DE2154557C3 - Verfahren zur Herstellung von hochreiner Kallidinogenase (Kallikrein) und ein die danach erhaltene kristalline Kallidinogenase enthaltendes Arzneimittel - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von hochreiner Kallidinogenase (Kallikrein) und ein die danach erhaltene kristalline Kallidinogenase enthaltendes ArzneimittelInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren
zur Herstellung von hochreiner Kallidinogemase (Kallikrein) und ein die danach erhaltene kristalline
Kallidinogenase enthaltendes Arzneimittel.
Bei Einwirkung auf körpereigenes Kininogen setzt Kallikrein die kreislaufwirksamen Kinine frei. KaIIikrein-Präparate
werden daher zur Therapie verschiedener Durchblutungsstörungen therapeutisch verwendet
(E. K. rrey, H. Kraut, E. Werle. Das Kallikrein-Kinin-System und s ine Inhibitoren, F.
Enke, Stuttgart 1968, S. '5Off).
Bisher verwendete man dazu '".ilweise gereinigte
Präparate des Kallikrein aus Pankras, Submaxillaris ©der Harn.
Es ist bereits bekannt geworden, daß man Präparate des Kallikrein aus. Pankreas, Submaxillaris oder Harn
gewinnen kann. Zur Gewinnung von teilweise gereinigtem Kallikrein sind verschiedene Verfahren bekannt
geworden, z. B. können nach DE-PS 890857 Kallikreinhultige Drüsen in wäßriger Suspension b„i
Temperaturen zwischen 38 und 65' C thermolysiert
und die kallikrein-haltigen wäßrigen Phasen von unlöslichen Anteilen abgetrennt werden. Zur Gewinnung
von teilweise gereinigtem Kallikrein können Buch nach DE-PS 910850 Harn sowie Autolysate von
Pankreas oder Submaxillaris mit wäßrigen Lösungen von Blei- oder Zinksalzen gefällt, die Fällungen abgetrennt,
in Phosphatpufferlösungen, vornehmlich in Diammoniumhydrogenphosphat-Lösungen, gelöst,
die Lösungen dialysiert, die Dialysate konzentriert Und der Wirkstoff aus den Konzentraten mit organischen
Lösungsmitteln, z. B. mit Äthanol oder Aceton gefällt werden.
Die noch unreinen Kallikrein-Präparatc können K. B. nach DH-PS 1 102973 so weiter gereinigt werden,
daß Kallikrein bei pH-Werten von 3 bis 10, vornehmlich bei pH 6,0 his 7,5 an basisch substituierte
Zellulosen adsorbiert wird, die basisch substituierten Zellulosen abgetrennt und unwirksame Begleitstoffe
mit einer stark verdünnten Pufferlösung ausgewa*
sehen Werden, Der Wirkstoff kann von der basisch »ubstituierten Zellulose mit 1 bis 5%igcn Elektrolytitisungen
desorbiert werden, Es werden Präparate mit ungefähr 50 bis 100 KE/mg PfüKlin (KE *= KaIIikfein-Einheil;
Bestimmung der Kallikrein-Einhcit durch Messung der Blutsenkung am Hund [E. Frey,
H. Kraut, E. Werle, Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, F. Enke-Verlag, Stuttgart
1968, S. 11]) erhalten. Noch sehr unreine Kallikrein-Präparate
können auch nach DE-PS 1124187 zur weiteren Reinigung einer Elektrodialyse unter Verwendung
von Austauschermembranen unterworfen werden. Es werden so Präparate mit 50 KE/mg gewonnen.
So gereinigte Kallikrein-Präparate eignen sich nur bedingt zur parenteralen Anwendung. Einmal kann
der Gehalt an Fremdproteinen zur immunologischen Sensibilisierung und bei mehrmaliger Anwendung
dann zum lebensgefährlichen anaphylaktischen ι Schock führen. Zum anderen war es mit den bisherigen
Reinigungsverfahren schwierig, Präparate zu erhalten, die ausreichend frei von pyrogenen Stoffen
waren. Es war auch nicht möglich, Pyrogene durch Filtration durch Klär- und Steril-Filterschichten zu
ι entfernen, da Kallikrein von diesen Materialien in hohem Maße selbst adsorbiert wird.
