DE2138848C3

DE2138848C3 - Verfahren zur Abtrennung von Glucagon aus Pankreas-Extrakten

Info

Publication number: DE2138848C3
Application number: DE2138848A
Authority: DE
Inventors: Milton Reynolds Indianapolis Ind. Smith (V.St.A.)
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1970-08-03
Filing date: 1971-08-03
Publication date: 1980-07-17
Also published as: NL172235C; DK126359B; GB1356427A; CA962590A; DE2138848A1; AU450307B2; US3715345A; ZA714873B; NL7110671A; AU3155771A; JPS5550959B1; NL172235B; SE378067B; DE2138848B2

Description

Bei der Gewinnung von Insulin aus Pankreasdrüsen fällt als Nebenprodukt auch Glucagon an, bei dem es sich um einen sehr interessanten hyperglykämischen Faktor handelt. Hierbei durchläuft das Glucagon zusammen mit dem Insulin die einzelnen Vorreinigungsstufen und wird selbst erst am Ende des Insulinverfahrens gewonnen. Während der Insulinextraktion wird das chemische Milieu jedoch bei für die Insulinisolierung optimalen Bedingungen gehalten und wenig auf eine Verhinderung von Glucagonverlusten geachtet, wobei außerdem in jedem Verfahrensschritt kleine Mengen Glucagon verlorengehen. Könnte man das Glucagon daher in einem frühen Abschnitt des Insulinreinigungsverfahrens abtrennen, dann ließen sich hierdurch die Glucagonverluste stark verringern.

Die meisten bekannten technischen Methoden, die für die Isolierung und Reinigung von Insulin zur Verfügung stehen, sind zur Trennung von Insulin und Glucagon nun jedoch leider ungeeignet. Sie beeinträchtigen jeweils die Ausbeuten an Glucagon und/ oder Insulin, wobei sich eine Abtrennung von Glucagon von anderen proteinartigen Pankreasnebenprodukten auch negativ auf die Reinheit und Ausbeute an Insulin auswirken kann. Zu solchen Verfahren gehören (1) die in US-PS 1520673 beschriebene isoelektrische Fällung von Insulin bei etwa pH 5 bis 5,5; (2) das aus US-PS 24490/6 bekannte Säureextraktions- und differentielle Aussalzverfahren für Insulin, das zuerst von Lautenschlager und Linder beschrieben wurde, und (3) das Ionenaustauschverfahren unter Verwendung eines Carboxylkationenaustauschharzes gemäß US-PS 2878159 oder das Ionenaustauschverfahren nach US-PS 3069323 unter Einsatz eines Aminocelluloseanionenaustauschhar-

zes.

In Chem. Abstracts 70, Referat 34712 (1969) wird bereits ein Verfahren zur Trennung von Insulin und Glucagon durch eine Kombination aus Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration beschrieben. Zu diesem Zweck adsorbiert man Insulin und Glucagon bei einem pH-Wert von 4,5 bis 5,0 an ein in einer Säule befindliches Ionenaustauschharz, wäscht das in der Säule vorhandene Material mit 60%igem Alkohol und dann mit Wasser und eluiert das Ganze anschließend mit 20%igem Aceton bei pH 6,4. Das Eluat, welches Insulin und Glucagon enthält, wird hierauf angesäuert und dann zur Auftrennung und weiteren Reinigung in bekannter Weise einer Gelfiltration [J. Biol. Chem. 235, Seite 2294 (I960)] unterzogen. Dieses Verfahren hat demnach den Nachteil, daß bei ihm sowohl Insulin als auchGlucagon zu Anfang an das Ionenaustauscherharz adsorbiert und somit gemeinsam durch diese Verfahrensstufe mitgezogen werden; eine alleinige Adsorption des an sich gewünschten Glucagons von Beginn des Verfahrens an ist hierdurch somit nicht möglich. Die Auftrennung der beiden Substanzen erfolgt hierbei vielmehr erst bei der abschließenden Stui'e der Gelfiltration. Dies hat nicht nur einen erhöhten Verfahrensaufwand zur Folge, sondern ergibt auch vermehrt Verluste an gewünschtem reinen Glucagon.

Im Chem. Abstracs 70, Referat 103295 (1969), wird ein Verfahren zur Isolierung von reinem Insulin und Glucagon beschrieben, das in einer Agargelelektrophorese von Gemischen aus Insulin und Glucagon unter Verwendung von 1.2%igem Agar in Triethanolaminhydrochlorid - NaOH bei pH 7,4 besteht, wobei sich die beiden Hormone infolge ihrer unterschiedlichen isoelektrischen Punkte (pH 5,39 bzw. pH 7,07) in entgegengesetzte Richtungen bewegen. Dieses Verfahren stellt jedoch - ähnlich wie die Blättchengelelektrophorese - nur eine rein analytische Trennmethode dar, die sich großtechnisch nicht anwenden läßt und auch nicht ohne weiteres in ein großtechnisches Trennverfahren umgewandelt werden kann.

