DE2448371A1

DE2448371A1 - Verfahren zur isolierung der transferrine aus biologischen stoffen

Info

Publication number: DE2448371A1
Application number: DE19742448371
Authority: DE
Inventors: Eraldo Antonini
Original assignee: TERAPEUTICA ITALIANA O T I LAB
Current assignee: TERAPEUTICA ITALIANA O T I LAB
Priority date: 1973-10-31
Filing date: 1974-10-10
Publication date: 1975-05-07
Also published as: GB1463327A; US3959249A; JPS5082213A; JPS5747919B2; DE2448371C2; IT1048150B

Description

Patentanmeldung
der Firma

Officina Terapeutica Italiana 0. T. I,
Laboratorio Biologico S. p. A.

Piazzale della Stazione 7
Parma / Italien

Verfahren zur Isolierung der Transferrine aus biologischen Stoffen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung der Transferrine aus biologischen Stoffen, insbesondere des Conalbumins, in reinem Zustand.

Bekanntlich enthalten viele biologische Flüssigkeiten, wie Blut- und Milch-Serum, Eiweiß ähnliche, als Transferrine bezeichnete Proteine, die einander ähnlich sind und die Eigenschaft haben, gewisse Metalle, wie Eisen und Kupfer, fest zu binden.

Bekanntlich enthält das Eiweiß beträchtliche Mengen eines Transferrins, ds unter der Bezeichnung Conalbumin bekannt ist. Die Iso-

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lierung großer Mengen reinen Conalbumins, im Nativ-Zustand, bedeutet einen beträchtlichen Vorteil für alle gewerblichen Anwendungsmöglichkeiten des Proteins und für alle Forschungszwecke, wo dieses Protein gebraucht wird.

Die bisher zur IsAierung der Transferrine bekannten Verfahren, insbesondere des Conalbumins aus dem Eiweiß, beruhen auf einer fraktionierten Fällung mittels Salzen oder organischen Lösungsmitteln und/oder auf Chromatographie auf Ionenaustauscherharzen. Diese bekannten Verfahren weisen jedoch Mängel auf, wie denjenigen zahlreicher Durchgangsstufen, eines großen Aufwandes an Zeit, Apparaturen und teurer Reaktionsstoffen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens, mittels dessen die Isolierung der Transferrine aus biologischen Stoffen, insbesondere aus Conalbumin, in höchstem Reinheitsgrad und mit einer geringster Anzahl Durchgänge möglich ist. Weiterhin soll ein Verfahren zur Isolierung der Transferrine geschaffen werden, welches kurzfristig und einfach abläuft und zwar bei Raumtemperatur und mit einer weniger aufwendigen Apparatur als bei den bekannten Verfahren.

Die Erfindung besteht darin, daß ein biologischer Stoff auf ein pH zwischen 3 und 6 gebracht wird und eine Materialmasse passiert, die aus einem festen Träger besteht, enthaltend chelierende Gruppen, welche zu metallischen Ionen der Transitionsgruppe koordiniert sind, in Gegenwart einer Pufferlösung mit zwischen 3 und 6 liegendem pH, ohne chelierende Eigenschaft, daß diese Masse alsdann durch eine Lösung passiert, enthaltend eine Komponente mit Wirksamkeit für den Transferrin-Metallkomplex und daß as der durch die Masse passierten Lösung das reine Transferrin mittels Abscheidung der ein geringeres Molekulargewicht als das Transferrin aufweisenden Komponenten abgesondert wird.

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Zwecks besseren Verständnisses des Verfahrens zur Isolierung der Transferrinen aus biologischen Substanzen werden nachfolgend ausführlich zwei Ausbildungsbeispiele beschrieben, während noch eine Andeutung zur Durchführung weiterer Abwandlungen des Verfahrens gemacht wird.

BEISPIEL 1

Zunächst wird ein Komplex Fe ⁺-Carboxymethylzellulose aufbereitet:

Zur Zubereitung dieses Komplexes werden 1,5 kg Carboxymethylzellulose in destilliertem H„0 aufgeschwemmt, mit 4-5 Volumen (ca. 10 1) einer wässerigen Lösung aus 0,5 M FeCL., versetzt und 4 Stunden lang gerührt. Alsdann wird auf Buchner der entstandene Komplex Fe-CMC filtriert ud die Harzschicht mit destilliertem H₂O bis zum Verschwinden der Reaktion der Fe -Ionen im Filtrat gewaschen.

