JPS5852226A - 牛トロンビンの精製法 - Google Patents
牛トロンビンの精製法Info
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- JPS5852226A JPS5852226A JP57137453A JP13745382A JPS5852226A JP S5852226 A JPS5852226 A JP S5852226A JP 57137453 A JP57137453 A JP 57137453A JP 13745382 A JP13745382 A JP 13745382A JP S5852226 A JPS5852226 A JP S5852226A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明に、牛のトロンビンから発熱物１ＪＩＩを除去す
る方法ｎ：ｐＡｔゐ。 発熱？″質゛・、熱、泉゛−１背中及び足の苦痛及び不
快ケ含めて、人間に対し、沁１しからぬ反応管引き起こ
す。動物でに、発熱物質か存在することＫよって上述の
’ｒ）Ｌ＋き望１［−力、らぬ生物学的試験が誘発ζ７
するから、製薬学的ｖ！４ｖ剤は発熱物質を比較的含ん
でいてにカら彦い。 人聞の病気の非経口的予防、診断又に処置のたｔ）のす
べての生物学的生成物は、発熱物質の存在に対する試験
を含めて、特別な試りに適合しかけわけならない。米国
薬局方に記述さＶている如き発熱物質試験に、ウサギの
熱応答全基準として用いる生物学的試験である。発熱ｍ
個を含むトロンビンの局所的施用にエリ局在化した血餅
が生成する場合にね、発熱物Ｊｊｒを体液系へ又は血液
循環系へ導入することにηるから、そのようカドロンビ
ン−製剤も非経口的製薬学的調製畑と−１−の、発熱物
質を含む基準に−Ａ合しな汀ｔ’ｌｉがらがい。 Ｒｅｍｊｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ ８ｃｉｅｎｃｅ。 餓１４版、１５２４〜１５２５真１１Ｑ７０年）に、＃
桑学トー製剤から発熱物負ケ除去マゐことｃｒ、＊ｔζ
會芳−（７ている。この文献Ｖコ、好適な方法が発熱物
質を除去する試みエリもむしろ発ｙＩＰ物質の非経口的
ｐ！！＃剤への導入を防止することにあること？ｙｔ−
ているが、こｒｌＬＤ・・・・・ ［東質的に不ｉ］能
で夛る」と述ベマいる。 Ｊ 、 Ｐｈａｒｍ、 Ｐｈａｒｍａｃ、 、 ３
０ 、 １９８１’１９７８１Ｈ１発熱勉１質を製薬学
的投薬形態から除去する六ぬｒ（従来から提案さＶてい
る方法が再結晶；希アル刀り、酸欠０酸イヒ剤の存在下
における汗繁深い処坤；活性炭、アスベスト又に他の物
情への吸着；了ニオン交捗りロｉトダラフイー或いａ珪
ｒ１１１１層クロマトグラフィー、を含むことを示して
い小。’Ｊた驚者ね、土述σ］方法が実験室で小規楔に
川・・なために１南片であるか、数リンドルの規模で不
値足彦桑剤から発熱物質試験適に除去すく、ことができ
ないことを示唆してい心。著者ね、費用の〃かゐ工程で
あゐ分子濾過ドエつて発熱＠’ｊＭ汚染物會除物上た。 従来の技術に、ファクタＩＬプロトロンビン）、ファク
４１１ａｌ）ロンビン）及びフ了りタＸＶｒ含む白液因
子σご精製法からかつている。２つの主たる方法にイオ
ンクロマトグラフィー及び親和性クロマトグラフィーで
ある。 例えげ、Ｊ 、Ｂｔｏｌ、 （：ｈｅｍ、 ＊ ２４
３ ＊ １１２〜１１７（１９６８Ｎ’：ｌ、ジエチ
ル了ミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース音片い／）ｔＰ
ｉ的／ロマトグラフイー払でグラ２ミノケン及びブラズ
ミン會除去するというトロンビンｆ）鞘製法會記述して
いる。ＦＥ）３８ Ｌｅｔｔｅｒｓ、 ５１１１）、
