JPS6241692B2 - - Google Patents
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- JPS6241692B2 JPS6241692B2 JP59190244A JP19024484A JPS6241692B2 JP S6241692 B2 JPS6241692 B2 JP S6241692B2 JP 59190244 A JP59190244 A JP 59190244A JP 19024484 A JP19024484 A JP 19024484A JP S6241692 B2 JPS6241692 B2 JP S6241692B2
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Description
本発明は、百日せき菌が産生するLPF−HA
（Leucocytosis promoting factor
hemagglutinin）の精製方法、さらに詳しくは、
百日せき菌培養物から得られるLPF−HA含有液
を、デキストラン硫酸が化学的に結合されたポリ
サツカライドゲル誘導体に接触せしめ、LPF−
HAを吸着させた後、LPF−HAを該ゲルから溶
出することによりLPF−HAを精製する方法に関
する。 産業上の利用分野 LPF−HAは、百日せき菌相菌および相菌
が産生する活性物質であつて、毒力
（virulence）を欠く相菌やパラ百日せき菌・気
管支敗血症菌は産生しない。このLPF−HAは百
日せき毒素とも称され、多様な生理活性を有する
蛋白質であることが知られている。その主な生理
活性としては、白血球増多活性、インシユリン分
泌増強活性、ヒスタミン増感活性、赤血球凝集活
性等が知られており、なかでも、そのインシユリ
ン分泌増強活性にもとづいて、糖尿病の治療剤と
しての応用が注目されている。 これらの生理活性とは別に、最近になつて百日
せき菌の感染および発病の防御にLPF−HAがき
わめて重要な役割を演じていることが明らかにさ
れ、百日せき菌感染防御抗原としても注目される
ようになつた〔ピツトマン（Pittman，Ｍ）；レ
ビユー・オブ・インフエクシヤス・デイジージズ
（Review of Infectious Diseases），１，401〜
409（1979）、およびサトウ（Sato，Ｙ）；セミナ
ーズ・イン・インフエクシヤス・デイジージズ
（Seminars in Infectious Diseases）、バクテ
リアル・ワクチン（Bacterial Vaccine），380〜
385（1982）〕。 したがつて、LPF−HAの生理活性を研究する
うえに、またその生理活性を利用した医薬品の製
造のために、さらには副作用のより少ない百日せ
きワクチンを工業的に製造するために、LPF−
HAを簡単にかつ大量に単離精製する方法の開発
が望まれている。 従来技術 従来知られているLPF−HAの採取精製法で
は、百日せき菌培養物を硫安塩析し、ついで抽
出、透析したものを出発材料とし、これをイオン
交換クロマトグラフイー、ゲル過〔アライ
（Arai，Ｈ）；ビオヒミカ・エ・ビオフイジカ・
アクタ（Biochimica et Biophysica Acta），
444，765（1976）〕、あるいは蔗糖濃度勾配遠心
〔サトウ（Sato，Ｙ）；インフエクシヨン・アン
ド・イミユニテイ（Infect.Immun.），６，897〜
704，（1972）〕などによつて精製する方法が採用
されている。しかしながら、このような方法で
は、高純度のLPF−HAを得ることは難しく、ま
たその収量も少ない。 高純度のLPF−HAを比較的大量に得る方法と
して、百日せき菌培養上清液をハイドロキシアパ
タイトのカラムに通してLPF−HAを吸着させ、
洗浄、溶出後、コンカナバリンＡ−セフアロース
（ConA−Sepharose，フアルマシア社製）による
アフイニテイクロマトグラフイーで精製する方法
が提案されているヤジマ（〔Yajima，Ｍ）；ジヤ
ーナル・オブ・バイオケミストリイ（Ｊ，
Biochem），83，295〜303（1978）〕。しかしなが
ら、このコンカナバリンＡをリガントとするとア
フイニテイクロマトグラフイーは、LPF−HAの
みと親和性を有するのではなく、糖類や糖脂質、
さらに他の糖蛋白質なども吸着するため、百日せ
き菌の他の成分、たとえばＦ−HA
（Filamentous−Hemagglutinin）や菌体膜成分な
ども吸着し、所望のLPF−HAを高純度で単離す
ることが難しく、優れたアフイニテイクロマトグ
ラフイーとはいえない。 最近、ヒトハプトグロビンがLPF−HAに特異
