-
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von Urokinase
für Injektionszwecke aus menschlichem Urin durch Adsorption der Urokinase an einen
Cellulose-Kationenaustauscher bei saurem pH-Wert, Waschen des @ustauschers, Elution
der Urokinase mit wäßriger alkalischer Lösung, Ausfällung der Urokinase aus dem
Eluat, Dialyse des Niederschlages und anschließende weitere Reinigung mittels Ionenaustauschern.
-
Durch Urokinase, ein Proteinenzym, wird das im Blut vorkommende Plasminogen
spezifisch aktiviert und Plasmin gebildet. Da Plasmin die Fähigkeit besitzt, Fibringerinsel
zu lösen und zu verteilen, können innerhalb der Blutgefäße oder durch Verletzungen
erzeugte Fibrinausfällungen oder fibrinöse Koagulate durch intravenöse Injektion
von Urokinase zur Auflösung gebracht werden, weshalb Urokinase für die Behandlung
verschiedenster Arten von Thrombosen von Bedeutung ist. Dabei ist nicht zu befürchten,
daß das im Blut durch Urokinase aus Plasminogen gebildete Plasmin irgendwelche artfremden
Eiweißstoffe enthält, so daß bei der klinischen Anwendung von Urokinase jede Sorge
bezüglich schädlicher Nebenwirkungen durch artfremde Eiweißstoffe vollkommen ausgeschaltet
ist.
-
Urokinase wird aus Menschenharn nach einem bekannten Verfahren gewonnen,
bei dem der Harn unter Druck durch eine chromatographische Säule geschickt, Urokinase
an Silicagel adsorbiert und anschließend mit wäßrigem Ammoniak eluiert wird. Diese
Arbeitsweise wird von L. P 1 o u g und K j e 1 d g a a r d in Biochim. Biophys.
Acta, Bd. 24 (1957), S. 278 und in der japanischen Patentschrift 252 825 (registriert
am 23. 6. 1959) beschrieben.
-
Dieses Verfahren ist jedoch nachteilig, und zwar nicht nur, weil bei
der industriellen Herstellung wegen der geringen Durchlaufgeschwindigkeiten extrem
große Säulen erforderlich sind, sondern auch wegen der Ausbreitung von Bakterien
im Harn im Verlauf der langen Behandlungszeiten; dadurch wird die bakterielle Bildung
von fiebererregenden Substanzen gefördert, die jede Injektion der gewonnenen Substanz
verbietet.
-
Proteasen allgemein können, wie in der deutschen Auslegeschrift 1036192
angegeben wird, zum einen durch ein sogenanntes »Adsorptions-Auswasch-Verfahren«
gereinigt werden, bei dem das Enzym an einem grobporösen Kationenaustauscher z.
B. auf Phenoxyharzbasis aus etwa neutraler Lösung selektiv adsorbiert wird, während
ein wesentlicher Teil der Verunreinigungen durch die Harzschicht hindurchgeht. Zum
anderen werden in dieser Patentschrift Ionenaustauscherharze, und zwar sowohl Kationenaustauscherharze
(mittelporöse Phenolpolymere, deren Ionenaustauschradikale durch Phenoxyessigsäure
gebildet werden) als auch Anionenaustauscherharze (grobporöse Phenolpolymere mit
primären, sekundären und tertiären Amingruppen oder mittelporöse Styrolpolymere
mit quaternären Ammoniumgruppen) genannt, die färbende Verunreinigungen der Proteasen
adsorbieren, die Proteasen selbst aber nicht zurückhalten und so zum Entfärben von
Proteasen verwendet werden können. Dabei werden die Kulturlösungen selbst oder eine
nach AussaIzen und Wiederauflösen erhaltene Lösung der zu reinigenden Enzyme verwendet.
-
Eine Anwendung des Adsorptions-Auswaschverfahrens auf die Gewinnung
von Urokinase aus menschlichem Urin ist aus der deutschen Auslegeschrift 1054 405
bekannt. Danach wird die Urokinase zunächst an einem Adsorptionsmittel wie Kieselsäuregel,
kationenaustauschendem Silikat oder Oxycellulose bei pH-Werten von 3 bis 7 bzw.