Alsdann wird dsB Harz in einen geeigneten Behälter geschüttet und mit 4-5 Volumen NH.OH IM (ca. 8 1) behandelt und 4 Stunden lang umgerührt. Es wird mit Buchner filtriert und alsdann mit destilliertem H2O gewaschen, bis d=s Filtrat ein pH zwischen 7-8 aufweist. Nun wird das Harz in einen entsprechenden Behälter umgeschüttet und unter Umrühren mindestens 30 Minuten lang mit 3-4 Volumen azetiertem Puffer 0,1 M, pH = 5 behandelt und erforderlichenfalls das pH auf 5 eingestellt.

10 kg Eier-Eiweiß (integrales Eiweiß) werden mittels Ionen-Austauscherharzen gemjssht aus Kationen-Anionen (Umrühren in Bacht) entionisiert.

Das so entionisierte Eiweiß wird im Fallen mittels Mulle filtriert, das Filtrat auf pH = 5 eingestellt und erneut filtriert durch Fäl-

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len im Papierfalten-Filter. Das pH des erhaltenen Filtrats, das völlig klar ist, wird erneut kontrolliert (es muß das pH = 5 beibehalten werden) und ggf. neu eingestellt, worauf 1/10 seines Volumens azetierter Puffer 0,1 M, pH = 5, zugesetzt wird und einige Minuten lang umgerührt wird. Die so erhaltene Flüssigkeit wird durch das Fe-CMC-Harz passiert, das zuvor wie beiats beschrieben zubereitet worden war, und geschichtet auf einem mit besonderer Filterpappe versehenem Buchner. Die progressive Adsorbierung des Conalbumins kann sichtbar verfolgt werden durch den Fortschritt einer hellbraunen Farbschicht auf der ursprünglichen dunkelbraunen Schicht des Fe-CMC. Nachdem die gesamte Flüssigkeit durchgesickert ist, wird mittels azetiertem Puffer 0,1 M, pH = 5, gewaschen, bis das Filtrat keine Anwesenheit von Protein mehr zeigt, worauf das Conalbumin eluiert wird und Verwendung als Eluiermittel eines Aze-

_3 tat-Puffers 0,1 M, pH = 5, enthaltend Natrium-Zitrat 2 χ 10 (0, 2 ml Natrium-Zitrat 1 M in 100 ml Azetat-Puffer 0,1 M mit pH = 5,5).

Die Lösung aus Conalbumin, die so erhalten wird, wird gemäß bekanntem Verfahren der Enteisenung unterzogen, beispielsweise indem das pH auf 4,7 mit fester Zitronensäure gebracht wird und wiederholt unter Umrühren im Bacht mit starken Kationenharzen mehrmals behandelt wird, beispielsweise mit handelsüblichen Kationenharzen in einer jeweils 25-30 Minuten dauernden Zeit und jedes Mal filtriert und die Aufrechterhaltung des pH bei 4,7 überwacht. Die eisenfreie Flüssigkeit, die mittels konzentrierten NaOH auf ein pH von 6,5 gebracht wurde, wird einer Dialyse in kaltem destilliertem H₃O (3° bis 4°C) unterworfen, bei häufigem Wechsel der Dialysierflüssigkeit während mindestens 48 Stunden. Das Dxalysierprodukt wird nach Filtrieren dreh Fällung mit Papier einer Lyophilisierung unterzogen. Das erhaltene Erzeugnis wird spektro-photometrischen Kontrollen unterzogen (bei 278 nm im UV in HCL o,o2 M und bei 470 und 480 nm im Sichtbaren als Fe-Conalbumin) und elektro-phoretischen

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Kontrollen, wobei es sich als maßgeblich reines Apoconalbumin erweist.

Die Ausbate beträgt ca. IO g Conalbumin pro kg Albumin.

Das lyophilisierte Conalbumin erweist sich als 6 Monate lang die Eigenschaften unverändert behaltend, wenn bei Raumtemperatur oder darunter aufbewahrt. Die nach Konservierung beobachteten Eigenschaften erwiesen sich u. a. als

a) Bindefähigkeit für Eisen-Nionen in stöcheometrischen Mengen,

b) Beweglichkeit bei Elektroforesis auf Gel,

c) Verhinderungfähigkeit des Bakterienwuchses.