的に結合することが発見されて以来、上記の方法
におけるコンカナバリンＡの代わりに、このヒト
ハプトグロビンをリガントとして用いるアフイニ
テイクロマトグラフイーでLPF−HAを精製する
方法が試みられている〔アイアンズ（Irons
Ｌ）；ビオヒミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ
（Biochimica et Biophisica Acta），580，175〜
185（1979）およびコウエル（Cowell，Ｊ）；セ
ミナーズ・イン・インフエクシヤス・デイジージ
ズ（Seminars in Infectious Diseases）、バ
クテリアル・ワクチン（Bacterial Vaccine），
371〜379（1982）〕。このヒトハプトグロビンをリ
ガントとして用いる場合には、新たに肝炎ウイル
ス対策の重要な問題が生じる。即ち、ヒトハプト
グロビンは人血液から採取されるため、肝炎ウイ
ルス混入の恐れがある。さらに他の未知の感染性
因子混入の懸念もなおざりにできないことであ
り、これは動物血清を用いる場合も同様である。
現在のところ肝炎ウイルス等の混入をチエツクす
る絶対的な方法はない。一方、かかる肝炎ウイル
ス等を不活化するための手段として、60℃、10〜
15時間加熱する方法が知られている。本発明者ら
は、そのような加熱処理を行うと、ハプトグロビ
ンのLPF−HAに対する親和性はほとんど喪失さ
れ、目的とする効果がなくなつてしまうという重
濁な欠陥があることを見出した。 また、前記のハイドロキシアパタイトゲルを用
いる精製法でも、ハイドロキシアパタイトが高価
であるために、LPF−HAを工業的にかつ安価に
採取するには問題がある。 発明の目的 本発明者らは、LPF−HAの工業的な単離精製
法を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、百日
せき菌培養物から得られるLPF−HA含有液を、
デキストラン硫酸が化学的に結合されたポリサツ
カライドゲル誘導体に接触せしめ、LPF−HAを
吸着させ、夾雑物質と分離した後該ポリサツカラ
イドゲル誘導体から溶出することにより、高純度
のLPF−HAがきわめて簡単にしかも非常に高い
収率で得られることを発見し、本発明を完成する
に至つた。 すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な
生物学的活性物質であるLPF−HAを、工業的に
簡単でかつ大量に、きわめて高純度にまで精製す
る方法を提供することにある。 発明の構成および効果 本発明は、百日せき菌養物から得られるLPF−
HA含有液を、デキストラン硫酸が化学的に結合
されたポリサツカライドゲル誘導体に接触せし
め、LPF−HAを吸着させた後、該ゲルからLPF
−HAを溶出することを特徴とするLPF−HAの
精製方法である。 本発明において出発材料として用いられる百日
せき菌培養物としては、百日せき相菌を通常の
培地、たとえばコーエン・ウイラー培地や、ステ
ナー・シヨルテ培地などの液状培地にて、常法に
より静置培養または振盪培養もしくは通気撹拌培
養して得られる培養物である。この培養物は、遠
心分離により菌体を除去した培養上清、あるいは
菌体破壊物遠心上清、あるいはこれらの部分精製
標品の形で本発明方法に供される。 本発明において用いられるデキストラン硫酸−
ポリサツカライドゲルとは、デキストランの硫酸
エステル化物をポリサツカライドゲル誘導体に化
学的に結合させたものである。このゲルを調製す
るにあたつては、デキストラン硫酸は種々の製品
がすでに市販されており、一般的に生物関連用と
して用いられているものを使用することができ
る。一方ポリサツカライドゲル誘導体とは、アガ
ロースス、デキストラン、セルロース等のポリサ
ツカライドに、クロマトグラフイー担体として用
い得るように、通常の結晶精製処理、三次元架橋
処理、形状成型処理等を施したゲル誘導体であ
り、これらもすでに市販されており、例えばアガ
ロースゲルとしてセフアロース（Sepharose，フ
アルマシア社製）、デキストランゲルとしてセフ
アデツクス（Sephadex、フアルマシア社製）、セ
ルロースゲルとしてアビセル（旭化成製）等があ
る。 デキストラン硫酸とポリサツカライドゲルとを
化学的に結合させるには種々の方法があるが、例
えば臭化シアンを用いるアンデルソンらの方法
（特開昭52−114018号）や、臭化シアンを用い、
スペーサーとしてリジンを介して結合させる方法
ブライアン・エム・ターナー（Bryan M.
