DE2154557A1 - Verfahren zur reinigung und kristallisation von kaudinogease (kallikrein) - Google Patents
Verfahren zur reinigung und kristallisation von kaudinogease (kallikrein)Info
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Description
- Verfahren zur Reinigung und Kristallisation von Kallidinogenase (Kallikrein) Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Kristallisation von Kallikrein sowie die Verwendung von kristallinem Kallikrein als Arzneimittel.
- Bei Einwirkung auf kdrpereigenes Kininogen setzt Kallikrein die kreislaufwirksamen Kinine frei. Kallikrein-Präparate werden daher zur Therapie verschiedener Durchblutungsstörungen therapeutisch verwendet (E.K. Frey, II. Kraut, E. Werle, Das Eallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, F. Enke, Stuttgart 1968, S. 150 f).
- Bisher verwendete man dazu teilweise gereinigte Präparate des Kallikrein aus Pankreas, Submaxillaris oder Harn.
- Es ist bereits bekannt geworden, daß man Präparate des Kallikrein aus Pankreas, Submaxillaris oder Harn gewinnen kann.
- Zur Gewinnung von teilweise gereinigtem Kallikrein sind verschiedene Verfahren bekannt geworden, z.B. können nach DBP 890 857 kallikreinhaltige Drüsen in wä0rigerSuspensaOn bei Temperaturen zwischen 38 und 65 0c therniolysiert und die kallikreinhaltigen wäßrigen Phasen von unlöslichen Anteilen abgetrennt werden. Zur Gewinnung von teilweise gereinigtem Kallikrein können auch nach DBP 910 850 Harn sowie Autolysate von Pankreas oder Submaxillaris mit wäßrigen Lösungen von Blei.-oder Zinksalzen gefällt, die Fällungen abgetrennt, in Phosphatpu Üfrlösungen, vornehmlich in Diammoniurnthydrogenphosphat-Lösungen, gelöst, die Lösungen dialysiert, die Dialysa-te konzentriert und der Wirkstoff aus den Konzentraten mit organs schen Lösungsmitteln, z. B. mit Äthanol oder Aceton gefällt werden.
- Die noch unreinen Kallikrein-Präparate können z. B. nach DBP 1 102 973 so weiter gereinigt werden, daß Kallikrein bei pH-Werten von 7 bis 10, vornehmlich bei pH 6,0 bis 7,5 an basisch substituierte Zellulosen adsorbiert wird, die basisch substituierten Zellulosen abgetrennt und unwirksame Begleitstoffe mit einer stark verdünnten Pufferlösung ausgewaschen werden. Der Wirkstoff kann von den basisch substituierten Zellulosen mit 1 bis 5 %igen Elektrolytlösungen desorbiert werden. Es werden Präparate mit ungefähr 0 bis 100 KE/mg Protein (KE = Kallikrein-Einheit)* erhalten. Noch sehr unreine Kallikrein-Präparate können auch nach DBP 1 124 187 zur weiteren Reinigung einer Elektrodialyse unter Verwendung von Austauschermembranen unterworfen werden. Es werden so Präparate mit 50 KE/mg gewonnen.
- So gereinigte Kallikrein-Präparate eignen. sich nur beding-t zur parenteralen Anwendung. Einmal kann der Gehalt an Fremdproteinen zur. immunologischen Sensibilisierung und bei mehrmaliger Anwendung dann zum lebensgefährlichen anaphylaktischen Schock führen. Zum anderen war es mit den bisherigen * Bestimmung der Kallikrein-Einheit durch Messung der B:lutdrucksenkung am Hund (E. Frey, H. Kraut, E. Werle, Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, F. Enke-Verlag Stuttgart 1968, S. 11).
- Reinigunss-\.erlahren schwierig, Präparate zu erhalten, die ausreichend frei von pyrogenen Stoffen waren. Es war auch nicht möglich, Pyrogene durch Filtration durch Klär- und Steril-Filterschichten zu entfernen, da Kallikrein von diesen Materialien in hohem Maße selbst adsorbiert wird.
