DE3229132A1 - Reinigung von rinder-thrombin - Google Patents
Reinigung von rinder-thrombinInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung pyrogenen Materials aus Rinder-Thrccbin.
5
5
Pyrogene können unerwünschte Reaktionen in menschlichen
Körper hervorrufen, darunter Fieber, Schüttelfrost, Schmerzen im Rücken und in den Beinen sowie Unwohlsein.
Wegen dieser unerwünschten physiologischen Reaktionen,
die durch die Anwesenheit von Pyrogenen in Tieren verursacht werden, müssen pharmazeutische Präparate relativ frei von Pyrogenen sein.
die durch die Anwesenheit von Pyrogenen in Tieren verursacht werden, müssen pharmazeutische Präparate relativ frei von Pyrogenen sein.
Sämtliche biologischen Produkte für die parenterale
Verbreichung zu Zwecken der Verhütung, Diagnose oder Behandlung von Erkrankungen beim Menschen nüssen besondere Tests erfüllen, darunter auch eine Prüfung auf die Anwesenheit von Pyrogenen. Der Pyrogen-Test, wie er in der U.S.-Pharmakopoe beschrieben ist, ist ein biologischer Test, bei dem eine Fieber-Reaktion bei Kaninchen als Kriterium dient. Da die Verwendung von Pyrogene enthaltendem Thrombin bei topischer Anwendung zur Erzeugung lokalisierter Gerinnung Pyrogene in die Körperflüssigkeits-Systeme oder den Blutkreislauf einführen
kann, müssen solche Thrombin-Präparate den gleichen Anforderungen in bezug auf Pyrogene wie parenterale pharmazeutische Präparate genügen.
Verbreichung zu Zwecken der Verhütung, Diagnose oder Behandlung von Erkrankungen beim Menschen nüssen besondere Tests erfüllen, darunter auch eine Prüfung auf die Anwesenheit von Pyrogenen. Der Pyrogen-Test, wie er in der U.S.-Pharmakopoe beschrieben ist, ist ein biologischer Test, bei dem eine Fieber-Reaktion bei Kaninchen als Kriterium dient. Da die Verwendung von Pyrogene enthaltendem Thrombin bei topischer Anwendung zur Erzeugung lokalisierter Gerinnung Pyrogene in die Körperflüssigkeits-Systeme oder den Blutkreislauf einführen
kann, müssen solche Thrombin-Präparate den gleichen Anforderungen in bezug auf Pyrogene wie parenterale pharmazeutische Präparate genügen.
MS-I186
-r-
Remington's Pharmaceutical Sciences, 14. Auflage, S. 1524-1525 (1970) , hebt die Schwierigkeit der Entfernung
von Pyrogenen aus pharmazeutischen Präparaten hervor. Der Artikel gibt an, daß die bevorzugte Arbeitsweise
darin besteht, die Einschleppung von Pyrogenen in parenterale Präparate eher zu verhindern als ihre Entfernung zu versuchen, eine Aufgabe, die, der Angabe entsprechend, "im Grunde genommen unmöglich ist".
darin besteht, die Einschleppung von Pyrogenen in parenterale Präparate eher zu verhindern als ihre Entfernung zu versuchen, eine Aufgabe, die, der Angabe entsprechend, "im Grunde genommen unmöglich ist".
J.Pharm.Pharmac. _30.' 198 (1978), gibt an, daß zu den
bisher vorgeschlagenen Methoden zur Entfernung von Pyrogenen aus pharmazeutischen Verabreichungsformen die
Umkristallisation, sorgfältige Behandlung in Gegenwart von verdünntem Alkali, verdünnter Säure oder verdünnten
Oxidationsmitteln, Adsorption an Aktivkohle, Asbest oder anderen Stoffen, Anionenaustauschchromatographie
oder Kieselsäure-Dünnschichtchromatographie zählen. Die Autoren geben zu bedenken, daß die vorerwähnten Methoden
für den Einsatz im Laboratorium zur Bewältigung
kleinerer Mengen wohl von Wert seien, jedoch keine bestmögliche Entfernung von Pyrogenen aus einem unbeständigen
Arzneimittel im Maßstab vieler Liter zu bewirken imstande sind. Die Autoren entfernten die Pyrogene
durch Molekularfiltration, die jedoch eine aufwendige Arbeitsweise darstellt.