Es ist weiterhin bereits bekannt geworden, daß man
kleinere Mengen von hochgereinigtem Kallikrein nach verschiedenen Verfahren gewinnen kann. Nach
, H. Fritz et al. (Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 348,1120-1132 [1967]) erhält man ein Präparat mit
einer spezifischen Aktivität von 1516 KE/mg Protein, indem man ein nacn DE-PS 910580 vorgereinigtes
Produkt ein- bis dreimal an Hydroxylapatit-Zellulose
chromatographiert. Es ist dabei jedoch erforderlich, die optimale Konzentration des Elutionspuffers für
jede Kallikrein-Probe und jede neue Charge der Hydroxylapatit-Zellulose
in Vorversuchen neu zu bestimmen. Diese Methode ist deshalb verfahrenstechnisch nicht realisierbar.
Nach einem anderen Vorschlag (H. Moriya et al.,
Biochem. Pharmacol. 18,549-552 [1968]) erhält man
elektrophoretisch reines Kallikrein in 6 bis 90? Ausbeute,
ausgehend von autolysiertem Pankreasbrei durch aufeinanderfolgende Anwendung von Diäthylaminoäthylgruppenhaltiger
Zellulose, Fällung mit 2-Äthoxy-6,9-diaminoacridiniumIactat, Extraktion des Niederschlages mit Ammoniumsulfatlösung, Fällung
mit Aceton, Chromatographie an Hydroxylapatit und Chromatographie an quervernetztem Polydextrangel
mit einem Aussdilußvolumen für Molekulargewichte größer als 150000.
Auch dieses Verfahren ist wegen der geringen Ausbeute und der Vielzahl der Schritte technisch unbrauchbar.
Die nach dem erfindungsgem;ißen Verfahren erhältliche
hochreine und gegebenenfalls kristalline Kallidinogenase (Kallikrein) besitzt überraschenderweise
eine wesentlich höhere Reinheit als die gemäß DE-OS 1617476 erhältliche Kallidinogenase, wobei
bei der Injektion der gebrauchsfertigen Lösungen das Risiko von Nebenwirkungen und Schock wesentlich
vermindert wird.
Kristallines Kallikrein ist hishcr noch nicht dargestellt
worden
Die vorliegende Erfindung behandelt nun ein einfaches
Verfahren zur Gewinnung des reinen, gegebenenfalls kristallinen Kallikrein in höher Ausbeute,
Es wurde gefunden, daß das reine Kallikrein gewonnen werden kann, indem man ein nach DE-PS
910580 aus dem Niederschlag der Blei- oder Zink*
saiz-Fallung gewonnenes Eluai entsalzt, die entsalzte
Lösung an einem geeigneten basisch substituierten
makroporösen Anionenaustausch^, Diäthylaminoäthylgruppen-haltiger
Zellulose oder Diäthylaminoäthylgruppen-haltigem
quervernetztem Polydextrangel Chromatographien, die so gewonnene Lösung des teilweise gereinigten Kalükrein mit einem geeigneten
sauer substituierten makroporösen Kationenaustauscher, wie z. B. Carboxymethylgruppen-haltigem
quervernetztem Polydextrangel oder Sulfoäthylgruppen-haltigem
quervernetztem Polydextrangel behandelt und das Kallikrein gegebenenfalls kristallisiert.
Das so erhaltene gegebenenfalls kristalline Kallikrein übertrifft in der spezifischen Aktivität alle bisher bekannt
gewordenen Präparate und ist frei von antigen wirksamen Fremdproteinen und Pyrogenen.
Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Kallikrein erfolgt durch Messung der Hydrolyse von
N-Benzoyl-l-arginin-äthylester (E. Werle und B.
Kaufmann-Bretsch,Naturwissenschaften46, 559
[1959]) in der von der F. I. P. (Federation Internationale Pharmaceutique) standardisierten Ausführungsform als titrimetrischer Test (Publikation 1972 in J.
mond. Pharm.j. Für die Umrechnung der enzymatischen Einheiten in die durch Messung der Brutdrucksenkung
am Hund bestimmten biologischen Kallikrein-Einheiten (KE) (E. Frey, H. Kraut, E.
Werle, Das Kallikrein-Kinin-Systcm und seine Inhibitoren,
F. Enke, Stuttgart 1968, S. 11) wird der Faktor 1 KE = 6,37 F. I. P.-Einheiten benutzt. Der Protein-Gehalt
von Lösungen des reinen Kallikrein wird aus der Extinktion bei 280 nm bestimmt, wobei ein
Extinktionskoeffizient von E\„o = 19,3 (= Extinktion
einer 1 %igen Lösung von Kallikrein bei pH 7,0) zugrunde gelegt wird.
