DE1617937B1 - Verfahren zur Gewinnung von Insulin - Google Patents

Description

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insbesondere Äthanol, bevorzugt. Der Wassergehalt Phosphorsäure auf einen pH von 3,1 gebracht war,

des Äthanol kann beispielsweise bis zu 35 % betragen. suspendiert. Die Suspension wurde vorsichtig auf

Die Hauptmenge des rückständigen Lösungsmittels pH 5,9 (Glaselektrode gegen eine Kalomel-Bezugs-

wird zweckmäßig durch Belüften oder Spülen mit elektrode), durch Zugabe von wäßrigem 5 N Ammo-Wasser entfernt. 5 niak, eingestellt. Man ließ stehen, bis der pH konstant

Das Eluieren kann beispielsweise in einfacher blieb, wobei der pH, wenn erforderlich, von Zeit

Weise mit einer Lösung von 0,1 N Salzsäure oder zu Zeit mit 5 N Ammoniak wieder eingestellt wurde,

durch mehrmaliges aufeinanderfolgendes Behandeln Das gepufferte Adsorbens wurde dann abfiltriert,

mit Säure oder Salzlösungen zunehmender Stärke zuerst durch Belüftung und dann bei 45° C während erfolgen, so daß Fraktionen verschiedener Reinheit io 30 Minuten getrocknet und in einem geschlossenen

erhalten werden. Eine auf diese Weise durch Eluieren Behälter gelagert.

erhaltene Insulinlösung ist nicht nur für die weitere __ Rinderpankreas wurde mit 80volumprozentigem

Reinigung nach herkömmlichen Verfahren geeignet; Äthanol, das Phosphorsäure (spezifisches Gewicht

es ist auch die Ausbeute bzw. die Qualität des hieraus 1,65, 6,3 ml/1) enthielt, extrahiert, so daß ein Extrakt

schließlich erhaltenen kristallinen Insulins im Durch- 15 (175 ml für je 50 g Pankreas) mit einem pH von

schnitt bedeutend besser als nach den bekannten Ver- etwa 3,3 erhalten wurde. Dieser wurde mit 5 N Ammo-

fahren. Das erschöpfte Adsorbens kann regeneriert niak auf pH 5,9 eingestellt und filtriert. Zu jeweils

und erneut verwendet werden, da keine Anzeichen 225 ml Anteilen der so erhaltenen Lösung (gleich

gefunden wurden, daß Carboxymethylcellulose Enzyme 25 g Pankreas) wurde gepuffertes Adsorbens (= 12 g

anlagert, die das Adsorbens für eine wiederholte 20 Trockengewicht) zugegeben, das Gemisch periodisch

Verwendung ungeeignet machen oder das vorherige 90 Minuten gerührt und dann durch einen versinterten

Erhitzen des Extraktes erforderlich machen, wie das Glasfilter filtriert.

von dem Alginsäure-Adsorbens (E. J ο r ρ e s et al, Das auf dem Filter gesammelte Adsorbens wurde

Acta Chemica Scandinavica 1960, 14, 1779) bekannt mit absolutem Äthanol (3mal 100 ml) gewaschen

ist. Wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung 25 und durch Belüftung bei Zimmertemperatur getrocknet,

auf den ursprünglichen insulinhaltigen Extrakt des Während es noch auf dem Filter war, wurde das

Pankreasgewebes angewendet, so kommt eine be- trockene Adsorbens mit 0,1 N Salzsäure (3mal 100 ml)

trächtliche Vereinfachung und Verbesserung der eluiert, die Eluate zusammengegeben und das rohe

Wirtschaftlichkeit des Verfahrens im Vergleich zu Insulin als Picrat gewonnen, in das Hydrochlorid

den herkömmlichen in der Industrie verwendeten 30 umgewandelt und bei seinem isoelektrischen Punkt,