１９１〜１９４＋１９７５１ｔｆｆ、親和性クロマトグ
ラフィーによる牛トリプシン及びトロンビンの精＃法に
ついて１述し１いる。 抑液因子のｎＩ製に関する敵本関連し、た従米伝ａ。 Ｈｉｏｃｈｅｍｉ＋〕ｎ、 ｅｔ Ｂｌｏｐｈｙ
ｓｉｒ、ａ、 Ａｅｔａ、。 ムス−２，６９１〜ｆｉ９Ｆｔ ＋ １９７０）及び４
３４゜１９９〜２（１８１１９７６１Ｋｒｙ？４光シゎ
てぃゐ。 １９７０任の文献り、人…ｊの抑餅ファクタＸを精製す
＾方法を１述し２でいる。プロトロンビン（ファクタｌ
）にファクタ）（ａの触媒作用１工ってトロンビン（〕
了クりＩａ）Ｋ転住できるから、著者ねトロンとンを含
めて、他の血餅因子ケ含１ないファクタＸを得ることに
関心１示したにの方法ね、青色染料−多糖類錯体及び血
餅因子を錯化させ、クロマトグラフィーで処欝すること
を含゛ またこの力ａ ｒ、ｒ 、血餅因
子と錯場合、ファクタｎ及びｈａ空ト容雪中１（ｆｉｆ
出する。こ′ｎＯそｒｌらが青色染料−多糖−と錯化す
ることケア＋＜シてい／）。ファクタ■及びＸに色含容
首（ｉｎｒ、１ｕｄｅｄ ｖｏｌｕｍｅ ）中に流
出する。こｔｉｔｘそｎらが實色染狙−多糖ａ鈴体と錯
化しかい仁と會示す。用いる青色染料の構造に、４−フ
ェニルアミノ−１−アミノ−アンスラキノン構造を有す
るものとしてＪ 、 Ｃｈｒｏｎｎａｔｏｇｒａｐｈｙ
、 −６９。 ２（１１〜２１４ ＋１９７２１に−１足さｎている。 １９７６年の文献ｒ１多糖類の重合体に１合した同一の
アンスラキノン青色染利會用いることによるファクタｍ
、■、ＩＸ及びＸの人間のｉｎ＃からの精製法を配達し
ている。酢敞塩酸価剤での流出ｆ（ＬＦ）、ファクタ＞
１７アクタｕ１■及びＩＸから分離している。著者に、
カラムに結合し介物質の１りＱ）ＦＡ１分が７アクタ１
ａ（）ロンビン）活性を示すこと、シロちファクタログ
ニトロンビンへの活性化への可能性を示唆
る方法ｎ：ｐＡｔゐ。 発熱？″質゛・、熱、泉゛−１背中及び足の苦痛及び不
快ケ含めて、人間に対し、沁１しからぬ反応管引き起こ
す。動物でに、発熱物質か存在することＫよって上述の
’ｒ）Ｌ＋き望１［−力、らぬ生物学的試験が誘発ζ７
するから、製薬学的ｖ！４ｖ剤は発熱物質を比較的含ん
でいてにカら彦い。 人聞の病気の非経口的予防、診断又に処置のたｔ）のす
べての生物学的生成物は、発熱物質の存在に対する試験
を含めて、特別な試りに適合しかけわけならない。米国
薬局方に記述さＶている如き発熱物質試験に、ウサギの
熱応答全基準として用いる生物学的試験である。発熱ｍ
個を含むトロンビンの局所的施用にエリ局在化した血餅
が生成する場合にね、発熱物Ｊｊｒを体液系へ又は血液
循環系へ導入することにηるから、そのようカドロンビ
ン−製剤も非経口的製薬学的調製畑と−１−の、発熱物
質を含む基準に−Ａ合しな汀ｔ’ｌｉがらがい。 Ｒｅｍｊｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ ８ｃｉｅｎｃｅ。 餓１４版、１５２４〜１５２５真１１Ｑ７０年）に、＃
桑学トー製剤から発熱物負ケ除去マゐことｃｒ、＊ｔζ
會芳−（７ている。この文献Ｖコ、好適な方法が発熱物
質を除去する試みエリもむしろ発ｙＩＰ物質の非経口的
ｐ！！＃剤への導入を防止することにあること？ｙｔ−
ているが、こｒｌＬＤ・・・・・ ［東質的に不ｉ］能
で夛る」と述ベマいる。 Ｊ 、 Ｐｈａｒｍ、 Ｐｈａｒｍａｃ、 、 ３
０ 、 １９８１’１９７８１Ｈ１発熱勉１質を製薬学
的投薬形態から除去する六ぬｒ（従来から提案さＶてい
る方法が再結晶；希アル刀り、酸欠０酸イヒ剤の存在下
における汗繁深い処坤；活性炭、アスベスト又に他の物
情への吸着；了ニオン交捗りロｉトダラフイー或いａ珪
ｒ１１１１層クロマトグラフィー、を含むことを示して
い小。’Ｊた驚者ね、土述σ］方法が実験室で小規楔に
