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Verfahren zur Darstellung von -wasserstoffübertragenden Co-Enzymen
Unter Co-Enzymen wird der aus einem niedrigmolekularen Wirkungsstoff bestehende
Teil eines Enzymkomplexes verstanden, der in Verbindung mit hochmolekularen Eiweißstoffen,
den sogenannten Zwischenfermenten, beim Oxydationsvorgang in der Zelle dem Inhalt
Wasserstoff zu entziehen vermag und in seiner hydrierten Form von einem zweiten
in einer höheren Oxydationsstufe vorliegenden Zellenzym, dem gelben Oxydationsenzym,
oxydiert wird. Dieses zweite Enzym ist autoxydabel und wird nach Abgabe des Sauerstoffes
an den in der hydrierten Form vorliegenden Enzymkomplex vom Sauerstoff der Luft
reoxydiert und vermag so den ersten Enzymkomplex von neuem zu oxydieren.
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Derartige wasserstoffübertragende Co-Enzyme sind in der Natur weitverbreitet.
So hat man sie bereits aus tierischem und pflanzlichem Material, wie Herzmuskel,
roten Blutzellen, Hefe u. dgl., isoliert. Die bisher gewonnenen Co-Enzyme sind jedoch
stets mehr oder weniger durch Begleitstoffe verunreinigt gewesen.
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Es wurde nun gefunden, daß man nach folgendem Verfahren Co-Enzyme
so weit reinigen kann, daß ihre katalytische Wirksamkeit auf keine Art mehr zu steigern
ist. Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man ein auf irgendeine Art
und Weise vorgereinigtes Ausgangsmaterial tierischen und pflanzlichen Ursprunges,
zweckmäßig ein solches vom Reinigungsgrad von etwa 0,3, in saurer Lösung
in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel durch Zusatz von mit Wasser nichtmischbaren
Lösungsmitteln ausfällt.
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Die Vorreinigung kann unter Benutzung der an sich für die Abtrennung
von Eiweißstoffen bekannten Extraktions- und Fällungsverfahren erfolgen. So kann
man einen aus Hefe, Blut o. dgl. erhaltenen Extrakt zunächst mit entsprechenden
Mengen eiweißfällender Mittel, wie Quecksilberacetat u. dgl., von einem großen Teil
des Eiweißes befreien. Eine weitere Abtrennung von Verunreinigungen kann darauf
z. B. durch Überführung derselben in in Wasser schwer lösliche oder unlösliche Salze,
wie z. B. die Bariumsalze, oder auf andere Art und Weise erfolgen.
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An diese auf irgendeine Art und Weise durchgeführte Vorreinigung,
bei der zweckmäßig ein Zwischenprodukt vom Reinigungsgrad 0,3 erhalten wird,
schließt sich dann die erfindungsgemäße Behandlung an, die zu einer Abtrennung sonst
schwer oder überhaupt
nicht entfernbarer Verunreinigungen führt.
Dabei fällt das Co-Enzym aus, während die Begleitstoffe in Lösung bleiben.
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Als mit Wasser mischbare Lösungsmittel kommen vor allem Säure enthaltende
Alkohole in Frage. Besonders geeignet ist Methanol mit einem Zusatz von Säure, wie
z. B. H C1, H, S 04, Toluolsulfosäure, Naphthalinsulfosäure u. dgl., wobei
darauf zu achten ist, daß die Säurekonzentration nicht zu hoch ist und die Temperatur
möglichst niedrig, d. h. um o° herum, gehalten wird, da sonst Inaktivierung des
Co-Enzyms eintritt. Als mit Wasser nichtmischbares Fällungsmittel hat sich besonders
Essigester bewährt; doch kann man auch Äther, Petroläther u. dgl. verwenden.
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Die Nachbehandlung eines nach dem beanspruchten Verfahren erhaltenen
hochwertigen Co-Enzyms kann ebenfalls in beliebiger Art und Weise erfolgen. So kann
man das Co-Enzym über seine Salze mit Alkaloiden. Mercuro- und Bleisalzen, Phosphorwolfrainsäure
und anderen Verbindungen, die mit ihnen schwer lösliche Salze zu bilden vermögen,
weiterreinigen.