Verfahren hinzu. pH 5,3, ausgefällt. Das Produkt wurde dann getrocknet

Die erfindungsgemäß im pH-Bereich zwischen 4,1 und papierchromatographisch untersucht,
und 6,3 erzielbare erhöhte Ausbeute ist aus den graphi- Die aus 24 ähnlichen Versuchen erhaltenen Aussehen Darstellungen 1 bis 4 erkennbar. Diese zeigen beuten, wobei insgesamt 6 verschiedene Pankreasanschaulich die Ergebnisse von vier durchgeführten 35 proben verwendet wurden, wurden jeweils mit der Versuchsreihen. Auf der Ordinate wurden jeweils die aus dem Kontrollversuch erhaltenen Ausbeute verAusbeuten in Prozent und auf der Abszisse die ver- glichen, wobei beim Kontrollversuch ein wäßriger schiedenen pH-Werte der Extrakte aufgetragen. Ge- äthanolischer Extrakt mit Diäthyläther extrahiert arbeitet wurde hierbei mit der auf S. 4 der Erfindungs- und anschließend am isoelektrischen Punkt wie oben beschreibung genannten Carboxymethylcellulose, die 40 ausgefällt und untersucht wurde (s S. S. R a η d a 11, eine theoretische Kapazität von 0,7 mÄquiv./g hatte. Biochim. Biophys. Acta 1964, 90, 472). Bei der besten Diese war in allen vier Versuchen auf einen pH von Probe war die Ausbeute an Insulin 60% höher als 5,9 eingestellt. beim Kontrollversuch und bei der schlechtesten 47 %

Die mit Hilfe des bekannten Eindampfverfahrens höher, wobei die mittlere Zunahme 36% rnit einer

erhaltene Ausbeute wurde zum Vergleich als 100% 45 geschätzten Fehlergrenze im Mittel von ±2,2% war.

gewählt. . .

Aus den graphischen Darstellungen ist deutlich Beispiel l

zu erkennen, daß im pH-Bereich zwischen 4,1 und 6,3 In einer Reihe weiterer Versuche wurde der äthanoli-

eine erhöhte Ausbeute erhalten wird. sehe Extrakt nach dem im Beispiel 1 beschriebenen

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von 50 Verfahren mit der Abwandlung behandelt, daß das

Beispielen näher beschrieben. Adsorbens in 62,5 Volumprozent Alkohol suspendiert

. -I₁ wurde, der mit Salzsäure auf pH 5,9 eingestellt war,

Beispiel 1 nachdem es seine Natrium- und Wasserstoff-Formen

100 g Carboxymethylcellulose, wie sie bei den vor- durchlaufen hatte und die überschüssige Säure entstehend beschriebenen Versuchen Verwendung fand, 55 fernt war.

wurde in Wasser suspendiert, absitzen lassen und Die aus 28 Versuchen erhaltenen Ausbeuten waren

feinteilige Materialien durch wiederholtes Dekantieren bei Verwendung von 6 Pankreasproben 11 bis 31 %

entfernt. Das Adsorbens wurde dann zyklisch über höher als solche, die beim Kontrollversuch erhalten

seine Natrium- und Wasserstoff-Formen geführt, wurden.

indem es nacheinander in 0,1 N Natriumhydroxid 60 Beispiel 3
und 0,1 N Salzsäure gebracht wurde. Überschüssige

Säure wurde durch Waschen mit destilliertem Wasser In einer Reihe weiterer Versuche wurde der äthanoli-

bis zur Neutralität entfernt. Anschließend wurde sie sehe Extrakt wie in dem im Beispiel 1 beschriebenen

zur Einstellung des Gleichgewichts etwa^ 30 Minuten Verfahren mit der Abwandlung behandelt, daß das

lang in neutrales 62,5volumprozentiges Äthanol ein- 65 durch Ausfällung am isoelektrischen Punkt erhaltene

gegeben. Der Alkohol wurde durch Filtrieren über Rohinsulin durch Kristallisation in einem Zitrat-

einen gesinterten Glastrichter entfernt und das Adsor- puffer bei pH 5,8 in Gegenwart von Zink einer weiteren

bens in 62,5volumprozentigem Äthanol, das mit Reinigung unterzogen wurde.

Das aus 6 Versuchen erhaltene kristalline Insulin hatte, bei Verwendung von zwei Pankreasproben, eine durchschnittliche Wirkung von 23,51.-Einheiten/ mg gegenüber dem Durchschnitt von 22,11.-Einheiten/ mg beim Kontrollversuch. Die Ausbeuten waren 40 bis 47% höher als die des Kontrollversuchs.

