DE2417859A1

DE2417859A1 - Verfahren zur herstellung von gemischten heparinsalzen

Info

Publication number: DE2417859A1
Application number: DE19742417859
Authority: DE
Inventors: Jean-Louis Amyot; Jean Choay; Jean Goulay
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1973-04-13
Filing date: 1974-04-11
Publication date: 1974-10-24
Also published as: NL7405033A; US4168377A; ES425303A1; AU6783674A; BE813707A; IT7830216A0; CH597259A5; JPS5052217A; AR210456A1; CA1042001A; IT1100950B; GB1471482A; AU504218B2; DE2417859C2

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Wrier :,;akn,

Dipl.-Ing. H. Wf. "CK','Ann, DiPi^-Purs. Dr.. K. Dipl.-Ing. R A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH S60S20

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 3921/22

CHOAY S.A.
48, Avenue Theophile Gautier, 75782 Paris CEDEX

"Verfahren zur Herstellung von gemischten Heparinsalzen"

Me Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung von einfachen Salzen von Heparin, die andere Metallkationen als Natrium enthalten oder von gemischten Salzen von Heparin, d.h. Heparinsalzen, die mehrere Metallkationen entha3.ten, darunter gegebenenfalls iJatriumkationen, und deren relati- · ver G-ehalt an diesen Kationen frei gewählten Werten entsprechen.

Die Erfindung betrifft ferner neuer Heparinsalze, die als Wirkstoffe für Arzneimittel, -insbesondere als Antikoagulan«

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tien geeignet sind, die sämtliche bekannten therapeutischen, Eigenschaften von Heparin entfalten und praktisch fre-i sind von Sekundär effekt en, wie Hautblutungen und Heiaa-tomen, die bis zum heutigen Tag die Verwendung von Heparin für bestimmte therapeutische Zwecke eingeschränkt haben«

Es ist bekannt, daß die im Handel erhältlichen oder gereinigten Heparine häufig in Form ihrer Natriumsalze zur Verfügung stehen, die im allgemeinen bei der Gewinnung und Reinigung dieses Materials gebildet werden, insbesondere bei der Exteaktioii aus natürlichen biologischen Medien.

Es ist andererseits bekannt, daß die Verwendung dieser Salze, deren antikoagulierende Wirkung wohl bekannt ist, in der Therapie nicht frei von Nachteilen ist. Da das Heparin für Kalzium eine stärkere Affinität besitst als für Natrium, wird die Verabreichung voii.Heparinnatrium oder ITatriumheparinat von einer Bindung von Kalzium begleitet, das aus verschiedenen Geweben des Organismus und insbesondere im lokalen Bereich der Gefäß- und Kapillarwandungen entnommen wird.

Im Pail der subkutanen. Verabreichung einer Lösung mit erhöhter Konzentration erfolgt die Chelatbildung des Kalziums überwiegend auf Kosten der kleinen benachbarten Kapillaren, deren Permeabilität dadurch vermindert wird, was Hautblutungen und Hematomen zur Folge hat.

Zur Überwindung dieser Schwierigkeiten wurden bereits vorgeschlagen, die Natriumkationen dieser Heparinsalze teilweise zu ersetzen und zwar insbesondere durch Kalzium. Die hierdurch erhaltenen Salze, die bereits einen merklichen Gehalt an Kalziumionen aufweisen, haben sich als für die Therapie viel leichter verwendbar erwiesen. Sie enthalten

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jedoch merkliche Mengen natrium, die sich in' der Größenordnung von etwa 5 "bis 4 Gew.-# erstrecken. Es wurde ferner festgestellt, daß diese, zwar an Kaisern angereicherten, gemischten So.lze dennoch in der Lage sind, gewisse der "bereits angesprochenen Sekundäreffekte herbeizuführen, insbesondere bei der Behandlung 'von akuter, übermäßiger Gerinnbarkeit (llyperkoagulabilität), v/o zu lokale, z.B. subkutane Injektionen von Dosierungen mit hoher Heparinkonzentration erforderlich sind, um eine schnelle und kräftige antikoagulierende Wirkung herbeizuführen.

Die bislang zur Substitution des Hatriurns durch Kalzium verwendeten Verfahren bestehen im allgemeinen darin, entweder die Katriumsalze von Heparin direkt mit einem Kalziumsalz, z.B. Kalziumchlorid, in Berührung zu bringen, oder das Heparin in freier Porm zu isolieren, insbesondere auf einem S3.ureii oder schwach-säur en Ionenaustauscherharz.

Das direkte Kontaktverfahren gestattet jedoch nur einen beschränkten Ersatz der Natriumionen des eingesetzten Salzes durch Kalziumionen. Gewiß ist bei einer gegebenen Heparinkonzentration festzustellen, daß die Zugabe wachsender Kalziumchloridmengen in einer ersten Stufe zu einer quantitativen Bindung der zugegebenen Kalziumionen an das Heparin führt. Zum Beispiel erhält man, wenn man zu 100 g Heparin-Natrium 6,5 g Kalzium in Form Kalziumchlorid, insbesondere unter Einhaltung der in den Beispielen angegebenen Bedingungen, zugibt, sehr leicht ein gemischtes Heparinsalz, das einen Kalziumgehalt von 6 Gew.-$ aufweist. Die Analyse dieses Heparinsalzes zeigt jedoch, daß es noch einen Natriumgehalt von 5» 12 Gew.-$ besitzt.

Man beobachtet jedoch andererseits, daß in einer zweiten Stufe, insbesondere nachdem ein Kalziumgehalt von 6 fo er-

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reicht ißt, die Bindung des Kalziums nicht mehr quantitativ erfolgt, wenn die Kalziuiacliloriösugabo fortgesetzt wird. Zum .Beispiel ist es cur Erzielung eines Kalaiuirige» halt es von 8,75 i-> notwendig, au dem Medium 12 ^{,ί Kalzium ssuaugeben. Selbst wenn die Zugabe bis jüu einer erheblichen Kalzium]; onaontration fortgesetzt wird, gelingt es nicht_y das Natrium vollständig axissutausehom.

Somit erscheint dieses Verfahren nicht dozu geeignet hu sein, ein vollständig Hatriiim onen--freies Heparinkalziura (Kalzitimheparinat) herzustellen. Gans allgemein ist es auch, jedenfalls bei Einhaltung der bekannten Bedingungen, nicht dazu geeignet, gemischte Salze von Heparin, z.B. von Kalzium und Magnesium, herzustellen, die praktisch vollständig fx^ei von Natriumionen sind, v-enn man als Ausgangsmateria.1 Heparinnatrium verwendet.

Die andere stark verallgemeinerte Form der oben angegebenen Verfahrensweise könnte im Prinzip diese Nachteile vermeiden. Die Anwendung des Heparins in Form der freien Säure führt jedoch zi* einer Reihe anderer Nachteile, von denen der gravierendste die Instabilität der Heparinsäure betrifft, gleichgültig welche Verfahrensbedingungen angewandt werden. Der beobachtete Verlust der antikoagulierenclen Wirkung liegt zwischen 20 und 30 ^, bezogen auf das eingesetzte Heparin.

Weiterhin ist ohne weiteres zu erkennen, daß dieses Verfahren nur sehr schwer, wenn überhaupt, für die Herstellung von gemischten Salzen geeignet ist, deren relative Konzentrationen an verschiedene Metallionen vorherbestimmten Werten entsprechen.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, diese verschiedenen Fachteile zu überwinden.

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Sie ist insbesondere dai?auf gerichtet, von Hatrium befreite Heparinsalse zu schaffen, die in allen Fällen ohne das Risiko des Auftretens der oben angegebenen Sekundäreffekte verwendet v/erden können. Sie betrifft ferner ein Verfahren, mit dem man ausgehend von einem gegebenen einfachen Heparinsalz, insbesondere von einem ITatriuruealz des Ileparins, ohne weiteres sov/obl einfache Heparinsalze eines von Natrium verschiedenen Metalls, die praktisch frei sind von irgendwelchen anderen Metallionen, sowie gemischte Salze, die frei vorh.erbestimmba.re, relative Gehalte an bestimmten Metallionen aufweisen, gleichgültig v/elcher Art diese sind.

