DE1492044C - Verfahren zur Gewinnung von Insulin aus Pankreasextrakt - Google Patents

Description

aus einer Lösung einer durch wiederholte fraktionierte Aussalzung praktisch vollkommen von Ballastproteinen befreiten Proteinfraktion.

Es wurde nunmehr gefunden, daß die vorstehend geschilderten Schwierigkeiten bei der Entfernung der fettartigen Bestandteile und bei der damit verbundenen Herabsetzung des Gehalts an organischem Lösungsmittel vermieden werden, wenn man die Gewinnung von Insulin aus dem Extrakt, der durch Extraktion von Pankreas mit einem sauren Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel gewonnen und gegebenenfalls von fettartigen Bestandteilen befreit worden ist, mit Hilfe von Metallionen, welche die Kristallisierung von Insulin fördern, wie Zn²+, Cd²+, Fe²+, Ni²+, Co²+, Cu²+ und Mn²+, insbesondere von Zinkionen, erfindungsgemäß derart durchführt, daß man die Metallionen dem Extrakt zusetzt, den durch Ammoniak- oder Alkalilaugezugabe entstehenden Niederschlag in verdünnter Säure aufnimmt, gegebenenfalls die fettartigen Bestandteile abfiltriert und das Insulin aus dieser sauren Lösung bzw. aus dem sauren Filtrat in an sich bekannter Weise gewinnt.

Die Erfindung beruht demnach auf dem Gedanken, die Fällung von Insulin mittels bestimmter Metallionen, die bisher als letzter Schritt des Insulingewinnungsverfahrens vorgenommen wurde, nunmehr als ersten Schritt nach der Gewinnung des Pankreasextraktes vorzunehmen und erst danach die übliche Aufarbeitung, z. B. durch Aussalzen, folgen zu lassen.

Es ist einer der überraschenden Aspekte der vorliegenden Erfindung, daß auch aus einer äußerst verdünnten Insulinlösung die insulinhaltige Proteinfraktion quantitativ gefällt werden kann, wodurch es möglich ist, das Entfernen der fettartigen Bestandteile ohne besondere Vorsichtsmaßnahmen mit jedem beliebigen bekannten Verfahren durchzuführen.

Der Extrakt wird in üblicher Weise dadurch erhalten, daß gemahlenes Pankreas innig, vorzugsweise mehrmals, mit einer Extraktionsflüssigkeit vermischt wird. Gemäß den bekannten Extraktionsverfahren wird dabei Äthanol als organisches Lösungsmittel verwendet, und die Flüssigkeit wird zweckmäßig mit Salzsäure angesäuert. Es können aber auch andere Säuren, wie z. B. Essigsäure, Oxalsäure oder Zitronensäure, und andere organische Lösungsmittel, wie z. B. Methanol oder Aceton, verwendet werden. Die Konzentrationen des organischen Lösungsmittels und der zugesetzten Säure werden meistens so gewählt, daß eine Extraktionsflüssigkeit erhalten wird, die einen Gehalt von 60 bis 80% des organischen Lösungsmittels und einen pH-Wert von 2 bis 3,5 hat. Bei Verwendung von Alkohol können jedoch auch niedrigere Konzentrationen verwendet werden. Die Menge der Extraktionsflüssigkeit schwankt gewöhnlich zwischen der zwei- bis siebenfachen Gewichtsmenge des verwendeten Pankreas. Wird ein wenig selektives Extraktionsverfahren durchgeführt, wie z. B. das Verfahren mit Alkohol-Salzsäure, so wird gewöhnlich zunächst ein Teil des Ballastproteins dadurch entfernt, daß der Extrakt, z. B. durch Zusatz von Ammoniak, neutralisiert oder alkalisch gemacht und der erhaltene Niederschlag abfiltriert wird.