川・・なために１南片であるか、数リンドルの規模で不
値足彦桑剤から発熱物質試験適に除去すく、ことができ
ないことを示唆してい心。著者ね、費用の〃かゐ工程で
あゐ分子濾過ドエつて発熱＠’ｊＭ汚染物會除物上た。 従来の技術に、ファクタＩＬプロトロンビン）、ファク
４１１ａｌ）ロンビン）及びフ了りタＸＶｒ含む白液因
子σご精製法からかつている。２つの主たる方法にイオ
ンクロマトグラフィー及び親和性クロマトグラフィーで
ある。 例えげ、Ｊ 、Ｂｔｏｌ、 （：ｈｅｍ、 ＊ ２４
３ ＊ １１２〜１１７（１９６８Ｎ’：ｌ、ジエチ
ル了ミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース音片い／）ｔＰ
ｉ的／ロマトグラフイー払でグラ２ミノケン及びブラズ
ミン會除去するというトロンビンｆ）鞘製法會記述して
いる。ＦＥ）３８ Ｌｅｔｔｅｒｓ、 ５１１１）、
１９１〜１９４＋１９７５１ｔｆｆ、親和性クロマトグ
ラフィーによる牛トリプシン及びトロンビンの精＃法に
ついて１述し１いる。 抑液因子のｎＩ製に関する敵本関連し、た従米伝ａ。 Ｈｉｏｃｈｅｍｉ＋〕ｎ、 ｅｔ Ｂｌｏｐｈｙ
ｓｉｒ、ａ、 Ａｅｔａ、。 ムス−２，６９１〜ｆｉ９Ｆｔ ＋ １９７０）及び４
３４゜１９９〜２（１８１１９７６１Ｋｒｙ？４光シゎ
てぃゐ。 １９７０任の文献り、人…ｊの抑餅ファクタＸを精製す
＾方法を１述し２でいる。プロトロンビン（ファクタｌ
）にファクタ）（ａの触媒作用１工ってトロンビン（〕
了クりＩａ）Ｋ転住できるから、著者ねトロンとンを含
めて、他の血餅因子ケ含１ないファクタＸを得ることに
関心１示したにの方法ね、青色染料−多糖類錯体及び血
餅因子を錯化させ、クロマトグラフィーで処欝すること
を含゛ またこの力ａ ｒ、ｒ 、血餅因
子と錯場合、ファクタｎ及びｈａ空ト容雪中１（ｆｉｆ
出する。こ′ｎＯそｒｌらが青色染料−多糖−と錯化す
ることケア＋＜シてい／）。ファクタ■及びＸに色含容
首（ｉｎｒ、１ｕｄｅｄ ｖｏｌｕｍｅ ）中に流
出する。こｔｉｔｘそｎらが實色染狙−多糖ａ鈴体と錯
化しかい仁と會示す。用いる青色染料の構造に、４−フ
ェニルアミノ−１−アミノ−アンスラキノン構造を有す
るものとしてＪ 、 Ｃｈｒｏｎｎａｔｏｇｒａｐｈｙ
、 −６９。 ２（１１〜２１４ ＋１９７２１に−１足さｎている。 １９７６年の文献ｒ１多糖類の重合体に１合した同一の
アンスラキノン青色染利會用いることによるファクタｍ
、■、ＩＸ及びＸの人間のｉｎ＃からの精製法を配達し
ている。酢敞塩酸価剤での流出ｆ（ＬＦ）、ファクタ＞
１７アクタｕ１■及びＩＸから分離している。著者に、
カラムに結合し介物質の１りＱ）ＦＡ１分が７アクタ１
ａ（）ロンビン）活性を示すこと、シロちファクタログ
ニトロンビンへの活性化への可能性を示唆
【た。
１９７０犀ルひ】９７６舘σノ双力の分離６、他σ曲Ｉ
Ｍ因子、？１１オけｎ ｖｎ及びＩＸをイ・細物とし
て除去するファクタＸの精製法？ｌｒ’述（ている。 いすわの分離も、発熱物質のトロンビンか［の除去ケ開
示［７ていｆｒｉ／−１１−、提案もし−でいかい。 数リットル知模Ｖ゛工８ＶＣも容易に適用［、うる、抑
液蛋白生成物から＠熱物質ケ除去する葡単１゛効果的η
方法ゾ・必要ときｖでいる。 本発明ｈ、牛トロンビンから発熱物＊’を除去する方法
に関する、本ｙＪ法に、構造式 〔式−申、■、及びり、つ水索又６Ｓす、１１であり、
及びＲａ ｆｃＩ （、’ ｌ Ｘ ｔｒ：ｌ ｉ、、
）でめる〕を肩するアンスラキノン青色染料とエピクロ
ルヒドリンでの架−にエリ多傭ａ會住危せしめたデキス
トランとσ）錯合体を形成はせ この錯合体を低イオン
強度の錫溶液と平衡化てゼる、工移管含んでいる。次い
で発熱物質含有の牛トロンビンｖｌ−錯合体と接触ハぜ
、トロンビン會低イオンＩｉ！ＩＦ＃の塩浴液で洗浄し
