DE2944792A1 - Mucopolysaccharidfraktion, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft eine Mucopolysaccharidfraktion, die aus Heparin oder Heparinbestandteilen mit Molekulargewichten von 2ooo bis 5o ooo enthaltenden Fraktionen erhältlich ist und die biologische Eigenschaften besitzt, aufgrund derer sie als Mittel zur Steuerung der Blutkoagulation verwendet werden kann, ein Verfahren zur Herstellung dieser Mucopolysaccharidfraktion und sie als Wirkstoff enthaltende pharmazeutische Zubereitungen oder Arzneimittel. Diese Fraktion kann insbesondere aus Heparinpräparaten, beispielsweise Säugetiergewebeextrakten, gewonnen werden.

Heparin ist bis heute eines der wichtigsten, wenn nicht das wichtigste Antikoagulans, das dem Kliniker zur Verfügung steht. Es ist in der Tat dazu in der Lage, in verschiedenen Niveaus von Kaskaden aufeinanderfolgender enzymatischer Reaktionen einzugreifen, die normalerweise bei der physiologischen Hämostase bei irgendwelchen Situationen ablaufen, die zu einer Hyperkoagulierbarkeit des Bluts führen. Heparin ist insbesondere dazu in der Lage, gleichzeitig eine große Vielzahl der Koagulationsfaktoren zu unterdrücken, die bei der Bildung und der Aufrechterhaltung der verschiedenen Formen der Hyperkoagulation teilnehmen.

Im folgenden sei soweit, wie es die Klarheit der vorliegenden Beschreibung erforderlich macht, auf einige der grundlegenden Phänomene, die die Koagulation oder die Blutgerinnung betreffen, eingegangen, wobei diese Diskussion absichtlich vereinfacht sei. Der Prozeß der Blutgerinnung umfaßt in der Tat drei Phasen, die im allgemeinen als aufeinanderfolgend beschrieben werden, selbst wenn sie innig miteinander verknüpft sind:

030020/0858

Die Thromboplastinbildung, die Phase der Bildung von Prothrombinase (oder des aktiven Thromboplastins), die Thrombinbildung, welche Phase als die Phase der Umwandlung des Prothrombins in Thrombin unter dem Einfluß der Prothrombinase in Gegenwart von ionisiertem Calcium beschrieben werden kann, und schließlich die Fibrinbildung, die Phase, in deren Verlauf das Fibrinogen des Bluts unter dem Einfluß des Thrombins in Fibrin umgewandelt wird, welches Protein zum Unlöslichwerden neigt.

Die Bildung der Prothrombinase verläuft im Zuge der Thromboplastinbildung im wesentlichen über zwei verschiedene Wege: Die intrinsische oder endogene Route und die extrinsische oder exogene Route, die zur Bildung von Prothrombinasen plasmatischen oder geweblichen Ursprungs führen, jedoch beide dazu in der Lage sind, Prothrombin in aktives Thrombin umzuwandeln.

Der endogene Weg (oder das endogene System) umfaßt eine Vielzahl von Faktoren oder Plasmaproenzymen, die nacheinander aktiviert werden (Faktoren XII, XI, IX, VIII und X), wobei jedes aktiverte Produkt (Faktoren XIIa, XIa, IXa, Villa und Xa) als Enzym wirken, das das folgende Proenzym zu aktivieren vermag, wobei der aktivierte Faktor X (Xa) dann insbesondere bei einer Reaktion mit dem Faktor V und einem Phospholipid, das von den Blutplättchen herstammt, bei der Bildung von aktiver endogener Plasmaprothrombinase teilnimmt. Das exogene System, das insbesondere direkt durch eine Gewebeverletzung hervorgerufen werden kann, umfaßt eine begrenztere Anzahl von Faktoren und schließt insbesondere die Produktion von Gewebe-Thromboplastin ein, das in Kombination mit dem Faktor VII, ebenso wie der Faktor Villa, den inaktiven Faktor X in den Faktor Xa umzuwandeln vermag. Die Folge der Aktivierung des Prothrombins in Thrombin verläuft dann ebenso wie bei dem endogenen System, wobei das Phospholipid in diesem Fall

030020/0858

aus dem Gewebe und nicht aus dem Plasma stammt.