Die erfindungsgemäßen Heparinoalae sind dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Natriumgehalt von weniger als O,1 % aufweisen.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Kalziumsalze von Heparin, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie mindestens 10 Gew.~?& Kalzium enthalten. Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Heparinöalz enthält 10,3 bis 10,6 Gew.-?S Kalzium und weniger als 0,1 G-ew.-^o Natrium.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von einfachen Heparinsalzen, die von ITatrium verschiedene Metallkationen enthalten oder von gemischten Heparinsalzen, bei dem in einer ersten Phase ein einfaches, als Ausgangsmaterial verwendetes Heparinsalz mit einem Salz des Metalles, mit dem man das in dem Ausgangsheparinsalz enthaltene ersetzen will, in Berührung gebracht wird, und das dadurch gekennzeichnet ist, daß man anschließend in ■ einer zweiten Phase mindestens einen Behandlungszyklus durchführt, der darin besteht, daß man die freien Metallionen von dem erhaltenen Heparinat abtrennt und das erhaltene Hepa3?inat erneut mit dem das Substitution.smetall ent-

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haltene Salz in Berührung bringt.

Vorzugsweise verwendet man als einfaches Ausgangshepar-insalz Heparinnatrium (Natriumheparinat) .

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß nach der Reaktion des Heparinnatriums mit ■Kalziumchlorid die im Verlaufe der anfänglichen Reaktion in 3Porm von Natriumchlorid freigesetzte ITatriumionen mit den Kalziumionen konkurrieren und schließlich den Austausch blockieren, trotz der Tatsache, daß die Affinität.des Heparins für Kalzium größer ist als für Hatrium. Die vorherige Entfernung der Natriumionen gestattet anschließend die Substitution der noch in dein Heparinat enthaltenen Natriumionen durch Kalziumionen.

Es versteht sich, daß bei der Reaktion eines als Ausgangsmaterial eingesetzten Salzes, wie Heparinnatrium oder eines Heparinsalzes mit einem anderen Metall, mit einem Metallsalz, das von einem Kalziumsalz verschieden ist, äquivalente Phänomene zum Tragen kommen.

Es hat sich gezeigt, daß, wenn man in der genannten zweiten Phase eine einzige Abtrennung der freien Metallionen, gefolgt von einer einzigen erneuten Behandlung der das Heparinat enthaltenen Lösung mit einer ausreichenden Menge eines Salzes des substituierenden Metalles ein Heparinat ' herstellen kann, das einen höheren Gehalt an Ionen des Substitutionsmetalls enthält, als es das Heparinat enthalten würde, das man nach Durchführung einer einzigen ersten Phase erhalten würde, selbst wenn man eine wesentlich größere Menge des Salzes des Substitutionsmetalls, bezogen auf das Ausgangsmaterial eingesetzte einfache Salz, verwenden würde.

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Mit anderen Worten besteht das erfindungsgemäße Verfahren, wenn es auf die Herstellung einen einfachen natriumfreien Heparinsaliscs, z.B. das Kalziumsala, gerichtet int, in einer ersten Phase,-in der man ein Hatriumsals von Heparin Kit einem Salz des Metalls, das Natrium ersetzen soll, insbesondere Kalzium, z.B. 'Kaliumchlorid, in Berührung bringt und anschließend in einer zweiten Phase mindestens einen Behandlungszyklus durchführt, der die Abtrennung der freien Metallionen von dem erhaltenen Heparinat und eine erneute Behandlung des erhaltenen Heparinats mit dem Kalziumsalε umfaßt, bis man eine praktisch vollständige oder totale Befreiung des als Ausgangsmaterial eingesetzten Heparinsalzes von Natrium erreicht hat. Die zwischenzeitlich im Verlaufe der genannten Abtrennungsphase durchgeführte Beseitigung der Natriuraionen gestattet die Weiterführung der Substitution der Natriumionen.

Es ist festzustellen, daß wenn die Behandlung in der ersten Phase bereits eine relativ weitgehende Substitution der in dem anfänglich eingesetzten Heparinat enthaltenen Metallionen durch die Ionen des Substitutionsmetalls bewirkt hat, ein einziger für die zweite Phase des erfindungsgemäßen Verfahrens charakteristische Behandlungszyklus dazu ausreichen kann, einen vollständigen Ersatz der in dem Ausgangsheparinat enthaltenen Metallionen zu bewirken.

Beispielsweise ist es möglich, von einer Heparinsalzlösung, die 8,75 $ Kalzium enthält, ausgehend eine praktisch vollständige Befreiung dieses Salzes von Natrium zu bewirken, indem man dieses Heparinsalz nach der Abtrennung der in dem Medium enthaltenen freien Metallionen mit einer Kalziuinchloridmenge in Berührung bringt, die - bezogen auf das Heparinat - 10 Gew.-$ Kalzium entspricht. Das Heparinat enthält nach Beendigung dieser Behandlung etwa 10,5-Kalzium.

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Wenn man eine Lösung des gleichen Hepaxinato, das 8,75 'K-KaIζium enthält, mit einer Kiilaiurachloridmenge in Berührung "bringt, die nur 3 Gew.-^ Kai ζ ium entspricht, erhält man-trotzdora ein Heparinat, das bereits 10,2 fi Kalzium enthält .

Die in der zweiten Phase des Verfahrens erforderliche Abtrennung der freigesetzten Ionen kann in irgendeiner, an sich bekannten Weise erfolgen. Vorzugsweise bewirkt man eine Dialyse, insbesondere gegen entnineralisiertes Wasser, oder man fällt das erhaltene Heparinat in einem Medium aus, in dem die aus den freigesetzten Metallionen gebildeten Salze löslich sind, insbesondere in einem wäßrig-alkoholischen Medium, das vorzugsweise eine Konzentration von 70° GL nicht übersteigt.

Wenn man eine Dialyse, insbesondere gegen eiitmineralisiertes Wasser, durchführt, muß diese normalerweise während einer Zeitdauer erfolgen, die für eine praktisch vollständige Beseitigung der nach der ersten Behandlung freigesetzten ITatriumioneii ausreicht. Diese Dialyse kann gegebenenfalls gleichzeitig mit dieser ersten Behandlung erfolgen, wenn man von Anfang an mit einem Überschuß des Kalziumsalzes arbeitet und die freigesetzten Natriuinionen in dem Maße, in dem sie freigesetzt werden, von dem Eeaktionsmediuni abtrennt, so daß man nach dieser ersten Behandlung oder diesem ersten Inberührungbringen, wenn man vorher bestimmte Mengen, z.B. des ITatriumsalzes, des Heparins und des Kalziumchlorids, anwendet, eine weitgehendere Entfernung des Natriums aus dem anfänglich eingesetzten Heparin erreicht, als man es erzielen würde, wenn man die gleichen Reagensmengen einsetzt, jedoch die Dialyse nicht gleichzeitig durchführt.

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Die Dialyse kann gegebenenfalls erst in dein Augenblick durchgeführt v/erden, da eine teilweise Substitution dea Natriums durch Kalzium, z.B. von 6 fo_f erreicht ist, d.h.. dem Augenblick, da der Wettstreit der Hatriumionen mit den Kalziumionen, der als "weitere Substitution verhindert, erheblich wird. ΖνύΆ Beispiel kann man, wenn man ein Heparin— salz, das 8,75 P Kalzium enthält, herstellen will, das als Ausgangsmaterial eingesetzte Heparinnatrium mit einer Kalziumchlor.tdmenge in Berührung bringen, die einer Zufuhr von 12 ia Kalzium entspricht, worauf die Dialyse in dem Augenblick durchgeführt wird, da die an das Heparin gebundene Kalziummenge 6 $ erreicht hat, was etwa 16 Std. nach dem Inberührungbringen des Natriumsalzes von Heparin mit Kalziumchlorid der Fall ist, wobei die Dialyse dann während etwa 6 Std. durchgeführt wird.

