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Verfahren zur Reinigung und Kristallisation von Kallidinogenase (Kallikrein)
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Kristallisation
von Kallikrein sowie die Verwendung von kristallinem Kallikrein als Arzneimittel.
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Bei Einwirkung auf kdrpereigenes Kininogen setzt Kallikrein die kreislaufwirksamen
Kinine frei. Kallikrein-Präparate werden daher zur Therapie verschiedener Durchblutungsstörungen
therapeutisch verwendet (E.K. Frey, II. Kraut, E. Werle, Das Eallikrein-Kinin-System
und seine Inhibitoren, F. Enke, Stuttgart 1968, S. 150 f).
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Bisher verwendete man dazu teilweise gereinigte Präparate des Kallikrein
aus Pankreas, Submaxillaris oder Harn.
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Es ist bereits bekannt geworden, daß man Präparate des Kallikrein
aus Pankreas, Submaxillaris oder Harn gewinnen kann.
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Zur Gewinnung von teilweise gereinigtem Kallikrein sind verschiedene
Verfahren bekannt geworden, z.B. können nach DBP 890 857 kallikreinhaltige Drüsen
in wä0rigerSuspensaOn
bei Temperaturen zwischen 38 und 65 0c therniolysiert
und die kallikreinhaltigen wäßrigen Phasen von unlöslichen Anteilen abgetrennt werden.
Zur Gewinnung von teilweise gereinigtem Kallikrein können auch nach DBP 910 850
Harn sowie Autolysate von Pankreas oder Submaxillaris mit wäßrigen Lösungen von
Blei.-oder Zinksalzen gefällt, die Fällungen abgetrennt, in Phosphatpu Üfrlösungen,
vornehmlich in Diammoniurnthydrogenphosphat-Lösungen, gelöst, die Lösungen dialysiert,
die Dialysa-te konzentriert und der Wirkstoff aus den Konzentraten mit organs schen
Lösungsmitteln, z. B. mit Äthanol oder Aceton gefällt werden.
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Die noch unreinen Kallikrein-Präparate können z. B. nach DBP 1 102
973 so weiter gereinigt werden, daß Kallikrein bei pH-Werten von 7 bis 10, vornehmlich
bei pH 6,0 bis 7,5 an basisch substituierte Zellulosen adsorbiert wird, die basisch
substituierten Zellulosen abgetrennt und unwirksame Begleitstoffe mit einer stark
verdünnten Pufferlösung ausgewaschen werden. Der Wirkstoff kann von den basisch
substituierten Zellulosen mit 1 bis 5 %igen Elektrolytlösungen desorbiert werden.
Es werden Präparate mit ungefähr 0 bis 100 KE/mg Protein (KE = Kallikrein-Einheit)*
erhalten. Noch sehr unreine Kallikrein-Präparate können auch nach DBP 1 124 187
zur weiteren Reinigung einer Elektrodialyse unter Verwendung von Austauschermembranen
unterworfen werden. Es werden so Präparate mit 50 KE/mg gewonnen.
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So gereinigte Kallikrein-Präparate eignen. sich nur beding-t zur parenteralen
Anwendung. Einmal kann der Gehalt an Fremdproteinen zur. immunologischen Sensibilisierung
und bei mehrmaliger Anwendung dann zum lebensgefährlichen anaphylaktischen Schock
führen. Zum anderen war es mit den bisherigen * Bestimmung der Kallikrein-Einheit
durch Messung der B:lutdrucksenkung am Hund (E. Frey, H. Kraut, E. Werle, Das Kallikrein-Kinin-System
und seine Inhibitoren, F. Enke-Verlag Stuttgart 1968, S. 11).
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Reinigunss-\.erlahren schwierig, Präparate zu erhalten, die ausreichend
frei von pyrogenen Stoffen waren. Es war auch nicht möglich, Pyrogene durch Filtration
durch Klär- und Steril-Filterschichten zu entfernen, da Kallikrein von diesen Materialien
in hohem Maße selbst adsorbiert wird.
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Es ist weiterhin bereits bekannt geworden, daß man kleinere Mengen
von hochgereinigtem Kallikrein nach verschiedenen Verfahren gewinnen kann. Nach
Hn Fritz et al. (Hoppe Seyler's ZO Physiol. Chem. 348, 1120-1132 (1967)) erhält
man ein Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 1516 KE/mg Protein, indem
man ein nach DBP 910 580 vorgereinigtes Produkt einbis dreimal -an Hydroxylapatit-Zellulose
chromatographiert.
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Es ist dabei jedoch erforderlich, die optimale Konzentration des Elutionspuffers
für jede Kallikrein-Probe und jede neue Charge der Hydroxylapatit-Zellulose in Vorversuchen
neu zu bestimmen. Diese Methode ist deshalb verfahrenstechnisch nicht realisierbar.