Beispiel 4

100 g Carboxymethylcellulose, wie sie unter der Bezeichnung CM11 von der Firma W. & R. Baiston Ltd. vertrieben wird, wurde in 31 0,1 N wäßrigem Natriumhydroxid suspendiert und etwa 15 Minuten gerührt. Nach Filtrieren und Waschen mit Wasser wurde das Adsorbens wieder in 0,3 M Phosphorsäure suspendiert, weitere 15 Minuten gerührt und erneut filtriert und mit Wasser gewaschen. Das Adsorbens, nunmehr in der Säureform, wurde in 64 Volumprozent Äthanol suspendiert und die Suspension mit Phosphorsäure auf pH 4,5 eingestellt. Man ließ so lange stehen, bis der pH keine weitere Wiedereinstellung erforderte, und das gepufferte Adsorbens wurde abfiltriert und über Nacht luftgetrocknet.

Das so hergestellte Adsorbens wurde mit 65 Volumprozent äthanolischem Extrakt (5 Liter) von Rinderpankreas (750 g), welche Phosphorsäure (etwa 24 g) enthielt, nach der Entfernung einer Ausfällung bei pH 5,9 und Wiedereinstellung auf pH 4,5 gerührt. Wenn kein weiteres Polypeptid durch Zugabe von Picrinsäure zu der überstehenden Lösung feststellbar war, wurde das Adsorbens filtriert, mit 3mal 500 ml Äthanol, das 5% Methanol enthielt, gewaschen und über Nacht luftgetrocknet.

Das Insulin wurde aus dem Adsorbens mit 0,1 N Salzsäure (3mal 1 Liter) eluiert. Das Eluat wurde dann mit einer gesättigten Lösung von Picrinsäure (4,5 Liter) behandelt und das abgetrennte Picrat mit Salzsäure in Aceton in das Hydrochlorid umgewandelt. Das Hydrochlorid des Insulins wurde dann weiter gereinigt durch die übliche Ausfällung beim isoelektrischen Punkt und Kristallisation in Gegenwart von Zinkchlorid. Es wurde kristallines Insulin mit 47001.-Einheiten/kg Pankreas erhalten.

Wenn eine andere Probe des gleichen äthanolischen Extraktes unter verringertem Druck verdampft wurde, anschließend das Fett abfiltriert, in das Picrat überführt und das Insulin wie oben kristallisiert wurde, war die Ausbeute 31001.-Einheiten kristallines Insulin/kg Pankreas.

Beispiel5

In einer Reihe weiterer Versuche wurde der äthanolische Extrakt nach dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren mit der Abwandlung verarbeitet, daß das Adsorbens und die Lösung auf pH 3,5 bzw. 7,5 eingestellt wurden, wobei die Ausbeuten 80 und 85% der Ausbeute waren, die nach dem herkömmlichen, in dem zweiten Teil des Beispiels 4 beschriebenen Kontrollversuch erhalten wurden. verfahren, wie im zweiten Teil des Beispiels 4 beschrieben, erhalten wurden.

Beispiel 7

In einer Reihe vergleichender Versuche wurden Extrakte von 100g Pankreas mit 80Volumprozent Äthanol, mit dem Gehalt an Phosphorsäure wie im Beispiel 1, in zwei gleiche Anteile geteilt. Die ersten Anteile wurden behandelt und die Produkte nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren papierchromatographisch auf Insulin untersucht.

Die zweiten Anteile wurden mit 5 N Ammoniak einzeln auf pH 5,9 eingestellt, nach Zugabe eines Äquivalents von 20 g Trockengewicht Carboxymethylcellulose (CM 11), die vorausgehend auf pH 3,1 equilibriert war, und das Gemisch 90 Minuten unter gelegentlichem Rühren und Wiedereinstellen auf pH 5,9 stehengelassen. Die Gemische wurden dann wie im Beispiel 1 filtriert, gewaschen, eluiert usw.