Es ist daher möglich, in gewissem Ausmaß davon zu sprechen, daß die beiden Wege, nämlich der endogene Weg und der exogene Weg sich an der Stelle der Aktivierung des Faktors X (der auch als Stuart-Faktor bezeichnet wird) vereinigen, worauf die sich dann anschließenden Phasen der Koagulation, nämlich die Thrombinbildung und die Fibrinbildung, nicht mehr in bezug auf den endogenen Weg oder den exogenen Weg unterscheiden.

Als Ergebnis des Koagulationsprozesses wird ein unlösliches Fibrinklümpchen gebildet, das insbesondere die Verletzung am Ursprung der Auslösung dieses Prozesses ausfüllt, beispielsweise im Bereich eines Blutgefäßes.

Diese Blutgerinnungsprozesse führen normalerweise dann zu einem als Fibrinolyse bezeichneten Prozeß, gemäß dem eine Lyse des Blutklümpchens erfolgt, insbesondere unter dem Einfluß von Plasmin, welches Enzym normalerweise in dem zirkulierenden Blut nur in Form eines inaktiven Vorläufers, nämlich als Plasminogen, enthalten ist, wobei das Fibrin als solches einen der Faktoren darstellt, der dazu in der Lage ist, die Umwandlung des inaktiven Plasminogens in das fibrinolytisch aktive Plasmin auszulösen.

Obwohl in den obigen Ausführungen die Systeme der Koagulation und der Fibrinolyse als zwei Prozesse erläutert wurden, die gleichzeitig ablaufen, ist dies in der Wirklichkeit normalerweise nicht der Fall. In der Tat bestehen bei den ablaufenden extrem komplizierten Prozessen ausgeglichene Mechanismen unter dem Einfluß von harmonisch entgegengesetzt wirkender aktivierender Faktoren und inhibierender Faktoren. Wenn diese Mechanismen im Hinblick auf die Hyperkoagulation ins Ungleichgewicht kommen, sind

030020/0868

29U792

Thrombosen möglich. Andererseits kann eine Verschiebung des Gleichgewichts im Sinne der Hyperkoagulation zu Blutungsrisiken Anlaß geben.

Im Hinblick auf die Linderung der Effekte der Hyperkoagulierbarkeit oder Hyperkoagulation ist es verständlich, daß derzeit von den starken Antikoaguians-Eigenschaften des Heparins Gebrauch gemacht wird, um den Koagulations/ Fibrinolyse-Mechanismus wieder ins Gleichgewicht zu bringen, wenn dieser erheblich gestört wird, beispielsweise im Verlaufe einer chirurgischen Operation des Organismus. Es ist jedoch gut bekannt, daß diese Versuche der Wiedereinstellung des Gleichgewichts äußerst delikat sind und daß demzufolge die Verabreichung einer zu starken Dosis des Antikoagulans oder bei einer unzureichenden Selektivität dieses Arzneimittels, das dazu verabreicht wird, die Risiken der Hyperkoagulation zu verhindern, wie es beispielsweise das Auftreten von postoperativen Thrombosen darstellt, schließlich zur Auslösung von ernsten BIutungen führen kann, was zur Folge hat, daß es erforderlich ist, die behandelten Patienten ständig zu überwachen und die verabreichten Dosierungen kontinuierlich oder diskontinuierlich in Abhängigkeit von Testergebnissen, insbesondere in Abhängigkeit von der gesamten Koagullerbarkeit, wie der Howell-Zeit, die in regelmäßigen Intervallen ermittelt werden müssen, anzupassen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, Arzneimittelwirkstoffe und Arzneimittel zu schaffen, mit denen es gelingt, diese Schwierigkeiten mindestens teilweise zu überwinden,und die dazu in der Lage sind, das Koagulations/Fibrinolyse-System von Patienten, die Koagulationsstörungen aufweisen und einer Behandlung unterworfen worden sind, wie einer chirurgischen Operation, bei der das Risiko der Hyperkoagulierbarkeit besteht, wie-

030020/0868

der ins Gleichgewicht zu bringen und/oder besser steuern zu können, wobei gleichzeitig die Kosten für die klinische überwachung der Patienten verringert werden können.