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h>h einem anderen Vorschlag (H. MorSya et al., Biochem.
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Pharmacol. 18, 549-552 (1968)) erhält man elektrophoretisch reines
Kallikrein in 6 bis 9 % Ausbeute, ausgehend von autolysiertem Pankreasbrei durch
aufeinanderfolgende Anwendung von DEAE-Zellulose, Fällung mit 2-Äthoxy-6,9-diamino-acridiniumlactat,
Extraktion des Niederschlages mit Ammoniumsulfatlösung, Fällung mit Aceton, Chromatographie
an Hydroxylapatit und Chromatographie an Sephadex G 100.
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Auch dieses Verfahren ist wegen der geringen Ausbeute und der Vielzahl
der Schritte technisch unbrauchbar.
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Kristallines Kallikrein ist bisher noch nicht dargestellt worden.
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Die vorliegende Erfindung behandelt nun ein einfaches Verfahren zur
Gewinnung des reinen, gegebenenfalls kristallinen Kallikrein in hoher Ausbeute.
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Es wurde gefunden, daß das reine Kallikrein gewonnen werden kann,
indem man ein nach DBP 910 580 aus dem Niederschlag der Blei- oder Zinksalz-Fällung
gewonnenes Eluatentsalzt, die entsalzte Lösung an einem geeigneten makroporösen
Anionenaustauscher, z.B. DEgE-Zellulose oder DEAE-Sephadex chromatographiert, die
so gewonnene Lösung des teilweise gereinigten Kallikrein mit einem geeigneten makroporösen
Kationenaustauscher, wie z.B. CM-Sephadex oder -SE-Sephadex behandelt und das Kallikrein
gegebenenfalls kristallisiert.
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Das so erhaltene kristalline Kallikrein übertrifft in der spezifischen
Aktivität alle bisher bekannt gewordenen Präparate und ist frei von antigen wirksamen
Fremdproteinen und Pyrogenen.
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Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Kallikrein erfolgt
durch Messung der Hydrolyse von N-Benzoyl-l-argininäthylester (E. Werle und B. Eaufmann-Bretsch,
Naturwissenschaften 46, 559 (1959)) in der von der F,I.P. (Federation Internationale
Pharmaceutique) standardisierten Ausführungsform als titrimetrischer Test (Publikation
1972 in J. mond.
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Pharm.). Für die Umrechnung der -enzymatischen Einheiten in die durch
Messung der Blutdrucksenkung am Hund bestimmten biologischen-Kallikrein-Einheiten
(KE) (E. Frey, H. Kraut, E. Werle, Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren1
F. Enke, Stuttgart 1968, S. 11) wird der Faktor 1 KE = 6,37 F.I.P.-Einheiten benutzt.
Der Protein-Gehalt von Lösungen des reinen Kallikrein wird aus der Extinktion bei
280 em bestimmt, wobei ein Extinktionskoeffizient von E1 = 280 Sephadex zu : eingetragenes
Warenzeichen der Pharmacia AG, -Uppsala
19,3 (= Extinktion einer
1 zeigen Lösung von Kallikrein bei pH 7,0) zugrundegelegt wird.
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Es wurde gefunden, daß die -Entsalzung des nach DBP 910 580 gewonnenen
Eluats durch Dialyse oder durch Gelfiltration erfolgen kann. Für die darauffolgende
Chromatographie an makroporösen Anionenaustauschern werden erfindungsgemäß insbesondere
basisch substituierte Zellulosen oder basisch substituierte Gele mit genügender
Porenweite verwendet. Bevorzugt wird dieser Reinigungsschritt an Säulen von DEAE-Sephadex
durchgeführt. Die Adsorption erfolgt bei einem pH von 4,0 bis 8,0, bevorzugt bei
pH 4,5 bis 5,0. Die Elution erfolgt durch Erhöhung der Salzkonzentration bei konstantem
pH oder Senkung des pH-Wertes bei konstanter Salzkonzentration oder eine Kombination
beider VerfakP2ne Wie Veränderung von pH und Salzkonzentration kann kontinuierlich
als Gradientenelution oder stufenweise erfolgene Es können alle bekannten Puffersalze
verwendet werden; bevorzugt werden flüchtige Puffersalze, z.B. Ammoniumformiat,
Ammoniumacetat, Ammonium propionat oder die entsprechenden Alkylammoniumsalze, z.B.
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Triäthylammoniumformiat, verwendet. In einer bevorzugten Ausführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Kallikrein aus o,2 M Ammoniumacetat pH 5,0
an DEAE-Sephadex in Form einer Säule adsorbiert, inaktives Protein mit 0,25 M Ammoniumacetat
pH 5,0 ausgewaschen und anschließend angereichertes Kallikrein mit 0,3 M Ammoniumacetat
pH 4,5 eluiert.