8 adsorbiert und dann mit wäßriger alkalischer Lösung wieder eluiert. Danach findet
vorzugsweise eine Ausfällung der Urokinase mit einem Salz wie Natriumchlorid oder
Ammoniumsulfat oder mit organischen Lösungsmitteln wie Äthanol, Aceton oder Dioxan
und eine Wiederauflösung statt. Die auf diese Weise erzielte angereicherte Lösung
wird gegebenenfalls dialysiert und dann, nach Einstellen des pH-Wertes auf Werte
zwischen 6 und 10, vorzugsweise zwischen 7 und 9, zur Adsorption der Urokinase auf
ein carboxyIgruppenhaltiges synthetisches Kationenaustauscherharz, das mit einer
wäßrigen Elektrolytlösung mit einem pH-Wert zwischen 5 und 7 und einer Kationenstärke
zwischen 0,1 und 1 Grammäquivalent pro Liter vorbehandelt wurde, gebracht, von dem
die Urokinase nachfolgend mit einer Puffersalzlösung eluiert wird, die einen pH-Wert
aufweist, der zur Bildung eines Eluats mit einem pH-Wert zwischen 5 und 11 führt.
-
Dieses bekannte Verfahren wird gemäß der Erfindung durch die. Auswahl
anderer Adsorbentien und die Durchfühung einer selektiven Adsorption von Verunreinigungen
an einem Anionenaustauscherharz derart verbessert, daß, wie weiter unten mehr im
einzelnen dargelegt wird, bedeutend höhere Ausbeuten an aktiverem Produkt erzielt
werden.
-
Ausgehend vom Stand der Technik zur Gewinnung von Urokinase für Injektionszwecke
aus menschlichem Urin durch Adsorption der Urokinase an einem Cellulose-Kationenaustauscher
bei saurem pH-Wert, Waschen des Austauschers, Elution der Urokinase mit wäßriger
alkalischer Lösung, Ausfällung der Urokinase aus dem Eluat, Dialyse des Niederschlages
und anschließend weitere Reinigung mittels Ionenaustauschern ist das erfindungsgemäße
Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß man als CelluIose-Kationenaustauscher Sulfomethylcellulose
bei einem pH-Wert von 2,5 bis 6,0 und für die weitere Reinigung mittels Ionenaustauschern
Diäthylaminoäthylcellulose und nachfolgend Carboxymethylcellulose verwendet.
-
Die erfindungsgemäß zu verwendende Sulfomethylcellulose hat die Eigenschaft,
basische Proteine, wie Urokinase, leicht zu binden, und sie kann außerdem im Harn
dispergiert bzw. verteilt werden, was eine Behandlung von 5001 Harn in etwa 3 Stunden
ermöglicht. Wenn ein Material wie Harn verarbeitet wird, so werden leicht fiebererregende
Substanzen während der Behandlung gebildet, und es ist folglich wichtig, daß ein
.solches Material wie Urin rasch, d. h. in kurzen Zeiten, verarbeitet wird. Die
Elution der Urokinase erfolgt mit verdünnter alkalischer Lösung von pH 8 bis 11
nach vorangehendem Waschen der Sulfomethylcellulose. Nach einer Zwischenfällung
zum Anreichern der Urokinase wird die Lösung zur Abtrennung gefärbter Verunreinigungen,
die darin zurückgehalten werden, mit Anionenaustauscher-Cellulose behandelt, woran
sich eine Behandlung mit Kationenaustauscher-Cellulose zur Abtrennung von artfremden
Eiweißstoffen anschließt. Den Abschluß bildet eine Filtration zur Entfernung von
Mikroorganismen, und man erhält so eine Urokinase für Injektionszwecke,
die
aseptisch und frei von fiebererregenden Substanzen ist.
-
Vergleichsversuche Die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens
gegenüber dem bekannten Verfahren nach der deutschen Auslegeschrift 1054 405 ergibt
sich aus der nachfolgenden Gegenüberstellung der neuen und bekannten Arbeitsweise
und der jeweils erzielten Ergebnisse.
-
Für diese Versuche wurden 1001 von gesunden, erwachsenen, männlichen
Personen gesammelter Urin verwendet, der in zwei Portionen zu je 501 zur Gewinnung
von Urokinase nach dem bekannten Verfahren A und gemäß der Erfindung B aufgeteilt
wurde.
-
A. 501 Urin wurden zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,5 vorsichtig
mit 7 n-NaOH versetzt. Die dabei erzielte weiße voluminöse Fällung wurde abfiltriert.
