AT304760B

AT304760B - Verfahren zur Reinigung von Insulin

Info

Publication number: AT304760B
Application number: AT819671A
Authority: AT
Inventors: Klavs Holger Jorgensen
Original assignee: Novo Terapeutisk Labor As
Priority date: 1969-08-08
Filing date: 1969-08-08
Publication date: 1973-01-25

Description


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   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Insulin. 



   Als Insulin-Ausgangsmaterial für das Reinigungsverfahren wird gewöhnlich handelsübliches Insulin verwendet,   d. h.   amorphes Insulin oder kristallines Insulin, das mehrmals kristallisiert worden sein kann. Man kann aber auch Rohinsulin verwenden wie   z. B.   den insulinhältigen Salzkuchen, der während der Gewinnung von Insulin aus Pankreasdrüsen gebildet wird und gewöhnlich 10 bis 30   Gel.-%   Insulin enthält, doch ist dieses Ausgangsmaterial wegen seines hohen Gehaltes an Verunreinigungen für die erfindungsgemässe Reinigung weniger gut geeignet.

   Ein besseres Ausgangsmaterial kann erhalten werden, wenn man eine Lösung des Salzkuchens durch Einstellen des PH-Wertes der Lösung auf 5,5 einer isoelektrischen Ausfällung unterzieht und den Niederschlag abzentrifugiert. 
 EMI1.1 
 ger, durch ebene Kristallflächen begrenzter Rhomboeder das reine Protein Insulin darstellte, dessen Konfiguration von Sanger und Mitarbeitern festgelegt worden war, siehe z. B. Biochemical Journal 50   [1955], S., 556.   



  Später wurde jedoch gefunden, dass dies nicht zutrifft. Wissenschaftliche analytische Untersuchungen zeigten, dass das vorgenannte kristalline Insulin Proteine aus dem Pankreas mit einem   höheren Molekulargewicht als dem-   jenigen des reinen Insulins und ausserdem insulinähnliche Substanzen mit ungefähr dem   gleichen Molekularge-   wicht wie demjenigen des reinen Insulins von etwa 6000 enthält. 



   So konnte nachgewiesen werden, dass kristallines Insulin, in 1 m Essigsäure gelöst, an einer Kolonne aus Sephadex G-50 [mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran mit einer Obergrenze der Durchdringbarkeit von ungefähr 10. 000 (Mindest-Molgewicht der ausgeschlossenen Substanzen) in Form von Perlen mit 20 bis   SO   Durchmesser ; Herstellerfirma Pharmacia, Uppsala, Schweden in Komponenten (a), (b) und   (c)   aufgetrennt werden kann. Diese drei Komponenten lassen sich aus ihren Lösungen nach üblichen Methoden, z. B. Aussalzen, Ausfällen mit einem Zinksalz bei neutraler Reaktion, Gefriertrocknung usw. isolieren.

   Jede der Komponenten (a) und (b) enthält Pankreas-Proteine mit einem Molekulargewicht über 6000, während die Komponente   (c)   reines Insulin, verunreinigt mit insulinartigen Proteinen von etwa dem gleichen Molekulargewicht wie demjenigen des reinen Insulins, enthält. 



   Die Menge der Komponente (a) kann 2 bis 5   Gel.-%   des kristallisierten Insulins betragen und weniger als 1   Gew. -'10   des rekristallisierten Insulins. Die Menge der Komponente (b) kann in beiden Fällen 4 bis 8   Gew. -'10   ausmachen, und die Menge der insulinartigen Proteine in der Komponente   (c)   kann 5 bis 13 Gew.-% der Komponente   (c)   betragen. 



   Immunologische Tierversuche, welche die Grundlage für die Erfindung lieferten, zeigten, dass die oben genannten Komponenten (a) und (b) und bis zu einem gewissen Ausmass auch die insulinartigen Proteine in der Komponente (c) im Prinzip für das antigene Verhalten der bisher bekannten Insulinpräparate verantwortlich sind. 