Wenn man die Ausfällungsmethode anwendet, wird der erhaltene Heparinatniederschlag erneut in destilliertem Wasser gelöst und mit Kalziumionen in Berührung gebracht, die insbesondere in l'orm von Kalziumchlorid zugeführt wez^den. In dieser Weise kann man leicht, z.B. ausgehend von einer Lösung eines gemischten Natrium-Kalziuni-Heparinsalzes, das einen ICaIziumgehalt von 8,75 $ enthält, und das unter Einhaltung der obigen Bedingungen erhalten wurde, durch einfache Ausfällung des gemischten Heparinats mit neutralem Äthylalkohol und Wiederauflösen dieses Niederschlags in Wasser und Zuführen einer wäßrigen Lösung, die unter Einsatz einer PCalziumchloridmenge hergestellt wurde, die, bezogen auf das anfänglich eingesetzte Heparin, eine Zuführung von 3 io Kalzium bewirkt, ein Kalziumsalz von Heparin herstellen, das praktisch frei von Natriumionen ist.

Es versteht sich schließlich von selbst, daß man die beiden Abtrennungsverfahren kombinieren kann, und zunächst eine

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Dialyse des Mediums durchführt und dann das Heparinat ausfällt, uTii es von dem Reaktionsmedium abzutrennen, worauf man das ausgefällte Heparinat erneut in Lösung bringt und mit-dem da,s gewünschte substituierende Metall enthaltende Salz in Berührung bringt.

In allen Fällen erhält man somit ohne weiteres ein Kalziumheparinat, daö einen Gehalt an Kalziumionen zwischen 10,3 iind 10,.6 fo und einen Hatriumgehalt von weniger als 0,1 °/o aufweist. Glücklicherweise hat es sich gezeigt, daß das Endprodukt die antikoagulierende Wirkung des anfänglich eingesetzten Heparins vollständig beibehalten hat.

Die Verwendung dieses natriumfreien Kalziumhepa/rinats in der Therapie ist dadurch von Vorteil, daß es in sehr konzentrierten Dosierungen durch lokale, insbesondere subkutane Injektionen verabreicht werden kann. Es ist ebenfalls möglich, einen maximalen. Nutzen aus der starken antikoagulierenden Wirkung des Heparins zu ziehen und dennoch die Patienten von den oben bereits kurz" angesprochenen Nachteilen zu bewahren.

Hinzukommt, daß die subkutane Verabreichung einer Lösung mit hoher Konzentration besonders interessant ist, da in dieser Weise die antikoagulierende Wirkung d.es Heparins verzögert werden kann, wodurch Perfusionen oder wiederholte intravenöse Injektionen vermieden werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet somit in einfacher Weise die Herstellung eines Heparinka,lziums, ohne daß es erforderlich ist, die Heparinsäure als Zwischenprodukt herzustellen, wodurch das Risiko eines Verlustes der antikoagulierenden Aktivität ausgeschlossen wird.

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Man kann unter den gleichen Bedingungen auch Hepar.inate von Magnesium oder anderen Kationen herstellen, die vollständig van Natrium befreit sind.

Die obigen .Ausführungen betrafen insbesondere die Anwendung des erfindungogemäßen Verfahrens zur Herstellung von einfachen Hepar-inaalzen, die Kationen enthalten, die von den ursprünglich vorhandenen, insbesondere Natrium, verschieden sind.

Das Verfahren ist jedoch auch zur Herstellung von gemischten Heparinsalzen geeignet, die die Ionen des genannten SuTdstitutionsmetalls und Ionen eines anderen Metalls in vorher bestimmten Verhältnissen enthalten, wenn man erfindungsgemäß eine dritte Phase-durchführt, die darin besteht, das nach der genannten zweiten Phase erhaltene einfache Heparinsalz des Substitutionsmetalls mit einem Salz des genannten weiteren Metalls in Berührung bringt, wobei man •dieses in solcher Menge verwendet, daß sich die gewünschten relativen Verhältnisse, des genannten Substitutionsmetalls und des genannten davon verschiedenen Metalls in dem als Endprodukt erhaltenen gemischten Heparinsalz ergeben.

Es kann natürlich auch der Fall eintreten, daß der Anteil der Ionen des Substitutionsmetalls, der in dieser Weise im Verlauf der in Betracht gezogenen dritten Phase substituiert werden kann, einerseits unter ähnlichen Bedingungen, wie sie weiter oben hinsichtlich der Behandlung des Natriuinsalzes von Heparin mit einem Kalziumsalz, wie Kalziumchlorid, eingeschränkt sein kann. Es versteht sich, daß man in dem EaIl, da man die Grenzen des Substitutionsverhältnisses überschreiten will, die mit einer einfachen Behandlung nicht erreicht werden können, auf das oben erwähnte Zweiphasenverfahren zurückgreifen muß.

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Man verfügt in dieser Weise über ein sehr geeignetes Verfahren zur Herstellung von gemischten Heparinsalzen mit vorher bestimmten relativen Gehalten von irgendwelchen unterschiedlichen Ketallioiien, bei dem man als .Ausgangsmaterial insbesondere Hatriumheparinat verwendet und über das Zwischenprodukt eines vollständig von Natrium befreiten einfachen Salzes eines der Metalle, das in dem gemischten Salz vorhanden sein soll, das Endprodukt erhält. Zum Beispiel bildet man zur Herstellung eines gemischten KalziuiL- und Magnesiumsalzes von Heparin, ausgeh.end von einem Natriumsalz von Heparin, zunächst das einfache, von Hatrium befreite Salz eines dieser Metalle, indem man die beiden ersten Phasen des erfiiidungsgemäßen Verfahrens durchführt, wonach man die Metallionen des gebildeten einfachen Heparinsalzes in dem gewünschten Aiismaß substituiert, indem man das letztere in der genannten dritten Phase mit einer entsprechenden, vorher bestimmten Menge eines Salzes, z.B. eines Chlorids, des anderen Metalls in Berührung bringt, was in den folgenden Beispielen genauer erläutert werden wird.

Zur Bildung der gemischten Salze, die als eine Sorte der Metallioneii diejenigen des in der ersten Phase des erfindungsgemäßen Verfahrens als Ausgangsmaterial eingesetzten Heparinsalzes, z.B. Uatrium enthalten, dessen Gehalt des anderen Metallion größer ist als der durch einfaches Inberührungbringen der entsprechenden Reagentien erreicht werden kann, z.B. eines gemischten Heparinats mit hohem Kalziumgehalt und geringem Hatriumgehalt, kann man die Reaktionen der ersten und zweiten Phasen des genannten Verfahrens nicht in der Weise durchführen, daß man ein vollständig von Natrium befreites Kalziumsalz erhält. So kann man insbesondere ge-.-.'ngere Mengen der Kalziumsalze, die entsprechend der gewünschten Endzusaminensetzung des gemischten Salzes gesteuert werden, bei diesen ersten und zweiten Phasen verwenden.

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Um das gleiche Ziel zu erreichen, kann man natürlich auch zunächst das von Natrium befreite Kalziunisala herstellen und dann dieses mit einer ausreichenden Menge Natriumchlorid in Berührung bringen, um einen "begrenzten Austausch der Kalziumionen durch die Natriumioneii zu bewirken.

Das erfindungsgemäße Verfahren ge.stattet ferner die Herstellung von gemischten, praktisch natriumionenfreien Heparincalzen, z.B. von Kalzium und Mangesium, ausgehend von einem aus Hatriumheparinat bestehenden Ausgangsmaterial.

So kann man aufgrund des erfindungsgemäßen Verfahrens gemischte Heparinate herstellen, die vorher bestimmte relative Mengenverhältnisse aufweisen, die besonderen gewünschten Erfordernissen entsprechen, die eine Punktion der Anwendungsformen sind, insbesondere im therapeutischen Bereich und die den Bedingungen entsprechen, bei denen derartige Heparinate verabreicht werden»

Im folgenden wird eine allgemeine Ausführungsforin der Herstellung eines natriumfreien Kalziurasalzes von Heparin beschrieben (wobei es sich versteht, daß man unter äquivalenten Bedingungen natriumfreie Salze anderer Metalle herstellen kann), wobei die verschiedenen Beispiele dazu dienen, die Anpassungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens und die verschiedenartigen damit herzustellenden Produkte zu erlä.utern.