BEISPIEL 2

Zunächst wird ein Komplex aus Carboxymethylzellulose mit Eisen aufbereitet; dazu werden 50 g Carboxymethylzellulose in für Chromatographie üblicher Form in 250 ml FeCl₃ 1 M aufgeschwemmt und die Schwemme wird 3 Stunden lang gerührt. Das Harz wird alsdann auf Filter aufgenommen und mit Wasser solange gewaschen, bis der Überschuß an Fe -Ionen beseitigt ist. Das Harz wird dann in 500 ml NH.OH 1 M aufgeschwemmt und 12 Stunden lang in diesem Mittel belassen.

Die Schwemme wird alsdann filtriert und das Harz auf Filter mit Wasser/gewaschen bis zur Entfernung des Überschusses an NH .0H. Das Harz wird alsdann in Wasser aufgeschwemmt und so kalt stehen lassen (+5⁰C).

Mit dem Fe -CMC-Harz das wie beschrieben aufbereitet wurde, werden Säulen für Chromatographie mit 0,7 cm Durchmesser hergestellt,

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die 15 ml der Schwemme enthalten. Die Säule wird alsdann mit einer Pufferlösung aus Puffer mit pH 5,5 0,05 M bestehend equilibriert.

Eine Lösung enthaltend ca. 50 mg Conalbumin und ein pH 5,5 aufweisend sowie eine Molarität 0,05 M, wird auf die Säule gegeben. Es wird alsdann das Waschen der Säule mit dem für die erste Equilibrierung benützten Puffer durchgeführt.

Das Eluierprodukt wird in Fraktionen von 2 ml aufgenommen. Es wird die optische Dichte der Fraktionen bei 280 nm bestimmt; den Fraktionen wird alsdann festes Natriumbikarbonat zugesetzt (Endkonzentration ungefähr 0,2 M) und es wird die optische Dichte bei 470 nm festgestellt. Mit diesen Vorgängen wird der Gehalt an Proteinen und an Conalbumin der Fraktionen im Eluierprodukt der Säule gemessen.

Das Eluierprodukt, das mit dem Azetat-Puffer bei pH 5,5 0,05 M erhaltenwird, enthält weitere Proteine, jedoch nur unerhebliche Mengen an Conalbumin.

Die Eluierung wird alsdann mit einem Natriumborat-Puffer per pH 9,2 0,05 fortgesetzt. Dieses zweite Eluat enthält Conalbumin, das maßgeblich von allen anderen Proteinen gereinigt ist, die anfangs im Ausgangsmaterial vorhanden waren.

Zahlreiche Versuche wurden durchgeführt unter Änderung der Versuchsverhältnisse, die oben beschrieben wurden. Die Ergebnisse dieser Versuche lauten wie folgt:

Wird das Conalbumin oder Apoconalbumin enthaltende Material af die mittels Puffern equilibrierte Kolonne aufgegeben, beispielsweise mit Kalium-Phosphat, mit über 7 liegendem pH und Molarität 0,05 - 0,2 M, und mit dem gleichen Puffer eluiert, wird das Conal-

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bumin nicht in der Kolonne zurückgehalten und tritt bei der Eluierfront aus.

Wird dagegen der Puffer, mit dem die Kolonne euqilibriert und eluiert, ein pH zwischen 3 und 6 aufweisen und ein Molgewicht von 0,01 - 0,2 M werden sowohl das Conalbumin als auch das Apoconalbumin adsorbiert und in der Kolonne zurückgehalten.

Das adsorbierte Conalbumin kann aus der Kolonne durch Veränderung der Waschflüssigkeit eluiert werden. Die letztere kann aus einem Puffer mit über dem pH 6 bestehen (Molargewicht 0,1 - 0,2 M). Die Eluierung der Proteine kann auch mittels eines Puffers erhalten werden, dessen pH unter 6 liegt, jedoch Natrium-Zitrat gleicher Konzentration oder über 10 M enthaltend.

Nach Eluierung des Conalbumins kann die Kolonne neu mittels des ersten Puffers equilibriert werden und das Adsorbierungs- und Eluierverfahren kann mit dem bereits zuvor benützten Harz wiederholt werden.