Turner）ら；ビオヒミカ・エ・ビオフイジカ・
アクタ（Biochimica et Biophysica Acta），
（659，７〜14（1981）〕等の通常よく用いられる
方法で行なえばよい。なお、デキストラン硫酸−
アガロースゲルについてはすでに市販されてお
り、例えばデキストラン硫酸−セフアロース
CL4B（フアルマシア社製）がある。 本発明において、デキストラン硫酸−ポリサツ
カライドゲルを用いて、百日せき菌が産生する
LPF−HAを精製採取するにあたつては、たとえ
ば、次のような方法で行なわれる。 原材料液であるLPF−HA含有液は、百日せき
菌培養物の遠心上清を、蒸留水または緩衝液で比
電導度が0.5〜5.0ms／cmとなるように希釈した
後、吸着操作に付すこともできるが、この上清中
にデキストラン硫酸−ポリサツカライドゲルに対
して同じく親和性を有するＦ−HA
（Filamentous−hemagglutinin）が含まれている
ため、あらかじめ、LPF−HAは吸着せずＦ−
HAを吸着する条件にて、デキストラン硫酸−ポ
リサツカライドゲルによるクロマトグラフイーを
行ない（比電導度5.0〜25.0ms／cm、PH５〜９の
緩衝液で平衡化されたデキストラン硫酸−ポリサ
ツカライドゲル充填カラムに比電導度5.0〜
25.0ms／cm、PH５〜９に調整した原材料液を通
液する）、その素通り画分であるところのＦ−
HAを含まずLPF−HAを大量に含んだ画分を吸
着操作に付してもよい。 デキストラン硫酸−ポリサツカライドゲルへの
LPF−HAの吸着、ゲルの洗浄、LPF−HAの溶
出等一連の精製操作は、バツチ法およびカラム法
等の工業的に通常よく用いられる操作方法で行な
うことができるが、カラム法の方が操作が簡単で
あり好都合である。カラム法の場合、デキストラ
ン硫酸−ポリサツカライドゲルをカラムに充填
し、あらかじめ例えば0.02Mマツキルベン
（Mcllvaine，ｓ）緩衝液（PH5.2）等の比電導度
0.5〜5.0ms／cmでPHが5.0〜9.0程度である適当な
緩衝液を通液して平衡化を行つた後に、LPF−
HAの吸着操作に移る。 吸着に際しては、LPF−HAの含有液をPHが5.0
〜9.0、比電導度が0.5〜5.0になるように適宜調整
して、デキストラン硫酸−ポリサツカライドゲル
充填カラムに通液し、LPF−HAを吸着させる。
この後、前述の平衡化に用いたのと同様の緩衝液
を通液し、ゲルを洗浄し、夾雑物質を洗い出す。 LPF−HAの溶出に際しては、PHが5.0〜9.0、
比電導度が5.0以上である適当な緩衝液を通液し
溶出を行なうが、好ましくは段階溶出または塩濃
度勾配溶出を行なう。すなわち、原材料液として
百日せき菌培養液の遠心上清の希釈したものをそ
のまま用いる場合は、前述の吸着条件下におい
て、LPF−HAと同時にＦ−HAも吸着されてく
るので、LPF−HAが溶出され、かつＦ−HAが
溶出されない条件下で溶出する必要がある。この
条件としてはPH５〜９において比電導度５〜
100ms／cm、好ましくは50〜60ms／cmである適
当な緩衝液（例えば0.7M塩化ナトリウム添加
0.02Mマツキルベン緩衝液）を最初に通液し、
LPF−HAを含む画分を回収する。この後に上述
の溶出用緩衝液より比電導度の大なる（100〜
300ms／cm）緩衝液を通液し、Ｆ−HAその他の
不純成分を溶出させ、デキストラン硫酸−ポリサ
ツカライドゲルを平衡化再使用に供する。 最も好ましくは、塩濃度勾配溶出を実施する。
原材料液として、あらかじめＦ−HAを分離した
LPF−HA含有液を用いる場合においても、比電
導度が0.5→300ms／cmとなるような塩濃度勾配
緩衝液（例えば塩化ナトリウム０→4.0M塩濃度
勾配・0.02Mマツキルベン緩衝液（PH5.2）を用
いて溶出を行ない、LPF−HA含有画分を分取す
れば、きわめて高純度のLPF−HAを得ることが
できる。 本発明の精製法によれば、LPF−HAの精製度
は数十倍に達し、しかもLPF−HAの回収率は90
％以上100％近くに達する。得られる精製LPF−
HAの比活性は９×104LPEU／mg蛋白質ときわめ
て高く、ポリアクリルアミドデイスク電気泳動
（PH4.5）分析において単一のバンドを形成し、百
日せき菌内毒素がほぼ完全に除去される。 上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料
の百日せき菌培養物から所望のLPF−HAを高収
率、高純度に採取することができ、その操作もき
わめて簡単で、またその精製用クロマトグラフイ
ー吸着体は、安価に調製でき、しかもくり返し使
