DE1966573C3

DE1966573C3 - Verfahren zur Reinigung von Insulin

Info

Publication number: DE1966573C3
Application number: DE19691966573
Authority: DE
Inventors: Klavs Holger Virum Joergensen (Daenemark)
Original assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Current assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Priority date: 1969-08-07
Filing date: 1969-08-07
Publication date: 1979-08-30
Also published as: DE1966573B2; DE1966573A1

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von handelsüblichem oder rohem Insulin durch Säulenchromatographie an Anionenaustauschern und Eluieren bei 0 bis 30° C.

Als Insulin-Ausgangsmaterial für das Reinigungsverfahren wird gewöhnlich handelsübliches Insulin verwendet, d. h. amorphes Insulin oder kristallines Insulin, das mehrmals kristallisiert worden sein kann. Man kann aber auch Rohinsulin verwenden wie z. B. den *o insulinhaltigen Salzkuchen, der während der Gewinnung von Insulin aus Pankreasdüsen gebildet wird und gewöhnlich 10 bis 30 Gew.-% Insulin enthält, doch ist dieses Ausgangsmaterial wegen seines hohen Gehaltes an Verunreinigungen für die erfindungsgemäße Reinigung weniger gut geeignet. Ein besseres Ausgangsmaterial kann erhalten werden, wenn man eine Lösung des Salzkuchens durch Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf 5,5 einer isoelektrischen Ausfällung unterzieht und den Niederschlag abzentrifugiert.

Ursprünglich wurde allgemein angenommen, daß richtig umkristallisiertes Insulin in der Form scharfkantiger, durch ebene Kristallflächen begrenzter Rhomboeder das reine Protein Insulin darstellte, dessen Konfiguration von Sanger und Mitarbeitern festgelegt worden war, siehe z. B. Biochemical Journal 60 (1955), 556. Später wurde jedoch gefunden, daß dies nicht zutrifft.

Wissenschaftliche analytische Untersuchungen zeigten, daß das vorgenannte kristalline Insulin Proteine aus ^wl dem Pankreas mit einem höheren Molekulargewicht als demjenigen des reinen Insulins und außerdem insulinähnliche Substanzen mit ungefähr dem gleichen Molekulargewicht wie demjenigen des reinen Insulins (etwa 6000) enthält.

So konnte nachgewiesen werden(vgl.z. B. Hoppe — S e y I e r , Z. Physiol. Chem., Bd. 349, S. 1160 (1968) Abb.

IUJ. ^|!·ιυ KriStäiiincS lilSüii

einer Kolonne aus Sephadex G-50® [mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran mit einer Obergrenze der Durchdringbarkeit von ungefähr 10 000 (Mindest-Molgewicht der ausgeschlossenen Substanzen) in Form von Perlen mit 20—80 μ Durchmesser; Herstellerfirma PHARMACIA, Uppsala, Schweden] in Komponenten (a), (b) und (c) aufgetrennt werden kann. Diese drei Komponenten lassen sich aus ihren Lösungen nach üblichen Methoden, z. B. Aussalzen, Ausfällen mit einem Zinksalz bei neutraler Reaktion, Gefriertrocknung usw. isolieren. Jede der Komponenten (a) und (b) enthält Pankreas-Proteine mit einem Molekulargewicht über 6C30, während die Komponente (c) reines Insulin, verunreinigt mit insulinartigen Proteinen von etwa dem gleichen Molekulargewicht wie demjenigen des reinen Insulins enthält

Die Menge der Komponente (a) kann 2—5 Gew.-% des kristallisierten Insulins betragen und weniger als 1 Gew.-% des rekristallisierten Insulins. Die Menge der Komponente (b) kann in beiden Fällen 4—8 Gew.-% ausmachen, und die Menge der insulinartigen Proteine in der Komponente (c) kann 5—13 Gew.-% der Komponente (c) betragen.