Zum Filtrat wurden unter Rühren bis zur Einstellung des pH-Wertes auf 4,0 Essigsäure
und dann 300 g Oxycellulose hinzugegeben. Zur Adsorption der Urokinase an der Oxycellulose
wurde weiter 30 Minuten lang gerührt: Die Flüssigkeit wurde dann etwa 1 Stunde lang
stehengelassen und danach die überstehende Flüssigkeit entfernt und die Oxycellulose
abfiltriert. Letztere wurde mit 1 1 0,05 M Phosphatpufferlösung von pH 7,0 gewaschen;
danach wurde die Urokinase mit etwa 11 1o/oigem wäßrigem Ammoniak eluiert. Zu dem
bräunlichen Eluat wurde Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 20 Gewichtsprozent
und 1 n-Salzsäure zur Einstellung des pH-Wertes auf 1,5 hinzugegeben. Nach 2 bis
3 Stunden langem Stehenlassen wurde die braune Flüssigkeit durch Zentrifugieren
abgetrennt und der Niederschlag gesammelt. Dieser wurde mit verdünntem wäßrigem
Ammoniak von pH 8,0 behandelt, und nach Entfernung des ungelösten Anteils wurde
die schwach ammoniakalische Flüssigkeit gegen destilliertes Wasser dialysiert und
einem Gefriertrocknen unterworfen. Es wurden so 450 mg eines trockenen Produkts
mit 250 Ploug-Einheiten je Milligramm (J¢rgen P 1 o u g und Niels Ole K j e 1 d
g a a r d , Biochim. Biophys. Acta, 24 [1957], S. 278) erhalten.
-
Dieses trockene Produkt wurde in 10 ml einer 0,1M Natriumchlorid enthaltenden
0,03 M Phosphatpufferlösung vom pH 6,2 gelöst, die über eine Ionenaustauschersäule
mit »Amberlite IRC 50 (XE 97)« gegeben wurde, der mit dem vorgenannten Puffer ins
Gleichgewicht gebracht worden war. Nach Waschen der Säule mit 100 ml der gleichen
Pufferlösung wurde mit 100 ml 0,5 M Natriumchloridlösung eluiert. Die proteinhaltige
Fraktion wurde gesammelt und nach Dialyse gegen destilliertes Wasser durch Gefriertrocknen
in ein trockenes Produkt verwandelt. Auf diese Weise wurden 4,5 mg Urokinase mit
9800 Ploug-Einheiten je Milligramm erhalten.
-
B. 501 Urin wurden zur Einstellung des pH-Wertes auf 2,5 unter Rühren
vorsichtig mit 5 n-Salzsäure und danach mit 100 g Sulfomethylcellulose versetzt,
die mit einem Phosphatpuffer von pH 3,0 ins Gleichgewicht gesetzt worden war und
60 Minuten lang gerührt. Die Sulfomethylcellulose wurde dann abfiltriert und zunächst
in 110,025 M Phosphatpuffer von pH 6,8 gerührt und gewaschen und nachfolgend mit
11 0,025 M Phosphatpuffer von pH 7,2 30 Minuten lang gerührt und gewaschen. Nach
dieser Behandlung wurde die Sulfomethylcellulose in 500 ml 3o/oigen wäßrigen Ammoniak
gegeben und 30 Minuten lang zur Eluierung der Urokinase gerührt. Der pH-Wert der
erhaltenen Flüssigkeit wurde durch Zugabe von 1 n-Salzsäure vorsichtig auf 3,5 eingestellt.
Danach wurde Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 40 Gewichtsprozent
zugegeben. Nach 2 Stunden Stehenlassen unter Rühren wurde der gebildete Niederschlag
durch Zentrifugieren abgetrennt. Nachfolgend wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert
und danach lyophylisiert. Es wurden 170 mg trockenes Produkt mit 1300 Ploug-Einheiten
je Milligramm erhalten.
-
Dieses trockene Produkt wurde in 20 ml 0,005 M Phosphatpuffer vom
pH 7,0 gelöst und über eine mit Diäthylaminoäthylcellulose gefüllte Säule (von 1,5
X 15 cm) gegeben, die mit der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden
war. Dabei wurden gefärbte Bestandteile der Lösung durch Adsorption abgetrennt.