Es wurde gefunden, daß die Entsalzung des nach DE-PS 910580 gewonnenen Eluats durch Dialyse
oder durch Gelfiltration erfolgen kann. Für die darauffolgende Chromatographie an basisch substituierten
makroporösen Anionenaustauschern werden erfindungsgemäß insbesondere basisch substituierte
Zellulosen oder basisch substituierte Gele mit genügender Porenweite verwendet. Bevorzugt wird dieser
Reinigungsschritt an Säulen von Diäthylaminäthylgruppenhaltigen
quervernetztem Polydextrangel durchgeführt. Die Adsorption erfolgt bei einem pH von 4,0 bis 8,0, bevorzugt bei pH 4,5 bis 5,0. Die
Elution erfolgt durch Erhöhung der Salzkonzentration bei konstantem pH oder Senkung des pH-Wertes bei
konstanter Salzkonzentration oder eine Kombination beider Verfahren. Die Veränderung von pH und Salzkonzentration
kann kontinuierlich als Gradientenelution oder stufenweise erfolgen. Es können alle bekannten
Puffersalze verwendet werden; bevorzugt werden flüchtige Puffersalze, z. B. Ammoniumformiat,
Ammoniumacetat, Ammoniumpropionat oder die entsprechenden Alkylammoniumsalze, z. B.
Triäthylammoniumformiat, verwendet. In einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird Kallikrein aus 0,2 M Ammoniumacetat pH 5,0 an Diäthylaminoäthylgrupper.-haltiges quervernetztes
Polydextrangel in Form einer Säule adsorbiert, inaktives Prolein mit 0,25 M Ammoniumacetat
pH SjO ausgewaschen und anschließend angereichertes
Kallikrein iriit 0,3 M Ammoniumacetat pH 4,5
eluieft.
Die Chromatographie an basisch substituierten , makroporösen Anionenaustauschern stellt eine wesentliche
Verbesserung des Verfahrens nach DE-PS 1102973 dar, das an Ausbeute und Einfachheit der
Durchführung im technischen Maßstab entscheidend übertroffen wird.
Das so nngereicherte Kallikrein wird erfindungsgemäß
durch Behandlung mit sauer substituierten makroporösen Kationenaustauschern weiter gereinigt.
Es werden dadurch Präparate von etwa 90% Reinheit erhalten. Als makroporöse Kationenaustauscher können
insbesondere sauer substituierte Zellulosen oder sauer substituierte Gele, z. B. aus quervernetzten
Dextranen oder Polyacrylamid, mit genügender Porenweite verwendet werden. Die Behandlung der Lösung
des angereicherten Kallikrein mit dem Kationenaustauscher kann erfolgen, indem man die Lösung
mit dem Austauscher ausrührt oder indem man die Lösung durch Schichten des Austauschers filtriert.
Verwendet man Säulen, so ist es zweckmäßig, die Lösung des angereicherten Kallikrein aus der vorherigen
Stufe zu konzentrieren und zu entsal-zen. Während des
Ausrührens oder während des Filtrationsvorganges werden von den Gelen Begleitstoffe zurückgehalten,
während Kallikrein ungehindert c1 ,ch die Filtration
iäuii.
Die zur Filtration oder zum Ausrühren verwendeten sauer substituierten makrokporösen Kationenaustauscher werden in bekannter Weise vorbehandelt.
Zur Filtration werden sie mit verdünnten Pufferlösungen
angerührt und z. B. in Säulen eingeschlämmt. Das Verhältnis Säulenlänge/Säulendurchmesser ist für den
Filtrationsvorgang von sekundärer Bedeutung. Bevorzugt verwendet werden Säulen rrit großem Säulendurchmesser.
Zur Herstellung der Pufferlösungen werden die bekannten Puffersalze, vornehmlich aber
flüchtige Puffersalze, z. B. Ammoniumformiat, Ammoniumacetat, Ammoniumpropionat oder die entsprechenden
Alkylammoniumsal/e, z. B. Triäthylammoniumformiat,
verwendet. Der pH-Wert der Pufferlösungen kann zwischen 4,5 und 8,5, vornehmlich
zwischen 5,0 und 7,0, gewählt werden.