ALLG-EMEIHE VEKFAHREKSIfBISE

Im folgenden sei eine allgemeine Ausführungsforin zur Herstellung von Heparinkalzium, das praktisch vollständig frei von Natrium ist, ausgehend von Heparin in Porm des Natrium-

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salzes "beschrieben.

Man löst das Heparinriatrium in destilliertem Wasser unter Bildung einer Lösung, die 15 000 bis 20 000 Ul/ml enthält, d.h. eine Konzentration von 10 "bis 12,5 $£ aufweist. Man hält die Temperatur zwischen 10 und 40⁰C, vorzugsweise "bei 25°C. Unter Rühren gibt man su der Heparinlösung Kalzium in Form von Kaliumchlorid in einer Menge zwischen 10 und 40 ^c/o, vorzugsweise 12 fo Kalzium, bezogen auf das Gewicht des eingesetzten Heparins. Man bringt dea pH-Wert des Mediums in CaO auf einen Wert von 7>5 und rührt dann wahrend 8 "bis 24 Std._t vorzugsweise während 16 Std. bei einer Temperatur von 25⁰C. Nach Ablauf dieser Zeit führt man während 6 Std. eine Dialyse durch. Das Dialysat wird aufgefangen und über eine Asbestplatte filtriert.

Das filtrierte Dialysat wird durch Zugabe von Chlorwasserstoff säure auf einen pH-Wert zwischen 4 und 7»5, vorzugsweise 6,5f gebracht. Dann gibt man 1,5 Teile neutralen Ithylalkohol (Konzentration 96° GL) pro einen Teil des Dialysats zu. Man läßt während 2 bis 6 Std. stehen und gewinnt das gebildete Heparinat mit neutralem Alkohol mit einer Konzentration von 99,5° GL. Dann verreibt und rührt man das Material gleichzeitig. Das nach der Filtration erhaltene gemischte Kalziumheparinat wird in der zur Bildung einer 15 000 bis 20 000 Ul/ml enthaltenden Lösung entsprechenden Wassermenge gelöst. Dann setzt isan unter Rühren und bei. einer Temperatur von 25⁰C zwischen 3 und 15 °ß>, vorzugsweise 10 $> Kalzium in Form von Kaliumchlorid zu. Man rührt während 8 "bis 24 Std, vorzugsweise während 12 Std., wobei man den pH-Wert durch Zugabe von Ca(OH)₂ oder 2n HCl bei 7,3 einstellt.

Mach 12-stündigem Rühren verteilt man die Kalsiumheparinat-Lösung in Dialyse schläuche und führt die Dialyse bei Raura-

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temperatur während etwa 6 Std. gegen pyrogenfreies, entmineralisiertes Wasser durch.

Das erhaltene Dialysat "besitzt bei 25°C eine leitfähigkeit und IO OCO/U HhO und einen pH-Wert von 7,2. Man stellt den pH-Wert durch Zugabe von 2n Chlorwasserstoffsäure auf einen Wert von 5,5 ein, gibt 3 foo m-Cresol als Bakteriostatikum zu und filtriert das Dialysat über Asbest. Das Kalsiumheparinat wird nach 2-stündigem Stehenlassen durch Zugabe von 1,5 Teilen neutralen Äthylalkohol, der eine Konzentration von. 96° CrL aufweist, aus der Lösung ausgefällt.

Das Kalziumheparinat wird in 10 Volumen neutralen Äthylalkohol mit einer Konzentration von 99,5° GL aufgenommen, verrieben, filtriert und auf einem Büchner-Eilter mit neutralem Äthylalkohol (99,5° GL) gewaschen. Das in dieser Weise erhaltene von Natrium befreite KalKiumheparinat wird anschließend bei 25°C im Vakuum bei 0,1 Torr getrocknet .

In dieser Weise kann man ohne weiteres, ausgehend von einem Co&ex-Heparin in !form des Natriumsalzes in der weiter unten angegebenen Zusammensetzung ein Kalziumheparinat herstellen, das

eine antxkoagulierende Wirkung im Bereich von 160 UI/mg,

einen Kalziumgehalt im Bereich von 10,6 $ und

einen IJatriumgehalt im Bereich von 0,05 $ aufweist.

Das in den folgenden Beispielen verwendete Heparin entspricht den folgenden Normen:

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Aussehen:

5 folge Lösung:

Schwermetalle:

Proteine:

Gesamtstickstoff:

Schwefel:

Antikoaguli οr end e Wirkung:

Pyrogene Substanzen.:

Histaniinsubstanzen: Ammoniumgehalt: Kalziumgehalt: Natriumgeha.lt: Kaliumgehalt: Magnesiumgehalt:

konform klar
keine keine 2,2 Io 10,7 <P 166 Ul/irig

pyrogenfrei (nach den allfiemein en Analys c^/erfahren der Pharruacop6e Pran™ 9 ai s e 8.Auf1age, S. 1615).

keine

< 0,1 f.

< 0,1 Jt 11,5 ^ 0,5 ^ <0,1 ^.

Beispiel 1_ Kalziumhepai'inat (Heparinlcalzium)

Man löst 100 g Codex-Heparin, das den dohen angegebenen Normen entspricht und eine antikoagulierende Wirkung von 160 TJI/mg aufweist, d.h. insgesamt 16 000 000 UI, in 800 ml destilliertem Wasser. Die Leitfähigkeit beträgt bei 25°C 22 000 /ti MhO, während sich ein pH-Wert von 7 einstellt. Unter Rühren gibt man das Äquivalent von 12 g Kalzium in Form von CaCl₂^HpO (MG- = 147) d.h. 44 g CaCl₂'2H₂O zu. Die Leitfähigkeit beträgt 50 000/U MIiO und der pH-Wert 5. Dann setzt man 200 mg

0 zu, um den pH-Wert auf 7,5 einzustellen und rührt während 16 Std., wobei man die Temperatur bei 25°C hält. Fach dem Rühren verteilt man die Lösung in Präzisionsschläuche, die unter der Bezeichnung NOJAX "bekannt sind, in Anteilen von

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jeweils 300 nil/Schlauch, und bringt die Schläuche mit 6 Ltr. entmineralisierteni Wasser in Berührung, dessen Widerstand 1000 k/l/cm beträgt und läßt V/asser während 6 Std. einwirken'. Man erhält 1600 ral eines Dialysats, dessen Leitfähigkeit 20 000 zu HhO aufweist und das einen pH-Wert von 7 besitzt.

Das Dialysat wird über einen Büchner-Trichter filtriert, der zuvor durch Behandeln mit Eau de Javelle gereinigt, dann mit pyrogenfreiern, entmineralisiertem V/asser gewaschen, ein weiteres Mal mit Wasser, das 3 ^cß>_o Phenol enthält, gereinigt und schließlieh bis zur Neutralität mit entmineralisiertem, pyrogenfreiem Wasser gewaschen wurde. Die filtration erfolgt über eine unter der Bezeichnung EKS 2 bekannte Asbestscheibe, die zuvor mit einer 5n HCl-Lösung und dann mit entmineralisiertem, pyrogenfreiem Wasser bis zur Neutralität gewaschen wurde.