   Die Erfindung bezweckt, in einfacher und wirksamer Weise die Verunreinigungen zu entfernen, die nicht nur in rohem Insulin, sondern insbesondere auch in handelsüblichem Insulin enthalten sind, so dass das gereinigte Insulin keine oder wesentlich verringerte antigene Eigenschaften besitzt. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man handelsübliches oder rohes Insulin der   Säulenchromatographie   an einem vorzugsweise stark basischen Anionenaustauscher unter Verwendung eines wasserhältigen, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, vorzugsweise eines aliphatischen Alkohols, als Elutionsmittel, unterwirft, jene Fraktionen sammelt, welche dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze entsprechen und bei der Analyse durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (DISC PAGE) im wesentlichen eine einzige Komponente zeigen, und das gereinigte Insulin aus den gesammelten Fraktionen gewinnt. Es ist überraschend, dass es möglich ist, durch einmalige Säulenchromatographie Insulin von so hoher Reinheit wie der vorstehend angegebenen zu erhalten. 



     Für analytische Zwecke wurde schon   früher diskontinuierliche Polyacrylamidgel-Elektrophorese (DISC PAGE) angewendet,   u. zw. auch im   Zusammenhang mit kristallinem Insulin. Diese spezielle Gel-Elektrophorese wurde von   B. J. DavisundL.   Ornstein entwickelt und ist in Ann. N. Y. Acad. Sci., 121,   [1964]   S. 321-349 und 404-427 beschrieben. 



   Es ist bekannt, zur Gewinnung von Insulin sauere oder neutralisierte alkoholische Pankreas-Extrakte der Säulenchromatographie an einem Kationenaustauscher,   z. B. Alginsäure (USA-Patentschrift   Nr. 2, 878, 159), Carboxymethylcellulose (franz. Patentschrift Nr. 1. 499. 126), sulfonierten Harzen, die aus dem Telomer von Styrol und Divinylbenzol synthetisiert sind (brit. Patentschrift Nr.   1, 054,   523), oder an einem Anionenaustauscher wie   Diäthylaminoäthylcellulose   (USA-Patentschrift Nr. 3,069, 323) zu unterwerfen. Das nach diesen Verfahren erhaltene Insulin enthält jedoch Verunreinigungen, ebenso wie das kristalline Insulin, das nach den gebräuchlichen Gewinnungsmethoden einschliesslich mehrmaliger Ausfällung durch Aussalzen aus den Rohinsulinlösungen mittels Natriumchlorid erhalten wird. 



   Auch ist es aus der brit. Patentschrift Nr. 881. 855 bekannt, nicht näher spezifizierte Insulin der Säulenchromatographie an dem   Kationenaustauscher "Do\'lex 50-X1"   (einem sulfonierten Styrol-Divinylbenzolcopolymeren in Perlenform, hergestellt von The Dow Chemical Company, Midland USA) zu unterwerfen, wobei wässeriges Äthanol als Elutionsmittel verwendet wird ; aber selbst wenn rekristallisiertes Insulin als Aus- 

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 gangsmaterial verwendet wird, zeigt das gewonnene Insulin in der Hauptsache die selben Verunreinigungen wie das Ausgangsmaterial. 



   Ferner ist aus der brit. Patentschrift Nr. 913, 042 bekannt, kristallines Insulin, das mit amorphen oder mikrokristallinen Fremdstoffen vermischt ist, dadurch zu reinigen, dass man das unreine Kristallisat mit einer wässerigen Flüssigkeit wäscht, deren PH-Wert mit Hilfe einer schwachen Säure oder eines Puffergemisches auf 3,8 bis 4, 3 eingestellt ist. Dieser Reinigungsvorgang entfernt jedoch nicht Verunreinigungen wie Proinsulin, das Dimer oder das Intermediat. 



   Schliesslich wird in der brit. Patentschrift Nr. 871,541 vorgeschlagen, 6-mal kristallisiertes Insulin und Insulin, das wie von Lens (Biochem. et Biophys. Acta   [1948],   2, S. 76) beschrieben, gereinigt worden war, der Säulenchromatographie an einem Styrol-Divinylbenzolpolymeren-Kationenaustauscher zu unterziehen, der auf einem inerten Streckmittel mit grosser Oberfläche abgelagert ist ; doch auch nach dieser Chromatographie wird das Insulin immer noch Verunreinigungen wie Proinsulin, das Dimer und das Intermediat zusammen mit Arginininsulin und Monodesamidoinsulin enthalten, da durch die Anwesenheit dieser Verunreinigungen nicht verhindert wird, dass das Chromatogramm so aussieht, als wäre das aus der Kolonne eluierte Material im wesentlichen homogen. 



