を回収する。
〜９．０、比電導度が０．５〜５．０になるように適宜
調整して、セルロース硫酸エステルデル充填カラムに通
液し、ＬＰＦ−ＨＡを吸着させる。この後、前述の平衡
化に用いたのと同様の緩衝液を通液し、ゲルを洗浄し、
夾雑物質を洗い出ＬＰＦ−ＨＡの溶出に際しては、ｐＨ
が５．０・〜９．０、比電導度が５．０以上である適当
な緩衝液を通渡し溶出を行なうが、好ましくは段階溶出
または塩濃度勾配溶出を行なう。′すなわ輻、原材料液
として百日せき菌培養液の遠心上清の希釈したものをそ
のまま用いる場合は、前述の吸着条件下において、ＬＰ
Ｆ−ＨＡと同時にＦ−ＨＡも吸着されてくるので、１．
ＰＦ’−ＨＡが溶出され、がっＦ−Ｈ，Ａが溶出されな
い条件下で溶出する必要がある。この条件としては１）
Ｈ５〜９において比電導度５−１ ＋１０ｍｓ／ｃａ＋
、好ましくは５０５０−６Ｏ／ｃｍである適当な緩衝液
（例えば０．７Ｍ塩化ナトリウム添加０．０２Ｍマツキ
ルベン緩衝液）を最初に通液し、ＬＰＦ−ＨＡを含む両
分を回収する。
この後に上述の溶出用緩衝液より比電導度の大なる（１
００−３００ｍｓ／ｃｍ）緩衝液を通液し、Ｆ−ＨＡそ
の他の不純成分を溶出させ、セルロース硫酸エステルデ
ルを平衡化再使用に供する。
００−３００ｍｓ／ｃｍ）緩衝液を通液し、Ｆ−ＨＡそ
の他の不純成分を溶出させ、セルロース硫酸エステルデ
ルを平衡化再使用に供する。
最も好ましくは、塩濃度勾配溶出を実施する。
原材料液として、あら劣化めＦ−ＨＡを分離したＬ Ｐ
Ｆ −ＨＡ含有液を用いる場合においても、比電導度
が０．５→３００ｍ５／ｃｍとなるような塩濃度勾配緩
衝液（例えば塩化す） ＩＪウム０→４．ＯＭ塩濃度勾
配・（１，０２Ｍマツキルベン緩衝液（ｐＨ５，２）を
用いて溶出を行ない、ＬＰＦ−ＨＡ含有画分を分取すれ
ば、きわめて高純度のＬＰＦ−ＨＡを得ることができる
。
Ｆ −ＨＡ含有液を用いる場合においても、比電導度
が０．５→３００ｍ５／ｃｍとなるような塩濃度勾配緩
衝液（例えば塩化す） ＩＪウム０→４．ＯＭ塩濃度勾
配・（１，０２Ｍマツキルベン緩衝液（ｐＨ５，２）を
用いて溶出を行ない、ＬＰＦ−ＨＡ含有画分を分取すれ
ば、きわめて高純度のＬＰＦ−ＨＡを得ることができる
。
本発明の精製法によれば、ＬＰＦ−ＨＡの精製度は数十
倍に達し、しかもＬＰＦ−ＨＡの回収率は９０％以上１
００％近くに達する。得られる精製ＬＰＦ−ＨＡの比活
性は９Ｘ１０喝ＬＰＥＵ／鴫蛋白質ときわめて高く、ポ
リアクリルアミ−ディスク電気泳動（ｐＨ４，５’）分
析において単一のバンドを形成し、百日せき菌内毒素が
ほぼ完全に除去される。
倍に達し、しかもＬＰＦ−ＨＡの回収率は９０％以上１
００％近くに達する。得られる精製ＬＰＦ−ＨＡの比活
性は９Ｘ１０喝ＬＰＥＵ／鴫蛋白質ときわめて高く、ポ
リアクリルアミ−ディスク電気泳動（ｐＨ４，５’）分
析において単一のバンドを形成し、百日せき菌内毒素が
ほぼ完全に除去される。
上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料の百日せ
き菌培養物から所望のＬＰＦ−ＨＡを高収率、高純度に
採取することかでｂ、その操作もきわめて簡単で、また
その精製用クロマトグラフィー吸着体は、安価に調製で
き、しかもくり返し使用しても劣化が全く無く、きわめ
て経済的にすぐれている。
き菌培養物から所望のＬＰＦ−ＨＡを高収率、高純度に
採取することかでｂ、その操作もきわめて簡単で、また
その精製用クロマトグラフィー吸着体は、安価に調製で
き、しかもくり返し使用しても劣化が全く無く、きわめ
て経済的にすぐれている。
したがって、本発明方法は高純度１． Ｆ’ Ｆ −Ｈ
Ａの工業的精製法としてきわめてすぐれた方法である。
Ａの工業的精製法としてきわめてすぐれた方法である。
また本発明の方法は従来の技術である蔗糖密度勾配超遠
心分離法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー法等
と組合わせることも可能であり、その際は従来方法で得