Diese Aufgabe wird nun durch die erfindungsgemäße Mucopolysacchar idf raktion bzw. die sie enthaltenden Arzneimittel gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist daher insbesondere eine Mucopolysaccharidfraktion, die eine regulierende Wirkung auf die Blutgerinnung oder Koagulation ausübt, Insbesondere indem sie diese verzögert und dennoch inhibierende Wirkungen ins Spiel bringt, die im Hinblick auf eine geringere Anzahl von Koagulationsfaktoren, insbesondere im Hinblick auf den aktivierten Faktor X selektiver sind als die des Heparins.

Die Erfindung betrifft somit eine Mucopolysaccharidfraktion, die aus Heparin oder Fraktionen, die Heparinbestandteile mit Molekulargewichten von insbesondere etwa 2ooo bis 5o ooo enthalten, wie man sie beispielsweise durch Extraktion aus Säugergewebe erhält, erhältlich ist, welche Fraktion dadurch gekennzeichnet ist, daß sie in einem wäßrig-alkoholischen Medium (Wasser/Äthanol) mit einem Titer von 55 bis 61° GL (Gay-Lussac) löslich ist, daß sie in einem Wasser/Äthanol-Medium mit einem höheren Alkoholgehalt zur Unlöslichkeit neigt, daß sie in reinem Alkohol unlöslich ist und daß sie einen Yin-Wessler-Titer und einen USP-Titer aufweist, deren Verhältnis mindestens 2, insbesondere mindestens 3 und vorzugsweise mehr als 6 beträgt.

Diese Mucopolysaccharidfraktionen ermöglichen weitere Fraktionierungen, wodurch die Herstellung von Mucopolysaccharidfraktionen mit hochspezifischer Wirkung in bezug auf den Yin-Wessler-Titer möglich sind, die ein Ver-

030020/0868

29U792

hältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer von mehr als 1o und sogar von mehr als 16 aufweisen.

Den Yin-Wessler-Titer bestimmt man nach der Methode dieser Autoren, die in J. Lab. Clin. Med. 81 (1976) 298 bis 3oo beschrieben ist.

Der USP-Titer, der in an sich bekannter Weise die gesamte Koagulationsintensität unter gut bestimmten Bedingungen mißt, ist ebenfalls bekannt. Dieser Titer wird nach der Methode beschrieben, die in The Pharmacopea of the United States XIX, Seiten 229 bis 23o beschrieben ist (siehe auch das Second Supplement USP-NF, Seite 62 bzw. das Fourth Supplement USP-NF, Seite 9o, mit dem Titel "Drug Substances and Dosage Forms").

Erfindungsgemäß wird somit eine besonders interessanter Wirkstoff geschaffen, der die Fähigkeit besitzt, den Faktor Xa in sehr selektiver Weise zu inhibieren, welche Fähigkeit im Gegensatz zu der Aktivität des Wirkstoffs auf die Gesamtkoagulation steht, die auf einem sehr niedrigen Niveau gehalten werden kann.

Die erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion stellt somit einen besonders vorteilhaften Wirkstoff eines Antikoagulans dar, mit dem durch eine bevorzugte Inhibierung eines aktivierten Faktors, der an einer Stufe in der Nähe der Stufe der Thrombinbildung und in der Praxis an den Schnittpunkt des endogenen Wegs mit dem exogenen Wegs oder später eingreift, ein Schutz gegen das Risiko der Hyperkoagulierbarkeit ermöglichtwird, der äquivalent dem Schutz ist, den man mit dem derzeit in der Therapie verwendeten Heparin erzielt, ohne daß jedoch aufgrund der Selektivität der Wirkung des erfindungsgemäßen Wirkstoffs die gleichen Blutungsrisiken auftreten, wie sie bei der herkömmlichen Anwendung von Heparin gegeben sind. Heparin