   Die beim erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Anionenaustauscher sind an sich bekannt. Beispiele von schwach basischen Anionenaustauschern sind Bio-Gel DM, hergestellt auf der Basis von Polyacrylamiden, DEAE-Sephadex, hergestellt aus vernetzten Dextranen, und DEAE-Cellulose, hergestellt aus Cellulose. 



  Beispiele für stark basische Anionenaustauscher sind Dowex   1,   hergestellt aus Polystyrolen, und QAE-Sephadex, hergestellt aus vernetzten Dextranen. Die Sephadex-Anionenaustauscher werden von der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden, erzeugt. 



   Beispiele für wasserhaltige, mit Wasser mischbare organische Elutionslösungsmittel sind Tetramethylharnstoff, Dimethylformamid, Dioxan, mit Wasser mischbare Ketone wie Aceton, und niedere Alkohole wie Methanol, Äthanol und Propanol. Bevorzugt werden die Alkohole, die in einer Konzentration von 30 bis 80% (v/v), vorzugsweise 50 bis 70% (v/v), verwendet werden. 



   Wenn das Elutionsmittel weniger als 50% (v/v) des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels enthält, kann es als wässeriges Medium bezeichnet werden. 



   Das Elutionsmittel enthält immer einer Puffer zur Kontrolle seines PH-Wertes. Vorzugsweise wird bei konstantem PH-Wert gearbeitet. Der PH-Wert des Elutionsmittels innerhalb des Bereiches von 6 bis 10, vorzugsweise 6,5 bis 8,5, gemessen mittels einer in der üblichen Weise gegen einen Standardpuffer eingestellten Glaselektrode, gehalten werden. 



   Geeignete Puffersubstanzen finden sich in der verfügbaren Literatur. 



   Es ist wesentlich, dass die Temperatur während des Ionenaustauschvorganges im wesentlichen konstant ist, Die Temperatur kann innerhalb eines Bereiches von-10 bis   40 C,   vorzugsweise 0 bis   30 C,   gewählt werden. 



   Das gereinigte Insulin kann aus den gesammelten Fraktionen in üblicher Weise gewonnen werden,   z. B.   durch Eindampfen, Aussalzen oder Ausfällen in amorpher oder kristalliner Form in Anwesenheit von Zinkionen. 



   Bei s pie 1 1 : Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt. 
 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> 



  0, <SEP> 1 <SEP> m <SEP> NH4C1 <SEP> 
<tb> 0, <SEP> 02m <SEP> NHg <SEP> 
<tb> zo <SEP> (v/v) <SEP> Äthanol
<tb> pH <SEP> 8,3 <SEP> bei <SEP> 250C
<tb> 
 
15 g Dowex 1x2   (mesh : 50/100) werden   in dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden abdekantiert. Das Material wird zum Packen einer Säule von 1, 6 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet, welche mit dem Puffer equilibriert wird. Dowex 1X2 ist ein Copolymeres aus Styrol und   20/0   Divinylbenzol in Perlenform mit   Benzyltrimethylammoniumgruppen   als funktionellen Gruppen und wird von The Dow Chemical Co. of Midland, USA, hergestellt. 



   500 mg eines einmal aus einem Citratpuffer kristallisierten Insulins werden in einer Mischung von 20 mg Äthylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz, 5 ml Puffer, 5 ml   60% gem   (v/v) Äthanol und 0, 04 ml 13, 3 m   NH,   gelöst (End-PH 8,5). Unlösliches Material wird abzentrifugiert und die klare Lösung wird auf die Säule aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei einer Temperatur von   250C   mit 7,5 ml/h. Es werden Fraktionen von je 5 ml aufgefangen. 



   Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der grössten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das insulin wird daraus durch Zusatz von 100 ml Wasser, 1, 3 ml ln HC1 und 2   mal 1   m Zinkacetat je 100 ml der vereinigten Fraktionen ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in an sich bekannter Weise aus 

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 EMI3.2 
 
<tb> 
<tb> 25 <SEP> g <SEP> TrisfhydroymeLhyliaminOiethan
<tb> 29, <SEP> 0 <SEP> ml <SEP> 6 <SEP> n <SEP> HCI <SEP> 
<tb> 1, <SEP> 21 <SEP> Methanol
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> einem <SEP> Gesamtvolumen
<tb> von <SEP> 21
<tb> PH <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> bei <SEP> 250C. <SEP> 
<tb> 
 
 EMI3.3 
 kantiert.