Aus Chem. Ber. 101, Seiten 3664 bis 3670 (1968), ist ein Verfahren zur Reinigung von synthetisch hergestelltem Rohglucagon durch Gelfiltration unter Arbeiten bei einem pH-Wert von etwa 3 (verdünnte Essigsäure) bekannt. Einer solchen Aufarbeitung von synthetischem Rohglucagon liegt jedoch eine ganz andere Problematik zugrunde als einer Abtrennung von Glucagon aus Pankreas-Extrakten, so daß im letzten Fall auch grundlegend andere Maßnahmen angewandt werden müssen, was sich unter anderem im Einsatz eines Ionenaustauschverfahrens statt einer Gelfiltration und einem Arbeiten bei anderen pH-Werten äußert. Die für das erstgenannte Verfahren geltenden Bedingungen lassen sich somit nicht auf ein Verfahren zur Gewinnung von Glucagon aus Pankreas-Extrakten übertragen.

Es gibt daher bisher kein Verfahren, durch das sich Glucagon aus Pankreas-Extrakten in einem frühen Abschnitt bei der Abtrennung und Reinigung von Insulin abtrennen läßt, um auf diese Weise sowohl übermäßige Glucagonverluste als auch jede nachteilige Wirkung auf Ausbeute oder Reinheit des schließlich erhaltenen Insulins zu vermeiden. Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, diesem Nachteil abzuhelfen, und diese Aufgabe wird durch das in den Ansprüchen gekennzeichnete Verfahren nun erfindungs-

gemäß gelöst.

Das vorliegende Verfahren ermöglicht die Isolierung von Glucagon aus Lösungen, die Glucagon und Insulin gemeinsam sowie gegebenenfalls andere PoIypeptidsubstanzen ähnlicher Art enthalten. Es eignet sich besonders zur Abtrennung von Glucagon aus ersten fettfreien hohen Konzentraten des Insulinverfahrens, die Glucagon, Insulin und andere insulinähnliche Polypeptide enthalten. Das Glucagon wird dabei bevorzugt adsorbiert, während das Insulin und andere Pankreasenzyme sowie andere proteinartige Stoffe im Abfluß verbleiben.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in der Praxis vorzugsweise folgendermaßen durchgeführt: Durch Behandlung zerkleinerter Pankreasdrüsen mit saurem wäßrigen Ethanol bei pH 2 und anschließende Abtrennung des Extrakts von jeglichem unlöslichen Material durch Filtration wird ein saurer wäßrig-alkoholischer Extrakt von Pankreas-Drüsen hergestellt. Zur Herstellung de>. sauren Ethanols geeignete Säuren sind beispielsweise Phosphorsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure. Als Extraktionslösungsmittel ist zwar Äthanol angegeben, doch läßt sich statt dessen selbstverständlich auch jedes andere flüchtige und mit Wasser mischbare Lösungsmittel verwenden. Die erhaltene saure Lösung wird durch Eindampfen unter Vakuum zur Entfernung des Ethanois eingeengt. Zu diesem Zeitpunkt trennt sich etwas Fett ab, und der alkoholische Extrakt wird davon durch Dekantieren und/oder Filtrieren abgetrennt. Die so bereitete saure wäßrige Lösung entliäit sowohl Insulin als auch Glucagon. Der pH-Wert dieser Lösung wird auf einen Wert im Bereich von 7 bis 8 eingestellt, und die Lösung wird auf ein sulfoniertes weitmaschiges Styrol-Divinylbenzol-Copolymer in der Alk&.i- oder Erdalkalimetallform, vorzugsweise als Kaliumsalz (als Handelsprodukt Amberlite® 200 erhältlich), aufgegeben. Um das Harz in die Salzform umzuwandeln, wird es vor dem Gebrauch beispielsweise gegen ein Kaliumsalz wie Kaüumphosphat bei etwa pH 7,5 äquilibriert. Das rohe Konzentrat wird auf die Harzfüllung bei einer Temperatur unter etwa 5° C aufgegeben. Die Lösung des rohen Konzentrats, die durch die Kolonne hindurchgeht, wird zur Gewinnung von Insulin nach den üblichen technischen Methoden weiter verarbeitet. Das Harz mit darauf adsorbiertem Glucagon wird mit einem geeigneten Puffer, vorzugsweise einem Phosphatpuffer, bei pH 7 bis 8 weiter gewaschen. Diese Waschlösungen werden zu den Insulinverfahrenslösungen gegeben. Das Waschen des Harzes mit dem gleichen Puffer wird so lange fortgesetzt, bis in der Waschlösung keine merkliche Proteinmenge mehr enthalten ist, wie sich an fehlender UV-Absorption bei 280 nm zeigt. Dann wird das Glucagon von dem Harz mit Ammoniumhydroxid oder einer anderen Base, wiij Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid oder Trimethylammoniumhydroxid, eluiert. Diese Eluierung wird vorzugsweise durchgeführt, indem man 0,1 η Ammoniumhydroxid durch die Harzfüllung leitet, das Harz und das Eluiermittel bis zu 2 Stunden äquilibriert und dann soviel 0,1 η Ammoniumhydroxid durch die Harzfüllung schickt, daß praktisch das gesamte Glucagon eluiert wird. Hierauf wird der pH-Wert des Eluais auf einen Wert im Bereich von 2 bis 3 eingestellt und das Glucagon durch Zugabe von Natriumchlorid ausgefällt. Der Nieaerschlag wird abfiltriert und der erhaltene Salzkuchen als Ausgangsmaterial für irgendein übliches Glucagonreinigungsverfahren venvendet, wie es beispielsweise in Sei. 117, Seite 628 (1953) beschrieben wird. Durch das folgende Beispiel wird das erfindungsgemaß.' Verfahren weiter erläutert.