Die Ergebnisse waren wie folgt:

60

Beispiel 6

In einer Reihe weiterer Versuche wurde der äthanolische Extrakt nach dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren mit der Abwandlung behandelt, daß das für das Waschen des Adsorbens verwendete Lipoidlösungsmittel Chloroform, Dichlormethan, Dichloräthylen, Methanol, n-Propanol oder iso-Propanol war. Die erhaltenen Ausbeuten waren alle höher als diejenigen, die nach dem herkömmlichen Kontroll-

	Ergebnisse (J. -Einheiten Insulin/g Pankreas)	Verfahren ohne Filtrieren bei pH 5,9
Versuch Nr.	Verfahren wie im Beispiel 1	7,1
1	5,8	6,7
2	4,7	7,5
3	5,0	9,0
4	5,1
Mittlere		7,6 ± 0,50
Ausbeute	5,1 ± 0,17
± Fehler
grenze
Mittlere
Wirkung des
Rohproduktes		6,3 ± 0,6
<X-E./mg)	11,8 ± 0,7

Beispiel 8

10 g Carboxymethylcellulose (CMIl), die zur Entfernung von pulverigem Material behandelt wurde, wurde in 0,1 N Natriumhydroxidlösung (250 ml) suspendiert. Die Suspension wurde in eine Chromatographiekolonne (Durchmesser 25,4 mm) gegossen, wobei darauf geachtet wurde, die Bildung von Schichten durch Rühren der Suspension mit einem Glasstab in der Kolonne zu vermeiden.

Überschüssige Natriumhydroxidlösung wurde aus der Kolonne, soviel als möglich, abgelassen, 0,03 M Phosphorsäure (250 ml) und anschließend ein alkoholischer Ammoniumphosphat-Puffer (500 ml) durch die Kolonne mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min durchgeführt.

Der alkoholische Ammoniumphosphat-Puffer wurde hergestellt durch Ansäuern von 65 Gewichtsprozent/ Volumprozent Äthanol mit Phosphorsäure auf eine Molarität von 0,03 M, Einstellen des pH auf 4,5 mit wenigen Tropfen 35%igem Ammoniak pro 500 ml Lösung und 30 Minuten langem Rühren der Lösung zur Entlüftung.

Ein alkoholischer Pankreasextrakt (1 Liter mit dem Gehalt von ungefähr 4,8 g Phosphorsäure) wurde wieder mit einer 10%igen Phosphorsäurelösung auf pH 4,5 eingestellt nach Entfernung des Unlöslichen bei pH 5,9.

Man ließ den Extrakt durch die oben hergestellte

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Kolonne mit einer Geschwindigkeit von 1,5 ml/min Kolonne (Durchmesser 152,4 mm, Höhe 1,52 m) durchlaufen. Das Adsorbens wurde dann mit 65°/₀igem gegossen. Die Natriumhydroxidlösung wurde dann neutralem Alkohol (250 ml), technischem absolutem auf das Niveau des Adsorbens abgeleitet, und man· Alkohol (250 ml), der 5% Methanol enthielt, und ließ 0,03 M Phosphorsäure (60 Liter) mit einer Fließdestilliertem Wasser (500 ml) mit einer Geschwindig- 5 geschwindigkeit von 251/Std. durchlaufen, keit von ungefähr 10 ml/min gewaschen. 65 Gewichtsprozent/Volumprozent Äthanol

Das Insulin wurde aus der Kolonne mit 0,1 N (150 Liter), angesäuert mit Phosphorsäure auf eine

Salzsäure mit einer Geschwindigkeit von 1,5 ml/min Konzentration von 0,03 M, wurde mit 35%igem

eluiert, das Eluat in 5 ml Anteilen gesammelt und Ammoniak auf pH 4,8 eingestellt. Man ließ die so

der Proteingehalt mittels UV.-Adsorption bei einer io erhaltene Pufferlösung durch die Kolonne mit einer

Wellenlänge von 280 πιμ gemessen. Der Peak nahm Geschwindigkeit von 251/Std. durchlaufen. Der pH

einen Elutionsbereich von 20 ml ein. Die kombinierten der abfließenden Pufferlösung sollte am Ausgang

Lösungen dieses Bereichs wurden mit einer gesättigten 4,8 sein.

Lösung von Picrinsäure (30 ml) behandelt und das Ein alkoholischer Pankreasextrakt (300 Liter), wie

ausgefällte Picrat zu dem kristallinen Insulin nach 15 er im Beispiel 8 erhalten wurde, wurde mit Phosphor-

dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren verarbeitet. säure auf pH 4,8 eingestellt, nachdem das bei pH 5,9

Das Ergebnis zeigte, daß ungefähr 80% des in dem Ausgefällte entfernt war. Man ließ durch die Kolonne

alkoholischen Extrakt enthaltenen Insulins in dem mit einer Geschwindigkeit von 251/Std. durchlaufen.