用しても劣化が全く無く、きわめて経済的にすぐ
れている。 したがつて、本発明方法は高純度LPF−HAの
工業的精製法としてきわめてすぐれた方法であ
る。また本発明の方法は従来の技術である蔗糖密
度勾配超遠心分離法、あるいはイオン交換クロマ
トグラフイー法等と組合わせることも可能であ
り、その際は従来方法で得られる結果に比して非
常にすぐれた結果を得ることができる。 本発明の方法で得られるLPF−HAは高純度で
他の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素
もほぼ完全に除去されているため、その生物学的
活性を利用した各種試薬、医薬品の調製、さらに
百日せきワクチンの調製に有用である。 実施例 以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに
具体的に説明する。 調製例 １ デキストラン硫酸ナトリウム塩５ｇを200mlの
0.5M炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、この溶液
に、0.5M炭酸ナトリウム水溶液で平衡化させた
セフアロースCL−4B（フアルマシア・フアイン
ケミカルズ社製）20mlを入れゆるやかに撹拌す
る。撹拌下に、100mlの蒸留水に10ｇの臭化シア
ンを溶解した液を加える。反応液に5M水酸化ナ
トリウム水溶液を添加しつつPHを11に15分間保持
する。その後、PHを下降するに任せ、室温にて撹
拌下17時間保持する。 反応終了後、グラスフイルター上でろ過し、ゲ
ルを0.15M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（PH
7.2）で充分に洗浄してデキストラン硫酸−アガ
ロースゲル20mlを得る。 実施例 １ 前記調製例１と同様にして得られたデキストラ
ン硫酸アガロースゲル５mlをカラム（40mmφ×
200mm）に充填し蒸留水100mlを通液する。このカ
ラムに百日せき菌相菌東浜株静置培養液の遠心
上清100mlを蒸留水で８倍に希釈した液（比電導
度約3.0ms／cm）、を通液する。約300mlの0.02M
マツキルベン緩衝液（PH5.2）をカラムに通液
し、ゲルを洗浄した後、塩化ナトリウム0.02Mマ
ツキルベン緩衝液（PH5.2）100mlを用い、塩化ナ
トリウム０→4.0Mの濃度勾配にて溶出を行な
い、２mlずつ分画して分取した後、LPF−HAを
含有する画分約12mlをプールする。 原材料液および精製LPF−HA画分の分析結果
および実験成績を第１表に示す。
（Leucocytosis promoting factor
hemagglutinin）の精製方法、さらに詳しくは、
百日せき菌培養物から得られるLPF−HA含有液
を、デキストラン硫酸が化学的に結合されたポリ
サツカライドゲル誘導体に接触せしめ、LPF−
HAを吸着させた後、LPF−HAを該ゲルから溶
出することによりLPF−HAを精製する方法に関
する。 産業上の利用分野 LPF−HAは、百日せき菌相菌および相菌
が産生する活性物質であつて、毒力
（virulence）を欠く相菌やパラ百日せき菌・気
管支敗血症菌は産生しない。このLPF−HAは百
日せき毒素とも称され、多様な生理活性を有する
蛋白質であることが知られている。その主な生理
活性としては、白血球増多活性、インシユリン分
泌増強活性、ヒスタミン増感活性、赤血球凝集活
性等が知られており、なかでも、そのインシユリ
ン分泌増強活性にもとづいて、糖尿病の治療剤と
しての応用が注目されている。 これらの生理活性とは別に、最近になつて百日
せき菌の感染および発病の防御にLPF−HAがき
わめて重要な役割を演じていることが明らかにさ
れ、百日せき菌感染防御抗原としても注目される
ようになつた〔ピツトマン（Pittman，Ｍ）；レ
ビユー・オブ・インフエクシヤス・デイジージズ
（Review of Infectious Diseases），１，401〜
409（1979）、およびサトウ（Sato，Ｙ）；セミナ
ーズ・イン・インフエクシヤス・デイジージズ
（Seminars in Infectious Diseases）、バクテ
リアル・ワクチン（Bacterial Vaccine），380〜
385（1982）〕。 したがつて、LPF−HAの生理活性を研究する
うえに、またその生理活性を利用した医薬品の製
造のために、さらには副作用のより少ない百日せ
きワクチンを工業的に製造するために、LPF−
HAを簡単にかつ大量に単離精製する方法の開発
が望まれている。 従来技術 従来知られているLPF−HAの採取精製法で