、て発熱物ＩＸケ除去する。発熱物質を含１ないトロン
とンに、例えけ尚イオン％！１ｑ・塩浴液での脱ｆＫ工
９回収ζわる。 本発明で９！用される不純な発熱物質含有のトロンビン
物質１■、７了クタ出σ〕トロンビンへの転化亭 ＫＬＯ、ファクタ１Ｃプロトｐビン）會含有する牛の佃
漿から製造することが１゛きゐ。トロンビンＶ和／）た
ｔＩ＆糧々の方法ｒ１文献（計述寧１ているー？１見げ
、プロトロンビンにファクタＩＸｉＭＩＸ物から製造す
めことができる。〔８肺、Ｊ、 Ｂｉｏｌ。 （’ｈｅｍ、、２４８，７７２９〜７７４１１１９７３
１］。プロトロンビン１、クエン醪バリウムに＠ｙｋζ
ゼ、エチレンジアミン四酢拳１流出１せ、１酸アンモニ
ウムで分別プせ、艷に１） Ｂ Ａ Ｅ−セルロースの
クロマトグラフィーｒ（工ってｆｉｌｌすることができ
る。θ′いて）″ロトロンビンを、 Ｊ 、 Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ ｔ：ｈｒｍｉｓｔｒｙ 、
’ｌ ５０ 。 ８８９７〜８９（１６１１９７５）Ｋ’計述されるよう
に牛のファクタｘａで活性什感ゼる。 トロンビン會含有する出発物ＪＪｌｌ？−製造するため
に用いる力ｇ：ｎ”）１３通りてオ）る。 殺菌して々い１０トンビン錯合体をイオン父俟江によっ
て牛の血Ｗから分別した。フィピリノーゲン及び他の汚
染物を沈廊′：ｖｃ工って除去【２、フ“ロトンビンを
牛σノドロンボンラスチン及び、ａ４４イオン１活性化
さゼた、 Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｒｍ、、５．２ｆｉｆｉ １１！
’１４４）ニトロンボブラスチン及び刀ルシウム、スト
ロンチウム、マグネシウム又にバリウムｔＩＡの使用を
記述している。 Ｊ 、 Ｂｉｏｌ、 （：ｈｅｍ、
＋ ２４６ 。 ｆｉ１０６〜６１１４（１９７１）ｔ’ｆｆプロトンビ
ンσｔクエン酸ナトリウムでの活性化、絖〈透析につい
て記述しでいる。 次いでトロンビン物質を高速遠心分＃ＩＫ伊り、て錯合
体を清Ｕさせ、続いて巨大有性及び１１石性膜でのｐ過
に伊する。先に示したように、種々のトロンビンの製造
法が技術的に数示さねてい６゜こｆ’！ｋ（ｒ）方法に
、本発明に用いる出発駿Ｊ質會得ゐためＫｌ’片−ｆ／
ｂことができる。本発明の方法で用いるものｒｆｆｃσ
゛発熱物質含弔σ、トロンビンである。 暢造式 〔式中、Ｈ６及びＢ、ｔａ水票又ｕ８Ｕ、Ｈであり及び
ｋＬ、に（１又に０である〕 を肩するアンスラギノン實仔染料に、エピクロルヒドリ
ン１゛架檎（て多糖類σ・３次元網状構造管形成させた
テキストランに結付セＥ５めＣ−わる。托−がじ１−ｉ
（ある過剰か青電染料−多糖類マトリックスｇ、Ｂｌｕ
ｅ ＩＭｅｐｈａｒｏｓｅ ｔ゛Ｌ ｆｉ Ｈの商
品名１゜ＰｈａｒｍａＣｉａ ｌ ｒｌｐｐｓａｌａ
、 ８ｗｅｄｅｎ ）から市販ζｎていｆ、）。Ｈ
１８が（１１゛訊ゐ適栴彦青色染料に、（：１ｂｒａｔ
＝ｏｎ Ｂｌｕｅ ｌ＋’３Ｇ−Ａの曲品名でＬ：ｉ
ｂａＡ Ｇ Ｉ Ｂａ５ｅ１．５ｗ１ｔｚｒｒ−Ｌａｎ
ｄ ｌから市鈑ζｊている。遣当彦多糖＠に、５ｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ型の商品名でＰｈａｒｍａｒ、ｉｍ −１
）１ｃｍ市販１１ている。 染料は技術的に十分公知の方法で多糖１ｉＫ結合せ１め
うる〔８即、Ｊ 、 （’ｈｒｏｍａｔｏｇｒｏｈｙ、
−ＬＬ２０９〜２１４１１９７２１］。染料及び多糖
類を水浴液で一緒に混合（、ナ） ＩＪウム塩を添加す
ることができる。次いで上述の如く得た低純度の牛のト
ロンビンを低イオン強参の墳溶液、例え、げ０．１ （
１〜０．２０ ＭＮａｔ′Ｊ Ｔ平伽什−Ａ？た實包染
料−多ｅｅ錯合体からなりカラムに適用ｆ、ｂ。トロン