Die Filtration erfolgt im Verlaufe von 1 Std., worauf das Produkt auf der Asbestscheibe mit 250 ml entmineraliöiertem Wasser gewaschen wird. Man vereinigt das 3?iltrat und die Waschflüssigkeit und erhält 1900 ml einer !Flüssigkeit, die man durch Zugabe einiger Tropfen 2n Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 6,5 einstellt, worauf man unter Rühren 2850 ml neutralen Äthylalkohol (Konzentration 96° GL) zugibt. Man läßt während 2 Std. stehen und nimmt das erhaltene gemischte Kalzium-Natrium-Heparinat in 1000 ml Äthylalkohol (99,5° GL) auf, bewirkt mit Hilfe eines Ultra-Turax-Rührers ein Verreiben und filtriert unter schwachem unterdruck bei einem Büchner-Trichter und saugt maximal unter Druck ab. Man nimmt das gemischte Kalzium-Natrium- ' Heparinat unter Rühren in 800 ml destilliertem Wasser auf. Dann gibt Dian das Äquivalent von 10 g Kalzium in Form von Kalziumchlorid, d.h. 36,7 g CaCl₂'2H₂O zu, stellt den pH-

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Viert durch Zugabe von (etwa 100 mg) CaO. auf 7» 3 und rührt während 16 Std. bei Raumtemperatur. Hacli dieser Rührzeit dialysiert man die Lösung erneut und während 6 Std. unter Einhaltung der oben angegebenen Bedingungen. Das Dialysat (15 000 ml) besitzt eine Leitfähigkeit von 10 000 /u MIiO und einen pH-Wert von 7*2. Man bringt den pH-Wert- durch Zugabe von 2n Chlorwasserstoffsäure auf einen Wert von 5»5 und gibt dann 4,5 g m-Cresol zu» Man filtriert die Lösung über eine Asbestscheibe (SKS 2), die in der obigen Weise vorbehandelt worden war. Dann versetzt man. das mit der Waschflüssigkeit vermischte Piltrat (1700 ml) mit 2550 ml neutralem Äthylalkohol (Konzentration 96° GL), wobei man von Hand rührt. ETach 2-stündigeßi Stehenlassen gewinnt man das Kalziumheparinat in 1000 ml neutralem Äthylalkohol (Konzentration 99,5° GL) und zerkleinert es mit .einem Ultra-Torax-Rührer in dem Alkohol. Das Kalziumheparinat wird über einen Büchner-Trichter filtriert, abgesaugt, mit . 200 ml Äthylalkohol (99,5° GL) gewaschen'und dann bei einer Temperatur von 45°C im Vakuum (0,1 Torr) getrocknet. Man erhält 102 g Kalziumheparinat mit folgenden Eigenschaften:

Antikoagulierende Wirkung: 155 Ul/mg, d.h.. 15 800 00 TJI, was einer Ausbeute von 99 ?<> entspricht.

Der Kalziumgehalt des wasserfreien Produkts betz-ägt 10,4 während das wasserfreie Produkt einen Hatriumgehalt von 0,05 $> aufweist.

Beispiel Kalziumheparinat

Man löst 10 000 g Codex-Heparin mit einer Aktivität von 160 Ul/mg, d.h. insgesamt 1 600 000 000 DI, in 80 Ltr. destilliertem Wasser. Die Leitfähigkeit beträgt bei 25°C

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22 000 /Ii MhO, während sich ein pE-¥ert von 7 ergibt. Unter Rühren setzt man das Äquivalent von 12 000 g Kalzium in Porm von Kalziuachlorid-dihydrat, d.h. 4400 g CaCl₂*2H_?0 zu. Die Leitfähigkeit des einen pH-Wert von 2,5 aufweisenden Mediums "beträgt 50 GOO /u MaO. Man "bringt den pH-Wert durch Zugabe von 20 g Kalziuinoxyd auf einen Wert von 7,5 und rührt während 16 Std. bei 25⁰O. Nach Beendigung des Rührens verteilt man die Lösung in Nojax-Präzisionsschläuche, wobei man pro Schlauch 300 ml einfüllt. Man bringt die Schläuche in ein Bad ein, das 600 Ltr. entinineralisiertes, pyrogenfreies Wasser mit einer Leitfähigkeit von 1000 k /cm enthält und läßt während 6 Std. einwirken. Das eine Leitfähigkeit von 20 000/U MhO aufweisende Dialysat besitzt ein Volumen von 160 Ltr. und zeigt einen pH-Wert von 7.

Das Dialysat v/ird über einen rostfreien (inox) Büchner-Trichter filtriert, der durch Behandeln mit Eau de Javelle gereinigt, mit entmineralisiertem, pyrogenfreiem Wasser gewaschen, erneut mit Wasser, das 3 °/>cPhenol enthält, gereinigt und schließlich mit entmineralisiertem, pyrogenfreiem Wasser "bis zur Neutralität gewaschen wurde. Die Filtration erfolgt unter Verwendung einer Asbestscheibe (EKS 2), die zuvor mit einer 5n HCl-Lösung behandelt und mit entmineralisiertem, pyrogenfreiem Wasser bis zur Neutralität gev/aschen worden war.

Die Eiltration erfolgt im Verlaufe von 12 Std., worauf man das Produkt auf der Asbestscheibe mit 25 Ltr. entmineralisiertem, pyrogenfreiem Wasser wäscht.

Dann vereinigt man das Eiltrat und die Waschflüssigkeit, wobei man 165 Ltr. erhält, die man durch Zugabe von 2n Chlorwasser stoff säure auf einen pH-Wert von 6 einstellt und unter Rühren mit 277,5 ltr. neutralem Äthylalkohol (96° GL) ver-

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setzt. Man läßt während 2 Std. stehen und gewinnt da;j erhaltene gemischte Kalzium-Natrium-Kepariiiat in 100 ml Äthylalkohol (89,5° G-L) von Hand. Man nimmt das gemischte Kalzium-liatriur.-Heparinat in 80 Ltr. destilliertem Wasser auf und gibt unter .Rühren das Äquivalent von 1000 g Kalzium, d.h. 3 670 g CaCl₂'2H₂O zu. Man stellt den pH-Wert durch Zugabe Ton (etwa 1000 mg) Kalziumoxyd auf 7,3 ein und rührt während 16 Std. bei 25°C. !Jach Beendigung des Rührvorgangs dialysiert man die lösung erneut unter den gleichen Bedingungen wie oben angegeben, während 6 Std. Das Dialysat (150 Ltr.) besitzt eine Leitfähigkeit von 10 000/U MhO und einen pll-¥ert von 7,2. Man bringt den pH-Wert durch Ziigabe von 2n Chlorv.^rasserstoffsäure auf einen Wert von 4,5 und setzt dann 450 g m-Cresol zu. Die Lösung wird über eine in der obigen Weise vorbehandelte Asbestscheibe (EES 2) filtriert. Me nach dem Vereinigen des Piltrats mit der Waschflüssigkeit erhaltene Lösung (170 Ltr.) wird unter Rühren mit der Hand mit 255 Ltr. neutralem Äthylalkohol (Konzentration 96° G-L) versetzt. Nach 2-stündigea Stehenlassen sammelt man das Kalziumheparinat in 100 Ltr. neutralem Äthylalkohol (Konzentration 99,5° GL) -und verreibt es in dein Alkohol unter Verwendung eines TJltra-Turax-Rührers. Dann filtriert man das Kalziumheparinat über einen Büchner-Trichter, saugt es ab, wäscht es mit 200 ml Äthylalkohol (99,5° GL) und trocknet es bei 45°C im Vakuum (0,1 Torr). Man erhält 10 300 g Kalziumheparinat mit einer Aktivität von 155 UI/mg, d.h. insgesamt 1 600 000 000 UI. (Ausbeute 100 #). Kalziumgehalt: 10,4 %
Natriumgehalt: 0,04 $·

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Beispiel 3

Herstellung von Magneeiumheparinat

Man löst 100 g Codcx-Heparin, das don obigen Normen entspricht und eine Aktivität von 160 g UI/ing aufweist, d.h. 16 000 000 ITI in 800 ml destilliertem Wasser und erhält eine Lösung mit einer Leitfähigkeit "bei 25⁰C von 22 000 Ai WhO und einen pH-¥ert von 7« Unter Rühren gibt man dann das Äquivalent von 12g Magnesium, d.h. 100 g MgCIp"6HgO zu. Die Leitfähigkeit "beträgt 50 000/U MiO, -während sich ein pH-Wert von 5 ergibt. Zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,5 gibt man 200 rag MgO und rührt während 16 Std. bei 25°C. Nach Beendigung des Rührvorgangs verteilt man die Lösung in Nojax-Präzisionsschläuche, wobei man pro Schlauch 300 ml einführt und bringt die Schläuche mit 6 Ltr. entmineralisiertem Wasser in Berührung, dessen Widerstand 1000 k-fl/cm aufweist und läßt während 6 Std. stehen. Man erhält 1 600 ml des Dialysats, dessen Leitfähigkeit 20 000 /u MhO und dessen pH-Wert 7 betragen.