Das Pankreas, von dem ausgegangen wird, enthält gewöhnlich 65 bis 75°/₀ Wasser, während der Trockenstoff, in Abhängigkeit von der Tierart und von der Güte des Pankreas, eine größere oder kleinere Menge Fette oder fettartige Stoffe enthält. Bei Verwendung von Rinderpankreas können pro Kilogramm verwendetem Pankreas etwa 20 bis 50 g dieser fettartigen Stoffe, die im wesentlichen aus Fettsäuren und Lipoiden bestehen, in den Extrakt gelangen; bei Schweinepankreas können diese Mengen erheblich höher sein. Es ist ein Vorteil der Erfindung, daß diese fettartigen Stoffe auf beliebige Weise abgetrennt werden können. Wenn die fettartigen Stoffe nicht vorher aus dem Extrakt entfernt werden, werden sie bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit der Proteinfraktion in Form von Seifen ausgefällt, da diejenigen Metalle, die bekanntlich die Kristallisation von Insulin fördern können, außerdem unlösliche fettsaure Salze liefern. Dies muß bei der Wahl der zuzusetzenden Metallionen berücksichtigt werden. Aus dem erhaltenen Niederschlag von Proteinen und fettsauren Salzen kann die insulinhaltige Fraktion mit angesäuertem Wasser, z. B. verdünnter Salzsäure, gelöst werden.

Mit Rücksicht auf die schwierige Filtrierbarkeit dieser fettsauren Salze ist es jedoch vorzuziehen, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zunächst, d. h. vor der Fällung der Proteinfraktion, die fettartigen Stoffe aus dem Extrakt zu entfernen. Dieses Entfernen des Fettes kann durch beliebige bekannte Verfahren, z. B.

durch Erniedrigung der Konzentration des organischen Lösungsmittels durch Destillation oder durch Verdünnung mit Wasser, und darauffolgende Filtration des Extraktes durchgeführt werden.
Wie bereits erwähnt, kann nach der vorliegenden Erfindung auch aus einer äußerst verdünnten Insulinlösung die insulinhaltige Proteinfraktion quantitativ gefällt werden. Dies bringt den Vorteil mit sich, daß es möglich ist, zum Entfernen des Fettes auch das sehr einfache Verfahren der Verdünnung des organischen Lösungsmittels mit Wasser durchzuführen. Es wird z. B. dem annähernd 70 °/_oigen äthanolischen Extrakt eine gleiche Menge Wasser zugesetzt, worauf die ausgeschiedenen fettartigen Stoffe durch Filtration entfernt werden.

Außerdem wurde gefunden, daß die fettartigen Stoffe auch sehr zweckdienlich aus dem Extrakt entfernt werden können, indem Ca- oder Mg-Ionen zugesetzt werden, wobei nur die fettartigen Stoffe und nicht die insulinhaltigen Proteine gefällt werden.

Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß das Volumen der Extraktionsflüssigkeit nicht vergrößert zu werden braucht, während im Gegensatz zu dem Verfahren, bei dem Fettsäure und insulinhaltige Proteine gleichzeitig niedergeschlagen werden, nur einmal ein Seifennieder-

Co schlag abfiltriert zu werden braucht.

Im allgemeinen wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren von einer Flüssigkeit ausgegangen, die pro Kilogramm Pankreas etwa 2 bis 101 organisches Lösungsmittel enthält und in der etwa 5 bis 25 g proteinartige Stoffe gelöst sind. Aus dieser Proteinfraktion können in Abhängigkeit von der Güte des Pankreas 2000 bis 5000 I. E., d. h. 80 bis 200 mg, reines Insulin gewonnen werden, wobei diese Flüssigkeit gegebenenfalls auf eine der vorstehend beschriebenen Weisen von den fettartigen Stoffen befreit worden ist.

Aus dieser Flüssigkeit wird durch Zusatz von Metallionen derjenigen Gruppe von Metallen, welche die Kristallisierung von Insulin fördern, eine Proteinfraktion (gegebenenfalls gemischt mit Metallsalzen der Fettsäuren der gelösten fettartigen Bestandteile des Pankreas) gefällt, die zwar nur etwa die Hälfte bis ein Fünftel der Gesamtmenge des Proteins der Lösung

