JPS5944286B2 - 牛トロンビンの精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、牛のトロンビンから発熱物質を除去する方法
に関する。

発熱物質は、熱、悪寒、背中及び足の苦痛及び不快を含
めて、人間に対し、望ましからぬ反応を引き起こす。

動物では、発熱物質が存在することによって上述の如き
望ましからぬ生理学的反応が誘発されるから、製薬学的
調製剤は発熱物質を比較的含んでいてはならない。

人間の病気の非経口的予防、診断又は処理のためのすべ
ての生物学的生成物は、発熱物質の存在に対する試験を
含めて、特別な試験に適合しなければならない。

米国薬局力に記述されている如き発熱物質汚染物は、ウ
サギの熱応答を基準として用いる生物学的試験である。

発熱物質を含むトロンビンの局所的施用により局在化し
た血液凝固が生成する場合には、発熱物質を体液糸へ又
は血液循環系へ導入することになるから、そのようなト
ロンビン調製剤も非経口的製薬学的調製剤と同一の、発
熱物質を含な基準に適合しなければならない。

Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
５ｃｉｅｎｃｅ＋第１４版、１５２４〜１５２５頁（
１９７０年）は、製薬学的調製剤から発熱物質を除去す
ることの難しさを強調している。

この文献は、好適な方法が発熱物質を除去する試みより
もむしろ発熱物質の非経口的調製剤への混入を防止する
ことにあることを示しているが、これは・・・・・１−
実質的に不可能である」と述べている。

Ｊ 、 Ｐｈａｒｍ、 Ｐｈａｒｍａｃ、、３０ 、１
９８（１９７８）は、発熱物質を製薬学的投薬形態から
除去するために従来から提案されている方法が再結晶；
希アルカリ、酸又は酸化剤の存在下における注意深い処
理：／８性炭、アスベスト又は他の物質への吸着；アニ
オン交換クロマトグラフィー或いは珪酸薄層クロマトグ
ラフィー、を含むことを示している。

また著者は、上述の方法が実験室で小規模に用いるため
には有用であるが、数リットルの規模で不安定な薬剤か
ら発熱物質を最適に除去することができないことを示唆
している。

著者は、費用のかかる工程である分子濾過によって発熱
物質汚染物を除去した。

従来の技術は、ファクタＨ（プロトロンビン）ファクタ
ｆｌａ（トロンビン）及びファクタＸを含む血液因子の
精製法からなっている。

２つの主たる方法はイオンクロマトグラフィー及び親和
性クロマトグラフィーである。

例えば、Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４３ 、１１
２〜１１７（１９６８）は、ジエチルアミンエチル（Ｄ
ＥＡＥ）セルロースを用いる段階的クロマトグラフィー
法でブラズミノゲン及びブラズミンを除去するというト
ロンビンの精製法を記述しているＦ Ｅ Ｂ Ｓ Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ、 ５１ （１）、１９１〜１９４（１９
７５）は、親和性クロマトグラフィーによる牛トリプシ
ン及びトロンビンの精製法について記述している。

血液因子の精製に関する最も関連した従来法は、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａ、 ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ、 Ａ
ｃｔａ、、 ２２２ 。

６９１〜６９５（１９７０）及び４３４，１９９〜２０
８（１９７６）に開示されている。

１９７０年の文献は、人間の血液凝固ファクタＸを精製
する方法を記述している。

プロトロンビン（ファクタ■）はファクタＸａの触媒作
用によってトロンビン（ファクタｆｆａ）に転化できる
から、著者は、トロンビンを含めて、他の血液凝固因子
を含まないファクタＸを得ることに関心を示した。

この方法は、青色染料−多糖類錯体及び血液凝固因子を
錯イヒさせ、クロマトクラフィーで処理することを含む
。

またこの方法は、血液凝固因子と錯体の青色染料部分と
のイオン強度に依存する会合及び続くゲル濾過に基づい
ている。

低イオン強度の場合、ファクタＵ及び■は空隙容量中に
流出する。

これはそれらが青色染料−多糖類と錯化することを示し
ている。

ファクタ■及びＸは色含容量（１ｎｃｌｕｄｅｄ ｖｏ
ｌｕｍｅ ）中に流出する。

これはそれらが青色染料−多糖類錯体と錯化しないこと
を示す。

用いる青色染料の構造は、４−フェニルアミノ−１−ア
ミノ−アンスラキノン構造を有するものとしてＪ 、
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ 、旦９゜２０１〜２１
４（１９７２）に同定されている。

１９７６年の文献は、多糖類の重合体に結合した同一の
アンスラキノン青色染料を用いることによるファクタＩ
Ｉ、ｖＩＩ、ＩＫ及びＸの人間の血漿からの精製法を記
述している。