   Das Material wird zum Packen einer Säule von 2, 5 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet. Die Säule wird mit dem Puffer equilibriert. QAE-Sephadex   A-25 ist   ein mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran mit 
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Diäthyl- (2-hydroxypropyl) -aminoäthylgruppenÄthylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz, 94 mg Tris (hydroxymethyl)aminomethan, 10   mlÜOTcigem (v/v)   Methanol und 0, 073ml 6nHCl gelöst (End-pH 7,3). Das unlösliche Material wird abzentrifugiert und die klare Lösung auf die Säule aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei 250C mit 30 ml/h. Fraktionen von je 5 ml werden aufgefangen. 



   Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der grössten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin durch Zusatz von 100 ml Wasser und 2 ml Im Zinkacetat je 100 ml der vereinigten Fraktionen ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem   acetonhaltigen Citratpuffer   kristallisiert. Die Ausbeute an gereinigtem Insulin beträgt 250 mg. 



   Beispiel 3 : Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt. 
 EMI3.5 
 
<tb> 
<tb> 



  0, <SEP> 06 <SEP> m <SEP> Tris <SEP> (hydroxymethyl) <SEP> aminomethan <SEP> 
<tb> 0,02 <SEP> n <SEP> HCl
<tb> 0,075 <SEP> NaCl
<tb> 60% <SEP> iges <SEP> (v/v) <SEP> Äthanol
<tb> pH <SEP> 8, <SEP> 3 <SEP> bei <SEP> 250C
<tb> 
 
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 gfeinsten Teilchen werden abdekantiert. Das Material wird zum Packen einer Säule von 2,   5   cm Durchmesser und 50 cm Höhe verwendet. Die Säule wird mit dem Puffer equilibriert. 



     2, 5   g eines einmal aus einem Citratpuffer kristallisierten Insulins werden bei   OOC   in einer Mischung von 
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 Puffers, 25 ml 60%iges (v/v) Äthanol und   0,   08 4 n HCl gelöst (Eng-pH bei 25 C: 8,4). Das unlösliche Material wird bei 2 bis 40C abzentrifugiert und der Mare Überstand wird auf die Säule aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei   4 C     mit 26 mllh, Fraktionen   von je 20 ml werden aufgefangen. 



   Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der grössten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin wird daraus durch Zusatz eines gleichen Volumens von 0, 02 m Zinkacetat + 0,03 n HCl ausgefallt. 



  Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem acetonhältigen Citratpuffer kristallisiert. Die Ausbeute beträgt   l, 3 gereinigtes   Insulin. 



     Beispiel 4 :   Ein Puffer folgender Zusammensetzung wird hergestellt : 
 EMI3.8 
 
<tb> 
<tb> 14,9 <SEP> g <SEP> Histidiniummonochlorid
<tb> 18, <SEP> 7 <SEP> ml <SEP> 1 <SEP> n <SEP> NaOH
<tb> 16, <SEP> 1 <SEP> g <SEP> NaCl <SEP> 
<tb> 
 

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 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> 3,12 <SEP> 1 <SEP> tiges <SEP> (v/v) <SEP> Äthanol
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> einem <SEP> Gesamtvolumen
<tb> von <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> PH <SEP> 6,5 <SEP> bei <SEP> 250C
<tb> 
 
35 g des in Beispiel 2 verwendeten Anionenaustauschers werden in dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden abzentrifugiert. Das Material wird zum Packen einer Säule von 2, 5 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet. Die Säule wird mit dem Puffer equilibriert. 



   500 mg eines einmal aus einem Citratpuffer kristallisierten Inulsins werden in einer Mischung von 20 mg Äthylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz, 6,5 ml des Puffers und 6 ml 60%igem (v/v) Äthanol gelöst und das PH wird mit 1 n NaOH auf 6, 8 eingestellt. Das unlösliche Material wird abzentrifugiert und die klare Lösung wird auf die Säule aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei 250C mit 30 ml/h. Es werden Fraktionen von je 5 ml gesammelt. 



   Die Extinktionen bei 276 mm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der grössten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin durch Zusatz eines gleichen Volumens 0, 02 m Zinkacetat ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem acetonhältigen Citratpuffer kristallisiert. Die Ausbeute an gereinigtem Insulin beträgt 210 mg. 