Es ist zu bemerken:

a) die Adsorbierung des Conalbumins auf der Kolonne unter den beschriebenen Bedingungen ist sehr spezifisch. Mittels Elektrophorese auf Gel kann nachgewiesen werden, daß andere Proteine (beispielsweise die im Ausgangs-Rohmaterial vorhandenen) nicht adsorbiert werden und daß das adsorbierte und danach aus der Kolonne eluierte Protein aus reinem Conalbumin besteht.

b) Im Durchgang durch die Kolonne der Fe -Carboxymethylzellulose wandelt sich das ggf. im Ausgangs-Rohmaterial vorhandene Apoconalbumin in Conalbumin um, also das aus der Kolonne eluierte Protein erweist sich stets als Komplex mit Eisen des Co-

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nalbumins.

b) Im Durchgang durch die Kolonne der Fe -Carboxymethylzellulose wandelt sich das ggf. im Ausgangs-Rohmaterial vorhandene Apoconalbumin in Conalbumin um, also das aus der Kolonne eluierte Protein erweist sich stets als Komplex mit Eisen des Conalbumins.

c) Die Fähigkeit des Harzes das Conalbumin unter den beschriebenen Bindungen zu adsorbieren, hängt spezifisch von der Gegenwart des an die Carboxymethylzellulose gebundenen Metalls ab. Nämlich eine Carboxymethylzellulose-Kolonne ohne Eisen, die mittels azetiertem Puffer per pH 5,5 0,1 M equilibriert ist, hält merklich nicht das Conalbumin zurück, im Gegenteil zu einer Kolonne aus
chen Bedingungen.

einer Kolonne aus Fe -Carboxymethylzellulose unter den glei-

d) Wird das oben beschriebene Adsxbtions- und Eluierverfahren des Conalbumins auf unreine Präparationen des Proteins oder sogar auf Eiweiß von Eiern angewandt, wird maßgeblich das Conalbumin in reinem Zustand erhalten.

Das Prinzip der Isolationsmethode der Transferrine wie vorbeschrieben, beruht auf der spezifischen Eigenschaft, insbesondere des Conalbumins, sich mit organischen Chelierstoffen und inorganischen des Eisens zu binden, sowie des Kupfers und anderer Metalle der Transitionsgruppe. Wenn die Cheliergruppen an eine in wässerigen Lösungsmitteln unlösliche Struktur gebunden sind, in Gegenwart eines Metalls der Transitionsgruppe, bleiben die Transferrinen auf der festen Matrize adsorbiert, während die anderen ggf. vorhandenen Proteine im biologischen Ausgangsmaterial keine Neigung besitzen, mit dem festen Metall-Matrize-chelierenden Komplex zusammenzuwirken. Die Eluierung der Transferrine der festen Matrize kann mittels

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der Exposition des Systems zu Lösungen erhalten werden, die ein pH und eine ionische Kraft aufweisen, die verschieden von der Anfänglichen sind oder zu Lösungen, welche ein in Lösung freies Cheliermittel aufweisen und in genügenden Konzentrationen, welche ggf. mittels Versuche bestimmt werden. Das Adsorbier- und Eluierverfahren der "Bansferrinen aus der festen Matrizen-chelierenden-Metallstruktur, kann vorteilhafterweise durch Verwendung von gewöhnlich für chromatographische Verfahren benützte Kolonnen&urchgeführt werden.

Das Material, auf welchem die Transferrinen adsorbiert werden, kann aus jeder beliebigen polynerisfen Substanz hergestellt werden, die in wässerigen Lösungsmitteln unlöslich ist, welche Gruppen ethalten, beispielsweise Carboxylgruppen, welche Metallionen chelieren können, der Transitionsgruppe, wie Eisen und Kuper-Ionen. Ein geeignetes Material aufgrund seiner handelsüblichen Verbreitung und des billigen Preises ist die Carboxymethylzellulose der üblicherweise für Chromatographie benützten Form.

Das chelierende feste Material wird mittels Ferri-Ionen gesättigt oder Ionen anderer Metalle der Transitionsgruppe gemäß allgemein bekannter Verfahren gesättigt. DieGegenwart von Ferri-Ionen oder sonstiger Metalle der Transitionsgruppe in der festen Matrize ist unerläßlich für die Adsorbtion des Conalbumins gemäß dem hier .beanspruchten Verfahren; unter den spezifischen Bedingungen dieses Verfahrens, beispielsweise pH 5,5, azetiertem Puffer 0,1 M, erfolgt keine wesentliche Adsorbtion auf Carboxymethylzellulose, die keine Metallionen enthält.