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enthält, aus der jedoch das gesamte Insulin gewonnen B e i s D i e 1 I

wird. Auf diese Weise wird bereits eine erste Anreicherung an Insulin in der aufzuarbeitenden Protein- 100 kg gefrorener, gemahlener Rinderpankreas wird fraktion erzielt. mit 2501 Alkohol und Salzsäure derart extrahiert, daß Es ist äußerst überraschend, daß aus einer Pankreas- S während der Extraktionszeit von 4 Stunden die Alkoholextraktionsflüssigkeit, aus der maximal 200 mg, unter konzentration (Äthanol) auf 65 °/₀ und der pH-Wert normalen Verhältnissen 5 bis 20 mg Insulin pro Liter auf etwa 2,5 eingestellt wird.

gewonnen werden kann, in der wenigstens die fünf- Nach Ausscheidung des Extraktes wurde das

fache, meistens mindestens die zwanzigfache Menge Pankreasresiduum mit 2501 65 °/_oigem Alkohol gean Eiweißen und eiweißartigen Bestandteilen gelöst io waschen und mit Salzsäure ebenfalls auf einen pH-Wert ist, mittels dieser Metallionen die insulinhaltige Frak- von 2,5 gebracht. Nach Abscheidung des zweiten Extion quantitativ gefällt werden kann. traktes wurden die beiden Extrakte vereinigt. Durch

Die Metallionen können auf jede geeignete Weise Zusatz von Ammoniak wurde der pH-Wert der Flüssigin die Lösung gebracht werden, z. B. auch, bei Ver- keit auf 7,5 bis 8,5 gebracht und darauf wurde der erwendung der sich leicht in Säure lösenden Metalle wie 15 haltene Niederschlag abfiltriert. Dem Extrakt wurde, Zink und Cadmium, durch Zusatz des Metalls zum nachdem er wieder mit Salzsäure auf einen pH-Wert sauren Extrakt oder durch Zusatz von Oxyden oder von 2,5 gebracht worden war, ein annähernd gleiches Hydroxyden. Vorzugsweise werden jedoch im Extrakt Volumen Wasser zugesetzt, worauf die frei gewordenen lösliche Salze der Metalle verwendet, wobei von den fettartigen Stoffe von der Lösung abfiltriert wurden. Metallen Eisen, Kobalt, Nickel, Kupfer und Mangan 20 I_n der Extraktionsflüssigkeit von etwa 10001 mit diejenigen Salze verwendet werden müssen, in denen einem Äthanolgehalt von 30 bis 35°/₀ ergab eine Stickdiese Metalle in zweiwertiger Form vorhanden sind. stoffanalyse einen Proteingehalt von schätzungsweise Diese Salze können z. B. Salze der Salzsäure, Schwefel- etwa 400 g.

säure oder Essigsäure sein. Nach Zusatz des Metalls Diesem sauren Extrakt wurde eine mit Salzsäure

zum sauren Extrakt wird durch Zusatz von Lauge, von 25 angesäuerte Lösung von 625 g Zinkchlorid in 1,5 1 Ammoniak oder von einer Pufferfiüssigkeit der pH- Wasser zugesetzt. Darauf wurde mittels Ammoniak Wert auf 5 bis 7,5 erhöht. Die minimal erforderliche der pH-Wert der Flüssigkeit auf 6 erhöht. Es lagerte Menge des zugesetzten Metalls ändert sich mit dem sich eine Proteinfraktion von etwa 160 g ab. Nach Atomgewicht des Metalles und mit dem Protein- und Abfiltrieren wurde dieser Niederschlag in 20 1 Wasser gegebenenfalls dem Fettsäuregehalt der Lösung. Für 30 aufgenommen, worauf der Suspension so lange konjeden Einsatz kann gegebenenfalls festgestellt werden, zentrierte Salzsäure zugesetzt wurde, bis der gesamte ob eine hinreichende Menge Metall zugesetzt worden Niederschlag gelöst und der pH-Wert 2,5 bis 3 betrug, ist, indem das Filtrat des Niederschlags wieder ange- Aus dieser Flüssigkeit konnte auf bekannte Weise, säuert wird, wieder Metall zugesetzt und der pH-Wert z. B. durch fraktioniertes Aussalzen durch isoelekwieder auf 5 bis 6 gebracht wird. 35 trische Präzipitation und Kristallisierung mittels Zink,