   Beispiel 5 : Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt : 
 EMI4.2 
 
<tb> 
<tb> 1, <SEP> 25 <SEP> kg <SEP> Tris <SEP> (hydroxymethyl) <SEP> aminomethan <SEP> 
<tb> 725 <SEP> ml <SEP> 12, <SEP> 3 <SEP> n <SEP> HCI
<tb> 62, <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 96%iges <SEP> (v/v) <SEP> Äthanol
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> einem <SEP> Gesamtvolumen
<tb> von <SEP> 100 <SEP> 1
<tb> pH <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> bei <SEP> 250C <SEP> 
<tb> 
 
1, 3 kg des in Beispiel 2 verwendeten Anionenaustauschers werden in dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden abdekantiert. Das Material wird zum Packen einer Säule von 15 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet. Die Säule wird mit dem Puffer equilibriert. 



   18 g rekristallisiertes Schweine- oder Rinder-Insulin, welches ungefähr   0, 40/0   Zn enthält, werden in einer Mischung von 0, 72 g Äthylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz, 10,2 g Tris (hydroxymethyl) aminomethan und 720   ml     60'igem   (v/v) Äthanol gelöst. Das unlösliche Material wird abzentrifugiert. Die klare Lösung wird nach Zusatz von 10, 7 ml 6 n   HCI   auf die Säule aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei   250C   und mit   1, 2 l/h.   Es werden Fraktionen von je 0,5   l   gesammelt. 



   Die Extinktionen bei 276 nm (E276) werden gemessen und gegen die Volumteile des Eluats aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der grössten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin wird durch Zusatz eines gleichen Volumens von 0,02 m Zinkacetat ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem acetonhältigen Citratpuffer kristallisiert. Die Ausbeute beträgt 8, 2 g gereinigtes Insulin. 



   Das Insulin wird aus einem Puffer folgender Zusammensetzung umkristallisiert : 
 EMI4.3 
 
<tb> 
<tb> 2, <SEP> 0 <SEP> Insulin
<tb> 0, <SEP> 8% <SEP> Zn++ <SEP> (als <SEP> Chlorid), <SEP> berechnet <SEP> auf
<tb> das <SEP> Gewicht <SEP> des <SEP> Insulins,
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> m <SEP> Natriumacetat <SEP> 
<tb> 7, <SEP> 00/0 <SEP> Natriumchlorid
<tb> HCI <SEP> bis <SEP> zu <SEP> einem <SEP> PH <SEP> von <SEP> 5, <SEP> 45 <SEP> bis <SEP> 5,55.
<tb> 
 



   Das Insulin wird in   HC1   und   ZnCl2   enthaltendem Wasser gelöst, wonach eine Lösung von Natriumacetat und Natriumchlorid zugesetzt wird. Die Kristallisation erfolgt bei Raumtemperatur unter mechanischem Rühren. 



  Sie ist innerhalb von 1 bis 2 Tagen vollendet. Das Insulin wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 8, 0 g. 

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 EMI5.1 
 
 EMI5.2 
 
<tb> 
<tb> 6 <SEP> :0, <SEP> 1 <SEP> m <SEP> NHd
<tb> 0, <SEP> 0036 <SEP> n <SEP> NHg
<tb> 60%iges <SEP> (v/v) <SEP> Äthanol
<tb> pH <SEP> 7,7 <SEP> bei <SEP> 25 C.
<tb> 
 
 EMI5.3 
 feinsten Teilchen werden abdekantiert. Das Material wird zum Packen einer Säule von 2,5 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet. Die Säure wird mit dem Puffer equilibriert. 



   1 g rekristallisiertes Rinder-Insulin mit einem Gehalt von ungefähr 0, 4% Zn wird in 10 ml   60loigem (vlv)   
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 wird auf die Säule aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei einer Temperatur von   2, 50C mit     25   ml/h. Es werden Fraktionen von je 10 ml aufgefangen. 



   Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der grössten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin wird daraus durch Zusatz eines gleichen Volumens von 0,02 m Zinkacetat + 0,003 n   HC1   ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem acetonhältigen Citratpuffer kristallisiert. Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 0,6 g.

Claims

PATENTANSPRUCH : EMI5.5 man das Insulin der Säulenchromatographie an einem vorzugsweise stark basischen Anionenaustauscher unter Verwendung eines wasserhältigen, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, vorzugsweise eines aliphatischen Alkohols, als Elutionsmittel, unterwirft, jene Fraktionen sammelt, welche dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze entsprechen und bei der Analyse durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (DISC PAGE) im wesentlichen eine einzige Komponente zeigen, und das gereinigte Insulin aus den gesammelten Fraktionen gewinnt.