Das hochgereinigte Kallikrein wird gegebenenfalls erfindungsgemäß durch Zusatz von Ammoniumsulfat
in fester Form oder als konzentrierte Lösung bei eine .i pH-Wert von 4,0 bis 8,0 kristallisiert. Die Kristallisationsetzt
bei einer Ammoniumsulfat-Sättigung von etwa 45% innerhalb weniger Tage ein, vorzugsweise
bei einer Temperatur von 15 bis 25° C. Die Kristalle haben die Form dünner NaUeIn, die sich in
Büscheln zusammenlagern. Die Kristalle können von der Mutterlauge durch Zentrifugieren oder Filtrieren
abgetrennt, mit 50% gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung
gewaschen und in verdünnten Salzlösungen oder Wasser gelöst werden.
Die Kristalle bestehen aus reinem Kallikrein. Die spezifische Aktivität von ca. 1600 KE/mg Protein läßt
sich auch durch mehrmaliges Umkristallisieren nicht weiter steigern.
Überraschenderweise gelingt es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, teilweise gereinigtes Kallikrein
von seinen Begleitstoffen und von Fremdenzymen äußerst einfach und ohne Anwendung umständlicher
Elutions-t^'ethoden abzutrennen und gegebenenfalls
zu kristallisieren. Es war nicht vorauszusehen, daß die Begleitstoffe und die Fremdenzyme, nicht
aber Kallikrein von den sauer substituierten makroporösen Kationenaustauschern festgehalten Werden
und das in Lösung bleibende Kallikrein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in sehr guten Ausbeuten
und in hoher Reinheit erhalten wird. Durch die Kristallisation werden auch schwer zu entfernende pyro-
gene Substanzen praktisch vollständig abgetrennt. Die
Einfachheit des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt die Durchführung auch im technischen Maßstab.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit eine Bereicherung der Technik dar.
Die Lösung der Kristalle ist charakterisiert durch ein UV-Spektrum bei pH 7 mit einem Maximum bei
282 nm, einem Minimum bei 251 nm, 2 Schultern bei
277 und 290 nm und einem Verhältnis der Extinktionen bei 280 und 260 nm von 1,78 (siehe Fig. 1, nicht
unterbrochene Kurve). In 0,1 η NaOH zeigt das UV-Spektrum zwei Maxima bei 280 und 289 nm (siehe
Fig. I gestrichelte Kurve).
Das erfindungsgemäß erhaltene kristalline KaIIikrein
kann als wirksamer Bestandteil von Arzneimitteln verwendet werden. Infolge ihrer gefäßerweiternden
Wirkung werden Kallikrein enthaltende Arzneimittel, wie bereits bekannt, insbesondere bei peripheren
Durchblutungsstörungen, z. B. Endangiitis obliterans,
Arteriosclerosis obliterans, Morbus Raynaud, bei gestörter Fraktur- und Wundheilung, z. B. Sudecksches
Syndrom, Verbrennungen, und bei Zirkulationsstörungen des Alters mit Erfolg verwendet.
Die Anwendung kann oral in Form von Tabletten oder Dragees, die das kristalline Kallikrein in Mischung
mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen enthalten oder parenteral
als intramuskuläre oder auch intravenöse Injektion einer wäßrigen Lösung des kristallinen Kallikrein erfolgen.
Insbesondere für die parenteral Anwendung bietet das kristalline Kallikrein gegenüber weniger
reinen Präparaten den Vorteil der weit geringeren Gefahr unerwünschter Nebenwirkungen und allergischer
Reaktionen.
Durch Zusatz von hochmolekularen Kolloiden nach DE-PS 941685, z. B. Polyvinylpyrrolidon oder
Dextran, oder durch Bildung des Komplexes mit dem Kallikrein-Inhibitor Aprotinin nach DE-PS 1 000566
können aus kristallinem Kaliikrein verzögert wirkende Injektionspräparate hergestellt werden. Kallikrein
für Injektionszwecke kann sowohl als gebrauchsfertige isutuniseiie Lösung ncfgcaieüt wcfucn,
als auch in fester Form durch Gefriertrocknen einer Mischung von kristallinem Kallikrein mit geeigneten
Trägerstoffen, z. B. Dextran, Mannit, Lactose, GeIatine, woraus durch Auflösen in einem geeigneten Lösungsmittel
die gebrauchsfertige Lösung unmittelbar vor der Anwendung hergestellt wird.