- Es ist weiterhin bereits bekannt geworden, daß man kleinere Mengen von hochgereinigtem Kallikrein nach verschiedenen Verfahren gewinnen kann. Nach Hn Fritz et al. (Hoppe Seyler's ZO Physiol. Chem. 348, 1120-1132 (1967)) erhält man ein Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 1516 KE/mg Protein, indem man ein nach DBP 910 580 vorgereinigtes Produkt einbis dreimal -an Hydroxylapatit-Zellulose chromatographiert.
- Es ist dabei jedoch erforderlich, die optimale Konzentration des Elutionspuffers für jede Kallikrein-Probe und jede neue Charge der Hydroxylapatit-Zellulose in Vorversuchen neu zu bestimmen. Diese Methode ist deshalb verfahrenstechnisch nicht realisierbar.
- h>h einem anderen Vorschlag (H. MorSya et al., Biochem.
- Pharmacol. 18, 549-552 (1968)) erhält man elektrophoretisch reines Kallikrein in 6 bis 9 % Ausbeute, ausgehend von autolysiertem Pankreasbrei durch aufeinanderfolgende Anwendung von DEAE-Zellulose, Fällung mit 2-Äthoxy-6,9-diamino-acridiniumlactat, Extraktion des Niederschlages mit Ammoniumsulfatlösung, Fällung mit Aceton, Chromatographie an Hydroxylapatit und Chromatographie an Sephadex G 100.
- Auch dieses Verfahren ist wegen der geringen Ausbeute und der Vielzahl der Schritte technisch unbrauchbar.
- Kristallines Kallikrein ist bisher noch nicht dargestellt worden.
- Die vorliegende Erfindung behandelt nun ein einfaches Verfahren zur Gewinnung des reinen, gegebenenfalls kristallinen Kallikrein in hoher Ausbeute.
- Es wurde gefunden, daß das reine Kallikrein gewonnen werden kann, indem man ein nach DBP 910 580 aus dem Niederschlag der Blei- oder Zinksalz-Fällung gewonnenes Eluatentsalzt, die entsalzte Lösung an einem geeigneten makroporösen Anionenaustauscher, z.B. DEgE-Zellulose oder DEAE-Sephadex chromatographiert, die so gewonnene Lösung des teilweise gereinigten Kallikrein mit einem geeigneten makroporösen Kationenaustauscher, wie z.B. CM-Sephadex oder -SE-Sephadex behandelt und das Kallikrein gegebenenfalls kristallisiert.
- Das so erhaltene kristalline Kallikrein übertrifft in der spezifischen Aktivität alle bisher bekannt gewordenen Präparate und ist frei von antigen wirksamen Fremdproteinen und Pyrogenen.
- Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Kallikrein erfolgt durch Messung der Hydrolyse von N-Benzoyl-l-argininäthylester (E. Werle und B. Eaufmann-Bretsch, Naturwissenschaften 46, 559 (1959)) in der von der F,I.P. (Federation Internationale Pharmaceutique) standardisierten Ausführungsform als titrimetrischer Test (Publikation 1972 in J. mond.
- Pharm.). Für die Umrechnung der -enzymatischen Einheiten in die durch Messung der Blutdrucksenkung am Hund bestimmten biologischen-Kallikrein-Einheiten (KE) (E. Frey, H. Kraut, E. Werle, Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren1 F. Enke, Stuttgart 1968, S. 11) wird der Faktor 1 KE = 6,37 F.I.P.-Einheiten benutzt. Der Protein-Gehalt von Lösungen des reinen Kallikrein wird aus der Extinktion bei 280 em bestimmt, wobei ein Extinktionskoeffizient von E1 = 280 Sephadex zu : eingetragenes Warenzeichen der Pharmacia AG, -Uppsala 19,3 (= Extinktion einer 1 zeigen Lösung von Kallikrein bei pH 7,0) zugrundegelegt wird.