Immunologische Tierversuche haben gezeigt, daß die oben genannten Komponenten (a) und (b) und bis zu einem gewissen Ausmaß auch die insulinartigen Proteine in der Komponente (c) im Prinzip für das antigene Verhalten der bisher bekannten Insulinpräparate verantwortlich sind (vgl. DE-OS 19 40 130).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Insulin zur Verfugung zu stellen, mit dem sich injizierbare Insulinpräparate herstellen lassen, die entweder überhaupt keine oder im Vergleich zu den am Anmeldetag bekannten injizierbaren Insuiinpräparaten, nur noch sehr geringe Insulinantikörperbildung nach der Injektion hervorrufen.

Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung bei dem eingangs als bekannt zugrunde gelegten Verfahren zur Reinigung von Insulin durch säulenchrcmatographische Behandlung einer Insulinlösung auf einem Anionenaustauscher vor, daß man mit einer 20 bis 70 Vol.-% Wasser und einen mit Wasser mischbaren niederen aliphatischen Alkohol enthaltenden Pufferlösung bei einem pH-Wert von 5,5 bis 10 eluiert, die dem mittleren Hauptteil des lnsulin-Peaks entsprechenden, bei der diskontinuierlichen Polyacrylamidgel-Elektrophorese im wesentlichen eine einzige Komponente aufweisenden Fraktionen sammelt und das darin enthaltene Insulin in an sich bekannter Weise gewinnt.

Für analytische Zwecke wurde schon früher die diskontinuierliche Polyacrylamidgel-Elektrophorese (DISC PAGE) eingesetzt, auch im Zusammenhang mit kristallinem Insulin. Diese spezielle Gel-Elektrophorese wurde von B. J. Davis und L. Ornstein entwickelt und ist in Ann. N. Y. Acad. Sei. 121, S. 321-349 und 404—427 (1964) beschrieben. In Verbindung mit dem Verfahren nach der Erfindung enthält das untere Gel 7,5% Polyacrylamid und 8 M Harnstoff und hat einen pH-Wert von etwa 8,7, während das obere Gel und die eingesetzte etwa 0,1 mg Insulin enthaltende Insulinlösung auch 8 M Harnstoff enthalten.

Es ist nicht nur überraschend, daß sich nach der Erfindung die hochmolekularen Pankreasproteine entfernen lassen, sondern auch, daß man als Kriterium für die Abwesenheit dieser Proteine die diskontinuierliche Polyacrylamidgel-Elektrophorese einsetzen kann. Es ist nämlich bekannt, daß man bei der Verwendung dieser Anah'senrp.ethode in VerhinHung mit handelsüblichem

Insulin ein Insulinband erhält, welches ein hochmolekulares Protein und zwar das Dimere enthält (vgl. Steiner und Mitarbeiter, Diabetes, 17, (1968) S. 728, rechte Spalte).

Es konnte auch nicht vorausgesehen werden, daß das erfindungsgemäß verwendete Eluierungsmittel eine solche Monomerisierung der anwesenden Proteine bewirken könnte, daß eine Abtrennung der insulinähnlichen Stoffe möglich wird.

Es ist zwar bekannt, zur Gewinnung von Insulin saure oder neutralisierte alkoholische Pankreas-Extrakte der Säulenchromatographie an einem Kationenaustauscher, z. B. Alginsäure (US-PS 28 78 159), Carboxymethylcellulose (FR-PS 14 99 126), sulfonierten Harzen, die aus dem Telomer von Styrol und Divinylbenzol synthetisiert sind (GB-PS 10 54 523) zu unterwerfen. Das nach diesem Verfahren erhaltene Insulin enthält jedoch die antigenen Verunreinigungen, ebenso wie das kristalline Insulin, das nach den gebräuchlichen Gewinnungsmethoden einschließlich mehrmaliger Ausfällung durch Aussalzen aus den Rohinsulinlösungen mittels Natriumchlorid erhalten wird. Dies gilt auch für diejenigen bekannten Verfahren, bei denen die Insulinlösung auf einem Anionenaustauscher wie Diäthylaminoäthylcellulose (US-PS 30 69 323) oder Dowex 1-X2® (1 s m a i 1 ο ν und Mitarbeiter, Azerb. Med. Zh. 45 (1), 8-13 (1968)) säulenchromatographisch behandelt wird.