られる結果に比して非常にすぐれた結果を得ることがで
きる。
心分離法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー法等
と組合わせることも可能であり、その際は従来方法で得
られる結果に比して非常にすぐれた結果を得ることがで
きる。
本発明の方法で得られるＬ Ｐ Ｆ −ＨＡは高純度で
他の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素もほぼ
完全に除去されているため、その生物学的活性を利用し
た各種試薬、医薬品の調製、さらに百日せきワクチンの
調製に有用である。
他の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素もほぼ
完全に除去されているため、その生物学的活性を利用し
た各種試薬、医薬品の調製、さらに百日せきワクチンの
調製に有用である。
ヌ蒸例
以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。
説明する。
調製例１
０℃以下の温度にてピリジン６００Ｊ にクロルスル
ホン酸１１７ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、混液
を加熱し、６５〜７０ ”Ｃに昇温する。
ホン酸１１７ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、混液
を加熱し、６５〜７０ ”Ｃに昇温する。
この中にセルロファインＧＣ−１５（チッソ社製）８１
）ｇを加え、撹拌下６５〜７０℃にて３時間反応させる
。反応終了後、冷却し、１０％水酸化ナトリウム水溶液
を加えて中和する。ゲルを濾過分離し、０ 、 （１１
Ｍ ＋７ン酸緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫
酸エステルゲルを得る。
）ｇを加え、撹拌下６５〜７０℃にて３時間反応させる
。反応終了後、冷却し、１０％水酸化ナトリウム水溶液
を加えて中和する。ゲルを濾過分離し、０ 、 （１１
Ｍ ＋７ン酸緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫
酸エステルゲルを得る。
調製例２
０ ’Ｃ以下の温度にてピリジン６００−にクロルスル
ホン酸１１７ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、混液
を加熱し、６５〜７０℃に昇温する。
ホン酸１１７ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、混液
を加熱し、６５〜７０℃に昇温する。
この中に結晶セルロースであるクロマトグラフィー用ア
ビセル（旭化成工業社製）８０ｇを加え、撹拌下６５〜
７０℃にて４時間保持する。反応終了後、冷却し、１０
％水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ケ′ルを
濾過分離し、０．ＯＩＭリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄
してセルロース硫酸エステルゲルを得る。
ビセル（旭化成工業社製）８０ｇを加え、撹拌下６５〜
７０℃にて４時間保持する。反応終了後、冷却し、１０
％水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ケ′ルを
濾過分離し、０．ＯＩＭリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄
してセルロース硫酸エステルゲルを得る。
実施例１
前記調製例１と同様にして調製したセルロファインＧＣ
−１５の硫酸エステルゲルをカラム（４０＋ｎｍφＸ２
００ｍｍ）に充填し、これに蒸留水１．（）ｌ）を通液
する。このカラムに百日せ％Ｉ相菌東浜株静置培養液の
遠心上清５ ＋’、） Ｏｌｌ１ｌを蒸留水で１０倍希