- Es wurde gefunden, daß die -Entsalzung des nach DBP 910 580 gewonnenen Eluats durch Dialyse oder durch Gelfiltration erfolgen kann. Für die darauffolgende Chromatographie an makroporösen Anionenaustauschern werden erfindungsgemäß insbesondere basisch substituierte Zellulosen oder basisch substituierte Gele mit genügender Porenweite verwendet. Bevorzugt wird dieser Reinigungsschritt an Säulen von DEAE-Sephadex durchgeführt. Die Adsorption erfolgt bei einem pH von 4,0 bis 8,0, bevorzugt bei pH 4,5 bis 5,0. Die Elution erfolgt durch Erhöhung der Salzkonzentration bei konstantem pH oder Senkung des pH-Wertes bei konstanter Salzkonzentration oder eine Kombination beider VerfakP2ne Wie Veränderung von pH und Salzkonzentration kann kontinuierlich als Gradientenelution oder stufenweise erfolgene Es können alle bekannten Puffersalze verwendet werden; bevorzugt werden flüchtige Puffersalze, z.B. Ammoniumformiat, Ammoniumacetat, Ammonium propionat oder die entsprechenden Alkylammoniumsalze, z.B.
- Triäthylammoniumformiat, verwendet. In einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Kallikrein aus o,2 M Ammoniumacetat pH 5,0 an DEAE-Sephadex in Form einer Säule adsorbiert, inaktives Protein mit 0,25 M Ammoniumacetat pH 5,0 ausgewaschen und anschließend angereichertes Kallikrein mit 0,3 M Ammoniumacetat pH 4,5 eluiert.
- Die Chromatographie an makroporösen Anionenaustauschern stellt eine wesentliche Verbesserung des Verfahrens nach DBP 1 102 973 dar, das an Ausbeute und Einfachheit der Durchführung im technischen Maßstab entscheidend übertroffen wird.
- Das so angereicherte Kallikrein wird erfindungsgemäß durch Behandlung mit makroporösen Kationenaustauschern weiter gereinigt. Es werden dadurch Präparate von etwa 90 ffi Reinheit erhalten. Als makroporöse Kationenaustauscher können insbesondere sauer substituierte Zellulosen oder sauer substituierte Gele, z.B. aus quervernetzten Dextranen oder Polyacrylamid, mit genügender Porenweite verwendet werden. Die Behandlung der Lösung des angereicherten Kallikrein mit dem Kationenaustauscher kann erfolgen, indem man die Lösung mit dem Austauscher aus rührt oder indem man die Lösung durch Schichten des Austauschers filtriert. Verwendet man Säulen, so ist es zweckmäßig, die Lösung des angereicherten Kallikrein aus der vorherigen Stufe zu konzentrieren und zu entsalzen. Während des Ausrührens oder während des Filtrationsvorganges werden von den Gelen Begleitstoffe zurückgehaltens während Kallikrein ungehindert durch die Filterschicht läuft.
- Die zur Filtration oder zum Ausrühren verwendeten makroporösen Kationenaustauscher werden in bekannter Weise vorbehandelt. Zur Filtration werden sie mit verdünnten Pufferlösungen angerührt und z.Bt in Säulen eingeschlämmt. Das Verhältnis Säulenlänge/Säulendurchmesser ist für den Filtrationsvorgang von sekundärer Bedeutung. Bevorzugt verwendet werden Säulen mit großem Säulendurchmesser. Zur Herstellung der Pufferlösungen werden die bekannten Puffersalze, vornehmlich aber flüchtige Puffersalze, z.B. Ammoniumformiat, Ammoniumacetat, Ammoniumpropionat oder die entsprechenden Alkylammoniumsalze, z.B. Triäthylammoniutformiat, verwendet. Der pH-Wert der Pufferlösungen kann zwischen 4,5 und 8,5, vornehmlich zwischen 5,0 und 7,0, gewählt werden.