Bei Rinderpankreasextraktionsflüssigkeit, die durch 17 g Insulin mit einer biologischen Aktivität von Verwendung von mit Salzsäure angesäuertem Alkohol 25 I. E. pro mg gewonnen werden, erhalten ist, wobei vorher durch alkalische Lagerung

ein Teil der Ballastproteine entfernt und das Fett Beispiel II

durch Verdünnung, Destillation oder Zusatz von Ca- 40 Durch Extraktion von 1 kg gefrorenem, gemahlenem oder Mg-SaIz abgeschieden worden ist, ergibt sich, Rinderpankreas mittels Aceton wurden 51 einer daß pro Kilogramm eingesetztem Pankreas etwa 1 g Extraktionsflüssigkeit erhalten, die 60°/₀ Aceton entZink oder etwa 2 g Zinkchlorid ausreicht. Da ein hielt und mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 4 anÜberschuß an Metallionen nicht störend wirkt, wird gesäuert wurde und in der etwa 30 g fettartige Subvorzugsweise eine größere Menge zugesetzt, z. B. 45 stanz aus dem Pankreas und etwa 20 g Protein gelöst 3 g Zn²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Fe²⁺, Cu²⁺ oder Mn²⁺ oder war. Dieser Flüssigkeit wurde 40 g Cadmiumchlorid 5 bis 6 g Cd²⁺. Wird nicht vorher entfettet, so sind in 200 ml mit Salzsäure angesäuertem Wasser zugebedeutend größere Metallmengen erforderlich, z. B. setzt, worauf der pH-Wert durch Natronlauge auf 7 10 bis 30 g Zink pro Kilogramm eingesetztem Pankreas. gebracht wurde. Der Niederschlag wurde filtriert und Ähnlich wie bei der Kristallisation von Insulin wird 50 darauf unter Rühren in 11 Wasser aufgenommen, bei dieser Proteinablagerung vorzugsweise Zinksalz Der Suspension wurde, ebenfalls unter Rühren, verwendet, da Zink ein im Pankreas natürlicherweise langsam Salzsäure zugesetzt, bis der pH-Wert der vorkommendes Metall ist und somit im allgemeinen Lösung 3 betrug. Das Gemisch wurde darauf wieder bei der Insulinkristallisation üblicherweise benutzt filtriert, und durch Aussalzen mit Natriumchlorid wird und sehr gute Ergebnisse liefert. 55 und weiter durch bekannte Verfahren wurde 150 mg

Der erhaltene Niederschlag wird auf bekannte Weise Insulin mit einer biologischen Aktivität von 25 I. E. z. B. durch Zentrifugieren oder Filtrieren, gesammelt pro mg gewonnen, und dann in verdünnter Säure aufgenommen. Der B e i s ο i e 1 III

Niederschlag wird z. B. zunächst unter Rühren in

Wasser suspendiert, worauf, ebenfalls unter Rühren, 60 Aus 1 kg Schweinepankreas wurde mittels eines mit eine Säure zugesetzt wird, bis der pH-Wert 2 bis 3 Salzsäure angesäuerten Äthanol-Wasser-Gemisches 51 beträgt. Ist das Fett vorher entfernt worden, so wird eines Extraktes erhalten, der 60°/₀ Äthanol enthält, eine nahezu klare Lösung erhalten. Wenn nicht, so einen pH-Wert von 2,5 hatte und in dem außer etwa wird aus dem Gemisch von fettsauren Salzen und 15 g Protein auch 35 g fettartige Substanz aus dem Proteinen die Proteinfraktion gelöst und durch FiI- 65 Pankreas gelöst war.

tration gereinigt. Aus der sauren, wässerigen Lösung Dieser Flüssigkeit wurde Calciumchlorid und eine

der Proteinfraktion kann durch bekannte Verfahren solche Menge Ammoniak zugesetzt, daß der ρH-Wert das Insulin in reiner Form gewonnen werden. etwa 8 betrug, worauf der erhaltene Niederschlag

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abfiltriert wurde. Das Filtrat wurde mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 5,9 gebracht. Der Niederschlag

wieder auf einen pH-Wert von 2,5 gebracht. Dem wurde abfiltriert und darauf in 600 ml 0,01 η Salzsäure

Filtrat wurde eine mit Salzsäure angesäuerte Lösung aufgenommen. Aus dieser Lösung konnten nach Aus-

von 10 g Cuprichlorid in 50 ml Wasser zugesetzt, und salzen mittels Natriumchlorid 144 mg reines Insulin

die Flüssigkeit wurde durch Zusatz von Ammoniak 5 durch bekannte Verfahren hergestellt werden.