釈した液（比電導度的１ 、５ ｍｓ／ｃｏ＋）、を通
液する。約５（１０ｍｌの０．０２Ｍマツキルベン緩衝
液（ｐＨ５，２）をカラムに通液し、ゲルを洗浄した後
、０．０２Ｍ塩化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液（
比電導度的２．Ｏｎ＋ｓ／Ｃｍ、ｐＨ５，２）２０００
輸１を用い、塩化ナトリウム０→４．ＯＭの塩濃度勾配
にて溶出を行ない、約２０ｍ１ずつ分画して分取した後
、ＬＰＦ−ＨＡを含有する両分的１３０ｍ１をプールす
る。
−１５の硫酸エステルゲルをカラム（４０＋ｎｍφＸ２
００ｍｍ）に充填し、これに蒸留水１．（）ｌ）を通液
する。このカラムに百日せ％Ｉ相菌東浜株静置培養液の
遠心上清５ ＋’、） Ｏｌｌ１ｌを蒸留水で１０倍希
釈した液（比電導度的１ 、５ ｍｓ／ｃｏ＋）、を通
液する。約５（１０ｍｌの０．０２Ｍマツキルベン緩衝
液（ｐＨ５，２）をカラムに通液し、ゲルを洗浄した後
、０．０２Ｍ塩化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液（
比電導度的２．Ｏｎ＋ｓ／Ｃｍ、ｐＨ５，２）２０００
輸１を用い、塩化ナトリウム０→４．ＯＭの塩濃度勾配
にて溶出を行ない、約２０ｍ１ずつ分画して分取した後
、ＬＰＦ−ＨＡを含有する両分的１３０ｍ１をプールす
る。
原材料液および精製ＬＰＦ−’ＨＡ画分の分析結果およ
び実験成績を第１表に示す。
び実験成績を第１表に示す。
第１表
１）ＬＰＦ−ＨＡのｉｎ ｖｉｔｒｏテスト：ハプト−
ＥＬＩＳＡ法［佐原ら、第２８回毒素シンポジウム予稿
集１４１−１４４（１９８１）を参照１によるＬＰＦ−
ＨＡの単位 ２）キルブール法蛋白窒素測定値Ｘ６．２５により蛋白
質含量として表示 ３） ６．２５μｇ蛋白質／ｍ ｌの含量に希釈後、
生物学的製剤基準（薬発２８７号、１９８１）に準じて
不活化して実施した。
ＥＬＩＳＡ法［佐原ら、第２８回毒素シンポジウム予稿
集１４１−１４４（１９８１）を参照１によるＬＰＦ−
ＨＡの単位 ２）キルブール法蛋白窒素測定値Ｘ６．２５により蛋白
質含量として表示 ３） ６．２５μｇ蛋白質／ｍ ｌの含量に希釈後、
生物学的製剤基準（薬発２８７号、１９８１）に準じて
不活化して実施した。
実施例２
調製例１と同様にして得ちれるセルロース硫酸エステル
ゲル２．Ｏｌを各１ｆずつ２本のカラム（８０鰭φＸ２
００＋ｕ）に充填する。一方のカラムを０．２Ｍ塩化ナ
トリウム添加０，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２、比
電導度２ ＬＯｅｉｓ／ｃ＠）を通液して平衡化させ、
他方のカラムには蒸留水を通液する。
ゲル２．Ｏｌを各１ｆずつ２本のカラム（８０鰭φＸ２
００＋ｕ）に充填する。一方のカラムを０．２Ｍ塩化ナ
トリウム添加０，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２、比
電導度２ ＬＯｅｉｓ／ｃ＠）を通液して平衡化させ、
他方のカラムには蒸留水を通液する。
百日ぜき■相菌束浜株の通気撹拌培養上清２０゜ＯＲを
、上記リン酸緩衝液で平衡化したカラムに通液し、その
素通り画ｄおよび０．２Ｍ塩化ナトリウム添加０．ＯＩ
ＭＩＪン酸緩衝液（比電導度２１゜０ＬＯｓ／ｃｍ）に
よる洗浄画分のうち、Ｌ Ｐ Ｆ −ＨＡを含有する両
分（２１，Ｊ）を集めてプールする。
、上記リン酸緩衝液で平衡化したカラムに通液し、その
素通り画ｄおよび０．２Ｍ塩化ナトリウム添加０．ＯＩ
ＭＩＪン酸緩衝液（比電導度２１゜０ＬＯｓ／ｃｍ）に
よる洗浄画分のうち、Ｌ Ｐ Ｆ −ＨＡを含有する両
分（２１，Ｊ）を集めてプールする。
このプール画分を蒸留水で希釈し、比電導度的１゜５ｍ
ｓ／ｃｎ＋に調整したのち、上記蒸留水を通液したカラ
ムに通す。約２０．ｅの０．０２Ｍマツキルベン緩衝液
（比電導度２ 、 Ｏｍｓ／ ｃｍ、ｐＨ５，２）を通
液して洗浄した後、０．０２Ｍマツキルベン緩衝液（ｐ