- Das hochgereinigte Kallikrein wird gegebenenfalls erfindungsgemäß durch Zusatz von Ammoniumsulfat in fester Form oder als konzentrierte Lösung bei einem pH-Wert von 4,0 bis 8,0 kristallisiert. Die Kristallisation setzt bei einer Ammoniv sulfat-Sättigung von etwa 45 % innerhalb weniger Tage ein, vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 25°C. Die Kristalle haben die Form dünner Nadeln, die sich in Büscheln zusammenlagern. Die Kristalle können von der Mutterlauge durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt, mit 50 % gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung gewaschen und in verdunnten Salzlösungen oder Wasser gelöst werden.
- Die Kristalle bestehen aus reinem Kàllikrein. Die spezifische Aktivität von ca. 1600 KE/mg Protein lädt sich auch durch mehrmaliges Umkristallisieren nicht weiter steigern, überraschenderweise gelingt es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, teilweise gereinigtes Kallikrein von seinen Begleitstoffen und von Fremdenzymen äußerst einfach und ohne Anwendung umständlicher Elutions-Methoden abzutrennen und gegebenenfalls zu kristallisieren. Es war nicht vorauszusehen, daß die Begleitstoffe und die Fremdenzyme,nicht aber Kallikrein von den makroporösen Kationenaustauschern festgehalten werden und das in Lösung bleibende Kallikrein naeh dem erfindungsgemäßen Verfahren in sehr guten Ausbeuten und in hoher Reinheit erhalten wird. Durch die Kristallisation werden auch schwer zu entfernende pyrogene Substanzen praktisch vollständig abgetrennt. Die Einfachheit des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt die Durchführung auch im technischen Maßstab. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit eine Bereicherung der Technik dar.-Die Lösung der Kristalle ist charakterisiert durch ein UV-Spektrum bei pH 7 mit einem Maximum bei 282 nm, einem Minimum bei 251 nm, 2 Schultern bei 277 und 290 nm und einem Verhältnis der Extinktionen bei 280 und 260 nm von 1,78 (siehe ig. 1, nicht unterbrochene Kurve).
- In 0,1 n NaOH zeigt das UV-Spektrum zwei Maxima bei 280 und 289 nm (siehe Fig. 1, gestrichelte Kurve).
- Das erfindungsgemäße kristalline Kallikrein kann als wirksamer Bestandteil von Arzneimitteln verwendet werden. Infolge ihrer gefäßerweiternden Wirkung werden Kallikrein enthaltende Arzneimittel, wie bereits bekannt, insbesondere bei peripheren Durchblutungsstörungen, z. B. Endangiitis obliterans, Arteriosclerosis obliterans, Morbus Raynaud, bei gestörter Braktur- und Wundheilung, z. B. Sudecksches Syndrom, Verbrennungen, und bei Zirkulationsstörungen des Alters mit Erfolg verwendet.
- Die Anwendung kann oral in Form von Tabletten oder Dragees, die das kristalline Kallikrein in Mischung mit inerten, -nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen enthalten oder parenteral als intramuskuläre oder auch intravenöse Injektion einer wässrigen Lösung des kristallinen Kallikrein- erfolgen. Insbesondere für die parenterale Anwendung bietet das kristalline Kallikrein gegenüber weniger reinen Präparaten den Vorteil der weit geringeren Gefahr unerwünschter Nebenwirkungen und allergischer Reaktionen.
- Durch Zusatz von hochmolekularen Kolloiden nach DEP 941 685, z. B. Polyvinylpyrrolidon oder Dextran, oder durch Bildung des Komplexes mit dem Kallikrein-Inhibitor TrasylolX nach DBP 1 000 566 können aus kristallinem Kallikrein verzögert wirkende Injektionspräparate hergestellt werden. -Kallikrein für Injektionszwecke kann sowohl als gebrauchsfertige isotonische Lösung hergestellt werden, als auch in fester Form durch Gefriertrocknen einer Mischung von kristallinem Kallikrein mit geeigneten Trägerstoffen, z. B. Dextran, Mannit, Lactose, Gelatine, woraus durch Auflösen in einem geeigneten Lösungsmittel die-gebrauchsfettige Lösung unmittelbar vor der Anwendung hergestellt wird.