Beispiel

45,4 kg zerkleinerter Rinderpankreas werden mit 65%igem sauren wäßrigen Ethanol bei pH 3,2 (0,02 m Phosphorsäure) zwei Stunden lang extrahiert, worauf das feste Material durch Filtration entfernt wird. Der pH-Wert des Extrakts wird mit NH₄OH auf 8,2 eingestellt, wodurch Ammoniumphosphatsalze ausgefällt werden, die ebenfalls durch Filtration entfernt werden. Dann wird der pH-Wert des Filtrats mit verdünnter Schwefelsäure auf 3,6 eingestellt, und die erhaltene Lösung wird durch Eindampfen im Vakuum eingeengt. Fett, das sich von der Lösung beim Verdampfen des Alkohols trennt, wird durch Dekantieren abgetrennt. Das erhaltene Konzentrat hat ein Volumen von 41 Liter. Das Konzentrat wird mit 5 η Kaliumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt und dann durch zwei Kolonnen mit je 4 Liter sulfoniertem weitma-

J-) schigenStyrol-Divinylbenzol-CopolymerharzinForm des Kaliumsalzes (die Kolonnen wurden vorher bei pH 7,5 gegen 0,005 m Kaliumphosphatpuffer äquil^;-briert) bei einer Temperatur unter 5⁰C geleitet. Das Konzentrat wurde mit einer Geschwindigkeit vor 200 ml/Minute durch die Kolonnen geleitet. Anschließend wurden die Kolonnen mit 16 Liter 0,005 m Phosphatpuffer mit pH 7,5 gewaschen, und die Waschlösungen wurden zur Verwendung in einem Insulinreinigungsverfahren beiseite gestellt. Das adsorbierte Glucagon wurde von dem Harz durch Durchleiten von 8 Liter 0,1 η Ammoniumhydroxid durch die Harzfüllung eluiert, dann wurden das Eluiermittel und das Harz zwei Stunden lang äquilibriert, und schließlich wurde das Eluieren durch Durchleiten von 16 Liter 0,1 η Ammoniumhydroxid durch die Harzfüllung beendet. Das Eluat wurde mit starker Säure auf pH 2,5 eingestellt und durch Zugabe von festem Natriumchlorid auf einen Natriumchloridgehalt von 15% gebracht, wodurch das Glucagon ausgefällt wurde. Bis zu 97% des in dem rohen Konzentrat gefundenen Glucagons wurden in dem Eluat mit 0,1 η Ammoniumhydroxid gewonnen.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Abtrennung von Glucagon aus Pankreas-Extrakten, die außer Glucagon Insulin und insulinähnliche Polypeptide enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man

A) den Extrakt in eine im wesentlichen wäßrige Lösung überführt und diese auf einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 8 einstellt,

B) die gemäß A) hergestellte Lösung bei einer Temperatur unter etwa 5 ° C über die Alkalioder Erdalkalimetallform eines sulfonierten weitmaschigen Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren leitet,

C) das Harz mit darauf adsorbiertem Glucagon mit einer Pufferlösung bei pH 7 bis 8 wäscht und hiernach

D) das Glucagon mit einer verdünnten wäßrigen Lösung einer Base eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung gemäß A) auf pH 7,5 einstellt, diese Lösung über die Kaliumforrn eines sulfonierten weitmaschigen Styrol-DivinylbenzoI-Copolymeren leitet und das Glucagon mit 0,1 η Ammoniumhydroxid eluiert.