Die spezifische Adsorbtion der Transferrinen, insbesondere der Conalbumine, auf Carboxymethylzellulose enthaltend chelierte Eisen-Ionen wird unter den Bedingungen der Zusammenstellung des Mittels wie zuvor dargelegt vorgenommen, insbesondere was das pH anbe-

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langt. Die Adsorbtion ist vor allem in Puffern wirksam, beispielsweise aus Essigsäure, Natriumazetat mit pH unter 5,5 und Molgewicht von 0,1 oder darunter. Es empfiehlt sich aus Gründen der Stabilität, die Exposition der Transferrinen bei einem unter 4,0 liegenden pH zu vermeiden.

Die Eluierung des Transferrins aus der festen Matrize kann durchgeführt werden, indem das pH und die ionische Stärke der Lösungen, in welchen die Matrize aufgeschwemmt ist, verändert wird. Sehr vorteilhaft kann sie auch mit Lösungen durchgeführt werden, welche imstande sind, Ionen der Metalle der Transitionsgruppe zu chelieren, insbesondere Eisen-Ionen, beispielsweise Lösungen enthaltend Natriumazetat in einer Konzentration über 10 M. Die Transferrinen werden aus der festen Matrize zum großen Teil in Form von Komplexen mit Eisen eluiert; zwecks Erhalt der eisenfreien Proteine wird das Metall gsmäß einem der dazu bekannten Verfahren ausgeschieden.

Zur praktischen Verwendung können die Transferrinen und insbesondere das Conalbumin vorteilhafterweise lyophilisiert werden, um Präparationen zu erhalten, welche bei Raumtemperatur aufbewahrt lange Zeit (auch monatelang) ihre chemisch-physikalischen und biologischen Eigenschaften behalten.

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Claims

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Patentansprüche

,Ί· Verfahren zur Isolierung der Transferrine aus biologischen Stoffen, insbesondere des Conalbumins, in reinem Zustand, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Material auf ein pH zwisden 3 und 6 gebracht wird und durch eine Materialmasse geführt wird, die aus einem festen Träger besteht, der chelierende Gruppen enthält, die metallischen Ionen der Transitionsgruppe zugeordnet sind, in Gegenwart einer Pufferlösung mit pH zwischen 3 und 6, ohne chelierende Eigenschaften, daß diese Masse alsdann durch eine Lösung passiert wird, welche eine Komponente aufweist, die Affinität für den Transferrinen-Metallkomplex besitzt, und daß aus der Lösung, welche die Masse passiert hat, das reine Transferrin abgesondert wird, mittels Entziehung derjenigen Komponenten, welche ein geringeres Molekulargewicht als die Transferrine aufweisen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das feste Material aus einem Carboxylgruppen enthaltendem Polymerharz besteht.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Metall-Ion ein Eisen-Ion ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung zur Adsorbtion der Transferrine auf der festen Masse aus einem azetierten Puffer mit einem Molargewicht zwischen 0,01 und 0,2 M besteht.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Eluierung der Transferrine aus dem festen Träger benützte Lösung eine Pufferlösung zwischen pH 6 und 11 ist.

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6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Eluierung der Transferrine aus dem festen Träger zur Verwendung kommende Lösung eine Pufferlösung mit pH zwischen 3 und 6 ist, enthaltend chelierende Gruppen einer Konzentration von über IO M.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die chelierende Substanz Natriumzitrat ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß, bevor sie durch die feste Masse passieren, aus dem biologischen Material die chelierende Eigenschaften aufweisenden Substanzen entfernt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die fragliche Entfernung der Substanzen mit chelierenden Eigenschaften aus dem biologischen Material mittels Exposition des Materials zu einer Mischung von Ionen-ABtauscherharz mit Anionen und Kationen erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die fragliche Entfernung der chelierende Eigenschaften aufweisenden Substanzen aus dem biologischen Material mittels Dialyse erfolgt oder mittels sonstigen bekannten Verfahren zur Entfernung von gelösten Stoffen mit unter 10.000 liegenden Molekulargewicht.

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