は、百日せき菌培養物を硫安塩析し、ついで抽
出、透析したものを出発材料とし、これをイオン
交換クロマトグラフイー、ゲル過〔アライ
（Arai，Ｈ）；ビオヒミカ・エ・ビオフイジカ・
アクタ（Biochimica et Biophysica Acta），
444，765（1976）〕、あるいは蔗糖濃度勾配遠心
〔サトウ（Sato，Ｙ）；インフエクシヨン・アン
ド・イミユニテイ（Infect.Immun.），６，897〜
704，（1972）〕などによつて精製する方法が採用
されている。しかしながら、このような方法で
は、高純度のLPF−HAを得ることは難しく、ま
たその収量も少ない。 高純度のLPF−HAを比較的大量に得る方法と
して、百日せき菌培養上清液をハイドロキシアパ
タイトのカラムに通してLPF−HAを吸着させ、
洗浄、溶出後、コンカナバリンＡ−セフアロース
（ConA−Sepharose，フアルマシア社製）による
アフイニテイクロマトグラフイーで精製する方法
が提案されているヤジマ（〔Yajima，Ｍ）；ジヤ
ーナル・オブ・バイオケミストリイ（Ｊ，
Biochem），83，295〜303（1978）〕。しかしなが
ら、このコンカナバリンＡをリガントとするとア
フイニテイクロマトグラフイーは、LPF−HAの
みと親和性を有するのではなく、糖類や糖脂質、
さらに他の糖蛋白質なども吸着するため、百日せ
き菌の他の成分、たとえばＦ−HA
（Filamentous−Hemagglutinin）や菌体膜成分な
ども吸着し、所望のLPF−HAを高純度で単離す
ることが難しく、優れたアフイニテイクロマトグ
ラフイーとはいえない。 最近、ヒトハプトグロビンがLPF−HAに特異
的に結合することが発見されて以来、上記の方法
におけるコンカナバリンＡの代わりに、このヒト
ハプトグロビンをリガントとして用いるアフイニ
テイクロマトグラフイーでLPF−HAを精製する
方法が試みられている〔アイアンズ（Irons
Ｌ）；ビオヒミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ
（Biochimica et Biophisica Acta），580，175〜
185（1979）およびコウエル（Cowell，Ｊ）；セ
ミナーズ・イン・インフエクシヤス・デイジージ
ズ（Seminars in Infectious Diseases）、バ
クテリアル・ワクチン（Bacterial Vaccine），
371〜379（1982）〕。このヒトハプトグロビンをリ
ガントとして用いる場合には、新たに肝炎ウイル
ス対策の重要な問題が生じる。即ち、ヒトハプト
グロビンは人血液から採取されるため、肝炎ウイ
ルス混入の恐れがある。さらに他の未知の感染性
因子混入の懸念もなおざりにできないことであ
り、これは動物血清を用いる場合も同様である。
現在のところ肝炎ウイルス等の混入をチエツクす
る絶対的な方法はない。一方、かかる肝炎ウイル
ス等を不活化するための手段として、60℃、10〜
15時間加熱する方法が知られている。本発明者ら
は、そのような加熱処理を行うと、ハプトグロビ
ンのLPF−HAに対する親和性はほとんど喪失さ
れ、目的とする効果がなくなつてしまうという重
濁な欠陥があることを見出した。 また、前記のハイドロキシアパタイトゲルを用
いる精製法でも、ハイドロキシアパタイトが高価
であるために、LPF−HAを工業的にかつ安価に
採取するには問題がある。 発明の目的 本発明者らは、LPF−HAの工業的な単離精製
法を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、百日
せき菌培養物から得られるLPF−HA含有液を、
デキストラン硫酸が化学的に結合されたポリサツ
カライドゲル誘導体に接触せしめ、LPF−HAを
吸着させ、夾雑物質と分離した後該ポリサツカラ
イドゲル誘導体から溶出することにより、高純度
のLPF−HAがきわめて簡単にしかも非常に高い
収率で得られることを発見し、本発明を完成する
に至つた。 すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な
生物学的活性物質であるLPF−HAを、工業的に
簡単でかつ大量に、きわめて高純度にまで精製す
る方法を提供することにある。 発明の構成および効果 本発明は、百日せき菌養物から得られるLPF−
HA含有液を、デキストラン硫酸が化学的に結合
されたポリサツカライドゲル誘導体に接触せし
め、LPF−HAを吸着させた後、該ゲルからLPF
−HAを溶出することを特徴とするLPF−HAの