030020/0868

inhibiert nämlich nicht nur den Faktor Xa, sondern auch andere Faktoren, die vor oder nach diesem Faktor an anderen Stufen des Blutgerinnungsprozesses auftreten, beispielsweise den Faktor Ha. Es wird angenommen, daß das in vivo-Wiederinsgleichgewichtbringen des Koagulations/ Fibrinolyse-Systems, wenn dieses unter der Einwirkung einer pathologischen Ursache oder eines äußeren Eingriffs, beispielsweise eines operativen Eingriffs, ins Ungleichgewicht gekommen ist, leichter mit einem Arzneimittel erreicht werden kann, das selektiv auf einen spezifischen Faktor, nämlich den Faktor X, einwirkt und insbesondere eine Inhibierung des Faktors Xa verursacht, als mit einem Arzneimittel, das in undifferenzierter Weise mehrere Koagulationsfaktoren zugleich beeinflußt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Mucopolysaccharidfraktion, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
eine Substanz auf der Grundlage von Heparin oder Heparlnbestandteilen, deren Molekulargewicht insbesondere in einem Bereich von 2ooo bis 5o ooo liegt, welche Substanz einen niedrigen Gehalt an anorganischen Salzen aufweist, der vorzugsweise weniger als 1 Gew.-% beträgt, in einem wäßrig-alkoholischen Medium des Wasser/Äthanol-Typs mit einem Titer zwischen etwa 55 und 61° GL, vorzugsweise mit. einem Titer von etwa 58° GL, suspendiert/ die unlösliche Fraktion abtrennt/und die Lösung gewinnt, die die gelöste Mucopolysaccharidfraktion enthält, aus der diese insbesondere durch alkoholisehe Fällung von dem oben erwähnten wäßrig-alkoholischen Medium abgetrennt werden kann.

Das Ausgangsmaterial, aus dem die erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion extrahiert werden kann, kann aus einem Heparin herkömmlicher, injizierbarer pharmazeuti-

030020/0851

2344792

scher Qualität oder einem rohen Heparin bestehen, wie man es nach dem Ablauf der Extraktionsmaßnahmen zur Gewinnung dieses Wirkstoffs aus dem Gewebe oder den Organen von Säugern, insbesondere aus der Darmschleimhaut oder den Lungen von beispielsweise Schweinen oder Rindern, erhält. Man kann als Ausgangsmaterial auch Fraktionen der Reinigung solchen rohen Heparins, die zur Gewinnung eines Heparins injizierbarer Qualität und mit höherer spezifischer Aktivität anfallen und normalerweise verworfen werden (Abfall), vorausgesetzt, daß diese Abfallmaterialien geringerer spezifischer Aktivität noch Heparinbestandteile (heparinic constituents) enthalten.

Ausgehend von solchen Ausgangsmaterialien, die im wesentliehen frei sind von Proteinen, von Nucleinsäuren und von anorganischen Salzen, wobei der Gehalt der letzteren vorzugsweise weniger als 1 Gew.-% beträgt, ist es möglich, durch Extraktion mit einem Alkohol mit einem Titer von 55 bis 61° GL eine Mucopolysaccharidfraktion zu extrahieren, die Bestandteile niedrigen Molekulargewichts enthält und deren Yin-Wessler-Titer und USP-Titer ein Verhältnis von etwa 2 bis etwa 5 und insbesondere von 3 bis 5 aufweisen.

Es ist festzuhalten, daß,wenn man Wasser/Äthanol-Mischungen mit einem Titer von mehr als 61° GL verwendet, die Extraktionsausbeute praktisch gleich Null wird. Andererseits führt die Verwendung eines wäßrig-alkoholischen Mediums mit einem Titer von weniger als 55 GL zu der Lösung von Bestandteilen, deren Anwesenheit das Verhältnis der Yin-Wessler/USP-Titer vermindert.

Es ist weiterhin festzuhalten, daß es möglich ist, weitere Fraktionierungen der nach der Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens anfallenden Mucopolysaccharid-

030020/0861

fraktion durchzuführen unter Anwendung verschiedenartiger Methoden, wie der Gelfiltration oder einer selektiven Ausfällung in einem wäßrig-alkoholischen Medium vorbestimmten Titers in Gegenwart von vorbestimmten Mengen anorganischer Salze, wie Natriumchlorid.

Man kann eine zusätzliche Fraktionierung auch mit Hilfe einer zusätzlichen Stufe erreichen, die man auf jede Mucopolysaccharidfraktion anwendet, die man zuvor wieder in Wasser gelöst hat, die darin besteht, daß man zu dieser wäßrigen Lösung 1 bis 2 Volumen Äthfenol und 1o bis 1oo g/l Natriumchlorid zugibt und einerseits den ebenso aktiven gebildeten Niederschlag gewinnt und andererseits die noch in der überstehenden Flüssigkeit gelösten Anteile insbesondere durch eine weitere Alkoholfällung sammelt, so daß man ein Fraktionierungsprodukt erhält, dessen Yin-Wessler- und USP-Titer ein noch höheres Verhältnis im Bereich von 6 bis 8 aufweisen, das höher liegt als das der Ausgangsfraktion, das im Bereich von 3 liegt.