Nach dem Stand der Technik gibt es zahlreiche Methoden der Reinigung von Blutfaktoren, darunter dem Faktor II
(Prothrombin) , dem Faktor Ha (Thrombin) und dem Faktor X. Die zwei wichtigsten Methoden sind die Ionenaustauschchromatographie
und die Affinitätschromatographie.
Beispielsweise beschreibt J.Biol.Chem. 243, 112-117
MS-1186
(1968), die Reinigung von Thrombin mittels einer stufenweisen
chromatographischen Arbeitsweise an Diethylaminoethyl-(DEAE) -cellulose zur Entfernung von Plasminogen
und Plasmin. PEBS Letters 5_1 (1) , 191-194 (1975) beschreibt die Reinigung von Rinder-Trypsin und -Thrombin
durch Affinitätschromatographie.
Die wichtigsten Angaben zum Stand der Technik bezüglich der Reinigung von Blutfaktoren scheinen in Biochenica
et Biophysica Acta 222, 691-695 (1970), und 434. 199-208 (1976) , vorzuliegen.
et Biophysica Acta 222, 691-695 (1970), und 434. 199-208 (1976) , vorzuliegen.
Der Artikel von 1970 beschreibt eine Methode- zur Reinigung
des menschlichen Blutgerinnungsfaktors X. Da Prothrombin (Faktor II) in Thrombin (Faktor Ha) mittels
Katalyse durch den Faktor Xa umgewandelt werden kann, beschäftigten sich die Autoren damit, den Faktor X frei
von anderen Blutgerinnungsfaktoren, darunter auch Thrombin, zu erhalten. Die Methode umfaßte die Komplexierung
eines Komplexes aus blauem Farbstoff-Polysaccharid und Blutgerinnungsfaktoren und Chromatographieren.
Die Methode beruht auf der von der Ionenstärke abhängigen Assoziation der Gerinnungsfaktoren mit den
blauen Farbstoff-Anteilen des Komplexes und nachfolgenden Gelfiltrationen. Bei niedrigen Ionenstärken wurden
die Faktoren II und IX aus dem Hohlraumvolumen eluiert, was zeigt, daß sie mit dem blauen Farbstoff-Polysaccharid
komplexiert waren. Die Faktoren VII und X wurden aus dem eingeschlossenen Volumen eluiert, was zeigt,
daß sie nicht mit dem blauen Farbstoff-Polysaccharid-Komplex
komplexiert waren. Die Struktur des verwendeten blauen Farbstoffs wurde in J. Chromatography 69,
201-214 (1972) , dahingehend identifiziert, daß es sich um eine 4-Phenylamino-l-aminoanthrachinon-Struktur handelte.
MS-1186
-X-
Der Artikel von 1976 beschreibt die Reinigung der Faktoren
II, VII, IX und X aus menschlichem Plasma unter Verwendung des gleichen blauen Anthrachinon-Farbstoffs,
der mit einem Polysaccharid-Polymeren gekuppelt ist..
Die Elution mit Acetatpuffern trennte den Faktor X von den Faktoren II, VII und IX. Die Autoren geben an, daß eine Fraktion des an die Säule gebundenen Materials Faktor Ha- (Thrombin-) -Wirksamkeit zeigte, was auf eine mögliche Aktivierung des Faktors II zu Thrombin
hindeutete.
Die Elution mit Acetatpuffern trennte den Faktor X von den Faktoren II, VII und IX. Die Autoren geben an, daß eine Fraktion des an die Säule gebundenen Materials Faktor Ha- (Thrombin-) -Wirksamkeit zeigte, was auf eine mögliche Aktivierung des Faktors II zu Thrombin
hindeutete.
Sowohl der Artikel von 1970 als auch der Artikel von
1976 beschreiben die Reinigung des Faktors X zur Entfernung anderer, als Verunreinigungen vorliegender Gerinnungsfaktoren,
z.B. der Faktoren II, VII und IX. In beiden Artikeln wird jedoch die Entfernung von Pyrogenen
aus Thrombin weder nahegelegt noch offenbart.
Es besteht Bedarf an einer einfachen und wirksamen Methode
zur Entfernung von Pyrogenen aus Bluteiweiß-Produkten, die sich leicht auf ein Verfahren im Maßstab
vieler Liter übertragen läßt.