Das Dialysat wird über einen Büchner-Ürichter filtriert, der zuvor mit Eau de Javelle gereinigt, mit entmineralisiertem, pyirogenfreiem Wasser gewaschen, mit einer Lösung von 3 "/<> Phenol in Wasser gereinigt und bis zur Neutralität mit entmineralisiertem·, pyrogenfreiem Wasser gewaschen wurde. Die Eiltration ex'folgt über eine Asbestscheibe (EKS 2), die zuvor mit einer 5n HCl-Lösung und schließlich bis zur Neutralität mit entmineralisiertem, pyrogenfreiem Wasser gewaschen wurde.

Die Filtration erfolgt im Yerlaufe von 1 Std., wobei man das Produkt auf einer Asbestscheibe mit 200 ml entmineralisiertem Wasser wäscht.

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Man vereinigte das I'iltrat und die Waschflüssigkeit und erhält 1900 ml einer Flüssigkeit, die man'durch Zugabe einiger Tropfen 2xi Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 6.,5 einstellt. Dann, gibt man unter Rühren 2850 ml neutralen Äthylalkohol (Konzentration 96° G-L) zu. Man läßt während 2 Std. stehen, gewinnt dann das erhaltene gemischte Hagnesium-liatriuci-Hcpariiiat in 1000 ml Äthylalkohol (99,5° G-L), Dann verreibt man das Produkt leicht mit Hilfe eines Ultra-Turax-Rührers in dem Alkohol und filtriert unter .Anwendung eines schwachen Unterdrucks über einen Büchner-Trichter, worauf man das Produkt maximal unter Druck absaugt.

Man nimmt das gemischte Magnesium-Matriura-Heparinat in 800 ml destilliertem Wasser auf und gibt unter Rühren das Äquivalent von 20 g Magnesium, d.h. 167,5 g Magnesiunichlorid-Eexahydrat zu, stellt den pH-Wert (mit etwa 200 mg) MgO auf 7,5 und rührt während 16 Std. bei 25⁰C Each Ablauf dieser Rührbehandlung dialysiert man die Lösung erneut kwährend 6 Std. unter Einhaltung der obigen Bedingungen. Das Dialysat (1500 ml) besitzt eine Leitfähigkeit von 10 000/U MIiO und einen pH-Wert von 7,2. Man stellt den pH-Wert durch Zugabe von 2n Chlorwasserstoffsäure auf 5»5 ein und gibt dann 4,5 g m-Cresol zu. Man filtriert die Lösung über eine Isbestscheibe (EKS 2), die in der obigen Weise vorbehandelt worden war.

Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Piltrat (1700 ml) wird mit 2550 ml neutralem Äthylalkohol (Konzentration 96° GL) versetzt, wobei man mit der Hand rührt. !lach 2-stündigem Stehenlassen gewinnt man das Magnesiumheparinat in 1000 ml neutralem Äthylalkohol (Konzentration 99,5° GL) und verreibt es in dem Alkohol mit Hilfe eines Ultra-Turax-Rührers. Das Magnesiumheptarinat wird über einen Büchner-

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Trichter filtriert, abgesaugt, mit 200 ml Äthylalkohol (99,5° GL) gewaschen und dann bei einer Temperatur von 45°C im Vakuum (0,1 Torr) getrocknet.

Man erhält"100 g Mangesiumheparinat mit einer antikoagulierenden .Aktivität von 158 UI/mg, d.h. einer Ausbeute von 98,8 °fo, wobei das Produkt einen Magnesiumgeha.lt von 5,4 7° und einen ITatriumgehalt von 0,1 $, bezogen auf das wasserfreie Produkt, aufweist.

Beispiel

Herstellung eines gemischten Kalzium-Magnesium-Heparinats, ausgehend von einem Magnesiumheparinat:

Man löst 100 g Magnesiumheparinat mit einer Aktivität von 158 UI/mg, d.h. insgesamt 15 800 000 UI, dessen Magnesiumgehalt 1,4 fo beträgt, bei 25°C in 650 ml destilliertem Wasser. Dann gibt man unter Rühren 22 g Kalziumchloriddihydrat (MG = 147), d.h. das Äquivalent von 6 g Kalzium, zu. Man stellt den pH-Wert mit einer Spur Kalziumoxyd auf 7,3 ein und rührt während 16 Std. bei 25°C. Dann führt man während 6 Std. eine Dialyse der Lösung gegen entmineralisiertes Wasser durch. Man stellt den pH-Viert mit 2n Chlorwasserstoffsäure auf 5j5· ein und fällt das gemischte Kalzium-Magnesium-Heparinat durch Zugabe von 1,5 Volumen Äthylalkohol (96° GL) aus. Man läßt während 2 Std. stehen und nimmt das gemischte Heparinat in Äthylalkohol (99,5° GL) auf, verreibt es in dem Alkohol, filtriert es und trocknet es bei einer Temperatur von 45⁰C im Vakuum (0,1 Torr).

Man erhält 102 g gemischtes Kalzium-Magnesium-Heparinat mit einer antikoagulierenden Aktivität von 155 UI/mg, d.h. mit einer Ausbeute von 100 ^.

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Gehalt an Ca⁺⁺ = 5,85 ^.
Gehalt an I«Ig⁺⁺ - 2,41 ^.
Gehalt an Na⁺ = 0,02 #.

Beispiel __^_5

Herstellung von. gemischten Kalziiim-Fagnesiura-Hoparinaterj, ausgehend von Ma.gnesiumheparinat:

Ivlach der in. Beispiel 4 "beschriebenen Verfahrensweise erhält man ausgehend von dem 5,4 f° Magnesium enthaltenden Magnesimnheparinat des Beispiels 3 gemischte Kalsium-Magnesium-Heparinate, die Kalzium, Magnesium und Natrium in den in der folgenden Tabelle I angegebenen Mengen enthalten, indes nan das einfache Magnesiuinhepariiiat mit den in der linken Spalte der Tabelle angegebenen Mengen Kalzium (das in Form von CaCl₂"2H₂O zugeführt wird) in Berührung bringt.

	TlBEIiLE	I	gemischten Mg⁺⁺ (fo)	Heparinats an: Na⁺ (SC)
Zugeführte Ca-Menge fo	Gehalt des Ca⁺⁺ (5t)	4,56	0,05
2	1,82	3,2	0,05
4	4,00	2,41	0, ΟΡ
6	5,85	1,85	Ο,02
8	7,05	1,22	0,02
10	8,18

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B e i s ρ i e 1 6

Herstellung eines gemischten Ea.lziujn-Mrignesiuni-Heparina.ts, ausgehend von Kalsinruheparinat mit einem Kalziuingehalt von

Man löst 10Og Kalziumheparinat mit einer Aktivität von 150 UI/mg, d.h. insgesamt 15 800 000 I'll, dessen Kalziumgehalt 10,5 # beträgt bei 25⁰C in 650 ml destilliertem Wasser. Dann gibt man unter Rühren 50 g Magnesiumchloridhexahydrat (ViQ- — 203,3), d.h. das Äquivalent von 6 g Magnesium zu. Man stellt den pH-Wert diirch Zugabe einer Spur Magnesiumoxyd auf 7,3 ein χναά. rührt während 16 Std. Dann, dialysiert man die lösung während 6 Std. gegen entmineralisiertes Wasser. Man stellt den pH-Wert durch Zugabe von 2n Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 5,5 ein und fällt das gemischte Kalsium-Magnesium-Heparinat durch Zugabe von 1,5 Volumen neutralen Äthylalkohols (Konzentration 96 Gl) aus. Man läßt während 2 Std. stehen, nimmt das gemischte Heparinat in neutralem Äthylalkohol (Konzentration 99,5° Gl) auf, verreibt es in dem Alkohol, filtriert es und trocknet es bei 45⁰C bei einem Vakuum von 0,1 Torr. Man erhält 103 g gemischtes Kalzium-Magnesiurn-Heparinat mit einer antikoagulierenden Aktivität von 152 UI/mg, was' einer Ausbeute von 99,3 ⁰P entspricht.+

Der Gehalt an Ca⁺⁺ beträgt 7,6 fo.
Der Gehalt an Mg beträgt 1,6 %.
Der Gehalt an Na⁺ ist <0,01 $>.