Hiervon unterscheidet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch, daß die Adsorption des Insulins an einem Anionenaustauscher in Verbindung mit weiteren, d. h. den das erfindungsgemäße Verfahren kennzeichnenden Maßnahmen durchgeführt wird, die erst in ihrer Gesamtheit zur Lösung der Erfindungsaufgabe führen.

Aus der GB-PS 8 81855 ist es bekannt, einen Ionenaustauscher mit einem salzhaltigen wäßrigen Alkohol zu dem Zwecke zu eluieren, verschiedene organische Stoffe, die aus verdünnten wäßrigen Lösungen solcher Stoffe auf den Ionenaustauscher adsorbiert sind, zu gewinnen. Als eine Ausführungsform dieses Verfahrens wird nicht näher spezifiziertes Insulin an einem Kationenaustauscher vom Typ sulfoniertes Styrol-Divinylbenzolcopolymer in Perlenform adsorbiert und mit salzhaltigem wäßrigen Äthanol eluiert. Aber selbst wenn rekristallisiertes Insulin als Ausgangsmaterial verwendet wird, zeigt das gewonnene Insulin in der Hauptsache dieselben Verunreinigungen wie das Ausgangsmaterial, indem sämtliche insulinhaltigen Fraktionen und nicht nur solche Fraktionen, welche im wesentlichen eine einzige Komponente bei der DISC PAGE-Analyse zeigen, vereinigt werden.

Ferner ist aus der GB-PS 913 042 bekannt, kristallines Insulin, das mit amorphen oder mikrokristallinen Fremdstoffen vermischt ist, dadurch zu reinigen, daß man das unreine Kristallisat mit einer wäßrigen Flüssigkeit wäscht, deren pH-Wert mit Hilfe einer schwachen Säure oder eines Puffergemisches auf 3,8—43 eingestellt ist Dieser Reinigungsvorgang entfernt jedoch nicht Verunreinigungen wie Proinsulin, das Dimer oder das Intermediat.

Schließlich wird in der GB-PS 8 71 541 vorgeschlagen, 6mal kristallisiertes Insulin und Insulin, das wie von Lens (Biochem. et Biophys. Acta (1948), 2, 76) beschrieben, gereinigt worden war, der .Säulenchromatographie an einem Styrol-Divinylbenzolpolymer-Kationenaustauscher zu unterziehen, der auf einem inerten Streckmittel mit großer Oberfläche abgelagert ist; doch auch nach dieser Chromatographie wird das Insulin immer noch Verunreinisuneen enthalten, die nicht verhindern, daß das Chromatogramm so aussieht, als wäre das aus der Kolonne eluierte Material im wesentlichen homogen.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Anionenaustauscher sind bekannt Beispiele von schwach basischen Anionenaustauschern sind Bio-Gel DM®, hergestellt auf der Basis von Polyacrylamiden, Diäthylaminoäthyl-Sephadex®, hergestellt aus vernetzten Dextranen, und Diäthylaminoäthylcellulose, hergestellt aus Cellulose. Beispiele für stark basische Anionenaustauscher sind Dowex 1®, hergestellt aus Polystyrolen, und QAE-Sephadex®, hergestellt aus vernetzten Dextranen. Die Sephadex®-Anionenaustauscher werden von der Firma PHARMACIA, Uppsala, Schweden, hergestellt

Die als Eluierungsmittel verwendeten wasserhaltigen aliphatischen Alkohole wie Methanol, Äthanol und Propanole werden nach der Erfindung vorzugsweise mit einem Wassergehalt von 30—50% (v/v) verwendet

Das Eluierungsmittel enthält immer einen Puffer zur Kontrolle seines pH-Wertes. Vorzugsweise wird bei konstantem pH-Wert gearbeitet Der pH-Wert des Eluierungsmittsls wird am besten zwischen 6 und 9, gemessen mittels einer in der üblichen Weise gegen einen Standardpuffer eingestellten Glaselektrode, gehalten.