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur
Entfernung von Pyrogenen aus Rinder-Thrombin gerichtet. Das Verfahren umfaßt die Stufen der Bildung eines Komplexes aus einem blauen Anthrachinon-Farbstoff der nachstehenden Struktur
NH,
Entfernung von Pyrogenen aus Rinder-Thrombin gerichtet. Das Verfahren umfaßt die Stufen der Bildung eines Komplexes aus einem blauen Anthrachinon-Farbstoff der nachstehenden Struktur
NH,
MS-1186
in der R- und R2 für Wasserstoff oder SO3H und R- für
Cl oder OH stehen, und einem Dextran, das mit Epichlorhydrin unter Bildung eines Polysaccharids vernetzt wurde,
und das Herbeiführen eines Gleichgewichts des Komplexes mit einer Salzlösung niedriger Ionenstärke. Das
Pyrogene enthaltende Rinder-Thrombin wird in Berührung mit dem Komplex gebracht, und das Thrombin wird zur
Entfernung der Pyrogene mit einer Salzlösung niedriger Ionenstärke gewaschen. Das Pyrogen-freie Rir.der-Thrombin
wird dann isoliert, beispielsweise durch Desorption mit einer Salzlösung hoher Ionenstärke.
Das unreine, Pyrogene enthaltende Thronbin-Material,
das bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird,
kann aus Rinder-Plasma, das den Faktor II (Prothrombin) enthält, durch Umwandlung des Faktors II in Thrombin
erzeugt werden. In der Literatur sind verschiedene Verfahren zur Gewinnung von Thrombin beschrieben. Beispielsweise
kann Prothrombin aus Konzentraten des Faktors IX hergestellt werden /.""vgl. J.Biol.Chem. 248,
7729-7741 (1973)_/. Das Prothrombin kann an Bariumcitrat adsorbiert, mit Ethylendiamintetraessigsäure
eluiert, mit Ammoniumsulfat fraktioniert und mittels
Chromatographie an DEAE-Cellulose weiter gereinigt werden.
Das Prothrombin kann dann mit dem Rinder-Faktor Xa aktiviert werden, wie in J.Biol.Chem. 250, 8897-8906
(1975) beschrieben ist-.
Das zur Gewinnung des thrombinhaltigen Ausgangsmaterials verwendete Verfahren wird im Folgenden beschrieben.
Ein nicht-steriler Prothrombin-Komplex wurde aus Rinder-Plasma
mit Hilfe von Ionenaustausch-Verfahren frak-
MS-I186
tioniert. Fibrinogen und andere Verunreinigungen wurden durch Ausfällung entfernt, und das Prothrombin wurde
mit Rinder-Thromboplastin und Ca -Ionen aktiviert.
20
Arch.Biochem. 5_, 265 (1944) , beschreibt die Verwendung
von Thromboplastin und Calcium-, Strontium-, Magnesiumoder Barium-Salzen. J.Biol.Chem. 246, 6106-6114 (1971),
beschreibt die Aktivierung des Prothrombins mit Natriumcitrat und die nachfolgende Dialyse.
Das Thrombin-Material wurde dann einer Hochgeschwindigkeits-Zentrifugierung
unterworfen, um den Komplex zu klären, und anschließend einer makroporösen und einer
mikroporösen Membranfiltration unterworfen. Wie bereits oben erwähnt umfaßt der Stand der Technik verschiedene
Lehren in bezug auf die Erzeugung von Thrombin. Diese Methoden können zur Gewinnung des in der vorliegenden
Erfindung verwendeten Ausgangsmaterials angewandt werden. Es ist dieses Pyrogene enthaltende Thrombin, das
bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird.
bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird.
30
Ein blauer Anthrachinon-Farbstoff mit der Struktur
0 NH
■Ri
in der R. und R- für· Wasserstoff oder SO-H und R, für
Cl oder OH stehen, wurde an ein Dextran, das mit Epi-
MS-1186
/fO
-J-
chlorhydrin unter Bildung eines dreidimensionalen PoIysaccharid-Netzwerks
vernetzt wurde, gebunden. Eine geeignete blaue Farbstoff-Polysaccharid-Matrix, in der R-Cl
ist, ist im Handel bei der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden, unter der Handelsbezeichnung Blue Sepharose
CL6B erhältlich. Ein geeigneter blauer Farbstoff, in dem R- OH ist, ist im Handel bei der Firma Ciba AG,
Basel, Schweiz, unter der Handelsbezeichnung Cibracon Blau F3G-A erhältlich. Geeignete Polysaccharide sind im
' Handel bei der Firma Pharmacia unter den Handelsbe- :'-: "hnunnen Sephadex Typ G erhältlich.