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Beispiel 7

Herstellung gemischter KaJriium-Magnesium-Hepariiiate, ausgehend von Kalzrumheparinat mit einem Kalziuffigehalt von 10,5 #:

ITa.ch der in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrensweise erhält man ausgehend von Kalziuraheparinat mit einem Kalziumgehalt von 10,5 °/o gemischte ICalaiua-Magnesium-Hepariiiate mit den in dex¹ folgenden 9?abelle II angegebenen Kalzium-, Magnesium- und Eatriumgehalten, indem man das von Natrium befreite KalziuKiheparinat mit v.^rachsenden Magnesiummengen (das in Form von MgCIp'61IpO zugeführt wird), die in der linken Spalte der Tabelle angegeben sind, in Berührung bringt.

	. TABELLE	II	Eeparinats an: ) Na⁺ (#)
Zugeführte Ca-Menge $	Gehalt des	gemischten Mg ⁺⁺ (fo]	0,02
Ί	9,15	0,81	<0,01
2	- 9	0,84	<0,01
3	8,55	1	<0,01
4	8,45	1,24	<0,01
•5	7,7	1,54	<0,01
6	7,6	1,60	0,01
12	6,27	2,34

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Beispiel 8

Herstellung eines gemischten Kalzium-Hatriwa-Heparinats, ausgehend von einem Kalziuiaheparinat mit einem Kalziurige-halt von 10,5 ^:

Man löst bei 25°C 10Og Kalaiumheparinat mit einer Aktivitat von 158 Ul/mg, d.h. insgesamt 15 800 000 UI, mit einem Kalziumgehalt von 10,5 i° in 650 ml destilliertem Wasser. Dann setzt man unter Rühren 6 g reines kristallisiertes Natriumchlorid zu, stellt den pH-liert mit 1 ml 2n ITaOH-Lösuiig auf 7,3 ein und rührt während 16 Std. "bei 25°C. Dann dialysiert man das Material während 6 Std. gegen entmineralisiertes Wasser, läßt während 6 Std. stehen, stellt den pH-Wert mit 2n Chlorwasserstoff säure auf 5,5 ein, fällt anschließend das gemischte Kalziuni-ifatrium-Heparinat durch Zugabe von 1,5 Volumen neutralem Äthylalkohol (Konzentration 96° G-L) aus und läßt während 2 Std. stehen. Man nimmt das gemischte Heparinat in neutralem Äthylalkohol (Konzentration 99,5° G-L) auf, verreibt es in dem Alkohol, filtriert es und trocknet es im Vakuum (0,1 Torr) bei 45⁰C, wobei man 102 g gemischtes KalziuTü-Natrium-Heparinat mit einer Antikoagulieraktivität von 155 UI/mg, was einer Ausbeute von 100 fo entspricht, erhält.

Ca⁺⁺-Gehalt = 8 <fo.
ITa⁺-GeImIt = 2,4 #.

Bei spiel

Herstellung von gemischten Kalzium-Fatrium-Heparinaten, ausgehend von Kalziumheparinat mit einem Kalziumgehalt von 10_s5 %

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Each der in Beispiel 7 beschriebenen Verfahrensweise' erhält man ausgehend von Kaljmirnheparinat mit einem KaIr-:xura-· gehalt von 10,5 ^ durch einfaches Inberübraingbringen der Reagentien gemischte KalEium-Natriiüii-Heparinate mit entsprechenden Oa⁴⁺-- und ITa⁺-Gehalten bio su 2,4 fo. Zur Bereitung der gemischten Heparinate, deren Natriumgehalt diesen V/ert übersteigt, ist es bevorzugt, das Iiiberuhrung-bringen während der Dialyse zu bewirken, insbeßonde.re wenn man Natriumgehalte oberhalb 3 f° erreichen will.

	TABELLE III
Zugeführte Ca-Henge ^cfo	G-ehalt des gern an: Ca⁺⁺ (si)
2	9,55
4	8,55
6	8
8	7,68
10	7,15
12	6,68

1,6 2,4 2,2 3,2

In den beiden rechten Spalten der obigen Tabelle III sind die Kalzium- und Natriumgehalte der gemischten Heparinate angegeben, die unter diesen Bedingungen durch Inberührungbringen des von Natrium befreiten Kalziumheparinats mit

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wachsenden ITatriumniengen erhalten wurden, die in der linken Spalte der obigen Tabelle angegeben sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt mm zu einer Reihe von Vorteilen, die bereits erwähnt wurden. Es sei erneut darauf hingewiesen, daß man mit diesem Verfahren, ausgehend von Natriumsalzen von Heparin einfache Salze anderer Metalle, wie Natrium, gemischte Ileparinsalze erhalten kann, die praktisch vollständig und sogar vollständig von Natrium befreit sind.

Die praktisch vollständige Entfernung von Natrium wird durch eine deutliche Steigerung der antikoagulierenden Aktivität des Heparins begleitet. Es ist festausteilen, daß diese antilcoagulieren.de Wirkung plötzlich um etwa 10 ^cß> zunimmt, wenn der Kalziumgehalt eines Kalzium-Natrivuii-IIeparinats von 9,5 $> auf 10 $ steigt (wobei die Dosierung mit Hilfe , der entsprechenden Heparinsalze durchgeführt wurde, die aus der gleichen Umfangscharge Heparin bereitet wurden. Die Dosierungstechnik entsprach der in "Pharmacopee Francaise", 8.Auflage, 1965, Seite 560 beschriebenen).

Die vollständig von Natrium befreiten Heparinsalze, insbesondere die Kalziumsalze besitzen eine bemerkenswerte antikoagulierende Wirkung, wie axis den folgenden Ergebnissen der pharmakologischen Untersuchungen hervorgeht. Sie stellen somit Wirkstoffe von Arzneimitteln mit großem Wert dar.

1. Subkutane Injektion an Kaninchen:

Man verabreicht drei Kaninchen durch subkutane Injektion ' 1000 UI/kg natriumfreies Kalziumheparinat. -Jedem Tier werden nach 5 Min., 15 Min., 30 Min, nach der Injektion

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sowie stündlich während insgesamt 12 Std. Blutproben aus der zentralen Ohrarterie entnommen.

Eine Bestimmung dos Heparins und eine Ermittlung der globalen Gerinnbarkeit erlaubt die Feststellung, daß 15 Min. nach der Injektion eine nachweisbare Heparinäraie vorliegt, die die gesamte Gerinnbarkeit des Kaninchens zu beeinflussen in der Lage ist. Diese Heparinämie ist bis zur 8. Stunde wirksam.

2. Intravenöse Injektion an Kaninchen:

Man verabreicht an drei, während 24 Std. nüchtern gehaltenen Kaninchen auf intravenösem Wege (Hauptvene des Ohrs) 300 Ul/kg natriumfreien Iialziumheparinats, d.h. etwa ein Drittel der in der vorhergehenden Untersuchung subkutan verabreichten Heparindosis.

Die Blutproben für die biologischen Untersuchungen werden 5 Min., 1 Std., 3 Std., 4 Std. und 5 Std. nach der Injektion entnommen.

Es ist festzustellen,, daß bei einer Dosis, die etwa einem Drittel der subkutan verabreichten Dosis, während der nach der Injektion folgenden Minuten und während 1 bis Std. eine erhöhte Heparinämie hervorgerufen wird, die größer ist als 1,1 UI/ml, die jedoch nach der 4. Stunde verschwindet.

~Das von Natrium befreite Kalziumheparinat ist besonders zur Behandlung aller Hyperkoagulabilitätszustunde geeignet, insbesondere denjenigen, die von Embolieen, arteriellen-venösen Thrombosen und Myocardinfarkten begleitet werden und ganz allgemein zur Behandlung aller

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Zustände, "bei denen eine antikoag'ulierende Behandlung erforderlich ist und insbesondere zur Behandlung jener Zustände, bei denen hohe Heparinkonzentrat ionen, erwünscht sind, wobei sich in allen diesen Fällen nicht das Risiko lokaler Hämorrhagie stellt.