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Wesentlich ist jedoch, daß zwischen Vor-und Nachbehandlungsstufe das
erfindungsgemäße Verfahren der Ausfällung des Co-Enzyms mit Hilfe von mit Wasser
nichtmischbaren Lösungsmitteln aus angesäuerten Lösungen in mit Wasser. mischbaren
Lösungsmitteln eingeschaltet wird, da, wie erwähnt, nur hierdurch sonst nicht oder
nur äußerst schwierig und mit Hilfe komplizierter Methoden entfernbare Verunreinigungen
abgetrennt werden können. Gerade durch diese Maßnahme unterscheidet sich das vorliegende
Verfahren von dem bekannten Verfahren der Abscheidung des Co-Enzyms sowie auch von
ähnlichen Verfahren zur Abscheidung anderer Enzyme. So ist z. B. in der französischen
Patentschrift 765687 ein Verfahren zur Herstellung des gelben Oxydationsenzyms
bzw. seiner eiweißfreien, gefärbten Komponente beschrieben, nach dem tierisches
und pflanzliches Zellmaterial, wie es auch für die Gewinnung des Co-Enzyms nach
vorliegendem Verfahren in Frage kommt, mit angesäuerten organischen, mit Wasser
mischbaren und Wasser enthaltenden Lösungsmitteln extrahiert wird. Der so erhaltene
Extrakt wird dann aber nicht mit Wasser nichtmischbaren Lösungsmitteln gefällt,
sondern nach dem Abdampfen der mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wird
die verbleibende wäßrige Lösung durch Alkalischmachen und Belichten oder Stehenlassen
oder Erwärmen nach dem Ansäuern mit mit Wasser nichtmischbaren Lösungsmitteln extrahiert.
Dann wird lediglich der Lösungsmittelextrakt weiterverarbeitet, während der Extraktionsrückstand
unberücksichtigt bleibt. Abgesehen davon, daß also das Verfahren dieser Patentschrift
wesentlich verschieden ist von dem beanspruchten Verfahren, ist ein weiterer Unterschied
darin zu sehen, daß kein vorgereinigtes Produkt dem letzteren unterworfen wird,
sondern der ursprüngliche, nicht vorgereinigte Hefe- o. dgl. Extrakt in wäßrigen,
mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln.
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Im folgenden sei an Hand eines Beispiels die Reinigung und Isolierung
eines wasserstoffübertragenden Co-Enzyms aus roten Blutzellen beschrieben. In diesen
roten Blutzellen ist der Reinheitsgrad des Co-Enzyms ungefähr o,oooo5, während das
gereinigte Co-Enzym den Reinheitsgrad i aufweist, d. h. bei dem im nachfolgenden
beschriebenen Reinigungsverfahren wird eine Reinigung -um das 2o ooofache erzielt.
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Beispiel i. Schritt: Acetonextrakt Pferdeblut wird zentrifugiert,
die Zellen werden mit o,9o/oiger Kochsalzlösung gewaschen und dicht zusammenzentrifugiert.
ioo 1 Zellen werden mit aoo 1 Wasser cytolysiert und sofort nach der Cytolyse mit
300 1 Aceton gefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit,
die das Co-Enzym enthält; wird mit einem ihr gleichen Volumen Aceton versetzt, der
Niederschlag wird durch Faltenfilter abgetrennt. Das Filtrat, das das Co-Enzym enthält,
wird unter vermindertem Druck auf 1/s seines Volumens eingeengt, wobei das Aceton
bis auf einige Prozente entfernt wird. Das Volumen des Acetonextraktes beträgt dann
etwa 22o 1.
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2. Schritt: Fraktionierung mit Mercuriacetat Prinzip: Gibt man zu
der schwach essigsauren Lösung des Acetonextraktes Mercuriacetat, so fällt zunächst
ein Niederschlag, der viel Substanz, aber fast kein Co-Enzym enthält. Mit mehr Mercuriacetat
fällt aus dem Filtrat alles Co-Enzym. Die zur Fraktionierung geeigneten Mengen Mercuriacetat
werden durch eine Vorprobe ermittelt.