.■ : Farbstoff wurde an das Polysaccharid mit Hilfe von
■ --.-."fahren gebunden, die in der Fachwelt wohlbekannt
sind /."vgl. J.Chromatography 6J3, 209-214 (1972)_7. Der
Farbstoff und das Polysaccharid können in wäßriger Lösung zusammengemischt werden, und ein Natrium-Salz kann
hinzugegeben werden. Das Rinder-Thrombin von geringer
Reinheit, das wie im Vorstehenden beschrieben erhalten wurde, wurde dann auf eine Säule aufgebracht, die aus
dem blauen Farbstoff-Polysaccharid-Komplex im Gleichgewicht
mit einer Salz-LÖsung niederer Ionenstärke, z.B. 0,10 bis 0,20 M NaCl, bestand. Das Thrombin wird mit
dem Komplex eine Zeit in Berührung gebrach't, die aus-
reicht, um eine Bindung des Thrombins an den Komplex zu ermöglichen. Bei der Berührung erfolgt die Bindung, und
das Waschen mit der die Gleichgewichtseinstellung bewirkenden Lösung wird unmittelbar nach der Berührung
durchgeführt. Das Thrombin wurde dann mit der die
Gleichgewichtseinstellung bewirkenden Lösung gewaschen, und die Pyrogene wurden mit der Waschlösung entfernt.
Das gereinigte Thrombin wurde dann von der Säule durch Desorption derselben mit einer Lösung hoher Ionenstärke,
z.B. 0,4 bis 2,0 M NaCl, entfernt.
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Eine Lösung von 2 g eines blauen Anthrachinon-Farbstoffs
mit der vorstehend dargestellten Struktur, in
der R.. für OH steht, in 60 ml Wasser wurde tropfenweise unter kräftigem Rühren bei einer Temperatur von 600C zu einer Suspension von 10 g Sephadex G-75 in 350 ml Wasser hinzugefügt, und anschließend wurde 30 min gerührt. Ein Anteil von 45 g NaCl wurde zugesetzt, und das Rtih-
der R.. für OH steht, in 60 ml Wasser wurde tropfenweise unter kräftigem Rühren bei einer Temperatur von 600C zu einer Suspension von 10 g Sephadex G-75 in 350 ml Wasser hinzugefügt, und anschließend wurde 30 min gerührt. Ein Anteil von 45 g NaCl wurde zugesetzt, und das Rtih-
ren wurde 1 h fortgesetzt. Die Mischung wurde dann auf 8O0C erhitzt, mit 4 g Na2CO3 behandelt und weiter lh
bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Abkühlen auf
Raumtemperatur wurde das Gel durch Absaugen über einen Büchner-Trichter filtriert und mit Wasser gewaschen.
Das Gel wurde in eine Säule (10 cm) gepackt .und mit
einer 0,2 M NaCl-Lösung bei einem pH im Bereich von etwa 6 bis 8 ins Gleichgewicht gesetzt.
Ein wie weiter oben beschrieben hergestelltes, pyrogenes Material enthaltendes Thrombin-Präparat mit einer
Anfangs-Reinheit von etwa 3 % Thrombin wurde dann auf die Gel-Säule aufgebracht. Das Gel wurde dann zur Entfernung
der Pyrogene mit der die Gleichgewichtseinstellung bewirkenden Lösung niedriger Ionenstärke gewaschen.
Die Anwesenheit des pyrogenen Materials in der durch die Kolonne hindurchtretenden Waschflüssigkeit
wurde mittels eines auf einem in Biochemica et Biophysica Acta 261, 284-289 (1972), beschriebenen Test beruhenden,
als "Limulus Amebocyte Lysate" bezeichneten Verfahrens geprüft.
Nachdem der Test auf die Anwesenheit pyrogenen Materials in der Lösung negativ verlaufen war, wurde das
MS-1186
-A -
Thrombin von der Gel-Säule dadurch desorbiert, daß diese mit einer Salzlösung hoher Ionenstärke, d.h. einer
2 M NaCl-Lösung in Berührung gebracht wurde. Das Thrombin hatte eine Reinheit von etwa 70 %. Das von der GeI-Säule
desorbierte Thrombin wurde dann gegen 0,15 M NaCl dialysiert, durch Filtration sterilisiert und gefriergetrocknet.