Ｈ５、２）１０ρを用い、塩化ナトリウム０→３．０Ｍ
の塩濃度勾配で溶出を行ない、ＬＰＦ−ＨＡを含有する
両分１．ＩＩ！を得る。
ｓ／ｃｎ＋に調整したのち、上記蒸留水を通液したカラ
ムに通す。約２０．ｅの０．０２Ｍマツキルベン緩衝液
（比電導度２ 、 Ｏｍｓ／ ｃｍ、ｐＨ５，２）を通
液して洗浄した後、０．０２Ｍマツキルベン緩衝液（ｐ
Ｈ５、２）１０ρを用い、塩化ナトリウム０→３．０Ｍ
の塩濃度勾配で溶出を行ない、ＬＰＦ−ＨＡを含有する
両分１．ＩＩ！を得る。
原材料液および精製ＬＰＦ−ＨＡ画分の分析結果および
実験成績を第２表に示す。
実験成績を第２表に示す。
また、ＬＰＦ−ＨＡのセルロース硫酸エステルゲルから
の溶出液のクロマトグラムを第１図に示す。第１図にお
け−る横軸は分取量的１００ｓｌの分画番号で、縦軸は
その両分の波長２８０ｎｍでの吸光値Ａ２１０と比電導
度（−ｓ／ｃｍ）、ハプト−ＥＬＴＳＡ法によるＬＰＦ
−ＨＡ含量（ＬＰＥＵ／＋ｅｌ）およびニワトリ血球凝
集試験［５ａｔｏ、 Ｙ、 ｅｔ ａｌ、＋Ｉｎｆｅｃ
ｔ、 Ｉｍｍｕｎ、、 ７． ９２９’（１９７３
）］ ｌこよるＨＡ価（ＨＡＵ／ｍｌ）をプロットした
ものである。
の溶出液のクロマトグラムを第１図に示す。第１図にお
け−る横軸は分取量的１００ｓｌの分画番号で、縦軸は
その両分の波長２８０ｎｍでの吸光値Ａ２１０と比電導
度（−ｓ／ｃｍ）、ハプト−ＥＬＴＳＡ法によるＬＰＦ
−ＨＡ含量（ＬＰＥＵ／＋ｅｌ）およびニワトリ血球凝
集試験［５ａｔｏ、 Ｙ、 ｅｔ ａｌ、＋Ｉｎｆｅｃ
ｔ、 Ｉｍｍｕｎ、、 ７． ９２９’（１９７３
）］ ｌこよるＨＡ価（ＨＡＵ／ｍｌ）をプロットした
ものである。
第２表
１）、 ２）、 ３） 第１表に同じ
第１図は、本発明方法によりＬＰＦ−ＨＡ含有液を精製
処理した場合の各溶出画分と、吸光値、比電導度、Ｌ
Ｐ Ｆ −ＨＡ含量およびＨＡ価の関係を示したグラフ
である。
処理した場合の各溶出画分と、吸光値、比電導度、Ｌ
Ｐ Ｆ −ＨＡ含量およびＨＡ価の関係を示したグラフ
である。
Claims (5)
- （１）百日せき菌が産生するＬＰＦ−ＨＡを精製取得す
るに際し、該ＬＰＦ−ＨＡ含有液を、セルロース硫酸エ
ステルのゲルに接触せしめ、ＬＰＦ−ＨＡを吸着させて
不純物と分離した後、該セルロース硫酸エステルゲルよ
りＬＰＦ−ＨＡを溶出することを特徴とするＬＰＦ−Ｈ
Ａの精製方法。 - （２）セルロース硫酸エステルゲルが結晶セルロースま
たは結晶領域および非結晶領域からなるセルロースの硫
酸エステルゲルである前記第（１）項記載の方法。 - （３）該吸着処理を、ｐＨ５．０〜９．０、温度０〜３
０℃、比電導度０．５〜５．０ｍｓ／ｃｍの条件下に行
なう前記第（１）項または第（２）項記載の方法。 - （４）ＬＰＦ−ＨＡを吸着したゲルからの溶出を、比電
導度５．０〜１００．０ｍｓ／ｃｍの緩衝液を用いて行
なう前記第（１）〜（３）項のいずれか１つの方法。 - （５）該溶出処理に先だって、吸着ゲルを、比電導度０
．５〜５．０ｍｓ／ｃｍの緩衝液で洗浄する前記第（４
）項記載の方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15094584A JPS6130528A (ja) | 1984-07-19 | 1984-07-19 | Ｌｐｆ−ｈａの精製方法 |
| KR1019850005097A KR890001003B1 (ko) | 1984-07-19 | 1985-07-16 | Lpf-ha의 정제방법 |
| AU45093/85A AU571713B2 (en) | 1984-07-19 | 1985-07-17 | Method of purification of lpf-ha from bordetella pertussis |
| CA000487035A CA1239104A (en) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Method for the purification of lpf-ha |