Claims (1)

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Apparatur und führt dennoch, sogar bei der größten Sorgfalt in der Durchführung, eine partielle Denatu-Patentanspruch: rierung des Insulins herbei.

Außerdem lösen sich in diesen organischen Lösungs-

Veifahren zur Gewinnung von Insulin aus einem 5 mitteln fettartige Stoffe aus den Drüsen, die sich bei Extrakt, der durch Extraktion von Pankreas mit Verringerung der Alkohol- oder Acetonkonzentration einem sauren Gemisch aus Wasser und einem mit wieder ablagern. Zum Entfernen dieser fettartigen BeWasser mischbaren organischen Lösungsmittel ge- standteile aus dem Extrakt muß die Destillation unterwonnen und gegebenenfalls von fettartigen Be- brochen werden, nicht nur, weil das Abdestillieren des standteilen befreit worden ist, mit Hilfe von io organischen Lösungsmittels bei Anwesenheit dieser Metallionen, welche die Kristallisierung von In- ungelösten fettartigen Stoffe erschwert wird, sondern sulin fördern, wie Zn²⁺, Cd² *", Fe^{2 h}, Ni^{2 h}, Co²¹-, besonders auch, weil dieses Gemisch fremder Bestand-Cu²⁺ und Mn²⁺, insbesondere von Zinkionen, teile auch Stoffe enthält, die bei einer niedrigen Alkodadurch gekennzeichnet, daß man hol- oder Acetonkonzentration in wässerigem Milieu die Metallionen dem Extrakt zusetzt, den durch 15 eine zersetzende Wirkung auf das Insulin ausüben. Ammoniak- oder Alkalilaugezugabe entstehenden In der britischen Patentschrift 566 351 wird ein VerNiederschlag in verdünnter Säure aufnimmt, ge- fahren beschrieben, bei dem die vorgenannten Schwiegebenenfalls die fettartigen Bestandteile abfiltriert rigkeifen vermieden werden sollen. Dabei werden aus und das Insulin aus dieser sauren Lösung bzw. aus einem alkoholischen Pankreasextrakt zunächst die dem sauren Filtrat in an sich, bekannter Weise ge- 20 fettartigen Stoffe durch Herabsetzung des Alkoholwinnt. ' gehalts ausgefällt, was entweder durch Hinzufügen von

Wasser oder durch Abdestillieren von Alkohol erfolgen kann. Aus. diesem so vorgereinigten Extrakt

wird dann das Insulin durch Zusatz von Pikrinsäure

25 ausgefällt. Diese Ausfällung ist jedoch sehr abhängig von dem Alkoholgehalt der Insulinlösung. So kann z. B. das Insulin nur dann nahezu quantitativ aus einer

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung 1 °/_oigen Lösung gefällt werden, wenn diese höchstens von Insulin aus einem Extrakt, der durch Extraktion 33 bis 34 % Alkohol enthält. Schon eine Erhöhung des von Pankreas mit einem sauren Gemisch aus Wasser 30 Alkoholgehalts um 1 % führt zu einer unvollständigen und einem mit Wasser mischbaren organischen Insulinfällung, während weiterhin bei einem Gehalt Lösungsmittel gewonnen und gegebenenfalls von fett- von 36,8% Alkohol in der Insulinlösung nur noch artigen Bestandteilen befreit worden ist, mit Hilfe von 38% des Insulingehalts ausgefällt werden. Als weiterer Metallionen, welche die Kristallisierung von Insulin Nachteil ergibt sich bei dem vorstehend beschriebenen fördern, wie Zn^2f, Cd²·-, Fe²⁺, Ni^2f, Co²⁺, Cu²^ und 35 Verfahren der britischen Patentschrift, daß das ausge-Mn²⁺, insbesondere von Zinkionen. fällte Pikrat nur schwierig und mit großen Verlusten