酢酸塩緩衡剤での流出により、ファクタＸをファクタ■
、ｖｎ及び仄から分離している。

著者は、カラムに結合した物質の１つの両分がファクタ
［Ｉａ（トロンビン）活性を示スこと、即ちファクタＨ
のトロンビンへの活性化への可能性を示唆した。

１９７０年及び１９７６年の双方の分献は、他の血液凝
固因子、例えばｎ、ｖｎ及び■を不純物として除去する
ファクタＸの精製法を記述している。

いずれの文献も、発熱物質のトロンビンからの除去を開
示していないし、提案もしていない。

数リットル規模の工程にも容易に適用しつる、血液蛋白
生成物から発熱物質を除去する簡単で効果的な方法が必
要とされている。

本発明は、牛トロンビンから発熱物質を除去する方法に
関する。

本方法は、構造式〔式中、Ｒ１及びＲ２は水素又は５Ｏ
３Ｈであり、及びＲ３はＣＩ又はＯである〕 を有するアンスラキノン青色染料とエビク田しヒドリン
での架橋により多糖類を生成せしめたデキストランとの
錯合体を形成させ、この錯合体を低イオン強度の塩溶液
と平衡化させる。

工程を含んでいる。

次いで発熱物質含有の牛トロンビンを錯合体と接触させ
、トロンビンを低イオン強度の塩溶液で洗浄して発熱物
質を除去する。

発熱物質を含まないトロンビンは、例えば高イオン強度
の塩溶液での脱着により回収される。

本発明で使用される不純な発熱物質含有のトロンビン物
質は、ファクタＨのトロンビンへの転化により、ファク
、りＩＩ（プロトロンビン）を含有する牛の血漿から製
造することができる。

トロンビンを得るための種々の方法は文献に記述されて
いる。

例えば、プロトロンビンはファクタ■の濃厚物から製造
することができる。

〔参照、Ｊ 、 Ｂｉｏｌ。Ｃｈｅｍ、、２４８．７７
２９〜７７４１（１９７３））。

プロトロンビンは、クエン酸バリウムに吸着させ、エチ
レンジアミン四酢酸で流出させ、硫酸アンモニウムで分
別させ、更にＤＥＡＥ−セルロースのクロマトグラフィ
ーによって精製することができる。

次いでプロトロンビンを、Ｊ 、 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 ２５０ 、８８９７〜８
９０６（１９７５）に記述されるように牛のファクタＸ
ａで活性化させる。

トロンビンを含有する出発物質を製造するために用いる
方法は下記の通りである。

殺菌してないプロトンビジ錯合体をイオン交換法によっ
て牛の血漿から分別した。

フイビリノーゲン及び他の汚染物を沈殿によって除去し
、プロトンビンを牛のトロンボプラスチン及びＣａ”イ
オンで活性化させた。

Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋ ５ ＋ ２６５（１９
４４）はトロンボプラスチン及びカルシウム、ストロン
チウム、マグネシウム又はバリウム塩の使用を記述して
いるｏ Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、＋２４６．６１６０
〜６１４４（１９７１）はプロトンビンのクエン酸すＩ
−ＩＪウムでの活性ｆに、続く透析について記述してい
る。

次いとトロンビン物質を高速遠心分離に供して錯合体を
清澄させ、続いて巨大孔性及び微孔性膜での濾過に供す
る。

先に示したように、種々のトロンビンの製造法が技術的
に教示されている。

これらの方法は、本発明に用いる出発物質を得るために
使用することができる。

本発明の方法で用いるものはこの発熱物質含有のトロン
ビンである。

構造式 〔式中、Ｒ１及びＲ２は水素又は５Ｏ３Ｈであり及びＲ
３はＣＩ又はＯである〕 を有するアンスラキノン青色染料は、エピクロルヒドリ
ンで架橋して多糖類の３次元網状構造を形成させたテキ
ストランに結合せしめられる。

Ｒ３がＣＩである適合な青色染料−多糖類マＩ−ＩＪラ
ックス、Ｂｌｕｅ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ ６ Ｂ
の商品名でＰｈａｒｍａｃｉａ （Ｕｐｐｓａｌａ、
Ｓｗｅｄｅｎ）から市販されている。

Ｒ３がＯである適当な青色染料は、Ｃ１ｂｒａｃｏｎ
Ｂｌｕｅ Ｆ ３ Ｇ−Ａの商品名でＣ１ｄａＡＧ（Ｂ
ａ５ｅｌ、 ５ｗ１ｔｚｅｒ Ｌａｎｄ ）から市販
されている。

適当な多糖類は、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ型の商品名でＰ
ｈａｒｍａｃｉａ から市販されている。

染料は技術的に充分公知の方法で多糖類に結合せしめう
る〔参照、Ｊ 、 Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒｏｈｙ ＋６
９ 。

２０９〜２１４（１９７２）〕。

染料及び多糖類を水溶液で一緒に混合し、ナトリウム塩
を添加することができる。

次いで上述の如く得た低純度の牛のトロンビンを低イオ
ン強度の塩溶液、例えば０．１０〜０．２０ＭＮａＣ１
で平衡化させた青色染料−多糖類錯合体からなるカラム
に適用する。