精製方法である。 本発明において出発材料として用いられる百日
せき菌培養物としては、百日せき相菌を通常の
培地、たとえばコーエン・ウイラー培地や、ステ
ナー・シヨルテ培地などの液状培地にて、常法に
より静置培養または振盪培養もしくは通気撹拌培
養して得られる培養物である。この培養物は、遠
心分離により菌体を除去した培養上清、あるいは
菌体破壊物遠心上清、あるいはこれらの部分精製
標品の形で本発明方法に供される。 本発明において用いられるデキストラン硫酸−
ポリサツカライドゲルとは、デキストランの硫酸
エステル化物をポリサツカライドゲル誘導体に化
学的に結合させたものである。このゲルを調製す
るにあたつては、デキストラン硫酸は種々の製品
がすでに市販されており、一般的に生物関連用と
して用いられているものを使用することができ
る。一方ポリサツカライドゲル誘導体とは、アガ
ロースス、デキストラン、セルロース等のポリサ
ツカライドに、クロマトグラフイー担体として用
い得るように、通常の結晶精製処理、三次元架橋
処理、形状成型処理等を施したゲル誘導体であ
り、これらもすでに市販されており、例えばアガ
ロースゲルとしてセフアロース（Sepharose，フ
アルマシア社製）、デキストランゲルとしてセフ
アデツクス（Sephadex、フアルマシア社製）、セ
ルロースゲルとしてアビセル（旭化成製）等があ
る。 デキストラン硫酸とポリサツカライドゲルとを
化学的に結合させるには種々の方法があるが、例
えば臭化シアンを用いるアンデルソンらの方法
（特開昭52−114018号）や、臭化シアンを用い、
スペーサーとしてリジンを介して結合させる方法
ブライアン・エム・ターナー（Bryan M.
Turner）ら；ビオヒミカ・エ・ビオフイジカ・
アクタ（Biochimica et Biophysica Acta），
（659，７〜14（1981）〕等の通常よく用いられる
方法で行なえばよい。なお、デキストラン硫酸−
アガロースゲルについてはすでに市販されてお
り、例えばデキストラン硫酸−セフアロース
CL4B（フアルマシア社製）がある。 本発明において、デキストラン硫酸−ポリサツ
カライドゲルを用いて、百日せき菌が産生する
LPF−HAを精製採取するにあたつては、たとえ
ば、次のような方法で行なわれる。 原材料液であるLPF−HA含有液は、百日せき
菌培養物の遠心上清を、蒸留水または緩衝液で比
電導度が0.5〜5.0ms／cmとなるように希釈した
後、吸着操作に付すこともできるが、この上清中
にデキストラン硫酸−ポリサツカライドゲルに対
して同じく親和性を有するＦ−HA
（Filamentous−hemagglutinin）が含まれている
ため、あらかじめ、LPF−HAは吸着せずＦ−
HAを吸着する条件にて、デキストラン硫酸−ポ
リサツカライドゲルによるクロマトグラフイーを
行ない（比電導度5.0〜25.0ms／cm、PH５〜９の
緩衝液で平衡化されたデキストラン硫酸−ポリサ
ツカライドゲル充填カラムに比電導度5.0〜
25.0ms／cm、PH５〜９に調整した原材料液を通
液する）、その素通り画分であるところのＦ−
HAを含まずLPF−HAを大量に含んだ画分を吸
着操作に付してもよい。 デキストラン硫酸−ポリサツカライドゲルへの
LPF−HAの吸着、ゲルの洗浄、LPF−HAの溶
出等一連の精製操作は、バツチ法およびカラム法
等の工業的に通常よく用いられる操作方法で行な
うことができるが、カラム法の方が操作が簡単で
あり好都合である。カラム法の場合、デキストラ
ン硫酸−ポリサツカライドゲルをカラムに充填
し、あらかじめ例えば0.02Mマツキルベン
（Mcllvaine，ｓ）緩衝液（PH5.2）等の比電導度
0.5〜5.0ms／cmでPHが5.0〜9.0程度である適当な
緩衝液を通液して平衡化を行つた後に、LPF−
HAの吸着操作に移る。 吸着に際しては、LPF−HAの含有液をPHが5.0
〜9.0、比電導度が0.5〜5.0になるように適宜調整
して、デキストラン硫酸−ポリサツカライドゲル
充填カラムに通液し、LPF−HAを吸着させる。
この後、前述の平衡化に用いたのと同様の緩衝液
を通液し、ゲルを洗浄し、夾雑物質を洗い出す。 LPF−HAの溶出に際しては、PHが5.0〜9.0、
比電導度が5.0以上である適当な緩衝液を通液し
溶出を行なうが、好ましくは段階溶出または塩濃
度勾配溶出を行なう。すなわち、原材料液として
百日せき菌培養液の遠心上清の希釈したものをそ
のまま用いる場合は、前述の吸着条件下におい
て、LPF−HAと同時にＦ−HAも吸着されてく
るので、LPF−HAが溶出され、かつＦ−HAが
溶出されない条件下で溶出する必要がある。この