Die Säule wurde mit 30 ml der gleichen Pufferlösung gewaschen und die vereinigten
Flüssigkeiten gegen 0,005 M Acetatpuffer von pH 3,15 dialysiert. Die Flüssigkeit
wurde dann zur Ab- bzw. Adsorption der Urokinase über eine mit Carboxymethylcellulose
gepackte Säule (1,5 X 20 cm) gegeben, die mit dem gleichen Acetatpuffer wie vorstehend
ins Gleichgewicht gebracht worden war. Nach einer Elution von Fremdeiweiß mit 0,025
M Acetatpufferlösung von pH 5,7 wurde die Urokinase mit einer 0,075 M Natriumchlorid
enthaltenden 0,025 M Acetatpufferlösung von pH 4,0 eluiert. Die proteinhaltige Fraktion
wurde gesammelt und nach einer Dialyse gegen destilliertes Wasser lyophylisiert.
Es wurden 11 mg trockenes Produkt mit 10100 Ploug-Einheiten je Milligramm erhalten.
-
Nachfolgend wird ein Beispiel für eine Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens in etwas größerem Maßstab beschrieben.
-
Beispiel 1000 g einer vorangehend mit Phosphatpuffer von pH 2,5 bis
6,0 ins Gleichgewicht gebrachten Sulfomethylcellulose werden zu 5001 Menschenharn
hinzugegeben. Zu der durch ausreichendes Rühren gut dispergierten bzw. verteilten
Sulfomethylcellulose wird allmählich 5n-Salzsäure zur Einstellung des pH-Wertes
auf 2,0 bis 3,0 zugefügt. Nach weiteren 60 Minuten Rühren wird stehengelassen.
-
Danach wird der überstehende transparente Harn entfernt und der in
der unteren Schicht abgesetzte braungefärbte Niederschlag bzw. Festkörper durch
Filtrieren oder Zentrifugieren gesammelt und mit 0,025 M Phosphatpuffer von pH 7,2
gewaschen, bis das abgehende Waschwasser wasserhell wird und ein fast weißer Rückstand
erhalten wird. Die erhaltenen Feststoffe werden in 3o/oigem wäßrigem Ammoniak suspendiert,
und danach wird zur Erzielung von etwa 51 Urokinase-Eluat filtriert. Durch allmähliche
Zugabe von etwa 500 ml 5 n-Salzsäure wird der pH-Wert des Urokinase-Eluats auf 3,5
eingestellt und feingepulvertes Ammoniumsulfat unter Rühren fortlaufend dazugegeben,
bis die Endkonzentration an Ammoniumsulfat 40 Gewichtsprozent erreicht. Das Rühren
wird weiter 2 Stunden lang nach dieser Salzzugabe fortgesetzt, und die sich abscheidenden
Feststoffe werden durch Filtrieren oder Zentrifugieren gesammelt und wieder in lo/oigem
wäßrigem Ammoniak gelöst, woran sich eine Dialyse gegen 0,005 M Phosphatpuffer
von
pH 7,0 anschließt. Nach Vervollständigung der Dialyse wird die konzentrierte Urokinaselösung
durch eine Säule (Innendurchmesser 3,00 cm und Länge 35 cm) mit Diäthylaminoäthylcellulose,
die vorangehend mit 0,005 M Phosphatpuffer von pH 7,0 bis zur Gleichgewichtseinstellung
behandelt wurde, geschickt zur Erzielung einer Urokinaselösung, von der die gefärbten
Bestandteile abgetrennt sind.
-
Diese Urokinaselösung wird nach Dialyse gegen 0,005 M Acetatpuffer
von pH 3,15 über eine Säule mit einer vorangehend mit 0,005 M Acetatpuffer von pH
3,15 ins Gleichgewicht gebrachten Carboxymethylcellulose gegeben und an dieser adsorbiert;
es folgt eine ausreichende Elution artfremder Eiweißstoffe mit 0,025 M Acetatpuffer
von pH 5,7 und eine daran anschließende Elution mit 0,025 M Acetatpuffer von pH
4,0, der 0,075 M Natriumchlorid enthält; die so erhaltene Urokinaselösung wird dann
einer ausreichenden Dialyse gegen physiologische Kochsalzlösung und Filtration zum
Abtrennen von Keimen sowie Lyophilisierung unterworfen. Auf dies Weise wurden etwa
100 mg aseptische Urokinase er, halten, die frei von fiebererregenden Substanzen
ist. Entsprechend der Bestimmungsmethode nach K j e 1 dg a ar d (s. oben zitierten
Aufsatz) hat diese gereinigte Urokinase eine spezifische Aktivität von etwa 10 000
Einheiten je Milligramm.