ビン會、錯合体に結合づ一＋Ｆるのに十分力時間、錯合
体と接ＰｆＪＩジせる。結合に接触嚇に起こり、接触向
後に平■イにｎ１液での洗浄１行なう。即ち、トロンと
ン會平絢（１７浴ｇで洗かし、発熱物質を洗浄＃敵で除
去すな。次いで高イオン強簾の塩酌液、例ｆｉ：Ｈ’ｌ
）、４〜２．ＯＮ Ｎａｔ二ｌ’ｔ”２Ｊラム？脱Ｉ
Ｉｉ着＃せることにより、ｎＩ製ばｆ＋たトロンビン會
カラムから除去する。 実施例Ｉ Ｒ８が（ＪＴ”よる前述σ）構造式を肩丁ゐアンスラキ
ノン青色染料２ｔの水６（）が中溶液會、８ｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−７５１０９の水３ Ｆｉ （１−甲ａｍ液
に、ａ ＜＋ ’（：６ＴＪ、４３１＃ｔ、 （攪拌ｔ
、７Ｔｈ カＣ：４ｍｋ ＩＩ（添７１ｏｔ、；ｑｎ分
間攪拌した。Ｎａ（°１ ４ Ｆｊ ｆ Ｍ分を添加し
２、攪拌を１岨パ間継紗した。次いで密合物上８０℃１
で加熱１、へａｔ、’ｏ＝ ４ ｆで処理［７、この１
１度で爽に１時間攪拌し、た。搦混１て冷却Ｅ左後、ゲ
ルをンフナーｐ斗で吸り・ｐ別［７、水洗し次。 このケＡｉ、ｉｌ、２ Ｍ Ｎａ（：ｊ ％液で約６〜
８の範囲のｐＨＫ＋伽什さゼたカラム１１０ｃ＋ｙ＋ｌ
中ｙｃ充填し１（。 前述の如く１製［六、弁勢物實Ｖ含む、約３嗟トロンヒ
ンの′ｖＪ期純阪ン南１ゐトロンビン−製物管、先のゲ
ルカラムに適用した。次いでとのトロンビン會低イオン
強度の塩平衡化溶液で洗浄して発熱物質を除去した。カ
ラムを通過する洗浄′＃４１［中の発熱物質の存在に、
Ｂ １ｏｃｈｅｒｎｉｃａ、 ｅｔＨｉｎｐｈｙｓｉｒ
、ａ、 Ａｃｔａ、＋ ２ ｆｉ １ 、
２ ８ ４〜２ ８ ９（１９７２１に記述ζ−る試
−に基づく１Ｌ１ｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ
Ｌｙｓａｔｅ″として表示ざｆ＋心方法ｆζ従りて麩
験し、た。 発熱物５Ｍσ２存在に対し、て浴液σ、ト１結果か負と
なった後、ゲルカラムを筒イオン俵屋の塩浴液、即ち２
Ｍ Ｎａｔ’ｌ溶液と接触プゼることにより、トロンビ
ン會ゲルカラムから説塾→せた。トロンビンね約７（Ｉ
ｇｋの純度會もした０次いでゲルカラム力ｌ−ｌ５ｓ
ｔ、ｆｆ ） ロンビン５（’１．１ ｆｉＭ Ｎｉ
１（’ｊに対し２て透析し無ｌＩ！濾過し、保結乾珠し
た。 得らｔまたトロンビンを、前述の発熱物質−ウサｄｆ賦
験で１−し１、発熱物質を含９ない及び局所的に投与で
き葵泄餅剤とＥて用いるσ′に適当ｒあることがわかっ
ｔｏ トロンビンに、酵素及びプロ酵素、例えばプラスミン及
びプラスミノゲンと唾、関連する。この物質ｕ、＊ｖｔ
トロンビンσン崩壊における面餅購程に含１ｔＩ心。−
上述の如く製造したトロンビンの予備ｆＣ＃ｔ２ 、上
述σ・力Ｂが牛σ７トロンビンか【プラスミン及びブラ
スミノゲンを除去す心ことを示す。 特許出願人 マイルス・ラボラドリース・インコーホ
レーテンド
Ｍ因子、？１１オけｎ ｖｎ及びＩＸをイ・細物とし
て除去するファクタＸの精製法？ｌｒ’述（ている。 いすわの分離も、発熱物質のトロンビンか［の除去ケ開
示［７ていｆｒｉ／−１１−、提案もし−でいかい。 数リットル知模Ｖ゛工８ＶＣも容易に適用［、うる、抑
液蛋白生成物から＠熱物質ケ除去する葡単１゛効果的η
方法ゾ・必要ときｖでいる。 本発明ｈ、牛トロンビンから発熱物＊’を除去する方法
に関する、本ｙＪ法に、構造式 〔式−申、■、及びり、つ水索又６Ｓす、１１であり、
及びＲａ ｆｃＩ （、’ ｌ Ｘ ｔｒ：ｌ ｉ、、
）でめる〕を肩するアンスラキノン青色染料とエピクロ
ルヒドリンでの架−にエリ多傭ａ會住危せしめたデキス
トランとσ）錯合体を形成はせ この錯合体を低イオン
強度の錫溶液と平衡化てゼる、工移管含んでいる。次い