条件としてはPH５〜９において比電導度５〜
100ms／cm、好ましくは50〜60ms／cmである適
当な緩衝液（例えば0.7M塩化ナトリウム添加
0.02Mマツキルベン緩衝液）を最初に通液し、
LPF−HAを含む画分を回収する。この後に上述
の溶出用緩衝液より比電導度の大なる（100〜
300ms／cm）緩衝液を通液し、Ｆ−HAその他の
不純成分を溶出させ、デキストラン硫酸−ポリサ
ツカライドゲルを平衡化再使用に供する。 最も好ましくは、塩濃度勾配溶出を実施する。
原材料液として、あらかじめＦ−HAを分離した
LPF−HA含有液を用いる場合においても、比電
導度が0.5→300ms／cmとなるような塩濃度勾配
緩衝液（例えば塩化ナトリウム０→4.0M塩濃度
勾配・0.02Mマツキルベン緩衝液（PH5.2）を用
いて溶出を行ない、LPF−HA含有画分を分取す
れば、きわめて高純度のLPF−HAを得ることが
できる。 本発明の精製法によれば、LPF−HAの精製度
は数十倍に達し、しかもLPF−HAの回収率は90
％以上100％近くに達する。得られる精製LPF−
HAの比活性は９×104LPEU／mg蛋白質ときわめ
て高く、ポリアクリルアミドデイスク電気泳動
（PH4.5）分析において単一のバンドを形成し、百
日せき菌内毒素がほぼ完全に除去される。 上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料
の百日せき菌培養物から所望のLPF−HAを高収
率、高純度に採取することができ、その操作もき
わめて簡単で、またその精製用クロマトグラフイ
ー吸着体は、安価に調製でき、しかもくり返し使
用しても劣化が全く無く、きわめて経済的にすぐ
れている。 したがつて、本発明方法は高純度LPF−HAの
工業的精製法としてきわめてすぐれた方法であ
る。また本発明の方法は従来の技術である蔗糖密
度勾配超遠心分離法、あるいはイオン交換クロマ
トグラフイー法等と組合わせることも可能であ
り、その際は従来方法で得られる結果に比して非
常にすぐれた結果を得ることができる。 本発明の方法で得られるLPF−HAは高純度で
他の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素
もほぼ完全に除去されているため、その生物学的
活性を利用した各種試薬、医薬品の調製、さらに
百日せきワクチンの調製に有用である。 実施例 以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに
具体的に説明する。 調製例 １ デキストラン硫酸ナトリウム塩５ｇを200mlの
0.5M炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、この溶液
に、0.5M炭酸ナトリウム水溶液で平衡化させた
セフアロースCL−4B（フアルマシア・フアイン
ケミカルズ社製）20mlを入れゆるやかに撹拌す
る。撹拌下に、100mlの蒸留水に10ｇの臭化シア
ンを溶解した液を加える。反応液に5M水酸化ナ
トリウム水溶液を添加しつつPHを11に15分間保持
する。その後、PHを下降するに任せ、室温にて撹
拌下17時間保持する。 反応終了後、グラスフイルター上でろ過し、ゲ
ルを0.15M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（PH
7.2）で充分に洗浄してデキストラン硫酸−アガ
ロースゲル20mlを得る。 実施例 １ 前記調製例１と同様にして得られたデキストラ
ン硫酸アガロースゲル５mlをカラム（40mmφ×
200mm）に充填し蒸留水100mlを通液する。このカ
ラムに百日せき菌相菌東浜株静置培養液の遠心
上清100mlを蒸留水で８倍に希釈した液（比電導
度約3.0ms／cm）、を通液する。約300mlの0.02M
マツキルベン緩衝液（PH5.2）をカラムに通液
し、ゲルを洗浄した後、塩化ナトリウム0.02Mマ
ツキルベン緩衝液（PH5.2）100mlを用い、塩化ナ
トリウム０→4.0Mの濃度勾配にて溶出を行な
い、２mlずつ分画して分取した後、LPF−HAを
含有する画分約12mlをプールする。 原材料液および精製LPF−HA画分の分析結果
および実験成績を第１表に示す。
【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 百日せき菌が産生するLPF−HAを精製取得
するに際し、該LPF−HA含有液を、デキストラ
ン硫酸が化学的に結合されたポリサツカライドゲ
ル誘導体に接触せしめ、LPF−HAを吸着させて