- Beispiel: a) 200 1 eines nach DBP 910 580 aus Schweinepankreas gewonnenen und dialysierten Eluats einer Bleisalz-Fällung, enthaltend 10,8 Mio. KE, wurden im Dünnschichtverdampfer auf 15 1 eingeengt und dann durch Gelfiltration über eine Säule von Sephadex G-25 entsalzt. Die entsalzte Lösung wurde mit Essigsäure auf pH 5,0 eingestellt und eine dabei entstandene geringe Fällung abfiltriert. Sodann wurde festes Ammoniumacetat bis zur spezifischen Leitfähigkeit 12 mS zugesetzt. Diese Lösung wurde über eine 20 x 65 cm große Säule (20 1) von DEAE-Sephadex A-50, äquilibriert mit 0,2 M Ammoniumacetat pH 5,0, gegeben, wobei Kallikrein adsorbiert wird. Die Säule wurde anschließend zuerst mit ca. 40 1 0,25 M Ammoniumacetat pH 5,0 und dann mit 0,3 M Ammoniumacetat pH 4,5 eluiert. Kallikrein erscheint im Eluat kurz nachdem der pH-Wert auf etwa 4,5 gesunken ist (Figur 2).
- Die aktiven Fraktionen enthielten 9,35 Mio KE (86,5 ), Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert und über eine Säule von Sephadex G-25 entsalzt: eine lyophilisierte Probe hatte die spezifische Aktivität von 414 KE/mg Einwaage.
- b) Die entsalzte Lösung mit einem Volumen von 300 ml wurde.
- über eine 10 x 130 cm große Säule (10 1) von CM-Sephadex C-50, äquilibriert mit 0,01 M Ammoniumacetat pH 5,0, filtriert Im Eluat erschien zuerst Kallikrein, gefolgt von inaktiven Verunreinigungen (Figur 3). Die Kallikrein-Fraktion (930 ml) enthielt 5,5 Mio KE (59 O). Eine lyophi'-lisierte Probe hatte die spezifische Aktivität 1060 i£Ang Einwaage bzw. 1220 KE/mg Protein. Die Fieberwirkung betrug nach DAB 1,85 ( t ( T)2 von 3 Tieren).
- c) Ein Teil der Lösung, enthaltend 115.000 KE, wurde auf 5 ml konzentriert und mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung-bis 45 % Sättigung versetzt. Nach 6 Tagen bei 20 bis 250C setzte die Kristallisation ein. Nach 3 Wochen wurden die Kristalle abzentrifugiert, mit 5 ml 50 % gesättigter Ammoniumsulfatlösung einmal gewaschen und in 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst. Die spezifische Aktivität des Kallikrein in dieser Lösung war 1560 KE/mg Protein.
- Die Ausbeute betrug 71 %, die Fieberwirkung nach DAB 0,32.
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung -von hochreiner Kallidinogenase (Kallikrein),
dadurch gekennzeichnet, daß der aus Organen nach bekannten Methoden durch Metallsalzfällung
gewonnene Niederschlag eluiert, das Eluat entsalzt, an geeigneten basisch substituierten
makroporösen Ionenaustauschern chrcmatographiert, dann mit einem geeigneten sauer
substituierten Ionenaustauscher'behandelt und die reine Kallidinogenase (Kallikrein)
gegebenenfalls aus der so erhaltenen Lösung durch Zusatz eines geeigneten Fällungsmittels
kristallisiert wird.
2. Kristalline Kallidinogenase (Kallikrein).
3. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an kristalliner
Kallidinogenase (Kallikrein).
4. Verfahren zur Herstellung eines chemotherapeutischen Mittels, dadurch
gekennzeichnet, daß man kristalline Kallidinogenase (KalliVrein)-mit inerten, nichttoxischen
pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen vermischt.
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1971
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-
1972
- 1972-11-02 ZA ZA727803A patent/ZA727803B/xx unknown
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