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Vorprobe: Zu So ccm Acetonextrakt gibt man o,i ccm zweifach normale
Essigsäure, wodurch die Reaktion schwach lackmussauer wird, dann i ccm io°/oiges
HgAcetat, wodurch Fraktion I fällt, die abzentrifugiert wird. Zugabe von i ccm HB-Acetat
und Zentrifugieren werden noch dreimal wiederholt, so daß man vier Fraktionen erhält,
die getrennt in Wasser suspendiert und mit
H, S
zerlegt werden.
Nach dem Waschen der HgS-Niederschläge mit Wasser wird jedes Filtrat auf 25 ccm
aufgefüllt. Die Prüfung der vier Filtrate ergibt z. B.:
| 0,5 ccm der Fraktion I verbraucht in zo Minuten =,2 cmm O.: |
| 0,5 - - - Il - - =o - 25 - 02 |
| 0,5 - - - III - - 10 - 29,7 - 02 |
| 0,5 - - - IV - - =o - 7,5 - 02 |
| Summe 63,4 cmm 02 |
| in 2 ccm Filtrat = z ccm Acetonextrakt. |
0,0038 mg Co-Enzym vom Reinheitsgrad I verbraucht in io Minuten 4,5 cmm O2. Die
Hauptmenge des Co-Enzyms war also in den beiden mittleren Fraktionen.
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In 5o ccmAcetonextraktwar
-0,0038-50 = o,268 mg- Co-Enzym vom Reinheitsgrad i, in 220 1 Acetonextrakt also
. o,268 i i 8o mg Co-Enzym vom Reinheitsgrad i. Vorschrift: Zu' 22o 1 Acetonextrakt
(aus ioo 1 Pferdeblutzellen) gibt man 0,441 zweifach normale Essigsäure-und 4,41
zoo/oige Hg-Acetatlösung, entfernt den Niederschlag, der sehr wenig Co-Enzym enthält,
mit der Sharpless-Zentrifuge und fällt die Lösung mit 121 ioo/oigem HgAcetat. Nach
etwa 12 Stunden, wenn sich der Niederschlag gesenkt hat, wird die überstehende Flüssigkeit
abgehebert. Der Niederschlag, der das Co-Enzym enthält, N@ ird dicht zusammenzentrifugiert,
in 2 1 Wasser zerteilt und mit HLS auf der Schüttelmaschine zerlegt. Das ÜgS wird
abzentrifugiert und dreimal mit Wasser gewaschen. Das Filtrat vom Hg S und das erste
Waschwasser fällt man mit dem 31/2fachen Volumen Aceton, läßt einige Stunden stehen,
zentrifugiert und wäscht den Niederschlag, der das Co-Enzym enthält, auf der Zentrifuge
mit reinem Aceton. Dies ist Fraktion A.
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Die Mutterlaugen der Acetonfällung und das zweite und dritte Waschwasser
des Hg S dampft man unter vermindertem Druck auf 300 ccm ein, fällt mit dem
31/2fachen Volumen Aceton, löst den Niederschlag, der viel Co-Enzym enthält, in
5 1 Wasser, fällt mit o,271 ioo/oigem Hg-Acetat, zerlegt den Niederschlag wie oben
mit Schwefelwasserstoff, engt das Filtrat des Hg S und die Waschwässer unter vermindertem
Druck auf 2o ccm ein, fällt mit dem 31/2fachen Volumen Aceton das Co-Enzym und wäscht
den Niederschlag auf der Zentrifuge mit reinem Aceton. Dies ist Fraktion B.
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Aus 220 1 Acetonextrakt (ioo 1 Pferdeblutzellen) wurden so erhalten:
4740 mg Fraktion A v om Reinheitsgrad o, 17,
i 2 5o mg Fraktion B vom Reinheitsgrad
o, i i, zusammen also 599o mg Co-Enzym vom mittleren Reinheitsgrad O,157 oder 943
mg vom Reinheitsgrad i.
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3. Schritt: Abtrennung der in Wasser schwer löslichen Bariumsalze
Prinzip: Phosphorsaures Barium und die Bariumsalze von Stoffen, wie Diphosphorglycerinsäure,
sind in Wasser schwer löslich, das Bariumsalz des Co-Enzyms ist in Wasser leicht
löslich, wird aber aus seiner wäßrigen Lösung durch Alkohol gefällt. Um aus dem
Bariumsalz das freie Co-Enzym zu gewinnen, fällt man die wäßrige Lösung des Bariumsalzes
mit Mercuriacetat und zerlegt das Ouecksilbersalz mit H2 S. Mit Aceton fällt aus
dem Filtrat des HgS das Co-Enzym. Es enthält meistens etwas Barium.
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Vorschrift: 5990 mg Co-Enzym vom mittleren Reinheitsgrad 0,i57 (aus
22o 1 Acetonextrakt, aus ioo 1 Pferdeblutzellen) werden in 50o ccm Wasser gelöst
und mit 53 ccm 20'/,igeln Bariumacetat gefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert
und mit 5o ccm einer 2°/oigen Bariumacetatlösung gewaschen. Die überstehende Flüssigkeit,
die das Co-Enzym enthält, und die Waschflüssigkeit werden gereinigt und mit kalt
gesättigter Barytlösung versetzt, bis die Farbe der Flüssigkeit in Gelb umschlägt
(PH etwa g), wozu etwa 5o ccm Barytlösung notwendig sind. Es entsteht ein zweiter
Niederschlag von Coenzymfreien Barytsalzen, der abzentrifugiert und mit
50 ccm 2o/oigem Bariumacetat gewaschen wird. Die überstehende Flüssigkeit,
die das Co-Enzym enthält, wird mit der Waschflüssigkeit vereinigt und mit dem dreifachen
Volumen Alkohol versetzt, wodurch das Bariumsalz des Co-Enzyms (mit anderen Barytsalzen)
niedergeschlagen wird. Man löst den Niederschlag in i 1 Wasser, fällt das Co-Enzym
mit 7 g Mercuriacetat, zentrifugiert, wäscht mit o,5o/oigem Hg-Acetat, suspendiert
den Niederschlag in Wasser, zerlegt ihn mit Ho S, zentrifugiert das HgS ab, wäscht
es mit Wasser, dampft das Filtrat vom HgS und die Waschwässer unter vermindertem
Druck auf 2o ccm ein, fällt das Co-Enzym mit dein dreifachen Volumen Aceton und
wäscht es auf der Zentrifuge mit reinem Aceton.
Aus 599o mg Co-Enzym
vom mittleren Reinheitsgrad 0,i57 wurden so 2ooo mg Co-Enzym vom Reinheitsgrad
0,322 erhalten = 644 mg Co-Enzym vom Reinheitsgrad i.
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4. Schritt: Fällung mit Essigester aus salzsaurem Methanol Prinzip:
Das Co-Enzym ist in Methanol vollständig unlöslich, löst sich aber, wenn der Alkohol
eine starke Säure enthält (Salzsäure, Schwefelsäure, Toluolsulfosäure, Naphthalinsulfosäure
usw.). Ist die Säure nicht zu stark und die Temperatur niedrig, so tritt in der
sauren alkoholischen Lösung, die möglichst wasserfrei -sein soll, keine Inaktivierung
des Co-Enzyms ein. Aus der sauren alkoholischen Lösung schlägt Essigester das Co-Enzym
nieder, während Begleitsubstanzen, vor allem Adenylsäure, in Lösung bleiben.
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Vorschrift: 500 mg Co-Enzym vom Reinheitsgrad 0,322
werden bei o° mit Methanol, das in bezug auf Salzsäure n/io ist, verrieben, wobei
sich, wenn das Methanol hinreichend wasserfrei ist, fast alles löst. Ein geringer
Rest wird schnell abzentrifugiert, die Überstehende Lösung wird sofort mit dem dreifachen
Volumen eiskalten Essigesters gefällt. Der flockige Niederschlag wird abzentrifugiert
und auf der Zentrifuge dreimal mit Essigester gewaschen, wobei darauf zu achten
ist, daß der Niederschlag beim Aufwirbeln mit Essigester jedesmal fein zerteilt
wird. Man trocknet im Vakuumexsikkator über Schwefelsäure und Kaliumhydroxyd.
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Aus 2ooo mg Co-Enzym vom Reinheitsgrad 0,322 (aus ioo 1 Pferdeblutzellen)
= 644 mg Co-Enzym vom Reinheitsgrad i wurden erhalten: 1150 mg Co-Enzym vom Reinheitsgrad
o,52 = 60o mg Co-Enzym vom Reinheitsgrad i.
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Dieses Präparat, das bereits um das toooofache konzentrierter ist
als die ursprünglich verwendeten Pferdeblutzellen, kann weiterhin noch gereinigt
werden, indem man es z. B. mit Bleiacetat fällt.
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5. Schritt: Fraktionierung mit Bleiacetat Prinzip: Aus einer Lösung
des Co-Enzyms in wäßriger normaler Essigsäure fallen mit Bleiacetat Verunreinigung
und ein Teil des Co-Enzyms. Aus der Mutterlauge dieser
| In Fraktion I und 1I =3z mg vom Reinheitsgrad o,623 |
| _ - III 261 - - _ =@o = 4=9 mg vom |
| - - IV 76 - - - =@o Reinheitsgrad I. |
Die Nachreinigung des aus seiner sauren methanolischen Lösung gefällten Co-Enzyms
vom Reinheitsgrad etwa o,,5 kann auch über Fällung schlägt Alkohol weitere Verunreinigungen,
vermischt mit Co-Enzym, nieder. Aus der Mutterlauge der Alkoholfällung scheidet
sich bei o° langsam ein körniges Pulver ab, das nicht kristallinisch ist, aber das
reinste Co-Enzym darstellt, das bisher erhalten wurde.
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Vorschrift: iooo mg Co-Enzym vom Reinheitsgrad o,52 werden in Zoo
ccm wäßriger n-Essigsäure bei Zimmertemperatur gelöst. Durch 32 ccm mol. Bleiacetatlösung
entsteht ein Niederschlag. Man stellt i Stunde in Eiswasser, zentrifugiert bei o°
und erhält Fraktion I der Bleisalze.
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Die Mutterlauge der Fraktion I erwärmt man auf 30°. Dann gibt man
unter Schütteln in feinem Strahl 6o ccm Alkohol hinzu, wobei ein Niederschlag fällt,
der abzentrifugiert wird. Die Temperatur fällt während des Zentrifugierens auf etwa
2o°. Dieser Niederschlag ist Fraktion II der Bleisalze.
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Fraktion III der Bleisalze erhält man, indem man die Mutterlauge der
Fraktion II 17 Stunden in den Eisschrank stellt und das ausgeschiedene Pulver bei
o° abzentrifugiert.
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Die Mutterlauge der Fraktion III erwärmt man auf 30°, gibt unter Schütteln
in feinem Strahl i20 ccm Alkohol hinzu, wobei die Flüssigkeit klar bleiben soll
oder sich nur eben trüben darf. Man stellt in den Eisschrank und zentrifugiert Fraktion
IV der Bleisalze nach 17 Stunden bei o° ab.
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Die Bleisalze werden nicht gewaschen. Man vereinigt die Fraktionen
I und II (da eine getrennte Verarbeitung nicht lohnt) und gewinnt folgendermaßen
aus den nunmehr 3 Teilen das freie Co-Enzym: jeder Teil wird mit io ccm Wasser fein
zerschüttelt. Dann wird mit H2 S zerlegt, zentrifugiert und das Pb S einmal
mit 5 ccm Wasser und zweimal mit 5 ccm n; i o-H N O3 gewaschen (beim Waschen mit
Wasser würde das Pb S kolloidal werden). Die Zersetzungs- und Waschflüssigkeiten
filtriert man in je 125 ccm eiskalten Alkohol, gibt etwa 2 ccm 2 n -H N 0S hinzu,
damit die Alkoholfällung flockig wird, dann noch je 50 ccm Äther, zentrifugiert
die ausgefallenen Niederschläge und wäscht sie auf der Zentrifuge gründlich (Entfernung
der H N 0g 1) mit absolutem Alkohol.
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Aus iooo mg Co-Enzym vom Reinheitsgrad
0,52 =
520 mg
Co-Enzym vom Reinheitsgrad i wurden erhalten: die Alkaloidsalze, Phosphorwolframate,
Mercurosalze und nach ähnlichen Methoden erfolgen. Zur Gewinnung des Co-Enzyms aus
seinen
Alkäloidsalzen, die in Wasser und auch in verdünntem Alkohol und Aceton leicht löslich
sind, geht man so vor, daß man z. B. 5o mg Brucinsalz in Zoo ccm Wasser löst, so
viel Mercuriacetat hinzufügt, daß die Lösung in bezug auf Mercuriacetat 2°/oig wird,
das ausgefallene Hg-Salz des Co-Enzyms abzentrifugiert, es mit o,5°/oiger Hg-Acetatlösung
wäscht und das Hg-Salz mit
H, S zerlegt. Das Filtrat vom HgS verdampft man
unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen, zentrifugiert nötigenfalls ausgeschiedenes,
vorher kolloidal gelöstes Hg S ab, fällt mit
| eine Fraktion I, wenn die H-Ionenkonzentration einer n/=o-Lösung
entspricht, |
| - - II aus der Mutterlauge von I, wenn die H-Ionenkonzentration
einer n/40-Lösung |
| entspricht, |
| - - III, wenn man die Mutterlauge von Fraktion II auf o° abkühlt, |
| - - IV aus der Mutterlauge von III, wenn die H-Ionenkonzentration
bis auf |
| n/7o-Lösung gesteigert wird. |
Um aus den Salzen das freie Co-Enzym zurückzugewinnen, löst man jede Fraktion in
2 ccm Wasser, fällt mit dem vierfachen Volumen Aceton (wobei das Co-Enzym ausfällt
und die Phosphorwolframsäure in Lösung bleibt), läßt einige Stunden bei o° stehen,
zentrifugiert bei o° klar und wäscht den blättrigen Niederschlag auf der Zentrifuge
mit reinem Aceton. Die so gewonnenen Co-Enzympräparate geben mit Zink und Salzsäure
keine Wolframreaktion.
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Bei der Reinigung über Mercurosalze geht man in folgender Weise vor-40
mg Co-Enzym werden in 2 ccm n/io-H N 03 gelöst und mit 2 ccm 5°/oiger Hg
N 02 Lösung (in n/io-H N 0,9) versetzt. Es .fällt ein Niederschlag, der sich beim
Erwärmen auf 35° vermindert. Man zentrifugiert die Fraktion I ab, gießt die noch
warme überstehende Lösung in ein Zentrifugierglas und kühlt i Stunde mit Eiswasser,
wobei Fraktion II als schwerer Niederschlag ausfällt, den man bei o° abzentrifugiert.
Ist das CO-Enzym vom Reinheitsgrad I, so besteht Fraktion II aus regelmäßigen, stark
lichtbrechenden Kugeln.
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Um das freie Co-Enzym zurückzugewinnen, gibt man zu jeder Fraktion
2 ccm n/io-H N 03,
leitet H2 S ein, zentrifugiert und gießt die überstehende
Lösung durch ein Faltenfilter in i o ccm eisgekühlten Alkohol. Sollte dabei das
Co-Enzym kollodial fallen, so gibt man zur Flockung noch einige Tropfen a n-H N
03.
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War das Ausgangsmaterial vom Reinheitsgrad o,6, so war Fraktion II
vom keinheitsgrad o,8.
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Wie man sieht, läßt sich die Vorreinigung und Nachreinigung des Co-Enzyms
auf veri_.e.. 1 xxr#__ e.._1 %'rdein dreifachen Volumen Aceton und wäscht
den Niederschlag auf der Zentrifuge mit reinem Aceton. Das so gewonnene Co-Enzym
gibt keine Brucinreaktion.
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Zur Reinigung über die Phosphorwolframate geht man in folgender Weise
vor: Löst man 25 mg Co-Enzym vom Reinheitsgrad o,5 bis i,o in 5 ccm Wasser und gibt
0,4 ccm 2o°/oige Phosphorwolframsäure hinzu, so fällt nichts. Macht man stärker
sauer, so entstehen Niederschläge, deren Menge von der Azidität und sehr wesentlich
von der Temperatur abhängt. Z. B. erhält man wendig ist jedoch, daß man nur solche
Reinigungsmethoden benutzt, bei denen kein Alkali zur Verwendung gelangt; denn das
Co-Enzym ist beständig gegen Säuren und unbeständig gegen Alkalien. In n/io-H Cl,
H2 S 04 oder H N O3 kann es bei Zimmertemperatur viele Stunden und bei o° viel länger
ohne Verlust an Wirkung aufbewahrt werden, während n/io-NaOH die katalytische Wirksamkeit
bei Zimmertemperatur in i Stunde vernichtet.
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Bemerkenswert ist auch die Tatsache, daß das Co-Enzym aus einigermaßen
reinen Lösungen, selbst wenn die Verdünnung i : ioo ooo ist, durch Mercuriacetat
vollständig gefällt wird, daß aber viele Salze die Empfindlichkeit dieser Reaktion
herabsetzen oder die Reaktion sogar völlig verhindern. Zu den störenden Salzen gehören
Natriumacetat und Natriumchlorid, zu den nichtstörenden Salzen Bariumacetat und
Calciumacetat.
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Co-Enzympräparate selbst lassen sich nach dem Trocknen im Vakuumexsikkator
über KO H und H2 S 04 jahrelang aufbewahren, wenn man die Aufbewahrung über Natronkalk
vornimmt.
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Über die Eigenschaften des CO-Enzyms sei folgendes ausgeführt: Co-Enzym
des Reinheitsgrades i ist sehr leicht löslich in Wasser, unlöslich in Alkohol und
Aceton und wird aus seiner wäßrigen Lösung durch Alkohol oder Aceton gefällt. Sind
die Co-Enzymlösungen verdünnt, so 'ist die Fällung kolloidal, wird aber flockig
bei Zusatz von etwas starker Säure (H Cl, H2 S 04, H N O3). Die wäßrige Lösung des
Co-Enzyms bläut Kongopapier. i mg Co-Enzym, gelöst in o,5 ccm Wasser, verbraucht
o,2 ccm n/ioo-NaOH bis zum Umschlag von Methylorange und 0,4 ccm n/ioo-NaOH bis
zum Umschlag von Phenolphthalein.
Das Co-Enzvm dreht die Ebene des
polarisierten Lichtes nach links. Für eine 3°/oige wäßrige Lösung fand man
| 5S9 m,u-'-24,6o /u/;i46mEt-w2@@".-_ |
Gibt man zu einigen Milligramm 't,=-0 zym 2 ccm Tryptophanreagens nach P i e r..
x@,e Thomas und erhitzt 5 Minuten auf ioo", so entsteht eine braune Färbung wie
mit Muskeladenylsäure (mit Hefeadenylsäure ist die Färbung blaßgrün, mit Thymusnucleinsäure
rot).
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Der Ring, der an der Berührungsstelle einer wäßrigen Co-Enzymlösung
mit einer Lösung von ß-Naphthol in konzentrierter Schwefelsäure entsteht, ist blau
wie mit Muskel- und Hefeadenylsäure (Thymusnucleinsäure gibt einen braunen Ring).
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Erhitzt man eine wäßrige Co-Enzymlösung 6o Minuten auf ioo°, so gibt
die Lösung Pyridinreaktion mit Bromcyan und Sulfanilsäure. Nicht erhitztes (aktives
Co-Enzym) gibt die Pyridinreaktion nicht.
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Bei der Hydrolyse wurde gefunden, daß das Co-Enzym aus i Mol. Adenin,
i Mol. NTicotinsäureamid, 3 Mol. H, P 04 und 2 Mol. Pentose, die unter Austritt
von 6 Mol. H,,0 miteinander vereinigt sind, besteht. Zwei der Phosphorsäurereste
sind einfach verestert, der dritte Phosphorsäurerest dagegen . mehrfach.
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Das Co-Enzym läßt sich reversibel und irreversibel hydrieren. Bei
der reversiblen Hydrierung wird i Mol. Wasserstoff aufgenommen, bei der irreversiblen
werden 3 Mol. absorbiert.
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Man kann die Wirksamkeit eines Co-Enzym enthaltenden Präparats bestimmen,
indem man die Geschwindigkeit seiner Hydrierung zum hydrierten Produkt bestimmt.
Das Co-Enzym soll für therapeutische Zwecke Verwendung finden.