Das erhaltene Thrombin wurde mittels des im Vorstehenden erwähnten Pyrogen-Kaninchen-Tests geprüft; hierbei
wurde festgestellt, daß das Thronbin pyrogen-frei und für die Verwendung als tcpisch verabreichtes Blutgerinnungsmittel
geeignet ist.
Mit dem Thrombin assoziiert können auch Enzyme und Pro-■ enzyme, z.B. Plasmin und Plasminogen, vorliegen. Diese
Substanzen sind an dem Gerinnungsvorgang beteiligt, speziell an der Lyse von Thromben. Vorläufige Tests mit
dem wie oben beschrieben hergestellten Thrombin zeigen, daß die angegebene Verfahrensweise Plasmin und Plasminogen
aus dem Rinder-Thrombin entfernt.
MS-1186
Claims (7)
1. Verfahren zur Entfernung pyrogenen Materials aus Pyro-
gene enthaltendem Rinder-Thrombin, das die folgenden
5. Stufen umfaßt:
Bildung eines Komplexes aus einem Farbstoff der r.achsteher.den Struktur
in der R1 und R„ für Wasserstoff oder SO-H und R-für
Cl oder OH stehen, und einem Dextran, das mit Epichlorhydrin unter Bildung eines dreidimensionalen
Polysaccharid-Netzwerks vernetzt wurde;
Herbeiführen eines Gleichgewichts des Komplexes mit einer Salzlösung niedriger Ionenstärke;
Zusammenbringen des Komplexes mit dem Pyrogene enthaltenden Rinder-Thrombin;
Waschen des Thrombins zur Entfernung' der Pyrogene mit einer Salzlösung niedriger Ionenstärke und
Isolierung des von Pyrogenen freien Rinder-Thrombins.
MS-1186
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Herbeiführung des Gleichgewichts mit dem Komplex
verwendete Lösung niedriger Ionenstärke eine Ionenstärke von nicht mehr als 0,20 besitzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zum Waschen des Thrombins verwendete Salzlösung
niedriger Ionenstärke die gleiche Salzlösung wie diejenige ist, die zur Herbeiführung des Gleichgewichts mit
dem Farbstoff-Polysaccharid-Komplex verwendet wurde.
4. Verfahren nach Anspruch I1 dadurch gekennzeichnet, daß
die Isolierung des von Pyrogenen freien Rinder-Thrcrr.-bins in der Weise durchgeführt wird, daß das Thrombin
mit einer Salzlösung, deren Ionenstärke ausreicht, um das Thrombin von dem Komplex zu entfernen, behandelt
und anschließend das von Pyrogenen freie Rinder-Thrombin gesammelt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Entfernung des Thrombins von dem Komplex verwendete
Salzlösung eine Ionenstärke von nicht weniger als 0,4 besitzt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Salzlösung niedriger Ionenstärke und die zur Entfernung
des Thrombins verwendete Salzlösung beide NaCl enthalten.
7. Pyrogen-freies Rinder-Thrombin, hergestellt durch die Schritte der
Bildung eines Komplexes aus Farbstoff der nachstehenden Struktur
MS-1186
O NH
in der R1 und R_ für Wasserstoff oder SO1-H und R,
für Cl oder OH stehen, und einem Dextran, das mit Epichlorhydrin unter Bildung eines dreidimensionalen
Polysaccharid-Netzwerks vernetzt wurde;
Herbeiführen eines Gleichgewichts des Komplexes mit einer Salzlösung niedriger Ionenstärke;
Zusammenbringen des Komplexes mit dem Pyrogene enthaltenden Rinder-Thrombin;
Waschen des Thrombins zur Entfernung der Pyrogene mit einer Salzlösung niedriger Ionenstärke und
Isolierung des von Pyrogenen freien Rinder-Thrombins.
MS-1186
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US06/292,236 US4380511A (en) | 1981-08-12 | 1981-08-12 | Purification of bovine thrombin |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3229132A1 true DE3229132A1 (de) | 1983-03-03 |
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Country | Link |
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1981
- 1981-08-12 US US06/292,236 patent/US4380511A/en not_active Expired - Fee Related
-
1982
- 1982-08-04 DE DE19823229132 patent/DE3229132A1/de not_active Withdrawn
- 1982-08-09 JP JP57137453A patent/JPS5944286B2/ja not_active Expired
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: MILES, INC., ELKHART, IND., US |
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8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: MUELLER, G., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT., PAT.-ASS., 5 |
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8130 | Withdrawal |