Eluat vorhanden war. Die Kolonne wurde dann nacheinander mit 65%igem

In einem weiteren Versuch wurden der Extrakt und 20 Äthanol (50 Liter), 85%igem Äthanol (50 Liter) und

die Kolonne auf pH 5,0 eingestellt, aber sonst die Wasser (100 Liter), alle mit einer Geschwindigkeit

Adsorption und Eluierung wie oben durchgeführt. von 251/Std., gewaschen.

90% des in dem alkoholischen Extrakt enthaltenen Das Insulin wurde aus der Kolonne mit 0,1 M Salz-Insulins waren in dem Eluat vorhanden. säure bei einer Fließgeschwindigkeit von 81/Std. ... 25 eluiert und die proteinhaltige Bande durch UV.- ü ei spiel y Adsorption bei einer Wellenlänge von 280ηιμ be-

4 kg Carboxymethylcellulose, welche zur Entfer- stimmt und gesammelt.

nung von pulverigem Material behandelt war, wurde Das Eluat wurde geprüft, und es zeigte sich, daß

in 0,1 M Natriumhydroxid (30 Liter) suspendiert. 92 bis 100% des anfangs im Extrakt vorhandenen

Nach Rühren wurde die Aufschlämmung in eine 30 Insulins im Eluat gewonnen wurden.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1 2

extrakt kann ein oder mehrere organische Lösungs-Patentanspruch: mittel wie z. B. niedere Alkohole und Aceton enthalten. Das Eluieren des Insulins erfolgt mit einer

Verfahren zur Gewinnung von Insulin durch wäßrigen säure- oder salzhaltigen Lösung.
Adsorption des Insulins aus rohen, ein organisches 5 Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird Lösungsmittel und Wasser enthaltenden Pankreas- der angegebene pH der Lösung, die überwiegend orgaextrakten an Carboxymethylcellulose und Elution nische Lösungsmittel enthält, durch Messen des pH des Insulins, dadurch gekennzeichnet, mit einer Glaselektrode gegen eine Kalomelbezugsdaß man die Adsorption des Insulins bei einem elektrode bestimmt, die vorher mit wäßrigen StandardpH von 4,1 bis 6,3 mit einer auf diesen pH ein- io puffern geeicht wurde.

gestellten Carboxymethylcellulose vornimmt und Das erfindungsgemäße Verfahren kann zweckmäßig

die insulinhaltige Carboxymethylcellulose vor der zur direkten Reinigung des rohen Insulinextraktes Elution des Insulins mit einem Lipoidlösungsmittel der Pankreas verwendet werden, der hauptsächlich behandelt. ein organisches Lösungsmittel, im allgemeinen 60-

15 bis 80%iges Äthanol, angesäuert mit Salz-, Schwefel-

oder Phosphorsäure enthält, und einen pH von etwa 3

aufweist. Bevor der Extrakt mit Carboxymethylcellulose in Kontakt gebracht wird, muß der pH,

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewin- beispielsweise mit Ammoniak, auf einen höheren nung von Insulin. ao als den oben angegebenen Wert eingestellt werden.

Bekannt ist ein Verfahren zur Gewinnung von Wenn der Extrakt bei einem pH, der sogar höher Insulin, bei dem das Pankreasgewebe von Rindern als 6,3 ist, vor der Adsorption filtriert werden muß, oder Schweinen mit angesäuertem wäßrigem Alkohol muß die klare Lösung anschließend mit einer geeigneten oder Aceton extrahiert wird. Der Extrakt kann an- Säure auf den für die Adsorption erforderlichen pH schließend im Vakuum zur Entfernung des organischen 25 eingestellt werden.