Beispiel
a) 200 1 eines nach DE-PS 910580 aus Schweine-
a) 200 1 eines nach DE-PS 910580 aus Schweine-
pankreas gewonnenen und dialysierten Eluats einer Bleisalz^Fällung, enthaltend 10,8 Mio. KE,
wurden im Dünnschichtverdampfer auf 15 I eingeengt und dann durch Gelfiltration über eine
Säule von quervernetztem Polydextrangel mit einem Ausschlußvolumen für Molekulargewichte
größer als 5000 entsalzt. Die entsalzte Lösung wurde mit Essigsäure auf pH 5,0 eingestellt
und eine dabei entstandene geringe Fällung abfiltrierl. Sodann wurde festes Ammoniumacetat
bis zur spezifischen Leitfähigkeit 12 mS zugesetzt.
Diese Lösung »urde über eine 20 χ 65 cm
große Säule (20 1) von Diüthylaminoäthylgriippenhaltigen
quervernetztem Polydextrangel, äquilibriert mit 0,2 M Ammoniumacetat pH 5,(1,
gegeben, wobei Kallikrein adsorbiert wird. Die Säule wurde anschließend zuerst mit ca. 40 1
0,25 M Ammoniumacetat pH 5,0 und dann mit 0,3 M Ammoniumacetat pH 4,5 eluiert. Kallikrein
erscheint im Eluat kut/ nachdem der pH-Wert auf etwa 4,5 gesunken ist (Fig. 2). Die aktiven
Fraktionen enthielten 9,35 Mio KE 86,5%). Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert
und über eine Säule von quervernetztem Polydextrangel mit einem Ausschlußvolumen für
Molekulargewichte größer als 5000 entsalzt: eine Ivophilisierte Probe hatte die spezifische Aktivi
tat von 414 KE/mg Einwaage.
b) Die entsalzte Lösung mit einem Volumen von 300 ml wurde über eine 1Ox 130 cm große
Säule (10 1) von carboxymethylgruppen-haltigem quervernetztem Polydextrangel, äquilibriert
mit 0,01 M Ammoniumacetat pH 5,0, filtriert. Im Eluat erschien zuerst Kallikrein, gefolgt von
inaktiven Verunreinigungen (Fig. 3). Die KaIlS-krein-Fraktion (930 ml) enthielt 5,5 Mio KE
(59%). Eine lyophilisierte Probe hatte die spezifische Aktivität 1060 KE/mg Einwaage bzw.
1220 KE/mg Protein. Die Fieberwirkung betrug nach DAB 1,85 (Σ[ΔΤ]2 von 3 Tieren).
c) Ein Teil der Lösung, enthaltend 115000 KE.
1- _„.f C ~ 1 U^-™«„*-:«-f ..nri mU riAcottintor
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Ammoniumsulfatlösung bis 45% Sättigung versetzt. Nach 6 Tagen bei 20 bis 25° C setzte die
Kristallisation ein. Nach 3 Wochen wurden die Kristalle abzentrifugiert, mit 5 ml 50% gesättigter
Ammoniumsulfatlösung einmal gewaschen und in 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst. Die
spezifische Aktivität des Kallikrein in dieser Lösung war 1560 KE/mg Protein. Die Ausbeute
betrug 71 %, die Fieberwirkung nach DAd 0,32.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von hochreiner Kallidinogenase (Kallikrein), dadurch gekennzeichnet,
daß der aus Organen nach bekannten Methoden durch Metallsalzfällung gewonnene Niederschlag eluiert, das Eluat entsalzt, an geeigneten
basisch substituierten makroporösen Ionenaustauschern chromatographiert, dann mit einem
geeigneten sauer substituierten Ionenaustauscher behandelt und die reine Kallidinogenase (KaIIikreinj
gegebenenfalls aus der so erhaltenen Lösung durch Zusatz eines geeigneten Fällungsmittels
kristallisiert wird.
2. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an kristalliner Kallidinogenase (Kallikrein)
gemäß Anspruch 1.
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Publication number | Publication date |
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DE2154557A1 (de) | 1973-05-10 |
DE2154557B2 (de) | 1979-08-02 |
ZA727803B (en) | 1973-07-25 |
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