不純物と分離した後、該ポリサツカライドゲル誘
導体よりLPF−HAを溶出することを特徴とする
LPF−HAの精製方法。 ２ 該デキストラン硫酸が化学的に結合されたポ
リサツカライドゲル誘導体が、デキストラン硫酸
−アガロ−スゲル、デキストラン硫酸−デキスト
ランゲルおよびデキストラン硫酸−セルロースゲ
ルから選ばれる前記第１項の方法。 ３ 該吸着処理を、温度０〜30℃、比電導度0.5
〜5.0ms／cmの条件下に行なう前記第１項または
第２項記載の方法。 ４ LPF−HAを吸着したゲルからの溶出を、比
電導度5.0〜100.0ms／cmの緩衝液を用いて行なう
前記第１〜３項のいずれか１つの方法。 ５ 該溶出処理に先だつて、吸着ゲルを、比電導
度0.5〜5.0ms／cmの緩衝液で洗浄する前記第４項
記載の方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59190244A JPS6168422A (ja) | 1984-09-10 | 1984-09-10 | Ｌｐｆ−ｈａの精製方法 |
| KR1019850005097A KR890001003B1 (ko) | 1984-07-19 | 1985-07-16 | Lpf-ha의 정제방법 |
| AU45093/85A AU571713B2 (en) | 1984-07-19 | 1985-07-17 | Method of purification of lpf-ha from bordetella pertussis |
| EP85108983A EP0170162B1 (en) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Method for the purification of leukocytosis-promoting factor haemagglutinin |
| CA000487035A CA1239104A (en) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Method for the purification of lpf-ha |
| DE8585108983T DE3577658D1 (de) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Verfahren zur reinigung vom leukocytosis-foerderungsfaktor haemagglutinin. |
| AT85108983T ATE52694T1 (de) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Verfahren zur reinigung vom leukocytosisf¯rderungsfaktor haemagglutinin. |
| US07/122,576 US4885359A (en) | 1984-07-19 | 1987-11-16 | Method for the purification of LPF-HA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59190244A JPS6168422A (ja) | 1984-09-10 | 1984-09-10 | Ｌｐｆ−ｈａの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6168422A JPS6168422A (ja) | 1986-04-08 |
| JPS6241692B2 true JPS6241692B2 (ja) | 1987-09-04 |
Family
ID=16254905
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59190244A Granted JPS6168422A (ja) | 1984-07-19 | 1984-09-10 | Ｌｐｆ−ｈａの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6168422A (ja) |
-
1984
- 1984-09-10 JP JP59190244A patent/JPS6168422A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6168422A (ja) | 1986-04-08 |
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