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Die Chromatographie an makroporösen Anionenaustauschern stellt eine
wesentliche Verbesserung des Verfahrens nach DBP 1 102 973 dar, das an Ausbeute
und Einfachheit der Durchführung im technischen Maßstab entscheidend übertroffen
wird.
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Das so angereicherte Kallikrein wird erfindungsgemäß durch Behandlung
mit makroporösen Kationenaustauschern weiter gereinigt. Es werden dadurch Präparate
von etwa 90 ffi Reinheit erhalten. Als makroporöse Kationenaustauscher können insbesondere
sauer substituierte Zellulosen oder sauer substituierte Gele, z.B. aus quervernetzten
Dextranen oder Polyacrylamid, mit genügender Porenweite verwendet werden. Die Behandlung
der Lösung des angereicherten Kallikrein mit dem Kationenaustauscher kann erfolgen,
indem man die Lösung mit dem Austauscher aus rührt oder indem man die Lösung durch
Schichten des Austauschers filtriert. Verwendet man Säulen, so ist es zweckmäßig,
die Lösung des angereicherten Kallikrein aus der vorherigen Stufe zu konzentrieren
und zu entsalzen. Während des Ausrührens oder während des Filtrationsvorganges werden
von den Gelen Begleitstoffe zurückgehaltens während Kallikrein ungehindert durch
die Filterschicht läuft.
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Die zur Filtration oder zum Ausrühren verwendeten makroporösen Kationenaustauscher
werden in bekannter Weise vorbehandelt. Zur Filtration werden sie mit verdünnten
Pufferlösungen angerührt und z.Bt in Säulen eingeschlämmt. Das Verhältnis Säulenlänge/Säulendurchmesser
ist für den Filtrationsvorgang von sekundärer Bedeutung. Bevorzugt verwendet werden
Säulen mit großem Säulendurchmesser. Zur Herstellung der Pufferlösungen werden die
bekannten Puffersalze, vornehmlich aber flüchtige Puffersalze, z.B. Ammoniumformiat,
Ammoniumacetat, Ammoniumpropionat oder die entsprechenden Alkylammoniumsalze, z.B.
Triäthylammoniutformiat, verwendet. Der pH-Wert der Pufferlösungen kann zwischen
4,5 und 8,5, vornehmlich zwischen 5,0 und 7,0, gewählt werden.
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Das hochgereinigte Kallikrein wird gegebenenfalls erfindungsgemäß
durch Zusatz von Ammoniumsulfat in fester Form oder als konzentrierte Lösung bei
einem pH-Wert von 4,0 bis 8,0 kristallisiert. Die Kristallisation setzt bei einer
Ammoniv
sulfat-Sättigung von etwa 45 % innerhalb weniger Tage ein,
vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 25°C. Die Kristalle haben die Form
dünner Nadeln, die sich in Büscheln zusammenlagern. Die Kristalle können von der
Mutterlauge durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt, mit 50 % gesättigter
Ammoniumsulfat-Lösung gewaschen und in verdunnten Salzlösungen oder Wasser gelöst
werden.
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Die Kristalle bestehen aus reinem Kàllikrein. Die spezifische Aktivität
von ca. 1600 KE/mg Protein lädt sich auch durch mehrmaliges Umkristallisieren nicht
weiter steigern, überraschenderweise gelingt es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren,
teilweise gereinigtes Kallikrein von seinen Begleitstoffen und von Fremdenzymen
äußerst einfach und ohne Anwendung umständlicher Elutions-Methoden abzutrennen und
gegebenenfalls zu kristallisieren. Es war nicht vorauszusehen, daß die Begleitstoffe
und die Fremdenzyme,nicht aber Kallikrein von den makroporösen Kationenaustauschern
festgehalten werden und das in Lösung bleibende Kallikrein naeh dem erfindungsgemäßen
Verfahren in sehr guten Ausbeuten und in hoher Reinheit erhalten wird. Durch die
Kristallisation werden auch schwer zu entfernende pyrogene Substanzen praktisch
vollständig abgetrennt. Die Einfachheit des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt
die Durchführung auch im technischen Maßstab. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt
somit eine Bereicherung der Technik dar.-Die Lösung der Kristalle ist charakterisiert
durch ein UV-Spektrum bei pH 7 mit einem Maximum bei 282 nm, einem Minimum bei 251
nm, 2 Schultern bei 277 und 290 nm und einem Verhältnis der Extinktionen bei 280
und 260 nm von 1,78 (siehe ig. 1, nicht unterbrochene Kurve).
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In 0,1 n NaOH zeigt das UV-Spektrum zwei Maxima bei 280 und 289 nm
(siehe Fig. 1, gestrichelte Kurve).