Geeignete Puffersubstanzen sind in der Literatur beschrieben.
Das gereinigte Insulin kann aus den gesammelten Fraktionen in üblicher Weise gewonnen werden, z. B. durch Eindampfen, Aussalzen oder Ausfällen in amorpher oder kristalliner Form in Anwesenheit von Zinkionen.

Beispiel 1

Als stark basischer Anionenaustauscher wird ein Produkt auf der Grundlage eines Copolymers aus Styrol mit 2% Divinylbenzol mit Benzyltrimethylammoniumgruppen als funktionell Gruppen verwendet, das in Perlenform (Durchmesser 120—250 μ) verwendet und von der Firma The Dow Chemical Company of Midlar d, USA unter der Bezeichnung Dowex® 1 χ 2 gebracht wird.

Für diesen Anionenaustauscher wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:

0,1 m NH₄CI
0,02 m NH_?
60% (v/v) Äthanol
pH 8,3 bei 25° C.

15 g des vorerwähnten Anionenaustauschers werden in dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen abdekantiert. Das Material wird zum Packen einer Säule von 1,6 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet, welche mit dem Puffer equilibriert wird.

500 mg eines einmal aus einem Citratpuffer kristallisierten Insulins werden in einer Mischung von 20 mg Äthylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz, 5 ml Puffer, 5 ml 60%igem (v/v) Äthanol und 0,04 ml 13,3 m NH₃ gelöst (End-pH 8,5). Unlösliches Material wird abzentrifugiert und die klare Lösung wird auf die Säule aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei einer Temperatur von 25°C mit 7,5 ml/h. Es werden Fraktionen von je 5 ml aufgefangen.

Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der größten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt

und das Insulin wird daraus durch Zusatz von 100 ml Wasser, 13ml InHCl und 2ml Im Zinkacetat je 100 ml der vereinigten Fraktionen ausgefällt Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in an sich bekannter Weise aus einem acetonhaltigen Citratpuffer s kristallisiert. Die Ausbeute an vereinigtem Insulin beträgt 200 mg.

Beispiel 2

In diesem wie auch bei den nachfolgenden übrigen Ausführungsbeispielen wird als stark basischer Anionenaustauscher ein Produkt auf der Grundlage eines mit Epichlorhydrin vernetzten Dextrans mit einer Obergrenze der Durchdringbarkeit von ungefähr 5000 (Mindest-Molgewicht der ausgeschlossenen Substanzen) verwendet, welches Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-aminoäthylgruppen als funktioneile Gruppen trägt und in Form von Perlen mit einem Durchmesser von 40—120 μ vorliegt Ein solcher Anionenaustauscher wird von der Firma PHARMACIA, Uppsala, Schweden unter der Bezeichnung QAE-Sephadex® A-25 auf den Markt gebracht

Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:

25 gTris-(hydroxymethyl)aminomethan 29,0 ml 6 η HCl

Ul Methanol

Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 2 1

pH 73 bei 25° C.

40 g QAE-Sephadex A-25® werden in dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden abdekantiert Das Material wird zum Packen einer Säule von 2,5 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet. Die Säule wird mit dem Puffer equilibriert

500 mg eines einmal aus einem Citratpuffer kristalliserten Insulins werden in einer Mischung von 20 mg Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz, 94 mg Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 10 ml 6O°/oigem (v/v) Methanol und 0,073 ml 6 η HCl gelöst (End-pH 7,3). Das unlösliche Material wird abzentrifugiert und die klare Lösung auf die Säule aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei 25° C mit 30 ml/h. Fraktionen von je 5 ml werden aufgefangen.

Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und « gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der größten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin durch Zusatz von 100 ml Wasser und 2ml Im Zinkacetat je 100ml der vereinigten Fraktionen ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem acetonhaltigen Citratpuffer kristallisiert. Die Ausbeute an gereinigtem Insulin beträgt 250 mg.

Beispiel 3

Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:

0,06 m Tris-(hydroxymethyl)aminomethan

0,02 η HCl

0,075NaCl

6O°/oiges (v/v) Äthanol

pH 8,3 bei 25°C.

80 g des in Beispiel 2 verwendeten Anionenaustau- ■ schers werden in dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden abdekantieirt. Das Material wird zum Packen einer Säule von 2,5 '.tp. Durchr

und 50 cm Höhe verwendet Die Säule wird mit dem Puffer equilibriert

23 g eines einmal aus einem Citratpuffer kristallisierten Insulins werden bei 0⁰C in einer Mischung von 450 mg Tris-{hydroxymethyl)aminomethan, 100 mg Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz, 25 ml des Puffers, 25 ml 60%iges (v/v) Äthanol und 0,08 ml 4 η HCl gelöst (End-pH bei 25° C: 8,4/. Das unlösliche Material wird bei 2—4°C abzentrifugiert und der klare Überstand wird auf die Säule aufgebracht Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei 4° C mit 26 ml/h.

Fraktionen von je 20 ml werden aufgefangen.

Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der größten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin wird daraus durch Zusatz eines gleichen Volumens von 0,02 m Zinkacetat + 0,03 η HCl ausgefällt Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem acetonhaltigen Citratpuffer kristallisiert Die Ausbeute beträgt 13 g gereinigtes Insulin.

Beispiel 4

Ein Puffer folgender Zusammensetzung wird hergestellt:

14,9 g Histidinium-monochlorid

38,7 ml 1 η NaOH

16,IgNaCl

3,12196%iges (v/v) Äthanol

Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 51

pH 6,5 bei 25° C.

35 g des in Beispiel 2 verwendeten Anionenaustauschers werden in dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden abzentrifugiert Das Material wird zum Packen einer Säule von 2,5 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet. Die Säule wird mit dem Puffer equilibriert.

500 mg eines einmal aus einem Citratpuffer kristallisierten Insulins werden in einer Mischung von 20 mg Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz, 6,5 ml des Puffers und 6 ml 6O°/oigem (v/v) Äthanol gelöst und das pH wird mit 1 η NaOH auf 6,8 eingestellt Das unlösliche Material wird abzentrifugiert und die klare Lösung wird auf die Säule aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei 25° C mit 30 ml/h. Es werden Fraktionen von je 5 ml gesammelt.

Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der größten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin durch Zusatz eines gleichen Volumens 0,02 m Zinkacetat ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem acetonhaltigen Citratpuffer kristallisiert Die Ausbeute an gereinigtem Insulin beträgt 210 mg.

Beispiel 5

Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:

1,25 kg Tris-(hydroxymethyl)aminomethan

725 ml 123 η HCl

62,4 1 96%iges (v/v) Äthanol

Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 100 I

pH 7,3 bei 25" C.

1,3 ke des in Beispiel 2 verwendeten Anionenaustau-

schers werden ·π dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden abdekantiert. Das Material wird zum Packen einer Säuie von 15 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet. Die Säule wird mit dem Puffer cquilibriert.

18 g i ■ kiir'.a!'i.sierte^r Schweine- oder Rinder-Insulin vveit-ht-s ungefähr 0,4% Zn enthält, werden in einer Mischung von 0,7? g Äthylendiamintetraessigsäure-dinairiumsalz, !0,2 g Tris-(hydroxymethyl)aminomc:han un:i 720 ml 60%ieem (v/v) Äthanol gelöst. Das unlösliche Material wird abzentrifugiert. Die klare Lösung wird nach Zusatz von 10,7 ml 6 η HCl auf die Säule aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei 25°C und mit 1,2 l/h. Es werden Fraktionen von je 0,5 I gesammelt.