Bekanntlich wird Insulin aus gemahlenem Pankreas, wieder in Lösung gebracht werden kann.
z. B. von Pferden, Schweinen oder Rindern, gewöhn- Es ist ferner bekannt, die Kristallisation von Insulin

lieh mittels eines angesäuerten Gemisches aus Wasser aus Lösungen durch Zusatz eines der Metalle Zn, Cd, und einem organischen Lösungsmittel, z. B. einem 40 Co, Ni, Fe, Cu oder Mn zu fördern. Diese Metalle Alkohol-Äthanol, Methanol— oder Aceton, extrahiert. müssen dabei in einer gegenüber dem vorhandenen Zwar kann die Extraktion auch mittels Wasser durch- Insulin geringen Menge, z. B. von 0,5 bis 50 Gewichtsgeführt werden, aber dabei tritt eine sehr starke Zer- prozent, der konzentrierten Insulinlösung zugesetzt setzung des Insulins auf, da die proteolytischen En- werden.

zyme aus dem Pankreas in aktiver Form auch in den 45 Es werden z. B. sauren, wäßrigen Lösungen von Extrakt aufgenommen werden. Einerseits wird diese Insulin, die mindestens 0,5 g Insulin pro Liter entZersetzung von Insulin durch die Verwendung von halten, Salzlösungen der vorerwähnten Metalle zuge-Alkohol oder Aceton auf ein Mindestmaß herab- setzt, wobei diese Metalle in zweiwertiger Form vorgesetzt, andererseits bringt gerade die Verwendung handen sind, worauf der pH-Wert der Lösung durch dieser organischen Flüssigkeiten wieder Schwierig- 5° Zusatz von Lauge oder Ammoniak auf 5 bis 6 erkeiten mit sich. Aus der Extraktionsflüssigkeit wird höht wird. Auf diese Weise werden Insulinkristalle ernämlich nach etwaiger Reinigung der erste das Insulin ' halten, die etwa 0,4% des Metalles enthalten. Es enthaltende Niederschlag durch Aussalzen, gewöhnlich werden auch zur Herstellung von Insulinkristallen mit durch Zusatz von Natriumchlorid bis zu einer 30 %igen einem höheren Metallgehalt größere Metallmengen Konzentration, erhalten, wobei ein Aussalzkuchen er- 55 dem in Wasser aufgenommenen Insulin zugesetzt, halten wird, der aus einer Proteinfraktion besteht, die z. B. bis 500 Gewichtsprozent in bezug auf die Insulinlediglich dann, wenn die Extraktionsflüssigkeit hin- menge. Wie jedoch auch in der niederländischen reichend frei von organischen Lösungsmitteln wie Patentschrift 84 723 beschrieben ist, hängt die Aus-Alkohol oder Aceton ist, die ganze oder nahezu ganze beute an kristallinem Insulin bei diesem Kristalli-Menge an extrahiertem Insulin enthält". Alkohol- 60 sationsverfahren von der Reinheit des gelösten Insulins konzentrationen von etwa 2% setzen die Ausbeute ab, und Insulinlösungen, bei denen die gelöste Proteinan Insulin bei diesem Aussalzverfahren bereits erheb- menge eine biologische Aktivität von weniger als lieh herab. Es ist daher notwendig, bevor das Insulin 50 I. E. pro mg hat, ergeben gewöhnlich eine weniger aus der Extraktionsrlüssigkeit auf übliche Weise ge- zufriedenstellende Ausbeute.

sammelt werden kann, zunächst das organische 65 Diese bekannte Ausnutzung der die Kristallisation Lösungsmittel zu enlfernen, was gewöhnlich durch von Insulin fördernden Metalle erfolgt daher lediglich Destillation bei niedriger Temperatur und niedrigerem am Ende der bekannten Insulinhcrstellungsvcrfahren, Druck eifolyt. Dieser Vorgang erfordert eine teure /. H. nach der isodcktrisihun Prä/ipitntion von Insulin