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Das erfindungsgemäße kristalline Kallikrein kann als wirksamer Bestandteil
von Arzneimitteln verwendet werden. Infolge ihrer gefäßerweiternden Wirkung werden
Kallikrein enthaltende Arzneimittel, wie bereits bekannt, insbesondere bei peripheren
Durchblutungsstörungen, z. B. Endangiitis obliterans, Arteriosclerosis obliterans,
Morbus Raynaud, bei gestörter Braktur- und Wundheilung, z. B. Sudecksches Syndrom,
Verbrennungen, und bei Zirkulationsstörungen des Alters mit Erfolg verwendet.
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Die Anwendung kann oral in Form von Tabletten oder Dragees, die das
kristalline Kallikrein in Mischung mit inerten, -nichttoxischen, pharmazeutisch
geeigneten Trägerstoffen enthalten oder parenteral als intramuskuläre oder auch
intravenöse Injektion einer wässrigen Lösung des kristallinen Kallikrein- erfolgen.
Insbesondere für die parenterale Anwendung bietet das kristalline Kallikrein gegenüber
weniger reinen Präparaten den Vorteil der weit geringeren Gefahr unerwünschter Nebenwirkungen
und allergischer Reaktionen.
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Durch Zusatz von hochmolekularen Kolloiden nach DEP 941 685, z. B.
Polyvinylpyrrolidon oder Dextran, oder durch Bildung des Komplexes mit dem Kallikrein-Inhibitor
TrasylolX nach DBP 1 000 566 können aus kristallinem Kallikrein verzögert wirkende
Injektionspräparate hergestellt werden. -Kallikrein für Injektionszwecke kann sowohl
als gebrauchsfertige isotonische Lösung hergestellt werden, als auch in fester Form
durch Gefriertrocknen einer Mischung von kristallinem Kallikrein mit geeigneten
Trägerstoffen, z. B. Dextran, Mannit, Lactose, Gelatine, woraus durch Auflösen in
einem geeigneten Lösungsmittel die-gebrauchsfettige Lösung unmittelbar vor der Anwendung
hergestellt wird.
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Beispiel: a) 200 1 eines nach DBP 910 580 aus Schweinepankreas gewonnenen
und dialysierten Eluats einer Bleisalz-Fällung, enthaltend 10,8 Mio. KE, wurden
im Dünnschichtverdampfer auf 15 1 eingeengt und dann durch Gelfiltration über eine
Säule von Sephadex G-25 entsalzt. Die entsalzte Lösung wurde mit Essigsäure auf
pH 5,0 eingestellt und eine dabei entstandene geringe Fällung abfiltriert. Sodann
wurde festes Ammoniumacetat bis zur spezifischen Leitfähigkeit 12 mS zugesetzt.
Diese Lösung wurde über eine 20 x 65 cm große Säule (20 1) von DEAE-Sephadex A-50,
äquilibriert mit 0,2 M Ammoniumacetat pH 5,0, gegeben, wobei Kallikrein adsorbiert
wird. Die Säule wurde anschließend zuerst mit ca. 40 1 0,25 M Ammoniumacetat pH
5,0 und dann mit 0,3 M Ammoniumacetat pH 4,5 eluiert. Kallikrein erscheint im Eluat
kurz nachdem der pH-Wert auf etwa 4,5 gesunken ist (Figur 2).
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Die aktiven Fraktionen enthielten 9,35 Mio KE (86,5 ), Die Lösung
wurde im Vakuum konzentriert und über eine Säule von Sephadex G-25 entsalzt: eine
lyophilisierte Probe hatte die spezifische Aktivität von 414 KE/mg Einwaage.
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b) Die entsalzte Lösung mit einem Volumen von 300 ml wurde.
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über eine 10 x 130 cm große Säule (10 1) von CM-Sephadex C-50, äquilibriert
mit 0,01 M Ammoniumacetat pH 5,0, filtriert Im Eluat erschien zuerst Kallikrein,
gefolgt von inaktiven Verunreinigungen (Figur 3). Die Kallikrein-Fraktion (930 ml)
enthielt 5,5 Mio KE (59 O). Eine lyophi'-lisierte Probe hatte die spezifische Aktivität
1060 i£Ang Einwaage bzw. 1220 KE/mg Protein. Die Fieberwirkung betrug nach DAB 1,85
( t ( T)2 von 3 Tieren).
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c) Ein Teil der Lösung, enthaltend 115.000 KE, wurde auf 5 ml konzentriert
und mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung-bis
45 % Sättigung versetzt.
Nach 6 Tagen bei 20 bis 250C setzte die Kristallisation ein. Nach 3 Wochen wurden
die Kristalle abzentrifugiert, mit 5 ml 50 % gesättigter Ammoniumsulfatlösung einmal
gewaschen und in 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst. Die spezifische Aktivität
des Kallikrein in dieser Lösung war 1560 KE/mg Protein.
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Die Ausbeute betrug 71 %, die Fieberwirkung nach DAB 0,32.