Die Extinktionen bei 276 nm (E27t>) werden gemessen und gegen die Volumteile des Eiuats aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der größten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin wird durch Zusatz des gleichen Volumens von 0,02 m Zinkacetat ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem acetonhaltigen Citratpuffer kristallisiert.

Die Ausbeute beträgt 8,2 g gereinigtes Insulin.

Das Insulin wird aus einem Puffer folgender Zusammensetzung umkristallisiert:

2,0% Insulin

0,8% Zn' + (als Chlorid), berechnet auf das Gewicht des Insulins),

0,1 m Natriumacetat

7.0% Natriumchlorid

HCI bis zu einem pH von 5,45 — 5,55.

Das Insulin wird in HCl und ZnCb enthaltendem Wasser gelöst, wonach eine erforderliche Menge an einer Lösung von Natriumacetat und Natriumchlorid zugesetzt wird. Die Kristallisation erfolgt bei Raumtemperatur unter mechanischem Rühren. Sie ist innerhalb von 1 bis 2 Tagen vollendet. Das Insulin wird abfiltriert, ip.ii Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrngt 8,0 g.

Das gereinigte Insult l-nrn zur Heisicilung al!·.; Arten von pharmazeutischen Insulinpräparaten für den ■) klinischen Gebrauch verwendet werden.

Beispiel 6

Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt.

^!" 0.ImNHiCl

0,0036 η NH₃
60%iges(v/v) Äthanol
pH7,7bei25°C.

!5 4ö g des in Beispiel 2 verwendeien Anionenaustauschers werden in dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden abdekantiert. Das Materia wird zum Packen einer Säule von 2,5 cm Durchmessei und 25 cm Höhe verwendet. Die Säure wird mit derr Puffer equilibriert.

1 g rekristallisiertes Rinder-Insulin mit einem Gehali von ungefähr 0,4% Zn wird in 10 ml 60%igem (v/v Äthanol, 10 ml des Puffers, 0,5 ml einer 0,2 m Lösung von Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz unc

Ji 0,04 ml 14 η Ammoniak (End-pH 7,7) gelöst. Da« unlösliche Material wird abzentrifugiert und die klare Lösung wird iuf die Säule aufgebracht. Die Elutior erfolgt mit den' Puffer bei einer Temperatur von 25⁰C mit 25 ml/h. Es werden Fraktionen von je 10 m

in aufgefangen.

Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen unc gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die den mittleren Kauptteil der Insulinspitze (der größter Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinig

i"> und das Insulin wird daraus durch Zusatz eines gleicher Volumens von 0,02 m Zinkacetat + 0,003 π HCl ausge fällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und ii bekannter Weise aus einem acetonhaltigen Citratpuffe kristallisiert. Die Ausbeute an reinem Insulin betrag

·>" 0,6 g.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Reinigung von handelsüblichem oder rohem Insulin durch Säulenchromatographie an Anionenaustauschern und Eluieren bei 0 bis 30⁰C, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer 20 bis 70 Vol.-% Wasser und einen mit Wasser mischbaren niederen aliphatischen Alkohol enthaltenden Pufferlösung bei einem pH-Wert von 5,5 bis 10 eluiert, die dem mittleren Hauptteil des lnsulin-Peaks entsprechenden, bei der diskontinuierlichen Polyacrylamidgel- Elektrophorese im wesentlichen eine einzige Komponente aufweisenden Fraktionen sammelt und das darin enthaltene Insulin in an sich bekannter Weise gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Eluieren mit einer 30 bis 50 Vol.-% Wasser enthaltenden Pufferlösung durchführt

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Eluieren mit einer Pufferlösung vom pH 6 bis 9 durchführt

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Säulenchromatographie an einem stark basischen Anionenaustauscher durchführt.