| EP85108983A EP0170162B1 (en) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Method for the purification of leukocytosis-promoting factor haemagglutinin |
| DE8585108983T DE3577658D1 (de) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Verfahren zur reinigung vom leukocytosis-foerderungsfaktor haemagglutinin. |
| AT85108983T ATE52694T1 (de) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Verfahren zur reinigung vom leukocytosisf¯rderungsfaktor haemagglutinin. |
| US07/122,576 US4885359A (en) | 1984-07-19 | 1987-11-16 | Method for the purification of LPF-HA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15094584A JPS6130528A (ja) | 1984-07-19 | 1984-07-19 | Ｌｐｆ−ｈａの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6130528A true JPS6130528A (ja) | 1986-02-12 |
| JPS6241691B2 JPS6241691B2 (ja) | 1987-09-04 |
Family
ID=15507848
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15094584A Granted JPS6130528A (ja) | 1984-07-19 | 1984-07-19 | Ｌｐｆ−ｈａの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6130528A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2010250465B2 (en) * | 2009-05-19 | 2014-07-10 | Chikusui Canycom, Inc. | Cutting blade mounting and removal structure for mower |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63269485A (ja) * | 1987-04-27 | 1988-11-07 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 厨房装置 |
-
1984
- 1984-07-19 JP JP15094584A patent/JPS6130528A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2010250465B2 (en) * | 2009-05-19 | 2014-07-10 | Chikusui Canycom, Inc. | Cutting blade mounting and removal structure for mower |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6241691B2 (ja) | 1987-09-04 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |