DE2834702A1

DE2834702A1 - Von mineralsalzen, insbesondere oxalaten, befreite heparinpraeparate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE2834702A1
Application number: DE19782834702
Authority: DE
Inventors: Jean Choay; Jean-Pierre Duclos; Jean Goulay
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1977-08-08
Filing date: 1978-08-08
Publication date: 1979-02-22
Also published as: FR2400036B1; IT1192564B; IE47169B1; DE2834702C2; JPS6129327B2; AU3874878A; AU529432B2; NL7808292A; ATA577078A; FR2400036A1; ES472430A1; SE447872B; SE7808487L; CA1105453A; JPS5446809A; CH636888A5; DK350078A; AT371713B; US4652555A; IT7826580A0

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Weickm^nn, Dip)..-?^ys. Dk. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr.Ing.H.Lxska 283A702

8000 MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

CHOAY S.A.

Von Mineralsalzen, insbesondere Oxalaten, befreite Heparinpräparate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Die Erfindung betrifft ein Reinigungsverfahren für Heparin und Heparinsalze sowie die in diesem Verfahren entstehenden Produkte, die gegenüber bekannten Heparinsalzen verbesserte. Eigenschaften aufweisen.

Natriumsalze von Heparin (im folgenden: Natriumheparinate) werden üblicherweise zur Herstellung von Heparin-Injektionslösungen verwendet. In jüngerer Zeit werden auch gemischte Calcium-Natrium-Heparinate oder Calcium-Magnesium-Heparinate und insbesondere Calciumheparinate angewandt, um verschiedene unerwünschte Gefässreaktionen insbesondere an der Injektionsstelle zu vermeiden, die von den Natriumionen verursacht werden.

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Gemischte Heparinate, d.h. Calcium-Natrium-Heparinate oder Calcium-Magnesium-Heparinate und natriumfreie Heparinate, insbesondere Calcium-Heparinate, können aus Heparlnaten, z.B. Natriumheparinat, nach dem Verfahren der GB-PS 1 471 hergestellt werden.Hierbei bringt man das eingesetzte Einfachsalz von Heparin in einem wässrigen Medium mit einem Salz des gewünschten Metalls in Berührung, das zumindest teilweise das Metall in dem eingesetzten Heparinsalz ersetzen soll. Hierbei entsteht als Zwischenprodukt ein gemischtes Heparinsalz, das das gewünschte Metall enthält und von den freien Metallionen, die in dem Medium enthalten sind, abgetrennt wird. Je nach dem gewünschten Anreicherungsgrad des Substitutionsmetalls wird das als Zwischenprodukt entstandene Heparinsalz nochmals in einem wässrigen Medium mit einem Salz des gewünschten Metalls in Berührung gebracht. Die Verfahrensbedingungen können hierbei gegebenenfalls so gewählt werden, dass ein einfaches Heparinat des Substitutionsmetalls entsteht, das das in dem ursprünglichen Heparinsalz enthaltene Metall nicht mehr enthält.

Bei der Lagerung von Lösungen von Heparinsalzen, die Calciumionen enthalten, hat sich gelegentlich gezeigt, dass sich Niederschläge bilden oder die Lösungen trübe werden. Diese Erscheinungen, die bei konzentrierten Heparinlösungen noch deutlicher ausgeprägt sind, sind vor allem bei Heparin-Injektionslösungen für den therapeutischen Einsatz von Nachteil, die vorher industriell angefertigt werden, insbesondere in Form von vorbestimmten Dosierungen, z.B. in Form von Ampullen oder Einmalspritzen, welche dementsprechend selbst nach mehrmonatiger Lagerung völlig klar bleiben müssen. Die Bildung geringer Niederschlagsmengen oder selbst eine geringe Trübung macht derartige Lösungen für die therapeutische Verabreichung unbrauchbar.

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Dies trifft umso mehr zu, als Teilchen oder Kristalle mit einer Grosse unterhalb etwa 50 um unsichtbar sind und andererseits die Kapillargefässe des Menschen einen Innendurchmesser von nur 1 bis 3μΐα aufweisen. Die Anwesenheit derartiger Teilchen oder Kristalle, die ohne optische Ausrüstung unsichtbar sind, in Injektionslösungen ist insbesondere dann gefährlich, wenn als Wirkstoff Heparin, das gerinnungshemmende Eigenschaften aufweist, injiziert wird. Die durch die in den Patienten injizierten festen Teilchen hervorgerufenen hämorrhagischen Risiken können durch die einerseits erwünschte Aktivität von Heparin noch erhöht werden.

Die Tatsache, dass die Lösung klar bleibt, muss nicht notwendigerweise bedeuten, dass sich kein Niederschlag gebildet hat. Insbesondere in den Fällen, bei denen die Ausfällung sehr langsam von statten geht, kann es vorkommen, dass die winzigen Kristalle (insbesondere unsichtbare Kristalle mit einer Grosse von weniger als 50 ixm) zu einigen wenigen, wenn nicht gar zu einem relativ grossen Kristall zusammenwachsen, der natürlich die Gesamtklarheit der Lösung nicht beeinflusst. Die Injektion einer derartigen Lösung kann daher zumindest genauso schädlich sein wie im vorangehenden Fall.

Die vorstehend geschilderten Risiken sind umso grosser, je höher die Heparinkonzentration in der pharmazeutischen Standardlösung ist. Sie können jedoch je nach der Injektionsart (subkutan, intramuskulär, intravenös etc.) variieren. Bekanntlich ist es oft erwünscht, möglichst hohe Heparinkonzentrationen einzusetzen, xvodurch die Möglichkeit der Ausfällung oder der Anwesenheit von unsichtbaren Teilchen in wachsender Anzahl ein ernsthaftes Problem darstellen kann.

Um diese Schwierigkeiten zu beheben, werden die frisch hergestellten Heparinlösungen, insbesondere Lösungen von Heparinsalzen mit physiologisch verträglichen Metallen, die zumindest teilweise von Calcium gebildet ttferden, relativ lange gelagert, worauf man gegebenenfalls entstandene Niederschläge abfiltriert, -

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bevor die Lösungen weiter gehandhabt werden, z.B·. in Ampullen oder Einmalspritzen aufgeteilt werden. Hierbei ist es offensichtlich, dass mit grösserer Vorlagerungszeit die Herstellung der pharmazeutischen Präparate unwirtschaftlicher wird.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, Heparin von Injektionsqualität bereitzustellen, das zur Herstellung von Lösungen, insbesondere Injektionslösungen, mit guter Lagerbeständigkeit verwendet werden kann. Eine weitere Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung derartiger Heparine bereitzustellen, bei dem die beschriebene Vorlagerung unterbleiben kann.

Es wurde nun gefunden, dass die meisten dieser Schwierigkeiten darauf beruhen, dass die Heparin-Injektionslösungen Mineralsalze von verschiedener Natur und in unterschiedlichen Mengen (bis zu 2,5 Gewichtsprozent) enthalten, je nach dem Ursprung der untersuchten Probe und den angewandten Verfahren zu ihrer Extraktion aus natürlichen Quellen und/oder zum Entfärben (oder Bleichen) der erhaltenen natürlichen Heparine, damit sie de:r für Heparine von Injektionsqualität üblicherweise geforderten Farblosigkeit genügen. Dies gilt auch trotz der Tatsache, dass der Gehalt an Mineralsalzen innerhalb der von geltenden Vorschriften tolerierten Grenzen liegt, z.B. den Standards des französischen Codex.

Der grössere Teil der Restsalze besteht aus Chloraten und Sulfaten in einer Menge von jeweils bis zu 1 %. Andere Salze, insbesondere Carbonate und Sulfite, sind in kleineren Anteilen vorhanden. Die Umwandlung der Natriumsalze von Heparin in calciumhaltige Salze von Heparin, z.B. nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren, sollte aufgrund der geringen Löslichkeit von Calciumsulfat, -sulfit und -carbonat, den Anteil dieser Salze verringern.

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Die Calciumsalze sollten als Feststoffe von der klaren Lösung der calciumhaltigen Heparinsalze abtrennbar sein.

Überraschenderweise hat sich jedoch gezeigt, dass gegen Ende der Umwandlung von Natriumheparinat in Calciumheparinat, insbesondere bei Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens, der Anteil der genannten Rest-Mineralsalze im Vergleich zum ursprünglichen Natriumheparinat nur gering modifiziert wird.

Noch überraschender war die Erkenntnis, dass Heparinsalze, einschliesslich Salze von Metallen, von denen zumindest ein Teil Calcium ist, in Form von klaren wässrigen Lösungen solubilisiert werden können, obwohl sie geringe, doch nicht vernachlässigbare Mengen an Oxalationen enthalten. Dies ist umso überraschender, als Oxalate von Metallen, wie Calcium, bekanntlich in Wasser sehr wenig löslich sind.

Der genaue Grund für dieses Verhalten ist noch nicht bekannt. Es ist jedoch eine Änderung der normalen Löslichkeitseigenschaften von Calciumoxalaten festgestellt worden, insbesondere wenn Calciumchlorid im Überschuss vorhanden ist. Es hat sich gezeigt, dass handelsübliche injizierbare Heparine oder Heparinate Restsalzgehalte von 1,0 bis 2,5 Gewichtsprozent aufweisen können. Zahlreiche Versuche mit solchen Proben haben gezeigt, daß ihr Oxalatgehalt durchweg über 90 ppm liegt. In einem Fall wurde ein Oxalatgehalt von 4o ppm gefunden, dieses Ergebnis stellte sich jedoch später als falsch heraus. Typischerweise liegt bei im Handel verfügbaren injizierbaren Heparinpräparaten der Oxalatgehalt zwischen 9ο und 3oo ppm, in manchen Fällen sogar noch höher.

Es wurde gefunden, dass die Abtrennung von Mineralsalzen, insbesondere Oxalatspuren, aus den behandelten Heparinen zur Folge hat, dass die nach der Herstellung von Calciumheparinatlösungen auftretenden Trübungen und Niederschläge verschwinden. Ferner wurde gefunden, dass bei längerer Lagerung keine wesent-

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liehe Zunahme an unsichtbaren Teilchen (nachweisbar mit üblichen optischen Vorrichtungen, z.B. Teilchenzählern zum Nachweis von Teilchen mit einer Grosse von 2 bis 50 μ,πι) in diesen Lösungen zu beobachten ist, wenn der Gehalt an Oxalationen ausreichend verringert wird.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren gereinigten Lösungen von Calcium- oder gemischten Calciumheparinaten bleiben selbst nach mehrmonatiger Lagerung klar. Es treten weder Trübungen noch Niederschläge auf. Ihr Gehalt an unsichtbaren Teilchen nimmt .selbst bei längerer Lagerung nicht zu, so dass die vorstehend beschriebenen Gefahren einer Kristallkoaleszenz ebenfalls verringert werden.

In den Heparinen oder Heparinsalzen der Erfindung ist somit der Gehalt an Rest-Mineralsalzen, insbesondere Oxalaten, ausreichend niedrig, damit aus diesen Heparinen und insbesondere aus Calciumheparinatlosungen Injektionslösungen mit der für diese Applikationsart üblichen Konzentration hergestellt werden können, die selbst nach mehrmonatiger Lagerung vollständig klar bleiben, z. B. mindestens 6 Monate.

Die Heparinsalze der Erfindung enthalten weniger als 30, vorzugsweise weniger als 20 ppm oder weniger, Oxalationen und können zu Lösungen, insbesondere Injektionslösungen, verarbeitet werden, die klar bleiben und deren Gehalt an unsichtbaren Teilchen, falls überhaupt vorhanden, bei längerer Lagerung, die zwei Jahre lang und sogar drei bis 5 Jahre dauern kann, im wesentlichen konstant bleiben. Diese Angaben zur Lagerung beziehen sich auf Raumtemperatur, also auf den Bereich von etwa 2o bis 25°C. Vorzugsweise beträgt der Gehalt an Rest-Mineralsalzen weniger als o,5 %, vorzugsweise weniger als o,3 %,

Der Ausdruck "Mineralsalze" ist nicht auf Salze von Mineralsäuren, wie Schwefel- oder Salzsäure, beschränkt, sondern schliesst auch Salze von Säuren, wie Oxal- oder Kohlensäure,

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oder sogar von niedermolekularen organischen Säuren, wie Essigsäure, ein. Alle derartigen Salze können als Nichtheparinsalze betrachtet werden.

Es wurde gefunden, dass derartige Heparinsalze zur Herstellung von Injektionslösungen verwendet werden können, die über längere Zeit lagerfähig sind, selbst wenn das Metall des Heparinsalzes zumindest teilweise ein Metall ist, dessen Oxalate nicht wasserlöslich sind, z.B. Calcium.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser gereinigten Heparine aus handelsüblichen Produkten, einschliesslich stark verfärbten Heparinprodukten, wie sie in herkömmlichen Entfärbungsverfahren, insbesondere Oxidationsverfahren anfallen, in denen im allgemeinen der Oxalatgehalt der behandelten Heparine erhöht wird.

Das Verfahren der Erfindung geht aus von den zu reinigenden Heparinpräparaten,im allgemeinen einem Gemisch aus Heparin und anderen Salzen, insbesondere Mineralsalzen, und führt eine selektive Ausfällung unter Nutzung des Löslichkeitsunterschiedes zwischen den Heparinsalzen und den Rest-Mineralsalzen durch. Hierbei wird eine wässrige Lösung, die das Heparin-Mineralsalzgemisch enthält, mit einer geeigneten Menge eines nicht-ionischen Fällungsmittels versetzt, z.B. einem Alkohol, wie Äthanol, um eine selektive Ausfällung des Heparins oder der Heparinsalze zu bewirken, während die Mineralsalze in der wässrigen Lösung bleiben. Hierauf trennt man das Heparin ab und wiederholt gegebenenfalls diese selektive Trennung mit einer neuen wässrigen Lösung des gewonnenen Heparins, bis die Oxalatkonzentratxon in dem erhaltenen Heparin unter einem Schwellenwert liegt,der in vielen Fällen 7o ppm sein kann, jedoch so niedrig wie 3o ppm sein kann und vorzugsweise noch unter 2ο ppm liegt, wenn längere Lagerungszeiten (z. B. 2 Jahre oder auch 3 bis 5 Jahre) erforderlich sind und wenn absolute Sicherheit für diesen Zeitraum gefordert wird, daß

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keine Fällungen auftreten. Es wird auch in Betracht gezogen, den Oxalationengehalt bis auf Spuren zu senken, bezogen auf die mit den derzeit verfügbaren Methoden bestehenden Nachweismöglichkeiten.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Heparin in Form eines Salzes eines Metalls, wie Natrium, Lithium oder Kalium, verwendet, dessen Oxalte wasserlöslich sind. Das Metall des schliesslich erhaltenen gereinigten Heparins, das im wesentlichen von seinem Oxalatgehalt befreit ist, kann zumindest teilweise durch ein anderes Metall ersetzt werden, insbesondere Calcium-, dessen Oxalate wasserunlöslich sind, oder gegebenenfalls durch Magnesium.

Die Konzentration der eingesetzten Heparinlösung kann stark variieren. Aus praktischen Gründen ist es bevorzugt, keine zu verdünnten Lösungen zu verwenden, da das verwendete Äthanolvolumen proportional dem der behandelten Lösung ist. Für eine gleiche Heparinmenge ist eine umso grössere Äthanolmenge erforderlich, je verdünnter die Lösung ist. Andererseits dürfen die Heparinlösungen einen gewissen Konzentrationsgrad nicht überschreiten, da ihre Viskosität rasch zunimmt und die Heparinausfällung aus derartigen Lösungen möglicherweise dazu führt, dass eine grosse Menge der ursprünglichen Verunreinigungen, die abgetrennt werden sollen, mitgefällt wird.

Das Verfahren wird daher vorzugsweise mit Lösungen durchgeführt, deren Konzentration in etwa der von gewöhnlichen Injektionslösungen entspricht, d.h. die etwa 40 bis 250 g/l Natriumheparinat enthalten, entsprechend etwa 5000 bis 30 000 ΙΕ/ml.

Der pH der Lösung beeinflusst das Ergebnis der Reinigung. Eine saure Lösung hält die Mineralsalze eher in Lösung zurück, insbesondere die Oxalate, und verbessert daher das Trennergebnis.

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Daneben kann jedoch Heparin durch starke Säuren angegriffen werden. Es werden daher vorzugsweise Lösungen mit einem pH oberhalb 3,5, insbesondere zwischen 5 und 7, angewandt..

Die so hergestellte Heparinlösung wird mit einer ausreichenden Äthanolmenge versetzt, so dass praktisch das gesamte Heparin ausfällt, während die Mineralsalze in der wässrigen Alkohollösung verbleiben. Vorzugsweise verwendet man ein Volumenteil Heparinlösung pro 0,5 bis 1,5 Volumenteile Äthanol. Vorzugsweise wird praktisch reiner neutraler Alkohol angewandt (99 bis 100⁰GL).

Der Heparinniederschlag wird dann von dem Überstand abgetrennt und geknetet und gewaschen, um verbliebene Spuren der Lösung zu entfernen. Das Auswaschen erfolgt vorzugsweise mit absolutem Alkohol. Hierauf wird das Heparin filtriert und getrocknet. Sollte diese erste Trennung unvollständig sein, wird die Behandlung des Heparinniederschlages gegebenenfalls wiederholt, bis Heparinsalze erhalten werden, die den vorstehenden Anforderungen genügen.

Das meiste eingesetzte Heparin wird bei der beschriebenen Ausfällung wiedergewonnen; der Rest verbleibt in der wässrigen Alkohollösung. Diese kann mit einer weiteren Menge Alkohol behandelt werden, um eine neue Heparinfällung zu erhalten.

Das Reinigungsverfahren der Erfindung ist in allen Fällen anwendbar, bei denen in handelsüblichen Heparinen von beliebiger Quelle enthaltene Oxalate abgetrennt werden sollen. Obwohl jedoch das Verfahren das Entfernen von messbaren freien Oxalaten ermöglicht, bis die Heparine weniger als 30, vorzugsweise weniger als 20 ppm, enthalten, hat sich in einigen Fällen bei der Behandlung von Heparinsalzen eines Metalls, wie Natrium, dessen Oxalat wasserlöslich ist, gezeigt, dass beim zumindest teilweisem. Überführen dieses Heparinsalzes in das eines Metalls, wie Calcium,

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dessen Oxalate unlöslich sind, das schliesslich erhaltene Produkt grössere Mengen an freien Oxalaten enthält. Obwohl noch keine Erklärung für diese Erscheinung gefunden wurde, wird vermutet, dass ein Teil der in handelsüblichen Heparinen aus bestimmten Quellen enthaltenen Oxalate sich so verhält, als· wären sie an den Heparinmolekülen absorbiert oder fixiert. Das Heparin verhält sich somit als eine Art Änionenaustauscher. Diese Erscheinung kann dazu führen, dass die erhaltenen Heparinsalze weiterhin nicht zur Herstellung von Heparin-Injektionslösungen verwendbar sind, die über längere Zeit gelagert werden können.

Es wurde jedoch gefunden, dass diese Schwierigkeiten behoben werden können, wenn man in einer Abwandlung des erfindungsgemässen Ver^- fahrens das nicht-ionische Heparin-Fällungsmittel in den vorstehend beschriebenen Reinigungsstufen mit einer zu reinigenden wässrigen Lösung von Heparin (oder des Heparin-Mineralsalzgemisches) in Berührung bringt, die wasserlösliche Mineralsalze ausser Oxalaten in einer ausreichenden Konzentration enthält, um die Abtrennung der Oxalate zu begünstigen _r einschliesslich der scheinbar fixierten oder adsorbierten Oxalate, die dann freigesetzt werden und bei der anschliessenden Ausfällung der Heparinsalze in der wässrigen Lösung verbleiben.

Einige der in der zu reinigenden Heparinlösung vorhandenen anderen Salze können daher beim Einstellen einer geeigneten Konzentration in der Lösung gegebenenfalls eine vollständigere Extraktion der Oxalationen bewirken.

In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens ist es daher gewöhnlich notwendig, die Konzentration dieser wasserlöslichen Mineralsalze in der eingesetzten wässrigen Heparinlösung vor dem Kontaktieren dieser Lösung mit dem nichtionischen Heparin-Fällungsmittel einzustellen. Es hat sich

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gezeigt, dass eine ausreichende Konzentration insbesondere von Salzen, die zweiwertige Anionen und vorzugsweise auch einwertige Anionen enthalten, offensichtlich bewirkt, dass die möglicherweise an dem Heparin a.dsorbierten oder fixierten Oxalate verdrängt werden.

Gegebenenfalls kann man dann die Fällungsstufen wiederholen, indem man eine Lösung des gewonnenen Heparins und von wasserlöslichen Mineralsalzen (mit Ausnahme von Oxalaten) in der vorstehend definierten Konzentration nochmals behandelt, bis die Konzentration an Gesamtoxalaten in dem erhaltenen Heparin weniger als 30 ppm, vorzugsweise weniger als 20 ppm, beträgt.

Bevorzugte Metalle von Salzen mit zweiwertigen Anionen.(ausser Oxalaten), die in der eingesetzten Heparinlösung enthalten oder dieser gegebenenfalls zugesetzt werden, sind Metalle, deren Oxalate wasserlöslich sind. Carbonate und insbesondere Natriumcarbonat haben sich im Verfahren der Erfindung als besonders wirksam erwiesen. Vorzugsweise liegt das Heparin in der genannten Lösung auch in Form eines Heparinsalzes desselben Metalls wie das der Mineralsalze vor. Die Möglichkeit eines Austausches des in den Mineralsalzen enthaltenen Metalls mit dem Metall des Heparinsalzes wird somit vermieden, so dass der Metallgehalt der gereinigten Heparinsalze genau kontrolliert werden kann.

Die Konzentration der Mineralsalze in der Lösung, die mit dem nicht-ionischen Fällungsmittel, z.B. einem Alkohol, in Berührung gebracht wird, beträgt vorzugsweise 0,3 bis 2,5, z.B. etwa 0,5 Gewichtsprozent, bezogen auf Heparin.

Vorzugsweise enthält die eingesetzte Lösung auch Salze mit einwertigen Anionen mindestens eines Metalls, dessen Oxalat wasserlöslich ist, z.B. Natriumchlorid. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens beträgt die Konzentration dieses einwertigen Salzes 1 bis 7, z.B. etwa 2,5 Gewichtsprozent/Volumen der Lösung oder wird auf diesen Wert eingestellt.

Es hat sich als vorteilhaft, jedoch nicht notwendig erwiesen, den pH der Lösung, die mit dem nicht-ionischen Fällungsmittel in Berührung gebracht wird, auf einen Wert von 7 bis 10, z.B. etwa 8,5, einzustellen. Dieser pH-Wert stellt sich automatisch ein, wenn man als Salz mit zweiwertigen Anionen Natriumcarbonat verwendet.

Diese Salze mit zweiwertigen und/oder einwertigen Anionen können in der Endstufe des Verfahrens leicht abgetrennt werden, z.B. in der letzten Kontaktierstufe der Heparinlösung mit dem nicht-ionischen Mittel. Vorzugsweise stellt man dann den pH, z.B. mit Salzsäure, auf einen leicht sauren Wert ein, der zur Zersetzung der Carbonate ausreicht, vorzugsweise einen pH von 3 bis 7. Die Chloridionen verbleiben beim Ausfällen des Heparinsalzes in der wässrigen Lösung.

Es werden somit im wesentlichen oxalatfreie Heparinpräparate, insbesondere Heparinsalze, erhalten, die

- entweder direkt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten verwendet werden können, insbesondere Injektions- oder Infusionslösungen mit langer Lagerfähigkeit, selbst wenn die Metallkationen der Heparinsalze zumindest teilweise von Metallen gestellt werden, deren Oxalate sehr wenig löslich sind, z.B. Calcium,

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- oder nach dem Verfahren der GB-PS 1 471 482 als Ausgangs-Heparinsalze, deren Metallkationen zumindest teilweise vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise ersetzt werden können, in andere, im wesentlichen oxalatfreie Heparinsalze überführt werden können, die dann zu pharmazeutischen Präparaten mit langer Lagerfähigkeit verarbeitet werden.

Gegenstand der Erfindung sind daher insbesondere oxalatfreie Heparinpräparate und Metallsalze von Heparin, d.h. entweder Einfachsalze von Heparin, wie die Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumsalze von Heparin, oder gemischte Heparinsalze, die mindestens zwei der genannten Metallkationen in beliebigen Mengenverhältnissen enthalten, wobei alle diese Heparinsalze im wesentlichen frei von Oxalaten sind, da sie einen Schwellenwert von 7o ppm unterschreiten, in vielen Fällen sogar so wenig wie 3o ppm Gesamtoxalate enthalten (im wesentlichen: oxalatfreie Heparine). Als gemischte Salze sind jene bevorzugt, die Natrium und Calcium enthalten.

Gegenstand der Erfindung sind ferner pharmazeutische Präparate, die das oxalatfreie Heparin neben einem pharmazeutischen Träger enthalten, insbesondere pyrogenfreie oxalatfreie , vorzugsweise farblose Heparinpräparate mit einer Aktivität von mindestens 120, vorzugsweise mehr als 150 ΙΕ/mg sowie hochkonzentrierte Lösungen von Heparin, die sich zur therapeutischen Anwendung zum Steuern der Blutgerinnung eignen, insbesondere oxalatfreie, vorzugsweise farblose Lösungen für die subkutane Injektion, die 5000 bis 35 000, vorzugsweise 20 000 bis 30 000, z.B. 25 000 ΙΕ/ml Heparin enthalten, oder oxalatfreie Lösungen für die intravenöse Injektion, die 1000 bis 10 000, z.B. 5000 IE/ml Heparin enthalten.

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Vorzugsweise liegt das Heparin in diesen Mitteln in Form eines physiologisch verträglichen Metallsalzes vor, das ein oder ,mehrere Metallkationen enthält. Vorzugsweise ist das Metall zumindest teilweise Calcium. Besonders bevorzugt sind Heparinsalze, bei denen Calcium das einzige Metall ist. Die pharmazeutischen Präparate können mit Vorteil zu anwendungsfertigen Einmalspritzen verarbeitet werden.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung des oxalatfreien Heparin der Erfindung zum Regeln der Blutgerinnung beim Menschen. Hierbei wird eine wirksame Dosis verabreicht, z.B. 13 500 bis 50 000 IE subkutan zweimal täglich, wie es der thrombotische Zustand des Patienten erfordert, oder 20 000 bis 50 000 IE pro 24 Stunden intravenös, gleichmässig verteilt über den Tag, vorzugsweise durch kontrollierte Infusion, oder 5000 bis 10 000 IE dreimal wöchentlich intramuskulär.

Das erfindungsgemäss gereinigte Heparin kann direkt z.B. zur Herstellung von Injektionslösungen mit der üblichen Dosierung und Konzentration verwendet werden. Es kann aber auch als Äusgangsmaterial zur Herstellung anderer Salze, z.B. Calciumheparinaten oder gemischten CaIcium-Magnesium- oder Calcium-Natr.ium-Salzen, z.B. nach dem Verfahren der GB-PS 1 471 482, verwendet werden.

Erstes Beispiel eines bevorzugten Reinigungsverfahrens für Heparin

In einem bevorzugten Alkoholfraktionierungs-Reinigungsverfahren für injizierbares Natriumheparinat wird Natriumheparinat vom Rind oder Schwein von Injektionsqualität verwendet. Das Heparinat wird in entsalztem Wasser aufgelöst (spezifischer Widerstand 300 000 bis 800 000, vorzugsweise 500 00Q-fl-/cm) . Die Konzentration der Heparinatlösung wird auf 5 000 bis 30 000, vorzugsweise 25 000 ΙΕ/ml eingestellt. Hierauf gibt man 0,3% m-Kresol zu, um eine Kontamination zu verhindern. Der pH der Lösung durch Zugabe von 5 η Natronlauge oder 5 η Salzsäure auf einen

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Wert von 5 bis 7 eingestellt. Die Leitfähigkeit der Lösung beträgt 7 000 bis 15 000

Die erhaltene Heparinatlösung wird mit 0,7 Volumenteilen neutralem Äthanol (99 bis 100° GL) versetzt und stehengelassen, bis sich der Niederschlag absetzt. Gegebenenfalls gibt man eine geringe Menge Natriumchlorid zu. Der Niederschlag wird dann von dem überstand abgetrennt und nochmals in entsalztem Wasser mit den oben genannten Eigenschaften gelöst, so dass eine Konzentration von etwa 12 500 IE/ml erhalten wird. Der pH wird erforderlichenfalls mit 5 η Natronlauge oder 5 η Salzsäure auf 5,5 eingestellt, worauf man die Lösung durch ein 0,3 μ-Millipore-Filter filtriert. Ein Volumenteil der Lösung wird dann unter Rühren mit 1,2 Volumenteilen neutralem Äthanol (99 bis 100° GL) versetzt. Man lässt den Niederschlag, gegebenenfalls unter Zugabe einer geringen Menge Natriumchlorid, absetzen.

Der erhaltene Heparinniederschlag wird entwässert, indem man ihn in absolutem Äthanol zerstösst, . auf einem Büchner-Trichter unter vermindertem Druck filtriert, mit absolutem Alkohol auswäscht und bei 35 bis 40°C/iTorr trocknet.

Falls weitere Fällungen erforderlich sind, werden sie genauso wie die zweite Fällungsstufe durchgeführt, d.h. mit einer . Heparinkonzentration von 12 500 ΙΕ/ml, einem pH von 5,5 und 1,2 Volumenteilen absolutem Alkohol pro 1 Volumenteil Lösung.

Zweites Beispiel einer bevorzugten Verfahrensweise

Erste Alkoholfraktionierung

Natriumheparinat vom Rind oder Schwein von Injektionsqualität wird in entsalztem Wasser gelöst, das einen spezifischen Widerstand von 300 000 bis 800 000, vorzugsweise 500 000 Ohm aufweist. Die Heparinkonzentration beträgt 5 000 bis 30 000, vor-

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zugsweise 25 000 IE/ml. Hierauf gibt man m-Kresol bis zu einer Konzentration von 0,003 % zu. Der pH der Lösung wird durch Zugabe einer Natriumcarbonatlösung (wasserfreies Natriumcarbonat in einem Mengenanteil von 0,5 %, bezogen auf das eingesetzte Heparingewicht) auf einen Wert von 7 bis 10, vorzugsweise 8,5, eingestellt. Die Leitfähigkeit der erhaltenen Lösung beträgt 7 000 bis 15 000 μίΟιοΞ/οΐα. Hierauf versetzt man die Lösung mit Natriumchloridkristallen in einer Menge von 2,5 Gewichtsprozent/Volumen. Die Heparinlösung wird dann pro Volumenteil mit 0,7 Volumenteilen neutralem Äthanol (99 bis 100° GLJ unter Rühren versetzt, worauf man das Medium 6 Stunden stehen lässt, und dann den Heparinniederschlag abtrennt.

Zweite Alkoholfraktionierung

Der erhaltene Heparinniederschlag wird in entsalztem Wasser mit den oben genannten Eigenschaften in einer Konzentration von etwa 12 500 IE/ml gelöst. Der pH beträgt etwa 8,5. Hierauf versetzt man mit Natriumchloridkristallen in einer Menge von 2,5 Gewichtsprozent/Volumen der Lösung. Ein Volumenteil neutrales Äthanol (99 bis 100° GL) wird dann unter Rühren zugegeben. Nach 12-stündigem Stehenlassen des Mediums wird der neue Heparinniederschlag abgetrennt.

Die zweite Alkoholfraktionierung wird unter denselben Bedingungen dreimal wiederholt, so dass insgesamt vier Fraktionierungsschritte erfolgen. Der Niederschlag aus der vierten Alkoholfraktionierung wird in entsalztem Wasser mit den oben genannten Eigenschaften in einer Konzentration von etwa 12 500 IE/ml gelöst. Der pH wird unter kräftigem Rühren mit Salzsäure auf einen Wert von 3 eingestellt. Hierauf rührt man weitere 15 Minuten und stellt dann mit 5 η Natronlauge einen pH von 5,5 ein. Die Lösung wird dann mit Natriumchloridkristallen

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in einer Menge von 2,5 Gewichtsprozent/Volumen versetzt und durch eine 0,3 μΜΐΙϋροΓβ-ΜβπώίΓαη filtriert. Das Filtrat wird unter Rühren mit neutralem Äthanol (99 bis 100° GL) in einem Volumenverhältnis von 1:1 versetzt. Hierauf lässt man das Medium 12 Stunden stehen und entwässert den erhaltenen Heparinniederschlag dann dadurch, dass man ihn in absolutem Äthanol zerstösst,unter vermindertem Druck filtriert, mit absolutem Alkohol wäscht und bei 35 bis 40°C/1Torr trocknet. Hierbei erhält man ein injizierbares Natriumheparinat, in dem der Anteil an Gesamt-Mineralsalzen weniger als 0,5 % und der Gesamt-Oxalatgehalt weniger als oder höchstens 20 ppm beträgt.

Beispiel 1

In diesem Beispiel wird handelsübliches Natriumheparinat mit einem Titer von 160 ΙΕ/ml verwendet. Der Gesamt-Mineralsalzgehalt beträgt 2,5 % und der Oxalatgehalt 220 ppm (d.h. 0,022 %).

10 000 g dieses Heparinats werden in einem 300 1-Edelstahlreaktor gelöst, indem man 50 1 entsalztes Wasser mit einem spezifischen Widerstand von 500 000 JVcm zugibt, das vorher durch eine 0,22 μ-Millipore-Membran filtriert worden ist.

Die Auflösung erfolgt durch einstündiges Rühren. Der pH wird gemessen und durch Zugabe von 5 η NaOH oder 5 η HCl auf einen Wert von 6,5 eingestellt. Hierauf verdünnt man mit demselben entsalzten Wasser auf 64 1. Die Leitfähigkeit beträgt 15 000 cm; die Temperatur wird zwischen 15 und 30⁰C gehalten. Anschliessend versetzt man mit 192 ml frisch destilliertem m-Kresol und gibt 0,7 Volumenteile neutrales Äthanol (99 bis 100° GL) pro 1 Volumenteil der Lösung zu, d.h. 44,8 1. Die Lösung wird stehen gelassen,bis sich ein Niederschlag bildet; gegebenenfalls wird eine geringe Menge Natriumchlorid zugesetzt. Hierauf trennt man den Natriumheparinat-Niederschlag von dem tiberstand. Der

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Mineralsalzgehalt des Niederschlages beträgt weniger als 0,5 %, der Gehalt an Oxalationen etwa 200 ppm.

Das Natriumheparinat wird wieder in 50 1 desselben entsalzten Wassers mit einem Widerstand von 500 000 JT/cm gelöst. Gegebenenfalls stellt man den pH mit 5 η NaOH oder 5 η HCl auf 5,5 ein. Die gemessene Leitfähigkeit beträgt 15 000 μΜηοε/οίη. Anschliessend verdünnt man mit demselben entsalzten Wasser auf 128 1, versetzt mit 384 g frisch destilliertem m-Kresol und lässt das Ganze 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Die Heparinlösung wird dann durch ein 0,3 \i CWSS-Millipore-Filter filtriert. 25 1 des Filtrats werden langsam unter Rühren-mit 30 1 neutralem Äthanol (99 bis 100° GL) (d.h. 1,2 Volumenteilen) versetzt. Hierauf lässt man stehen, bis sich ein Niederschlag bildet, gegebenenfalls wird eine geringe Menge Natriumchlorid zugegeben. Anschliessend trennt man den überstand und den Natriumheparinat-Niederschlag, der dann mit absolutem Alkohol entwässert, zerstossen, auf einem Büchner-Trichter unter vermindertem Druck filtriert und schliesslich getrocknet und gefriergetrocknet wird. Hierbei werden 9,40 g (Ausbeute 94 %) Natriumheparinat erhalten, das einen Titer von 160 IE/mg, einen Mineralsalzgehalt von 0,15 % und einen Gehalt an Oxalationen von 30 ppm aufweist.

Um das in der wässrigen Alkohollösung noch enthaltene Heparinat zu gewinnen, wird folgende Behandlung angewandt:

Ein Volumenteil des Überstandes aus der ersten Alkoholfällung wird mit 1 Volumenteil neutralem Äthanol (99 bis 100° GL) versetzt. Nach 24-stündigem Absetzen zieht man die klare bis leicht trübe überstehende Flüssigkeit ab und arbeitet sie auf Restalkohole auf. Der Niederschlag wird abgetrennt, mit absolutem Itthanol behandelt, entwässert, zerstossen und getrocknet.

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Der überstand aus der zweiten Fällung wird unter. Rühren mit neutralem Äthanol (90 bis 100° GL) in einem Volumenverhältnis von 1:0,5 versetzt und 24 Stunden stehen gelassen. Das Natriumheparinat wird unter ähnlichen Bedingungen wie im Falle des ersten Überstandes abgetrennt.

Das erhaltene Natriumheparinat wird zur Herstellung des Calciumsalzes nach dem Verfahren der GB-PS 1 471 482 verwendet. Hierzu versetzt man die Natriumheparinatlösung mit Calciumchlorid, so dass ein mit Calcium angereichertes Heparinat entsteht. Durch Abtrennen der freigesetzten Natriumionen und nochmalige Zugabe von Caliumionen erhält man ein Calciumheparinat mit einem Titer von 160 ΙΕ/mg, das 10,3 % Calcium, 0,2 % Natrium und 20 ppm Oxalationen enthält.

Beispiel 2

Ein gemäss Beispiel 1 hergestelltes Natriumheparinat mit einem Titer von 160 ΙΕ/mg, das etwa 30 ppm Oxalat enthält, wird nach dem Verfahren der GB-PS 1 471 482 zu Calcium-Natriumheparinat ι verarbeitet. Hierauf versetzt man die Natriumheparinatlösung auf einmal mit Calciumchlorid und trennt dann die freigesetzten Natriumionen ab. Das erhaltene Calcium-Natriumheparinat hat einen Titer von 160 ΙΕ/mg und enthält etwa 7 % Calcium. Der Gehalt an Oxalationen beträgt 18 ppm. Eine Lösung dieses Heparinats mit einem Titer von 25 000 ΙΕ/ml zeigt nach mehrmonatiger Lagerung in einer Ampulle keine Niederschlagsspuren.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 2 wird wiederholt, jedoch überführt man das Natriumheparinat diesmal nach dem Verfahren der GB-PS 1 471 482 vollständig in Calciumheparinat. Das erhaltene

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Heparinat hat einen Titer von 160 ΙΕ/mg und enthalt etwa 10,4 % Calcium sowie weniger als 0,1 % Natrium. Der Gehalt an Mineralsalzen beträgt 0,4 %, einschliesslich 20 ppm Oxalationen. Lösungen mit einem Titer von 25 000 ΙΕ/ml besitzen dieselbe Lagerfähigkeit wie die Lösung von Beispiel 2.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird ein handelsübliches injizierbares Natriumsalz von Heparin mit einem Titer von 160 ΙΕ/mg verwendet, das 2,5% Mineralsalze und 1000 ppm (d.h. 0,1 %) Oxalate enthält. 10 000 g dieses Heparins werden in 50 1 entsalztem Wasser gelöst, das einen spezifischen Widerstand von 500 000 Ohm aufweist und vorher mit einer 0,22 μ,-Millipore-Membran filtriert worden ist. Die Lösung wird in einem 300 1-Edelstahlreaktor 15 Minuten gerührt und dann mit entsalztem Wasser auf 64 1 verdünnt. Die Konzentration beträgt 25 000 IE/ml, Hierauf gibt man 192 ml frisch destilliertes m-Kresel, dann 50 g Natriumcarbonat als wässrige Lösung und schliesslich 1600 g Natriumchloridkristalle zu. Die Lösung wird dann weitere 15 Minuten gerührt. Der pH, der einen Wert von 8,5 haben soll, wird gegebenenfalls mit einer Natriumcarbonatlösung auf diesen Wert eingestellt. Unter Rühren werden 44 1 neutrales Äthanol (99 bis 100° GL) zugegeben (0,7 Volumenteile Alkohol pro 1 Volumenteil· der eingesetzten Lösung). Hierauf lässt man das Medium 6 Stunden stehen und trennt den Heparinniederschlag ab.

Dieser wird einer zweiten Alkoholfraktionierung unterworfen, indem man ihn in 110 1 entsalztem Wasser mit den vorstehend genannten Eigenschaften in einer Konzentration von etwa 12 ΙΕ/ml auflöst. Die Lösung wird 15 Minuten gerührt und dann mit entsalztem Wasser auf 128 1 verdünnt. Hierauf gibt man 384 ml frisch destilliertes m-Kresol zu, stellt mit einer

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Natriumcarbonatlösung einen pH von 8,5 ein, versetzt mit 3200 g Natriumchlorid und rührt weitere 15 Minuten. Unter Rühren wird dann neutrales Äthanol (99 bis 100° GL) in einem Volumenverhältnis von 1:1 zugegeben. Nach 12-stündigem Stehenlassen des Gemisches trennt man den Heparinniederschlag ab, nachdem der Überstand abgetrennt wurde.

Die Alkoholfraktionierung wird dreimal unter denselben Bedingungen wie bei der zweiten Fraktionierung wiederholt, wobei jeweils der in der vorangehenden Fraktionierungsstufe gewonnene Heparinniederschlag eingesetzt wird.

Der schliesslich erhaltene Heparinniederschlag wird in entsalztem Wasser in einer Konzentration von etwa 12 500 IE/ml gelöst, wobei die Lösung ein Volumen von 128 1 hat. Hierauf stellt man unter kräftigem Rühren mit Salzsäure einen pH von 3 ein, rührt die Lösung 15 Minuten, stellt mit 5 η Natronlauge einen pH von 5,5 ein, versetzt mit 384 ml frisch destilliertem m-Kresol und dann mit 3 200 g kristallinem Natriumchlorid. Die erhaltene Lösung wird durch eine 0,3 n-Millipore-Membran filtriert. Alle Verfahrensschritte werden bei einer Temperatur von 15 bis 30⁰C durchgeführt. Unter Rühren versetzt man dann das Filtrat mit 1 Volumenteil neutralem Äthanol.· (99 bis 100° GL) und lässt 12 Stunden stehen.

Der auf diese Weise erhaltene Heparinniederschlag wird durch Zerstossen in absolutem Äthanol entwässert, unter vermindertem Druck filtriert, mehrmals mit absolutem Alkohol ausgewaschen und schliesslich 24 Stunden bei 35 bis 40°C/1Torr getrocknet. Das Pulver wird nochmals zerrieben und 24 Stunden bei 40°C/1Torr getrocknet, um letzte Lösungsmittelspuren zu entfernen. Hierbei erhält man 9100 g eines Natriumsalzes von Heparin, das weniger als 0,5 % Mineralsalze und weniger als 20 ppm Oxalat enthält. Die Ausbeute dieser Fraktion beträgt 90,43 % und der Titer 157 IE/mg.

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Die Bestimmung der Oxalationen in den gereinigten Heparinen erfolgt nach ihrer Extraktion nach dem Verfahren von J.R. HELBERT und M.A. MARINI, Biochem.J., (1963), Bd. 2 (5),

S. 1101-6, jedoch mit der Abwandlung, dass die in den Heparinen vorhandenen Oxalationen daraus in Gegenwart von überschüssigem Natriumcarbonat extrahiert werden, bevor sie an dem IRA 400-Anionenaustauscherharz absorbiert werden, dessen Verwendung von den Autoren empfohlen wird. Nach der Elution von dem Harz werden die Oxalationen nach dem Verfahren von P.M. ZAREMBSKI und A. HODGKINSON, Biochem.J., (1965), Bd. 96, S. 717-721, fluorometrisch bestimmt.

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Claims

Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Veickhann, Dipl -Phys. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H. Liska

■ 2Ä2A2Ü2

Ba/ht. 8000 MÜNCHEN 86, DEN 1 4. NOV, 1978

POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

.CHOAY S.A.

48, Avenue Theophile-Gautier . L₁ I

75782 Paris Cedex 16 / Frankreich

Von Mineralsalzen, insbesondere Oxalaten, befreite Heparinpraparate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

P AT EN TANSPRÜCHE

Verfahren zum Reinigen von .Heparin, insbesondere zum Abtrennen des Mineralsalzgehaltes, einschliesslich der Oxalate, dadurch gekennzeichnet , dass man eine wässrige Lösung von Heparin in löslicher Form mit einer geeigneten Menge eines nicht-ionischen Fällungsmittels, z.B. eines Alkohols, versetzt, so dass das Heparin oder die Heparinsalze selektiv ausgefällt werden, während die Mineralsalze in der wässrigen Lösung bleiben, das Heparin gewinnt und gegebenenfalls diese selektive Trennung mit einer neuen wässrigen Lösung des gewonnenen Heparins wiederholt, bis die Oxalatkonzentration in dem erhaltenen Heparin weniger als 70 ppm, vorzugsweise weniger als 30 ppm, insbesondere weniger als 20 ppm, beträgt.

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I nachgereichtJ
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Heparin in der Ausgangslösung in Form eines Salzes eines Metalls vorliegt, dessen Oxalate wasserlöslich sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , dass das Heparin in der Ausgangslösung in Form eines Natriumheparinats vorliegt und 4 0 bis 250 g/l Natriumheparinat enthalten sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass die Ausgangslösung 5000 bis 30 000 IE/ml Heparin enthält.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , dass man den pH der Lösung auf einen Wert oberhalb 3,5, vorzugsweise 5 bis 7, einstellt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , dass man die Ausfällung unter Verwendung von 0,5 bis 1,5 Volumenteile Alkohol pro 1 Volumenteil Heparinlösung durchführt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , dass man die Konzentration der Mineralsalze, mit Ausnahme der Oxalate, in der wässrigen Ausgangslösung vor dem Kontaktieren mit dem nicht-ionischen Mittel so wählt oder einstellt, dass sie die Abtrennung der Oxalate, einschliesslich der fixierten oder absorbierten Oxalate, begünstigt, -die dann freigesetzt werden und bei der anschliessenden Ausfällung des Heparins in der wässrigen Lösung verbleiben, und dass man das ausgefällte Heparin gewinnt und gegebenenfalls diese selektive Trennung in einer neuen wässrigen Lösung des gewonnenen Heparins wiederholt, bis die Konzentration an Gesamtoxalaten in dem Heparin weniger als 70 ppm, vorzugsweise weniger als 30 ppm, insbesondere weniger als 20 ppm, beträgt.

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8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung mit der ausreichenden Mineralsalzkonzentration mindestens ein Salz eines zweiwertigen Anions und eines Metalls, dessen Oxalat wasserlöslich ist, enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das zweiwertige Salz ein Carbonat, vorzugsweise Natriumcarbonat, ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch g e k e η η zeichnet, dass die Konzentration der Salze mit zweiwertigen Anionen, mit Ausnahme der Oxalate, in der wässrigen Lösung 0,3 bis 2,5, vorzugsweise etwa 0,5 Gewichtsprozent, bezogen auf Heparin, beträgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet , dass die Salze auch Salze mit einwertigen Anionen von mindestens einem Metall enthalten, dessen Oxalate wasserlöslich sind.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Salz mit einwertigen Anionen ein Chlorid, vorzugsweise Natriumchlorid, ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet , dass die Konzentration des Salzes mit einem einwertigen Anion in der wässrigen Lösung 1 bis 7, vorzugsweise 2,5 Gewichtsprozent, bezogen auf die Lösung, beträgt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet , dass das Heparin in der Lösung, die mit dem nicht-ionischen Mittel in Berührung gebracht wird, als Heparinsalz eines Metalls, wie Natrium, dessen Oxalat wasserlöslich ist, vorliegt.

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15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch g e. k e η η zeichnet, dass das Heparin als Salz eines Metalls vorliegt, das dem der Mineralsalze entspricht.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 15, dadurch gekennzeichnet , dass man zusätzlich zumindest einen Teil des Metalls in dem Heparin, das aus der schliesslich gewonnenen Heparinfällung erhalten wurde, durch ein Metall ersetzt, dessen Oxalate nicht wasserlöslich sind, z.B. Calcium.
17. Heparin, enthaltend weniger als 30 ppm, vorzugsweise weniger als 20 ppm, Gesamtoxalate.
18. Heparin von injizierbarer Qualität mit einem Oxalationengehalt, der ausreichend niedrig ist, um bei mehrmonatiger Lagerung Fällungen und Bildung von Niederschlägen zu vermeiden.
19. Heparin nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt unter 7o ppm liegt.
20. Heparin nach Anspruch 17, 18 oder 19, enthaltend weniger als 0,5 %, vorzugsweise weniger als o,3 % Mineralsalze.
21. Heparin nach Anspruch 17, 18 oder 19 in Form eines Metallsalzes von Heparin, wobei zumindest ein Teil des Metalls Calcium ist.
22. Heparin nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet ,daß das Metall insgesamt Calcium ist und andere Metalle im wesentlichen ausgeschlossen sind.

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23. Heparin nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet , dass es eine Aktivität von mindestens 120, vorzugsweise mehr als 150 ΙΕ/mg aufweist.
24. Injizierbare Heparinkonzentrate nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet , dass sie mindestens 1000 ΙΕ/ml Heparin enthalten.
25. Konzentrat nach Anspruch 24 für die subkutane Injektion, dadurch gekennzeichnet , dass es 5000 bis 35 000, vorzugsweise 20 000 bis 30 000 ΙΕ/ml Heparin enthält.
26. Konzentrat nach Anspruch 24 für die intravenöse Injektion, dadurch· gekennzeichnet , dass es 1000 bis 10 000, vorzugsweise 5000 ΙΕ/ml Heparin enthält.
27. Einmalspritze, enthaltend eine Heparinlösung nach einem der Ansprüche 24 bis 26.
28. Verwendung des Heparins nach einem der Ansprüche 17 bis

23 oder eines Heparinkonzentrats nach einem der Ansprüche

24 bis 26 bei der Regelung der Blutgerinnung.

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