で発熱物質含有の牛トロンビンｖｌ−錯合体と接触ハぜ
、トロンビン會低イオンＩｉ！ＩＦ＃の塩浴液で洗浄し
、て発熱物ＩＸケ除去する。発熱物質を含１ないトロン
とンに、例えけ尚イオン％！１ｑ・塩浴液での脱ｆＫ工
９回収ζわる。 本発明で９！用される不純な発熱物質含有のトロンビン
物質１■、７了クタ出σ〕トロンビンへの転化亭 ＫＬＯ、ファクタ１Ｃプロトｐビン）會含有する牛の佃
漿から製造することが１゛きゐ。トロンビンＶ和／）た
ｔＩ＆糧々の方法ｒ１文献（計述寧１ているー？１見げ
、プロトロンビンにファクタＩＸｉＭＩＸ物から製造す
めことができる。〔８肺、Ｊ、 Ｂｉｏｌ。 （’ｈｅｍ、、２４８，７７２９〜７７４１１１９７３
１］。プロトロンビン１、クエン醪バリウムに＠ｙｋζ
ゼ、エチレンジアミン四酢拳１流出１せ、１酸アンモニ
ウムで分別プせ、艷に１） Ｂ Ａ Ｅ−セルロースの
クロマトグラフィーｒ（工ってｆｉｌｌすることができ
る。θ′いて）″ロトロンビンを、 Ｊ 、 Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ ｔ：ｈｒｍｉｓｔｒｙ 、
’ｌ ５０ 。 ８８９７〜８９（１６１１９７５）Ｋ’計述されるよう
に牛のファクタｘａで活性什感ゼる。 トロンビン會含有する出発物ＪＪｌｌ？−製造するため
に用いる力ｇ：ｎ”）１３通りてオ）る。 殺菌して々い１０トンビン錯合体をイオン父俟江によっ
て牛の血Ｗから分別した。フィピリノーゲン及び他の汚
染物を沈廊′：ｖｃ工って除去【２、フ“ロトンビンを
牛σノドロンボンラスチン及び、ａ４４イオン１活性化
さゼた、 Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｒｍ、、５．２ｆｉｆｉ １１！
’１４４）ニトロンボブラスチン及び刀ルシウム、スト
ロンチウム、マグネシウム又にバリウムｔＩＡの使用を
記述している。 Ｊ 、 Ｂｉｏｌ、 （：ｈｅｍ、
＋ ２４６ 。 ｆｉ１０６〜６１１４（１９７１）ｔ’ｆｆプロトンビ
ンσｔクエン酸ナトリウムでの活性化、絖〈透析につい
て記述しでいる。 次いでトロンビン物質を高速遠心分＃ＩＫ伊り、て錯合
体を清Ｕさせ、続いて巨大有性及び１１石性膜でのｐ過
に伊する。先に示したように、種々のトロンビンの製造
法が技術的に数示さねてい６゜こｆ’！ｋ（ｒ）方法に
、本発明に用いる出発駿Ｊ質會得ゐためＫｌ’片−ｆ／
ｂことができる。本発明の方法で用いるものｒｆｆｃσ
゛発熱物質含弔σ、トロンビンである。 暢造式 〔式中、Ｈ６及びＢ、ｔａ水票又ｕ８Ｕ、Ｈであり及び
ｋＬ、に（１又に０である〕 を肩するアンスラギノン實仔染料に、エピクロルヒドリ
ン１゛架檎（て多糖類σ・３次元網状構造管形成させた
テキストランに結付セＥ５めＣ−わる。托−がじ１−ｉ
（ある過剰か青電染料−多糖類マトリックスｇ、Ｂｌｕ
ｅ ＩＭｅｐｈａｒｏｓｅ ｔ゛Ｌ ｆｉ Ｈの商
品名１゜ＰｈａｒｍａＣｉａ ｌ ｒｌｐｐｓａｌａ
、 ８ｗｅｄｅｎ ）から市販ζｎていｆ、）。Ｈ
１８が（１１゛訊ゐ適栴彦青色染料に、（：１ｂｒａｔ
＝ｏｎ Ｂｌｕｅ ｌ＋’３Ｇ−Ａの曲品名でＬ：ｉ
ｂａＡ Ｇ Ｉ Ｂａ５ｅ１．５ｗ１ｔｚｒｒ−Ｌａｎ
ｄ ｌから市鈑ζｊている。遣当彦多糖＠に、５ｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ型の商品名でＰｈａｒｍａｒ、ｉｍ −１
）１ｃｍ市販１１ている。 染料は技術的に十分公知の方法で多糖１ｉＫ結合せ１め
うる〔８即、Ｊ 、 （’ｈｒｏｍａｔｏｇｒｏｈｙ、
−ＬＬ２０９〜２１４１１９７２１］。染料及び多糖
類を水浴液で一緒に混合（、ナ） ＩＪウム塩を添加す
ることができる。次いで上述の如く得た低純度の牛のト
ロンビンを低イオン強参の墳溶液、例え、げ０．１ （