トロンビンを、錯合体に結合させるのに十分な時間、錯
合体と接触させる。

結合は接触時に起こり、接触直後に平衡化溶液での洗浄
を行なう。

即ち、トロンビンを平衡化溶液で洗浄し、発熱物質を洗
浄溶液で除去する。

次いで高イオン強度の塩溶液、例えば０．４〜２．０Ｍ
ＮａＣ１でカラムを脱吸着させることにより、精製
されたトロンビンをカラムから除去する。

実施例 Ｉ Ｒ３が０である前述の構造式を有するアンスラキノン青
色染ｆ４２ｇの水６０ｍ１中溶液を、５ｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ −７５１０９の水３５ＯｒｒＬｌ中懸濁液に、６
０℃の温度で激しく攪拌しなから滴々に添加し、攪拌を
１時間継続した。

次いで混合物を８０℃まで加熱し、ＮａＣＯ３４ｊ？で
処理し、この温度で更に１時間攪拌した。

室温まで冷却した後、ゲルをブフナーＰ斗で吸引Ｐ別し
、水洗した。

このゲルを、０．２Ｍ ＮａＣ１溶液で約６〜８の範
囲のｐＨに平衡化させたカラム（１０ｃｒＩＬ）中に充
填した。

本明細書第１２頁９行〜第１３頁８行に記載したように
して調製した発熱物質を含む、約３％トロンビンの初期
純度を有するトロンビン調製物を、先のゲルカラムに適
用した。

次いでこのトロンビンを低イオン強度の塩平衡化溶液す
なわち０．１０〜０．２０ Ｍ ＮａＣｌ溶液を用い
て室温において充分に洗浄して発熱物質を除去した。

カラ゛ムを通過する洗浄溶液中の発熱物質の存在は、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ−ｉｃａ、 ｅｔ Ｂｉｏｏｈｖｓｉｃ
ａ、 Ａｃｔａ 、 ＋ ２６１．２８４〜２８９ （１９７２）に記述される試験に基づく ” Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔ
ｅ”として炎示される方法に従って試験した。

発熱物質の存在に対して溶液の試験結果が負となった後
、ゲルカラムを高イオン強度の塩溶液。

即ち２Ｍ ＮａＣ１溶液と接触させることにより、ト
ロンビンをゲルカラムから脱着させた。

トロンビンは約７０％の純度を有した。

次いでゲルカラムから脱着したトロンビンを０．１５
Ｍ ＮａＣ１に対して透析し無菌濾過し、凍結乾燥し
た。

得られたトロンビンを、本明細書第５頁６〜８行に記載
した米国薬局法に記載された方法に従って発熱物質−ウ
サギ試験で試験し、発熱物質を含まない及び局所的に投
与できる血液凝固剤として用いるのに適当であることが
わかった。

トロンビンは、酸素及びプロ酵素、例えばプラスミン及
びプラスミノゲンとも関連する。

この物質は、特にトロンビンの崩壊における血液凝固過
程に含まれる。

上述の如く製造したトロンビンの予備試験は、上述の方
法が牛のトロンビンからプラスミン及びプラスミノゲン
を除去することを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 〔式中、Ｒ１及びＲ２は水素又は５Ｏ３Ｈであり、Ｒ３
   はＣ１又はＯである〕 を有する染料と、エピクロルヒドリンでの架橋により多
   糖類の３次元網状構造を生成せしめたデキストランとの
   錯合体を形成させ；この錯合体を低イオン強度の塩溶液
   で平衡化させ：該錯合体を発熱物質含有の牛トロンビン
   と接触させ；該トロンビンを低イオン強度の塩溶液で洗
   浄して該発熱物質を除去し；そして発熱物質を含まない
   牛トロンビンを回収することを特徴とする、発熱物質を
   含む牛トロンビンから発熱物質を除去する方法。 ２ 錯合体を平衡化させるために用いる低イオン強度の
   塩溶液が０．２０よりも大きくないイオン強度を有する
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ トロンビンを洗浄するために用いる低イオン強度の
   塩溶液が染料−多糖類錯合体を平衡化させるために用い
   るものと同一のものである特許請求の範囲第２項記載の
   方法。 ４ 発熱物質を含有しないトロンビンの回収が、錯合体
   からトロンビンを除去するのに十分なイオン強度の塩溶
   液でトロンビンを処理し、発熱物質を含まない牛トロン
   ビンを回収することを含んでなる特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ５ 錯合体からトロンビンを除去するために用いる塩溶
   液が０．４よりも小さくないイオン強度を有する特許請
   求の範囲第４項記載の方法。 ６ 低イオン強度の塩溶液と、トロンビンを除去するた
   めに用いる塩溶液が双方ともＮａＣ１を含有する特許請
   求の範囲第５項記載の方法。