Die Heparinsalze, insbesondere Kalziumheparinat oder Ileparinknlzium werden vorzugsweise in 3?orrn von Lösungen in einer injizierbaren, sterilen Flüssigkeit, die für die ausgewählte Verabreichungsart (Injektion oder Perfusion) geeignet ist, verabreicht. Zum Beispiel stellt glukosehaltiges Serum ein Vehikel oder Trägermaterial dar, das für die drei oben genannten Verabreichungsarten geeignet ist.

Diese Verabreichungen können unter den folgenden Bedingungen erfolgen:

a) auf subkutanem Wege

- zur Vorbeutung 500 UI, zweimal während 24 Std. und dies während 7 bis 10 Tagen,

- zur Heilung in Abhängigkeit von dem Zustand des " Patienten, 13 500 bis 20 000 UI, zweimal pro 24 Std. ebenso lang wie es der thrombolytisehe Zustand des Patienten erfordert;

b) auf intravenösem Wege

von 20 bis 40 000 UI, die harmonisch auf 44 Stunden verteilt sind, vorzugsweise durch gesteuerte Perfusion;

c) auf intramuskulärem Wege

5 bis 10 000 UI, dreimal pro Woche.

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Claims

P A T E Π Q¹ A NSPEDCHE :

. Verfahren zur Herstellung von einfachen licparirLsalEen, • die von Natrium verschiedene Metallisationen enthalten oder von gemischten Heparinsalzen, bei dem in einer ersten Phase ein derartigec einfaches Ausgan^sheparinsalz mit einem Metallsalζ in Berührung gebracht wird, mit dem man das in dem Außgangsheparinat enthaltene Metall ersetzen will, dadurch gekennzeichnet, daß man anschließend in einer zveiten Phase mindestens einmal einen Behandlungszyklus durchführt, der darin besteht, die freien Metallionen von dem erhaltenen Ileparinat abzutrennen und das erhaltene Ileparinat mit dem das Substitutionsmetall enthaltende Salz erneut in Berührung zu bringen.

Z. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Anzahl dieser Behandlungszyklen durchführt, die dazu ausreichen, ein Heparinsalz zu bilden, das statt des im einfachen Ausgangsheparinsalz enthaltenen Metall praktisch nur noch das Substitutionsmetall enthält.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der genannten ersten Phase das einfache als Ausgangsmaterial verwendete Heparinsalz mit einer ausreichenden Menge des das Substitutionsmetall enthaltenden Salzes in Berührung bringt, so daß man nach der

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Abtrennung der freine Metallionen aus dem das gebildete gemischte Hepaxinat enthaltenden Medium, in einer einzigen Stufe durch ein erneutes in Berührung "bringen diese« gewischten Heparinats mit einer ausreichenden Menge des Salzes dec Substitutionüinetalls das einfache Keparinat dos Substitutionsmetalls herzustellen, das praktisch frei ist von den Metallionen, die in dem als Ausgangsraaterial verwendeten einfachen Heparinsal« enthalten waren.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine dritte Phase durchführt, die darin besteht, daß nach der Durchführung der zweiten Phase erhaltene einfache Heparinat des Substitutionsmetalls mit einem SaIa eines anderen Metalls in Berührimg zu bringen, um dadurch ein gemischtes Heparinat aus dem Subütitutienßruetall und dem weiteren Metall au bilden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des genannten v/eiteren Metalls relativ zu der Menge des Heparinats des Substitutionsmetalls so gesteuert wird, wie dieses Metall in dem betreffenden Heparinat durch das v/eitere Metall ersetzt werden soll.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Abtrennung durch eine Dialyse des nach der Durchführung der ersten Stufe erhaltenen Mediums gegen entmineralisiertes Wasser erfolgt .

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7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 oder den Ansprüchen 1 bis 6 zusammen mit einem der Ansprüche 2 biß 5j dadurch gekennzeichnet, daß man in der ersten Phase des Verfahrens das einfache Äusgangsheparinsalz mit einem. Überschuß des Salzes des Substitutionsnietalls in Berührung bringt und die Dialyse in dem Augenblick beginnt _t da der Wettstreit zwischen den Metallionen des einfachen Ausgangsheparinsalzes und des Salzes des Substitutionsmetalls so groß wird, daß ein weiteres Fortschreiten der Substitution verhindert wird.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis -5, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Abtrennung durch Ausfällen in einem Medium erfolgt, in dein die aus den freigesetzten Metallionen gebildeten Salze löslich sind, worauf das gefällte Heparinat erneut in Wasser gelöst wird, bevor man es in der genannten zweiten

. Phase erneut mit dem das Substitutionsmetall enthaltenden Salz in Berührung bringt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die selektive Ausfällung in einem wäßrig-alkoholischen Medium erfolgt,=das vorzugsweise eine Konzentration von nicht mehr als 70° GL aufweist.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Dialyse durch eine selektive Ausfällung und eine erneute Auflösung des ausgefällten Heparinats in einem wäßrigen Medium, nach dem Verfahren der Ansprüche 8 oder 9, vervollständigt'wird.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1.Ms 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als einfaches Ausgangsheparinsalz Fatriumheparinat (Heparin-Natriuin) verwendet.

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12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, ' daß man als SaIs des Substitutionsraetalls Kalziumsala verwendet. -

13. Verfahren gemäß Anspruch 11,- dadurch gekennzeichnet, daß man als Salz des Substitutionsmetalls Magnesiumsalis verwendet.

14. Verfahren gemäß Anspruch 11 in Kombination mit einem der Ansprüche 4 und 5 oder gemäß Anspruch 11 in Kombination mit einem der Ansprüche 4 und 5 und einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Salz des Substitutionsmetalls in den ersten und zweiten Phasen ein Kalzium- oder Magnesiumsalz verwendet und als das in dar dritten Phase verwendete

• Salz des weiteren Metalls ein Magnesium-, Kalziumoder Natriumsalz einsetzt.

15· Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man in der genannten ersten Phase das Ausgangsnatriumsalz von Heparin mit einem Überschuß des Kalziumsalzes in Berührung bringt, bis man ein gemischtes Heparinat erhält, das etwa 6 Cew.~$ Kalzium enthält und dieses.Inberührungbringen während einer Dialyse des Mediums gegen entmineralisiertes Wasser aufrechterhält, bis man einen Gehalt von an das Heparin gebundenen Kalzium im Bereich von 8,75 $ erreicht hat, anschließend das gebildete Heparinat aus dem erhaltenen Medium alkoholisch ausfällt und schließlich das gebildete Heparinat mit einem Kalziumsalz in Berührung bringt, das in einer solchen Menge verwendet wird, daß man ein Kalziumheparinat erhält, das zwischen 10,3 und 10,6 °/o Kalzium enthält.

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16. Gewiachte, praktisch vollständig von Natrium befreite Salze von Heparin mit von ITatriuiü verschiedenen Metallen.

17. Gemischte, von Natrium praktisch vollständig befreite Heparinsalze von Kalzium und Maines ium.

18. Gemischte, vollständig von Hatriuin befreite Heparinsalze von von Uatrium verschiedenen Metallen.

19. Gemischte, vollständig von Natrium befreite Heparinsalse von von Magnesium verschiedenen Metallen.

20. Kalziumheparinat oder Heparinkalzium mit einem Katriuinioneiigelialt von weniger als 0,1 Gew.-^.

21. Kalziumheparinat oder Heparinkalzium gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Kaiisiuingehalt gleich oder größer ist als 10 Gew.-^ des Gesamtgev/ichts des Salzes.

22\ Kalziumheparainat oder Heparinkalzium gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Kalziuragehalt 10,3 bis 10,6 Gew.-# und der ITatriumgehalt weniger als 0,1 Gew.-^, bezogen auf das Gesamtgewicht des Salzes, beträgt.

23. ■ Kalziumheparinat oder Heparinkalsium, dadurch gekennzeichnet, daß es vollständig von Natriumionen befreit ist.

24. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es irgendein Heparinsalz gemäß den Ansprüchen 16 bis 23 als Wirkstoff neben üblichen pharmazeutischen Bindemitteln oder

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Trägermaterialen enthält.

25. Arzneimittel gemäß Anspruch 24, dadurch gekemizeiclinet, daß es in Form einer auf subkutanem, intravenösem oder intramuskulärem V/ege verabreichbairon Lösung vorliegt.

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