Lösungsmittels und zur Abtrennung der so unlöslich Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann

gemachten Lipoide konzentriert werden. Wahlweise jedes wasserunlösliche Carboxymethylcellulose-Adsorkönnen das Lösungsmittel und die Lipoide mit einem bens verwendet werden. Beispielsweise kann eine mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert handelsübliche Carboxymethylcellulose mit einer theowerden. Das Rohinsulin wird sodann mit Natrium- 30 retischen Kapazität von 0,7 mÄquiv./g verwendet chlorid aus dem wäßrigen Konzentrat ausgefällt und werden.

durch Ausfällung an seinem isoelektrischen Punkt, Es ist wichtig, daß der pH-Wert des Adsorbens

bei etwa pH 5,3, oder durch Auskristallisieren aus vorher im wesentlichen auf denjenigen der Lösung verschiedenen Puffer-Systemen in Gegenwart von oder des Extrakts eingestellt wird, woraus das Insulin Zink einer weiteren Reinigung unterzogen. Es wird 35 entfernt werden soll. Im allgemeinen erfolgt diese angenommen, daß besonders in den frühen Verfah- Einstellung dadurch, daß man das Adsorbens in eine rensstufen beträchtliche Verluste auftreten; gleich- Lösung einer Säure in einem Lösungsmittel-System wohl sind Versuche, dieselben zu vermeiden und die gibt, das mit der Insulinlösung oder -extrakt identisch Ausbeute zu verbessern, bisher nicht erfolgreich oder ähnlich ist, und anschließend Ammoniak hinzugewesen. 40 fügt, bis der gewünschte pH erreicht ist. Vorzugsweise Es ist ferner aus der japanischen Patentschrift ist die für diesen Zweck verwendete Säure eine schwache 6492/63 ein Verfahren bekannt, Rohinsulin durch Säure, die Puffereigenschaften hat, oder eine mehr-Adsorption aus einer wäßrigen Lösung an Carboxy- wertige Säure, wie z. B. Phosphor- oder Zitronensäure, methylcellulose bei einem pH-Wert zwischen 2 und 4 Die Adsorption des Insulins kann chargenweise und nachfolgendem Eluieren mit einer Säure oder 45 durchgeführt werden, unter Verwendung eines oder einer Salzlösung zu reinigen. Die Adsorption von mehrerer Anteile des Adsorbens und Abtrennen dieser Insulin aus einem wäßrigen System an Carboxymethyl- Anteile von der Lösung, nach Einstellung des Gleichcellulose bei einem pH von etwa 3,3 wurde auch schon gewichts. Dies wird so oft wiederholt, bis kein Insulin von L.F.Smith, Biochim.Biophys.Acta, 1964, mehr in der Lösung festgestellt werden kann. Bei 82, S. 231 bis 236, beschrieben. Diese Verfahren 50 Verwendung des obenerwähnten Adsorbens mit einer leiden jedoch an dem Nachteil, daß mit ihrer Hilfe theoretischen Kapazität von 0,7 mÄquiv./g wurde die Verluste nicht ausgeglichen werden können, die das Äquivalent von etwa 20 bis 40 g (Trockengewicht) während der frühen Verfahrensstufen aufgetreten pro 100 g Pankreas als ausreichend befunden. Wahlsein können, und schaffen selbst keine Bedingungen weise kann das Adsorbens auch in Form einer Kolonne, für eine wirksame Extraktion. 55 Platte oder Schicht verwendet werden, und die Ad-Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb sorption oder das nachfolgende Eluieren kann durch ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Insulin. geeignete Arbeitsweisen, die auf dem Gebiet der Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, bei Chromatographie bekannt sind, durchgeführt werden, dem das Insulin aus rohen, ein organisches Lösungs- Nachdem das Insulin auf der Carboxymethylcellumittel und Wasser enthaltenden Pankreasextrakten 60 lose zurückbehalten wurde, können Lipoide und an Carboxymethylcellulose adsorbiert und eluiert andere Verunreinigungen zweckmäßig durch ein wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die gegenüber Insulin unschädliches Lipoidlösungsmittel, Adsojpijon ,de? Insulins bei einem pH von 4,1 bis 6,3, das das Insuün von dem Adsorbens nicht eluiert, vorzugsweise bei einem-pH-zwischen 4,5 und 5,9, entfernt werden. Beispiele solcher Lösungsmittel sind mit einer auf diesen pH eingestellten Carboxymethyl- 65 Chloroform, Dichloräthylen, Dichlormethan oder die cellulose vornimmt und die insulinhaltige Carboxy- niederen Alkohole mit oder ohne etwas Wasser, methylcellulose vor der Elution des Insulins mit einem Obgleich die meisten dieser Lösungsmittel geeignet Lipoidlösungsmittel behandelt. Der rohe Pankreas- sind, werden solche, die mit Wasser mischbar sind,