１〜０．２０ ＭＮａｔ′Ｊ Ｔ平伽什−Ａ？た實包染
料−多ｅｅ錯合体からなりカラムに適用ｆ、ｂ。トロン
ビン會、錯合体に結合づ一＋Ｆるのに十分力時間、錯合
体と接ＰｆＪＩジせる。結合に接触嚇に起こり、接触向
後に平■イにｎ１液での洗浄１行なう。即ち、トロンと
ン會平絢（１７浴ｇで洗かし、発熱物質を洗浄＃敵で除
去すな。次いで高イオン強簾の塩酌液、例ｆｉ：Ｈ’ｌ
）、４〜２．ＯＮ Ｎａｔ二ｌ’ｔ”２Ｊラム？脱Ｉ
Ｉｉ着＃せることにより、ｎＩ製ばｆ＋たトロンビン會
カラムから除去する。 実施例Ｉ Ｒ８が（ＪＴ”よる前述σ）構造式を肩丁ゐアンスラキ
ノン青色染料２ｔの水６（）が中溶液會、８ｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−７５１０９の水３ Ｆｉ （１−甲ａｍ液
に、ａ ＜＋ ’（：６ＴＪ、４３１＃ｔ、 （攪拌ｔ
、７Ｔｈ カＣ：４ｍｋ ＩＩ（添７１ｏｔ、；ｑｎ分
間攪拌した。Ｎａ（°１ ４ Ｆｊ ｆ Ｍ分を添加し
２、攪拌を１岨パ間継紗した。次いで密合物上８０℃１
で加熱１、へａｔ、’ｏ＝ ４ ｆで処理［７、この１
１度で爽に１時間攪拌し、た。搦混１て冷却Ｅ左後、ゲ
ルをンフナーｐ斗で吸り・ｐ別［７、水洗し次。 このケＡｉ、ｉｌ、２ Ｍ Ｎａ（：ｊ ％液で約６〜
８の範囲のｐＨＫ＋伽什さゼたカラム１１０ｃ＋ｙ＋ｌ
中ｙｃ充填し１（。 前述の如く１製［六、弁勢物實Ｖ含む、約３嗟トロンヒ
ンの′ｖＪ期純阪ン南１ゐトロンビン−製物管、先のゲ
ルカラムに適用した。次いでとのトロンビン會低イオン
強度の塩平衡化溶液で洗浄して発熱物質を除去した。カ
ラムを通過する洗浄′＃４１［中の発熱物質の存在に、
Ｂ １ｏｃｈｅｒｎｉｃａ、 ｅｔＨｉｎｐｈｙｓｉｒ
、ａ、 Ａｃｔａ、＋ ２ ｆｉ １ 、
２ ８ ４〜２ ８ ９（１９７２１に記述ζ−る試
−に基づく１Ｌ１ｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ
Ｌｙｓａｔｅ″として表示ざｆ＋心方法ｆζ従りて麩
験し、た。 発熱物５Ｍσ２存在に対し、て浴液σ、ト１結果か負と
なった後、ゲルカラムを筒イオン俵屋の塩浴液、即ち２
Ｍ Ｎａｔ’ｌ溶液と接触プゼることにより、トロンビ
ン會ゲルカラムから説塾→せた。トロンビンね約７（Ｉ
ｇｋの純度會もした０次いでゲルカラム力ｌ−ｌ５ｓ
ｔ、ｆｆ ） ロンビン５（’１．１ ｆｉＭ Ｎｉ
１（’ｊに対し２て透析し無ｌＩ！濾過し、保結乾珠し
た。 得らｔまたトロンビンを、前述の発熱物質−ウサｄｆ賦
験で１−し１、発熱物質を含９ない及び局所的に投与で
き葵泄餅剤とＥて用いるσ′に適当ｒあることがわかっ
ｔｏ トロンビンに、酵素及びプロ酵素、例えばプラスミン及
びプラスミノゲンと唾、関連する。この物質ｕ、＊ｖｔ
トロンビンσン崩壊における面餅購程に含１ｔＩ心。−
上述の如く製造したトロンビンの予備ｆＣ＃ｔ２ 、上
述σ・力Ｂが牛σ７トロンビンか【プラスミン及びブラ
スミノゲンを除去す心ことを示す。 特許出願人 マイルス・ラボラドリース・インコーホ
レーテンド
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、構造式 〔式中、）Ｌ、及びｉ（瀧に水嵩又は８ｔ）、 Ｈであ
り、托、は（：１又にＵである〕 【有する肇刺と、エピクロルヒドリンでの架橋により多
糖−の３次元網状構造を生成ゼしめたデキストランとの
釦＠体ケ形敗させ；この錯合体ｔ−倶イオン強１の塩浴
液で平鞠化孕せ：該錯合体ケ発熱物質含有の牛トロンビ
ンと接触させ；該トロンビンを低イオン強腹の塩浴液で
洗浄して１発熱物質を除去し；そして発熱物９ｉｖ苫１
ｉい牛トロンビン會回収することをや書とする、発熱物
質會含む牛トロンビンから発熱←ノ質會除去する方法。 ２．９合体を平絢化さゼるために用いる低イオン＠腹の
錫＃液か０．２０Ｌ９％、大きくないイオン強要を南す
る特許−求の節−謝１項記載の方び。 ３、トロンビンを洗浄するために用いる低イオンＷｓ倉
の塩浴液が梁刺−多糖類錯合体を平向化させるために用
いるものとｔｒ！Ｉｌ−のものである特許ト＊の静囲第
２項記載Ｃ；方法。 ４、Ａ１１＊餉會含弔【、ないトロンビンσノ仲１収が
、錯＠体力・らトロンビンを除去するのに十分なイオン
強度の塩浴液でトロンビン會処珈し、発熱物質を含まな
い牛欧トロンビン會回収することを含んでなる勢許請求
の範囲第１項記載の方法。 ５、錯Ｏ体からトロンビンを除去するために用いる塩溶
液が０．４よりも小さくないイオン強度１有する特許請
求の範囲第４璃記載の方法。 ６、低イオン強度の塩溶液と、トロンビン會除去すゐた
めに用いる塩浴液が双方と％＋Ｎａ（’１會含壱するｑ
＃計話求の範曲第５項に載σご方法。 ７、＄造式 〔式中、Ｈｌ及びＨ９ね水木又にｓｕ、ｔ−ｔであり、
）ｔｌにじ１又Ｆ’ＳＯでめる〕を有すと染狛と、エピ
クロルヒドリン↑の架橋により多糖類の３次元網状＃ｌ
Ｉ造會牛敢せしめたテキストランとの鉢＠体會形Ｉｆｔ
？ゼ；この錯会体ｉ低イオン強腹の＃Ａ浴溶液平働（ヒ
ζゼ；該錯合体を発熱物質室７ｆ４（１）牛トロンビン
と接触ζせ：＃トロンビンを低イオン伽ｆＭ（７塩＃・
液で洗浄して１発熱物質金除去（、；発熱物ｌＪＮ會含
１ない牛トロンビンを回収すゐという工１ｉ！によって
製造Ｌ＝ｆｃ発熱物債を物情ない牛トロンビン。
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|---|---|---|---|
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| US06/292,236 US4380511A (en) | 1981-08-12 | 1981-08-12 | Purification of bovine thrombin |
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| JPS5944286B2 JPS5944286B2 (ja) | 1984-10-29 |
Family
ID=23123800
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57137453A Expired JPS5944286B2 (ja) | 1981-08-12 | 1982-08-09 | 牛トロンビンの精製法 |
Country Status (3)
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|---|---|
| US (1) | US4380511A (ja) |
| JP (1) | JPS5944286B2 (ja) |
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- 1981-08-12 US US06/292,236 patent/US4380511A/en not_active Expired - Fee Related
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1982
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- 1982-08-09 JP JP57137453A patent/JPS5944286B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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