Man kann auch Mucopolysaccharidfraktionen mit einem höheren Verhältnis von Yin-Wessler/üSP-Titer durch Gelfiltration aus den Fraktionen der ersten Extraktion mit dem wäßrig-alkoholischen Medium mit einem Titer von 55 bis 61° GL gewinnen, nachdem man diese letzteren Fraktionen in einem wäßrigen Lösungsmittel, wie einer o,5 m NaCl; o,1 m Tris-HCl-Lösung bei einem pH-Wert von 7,5 gelöst hat. Man kann diese Lösung dann durch ein Polyacrylamid- und Agarose-Gel in Kugelform, das im Handel unter der Bezeichnung ULTROGEL AcA 44 erhältlich ist, führen, dessen wirksamer Fraktionierbereich zwischen effektiven Molekulargewichten von 4ooo bis 6o ooo (für lineare Moleküle) liegt.

Die erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktionen mit ei-

030020/0858

- 2ο -

nem höheren Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer sind jene, die nach der Elution eines Volumens von 2,5 1, Totvolumen nicht eingeschlossen (wobei das Totvolumen das Flüssigkeitsvolumen ist, das in der Gelsäu-Ie und insbesondere in den Zwischenräumen zwischen den Gelkörnchen vorliegt) eluiert werdoi, wenn man die Gelfiltration mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2oo ml/h in einer Säule mit einem Durchmesser von 1oo mm und einer Länge von 1 m durchführt, wobei die Konzentration des auf die Säule aufgetragenen Mucopolysaccharids 5o mg/ml und das Volumen der auf die Säule aufgetragenen Lösung 37,5 ml betragen. Die aktivsten Fraktionen sind dann in den 1,5 enthalten, die anschließend eluiert werden. Der Gehalt der ersten 2,5 1 des Eluats besteht in großem Ausmaß aus Heparan-sulfaten oder Heparitin-sulfaten, d. h. Produkten mit hohem Molekulargewicht und hoher Viskosität, die keine antikoagulierende Wirkung besitzen.

Wenn man von einer Säule zu einer anderen Säule gleicher Länge, jedoch unterschiedlichen Querschnitts übergeht, ergibt sich eine Änderung des Volumens der Lösung (der gleichen Konzentration), die auf die andere Säule aufgetragen wird in bezug auf das auf die erste Säule aufgebrachte Volumen, wobei dieses Verhältnis gleich ist dem Quadrat der Querschnitte (oder Durchmesser) dieser Säulen, so daß man die gleichen Fraktionen in einem Elutionsvolumen aus der anderen Säule erhält, das ebenfalls in einem Volumen zu dem entsprechenden Elutionsvolumen der ersten Säule anfällt, das im wesentlichen gleich ist dem Quadrat des Verhältnisses der genannten Querschnitte.

Gelfiltrationen dieser Art besitzen neben der Tatsache, daß sie Fraktionen liefern, deren Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer günstiger ist, den Vorteil, daß sie Produkte liefern, deren Lösungen eine niedrige Viskosität aufweisen.

030020/0858

In dieser Hinsicht ist darauf hinzuweisen, daß das erfindungsgemäße Verfahren der Extraktion von Mucopolysaccharidfraktionen mit Hilfe eines wäßrig-alkoholischen Mediums mit einem Titer von 55 bis 61° GL, vorzugsweise mit einem Titer von 58° GL, von kommerziell erhältlichem oder gereinigtem Heparin, insbesondere mit einer für Injektionszwecke geeigneten Qualität, das noch merkliche Anteile von Heparan-sulfaten oder ähnlichen Produkten mit hohem Molekulargewicht enthält, es auch ermöglicht, eine erhebliche Verminderung der Viskosität der wäßrigen Lösungen zu erreichen, die man aus diesen Heparinen bilden kann, die dann im wesentlichen frei sind von diesen Mucopolysaccharidfraktionen.

Diese Verminderung der Viskosität bringt erhebliche Vorteile im Hinblick auf die spätere Anwendung dieser Heparine als Antikoagulantien bei der parenteralen und insbesondere bei der subcutanen Injektion mit sich.

Aus Fraktionen mit einem Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer im Bereich von 6 bis 8 ist es möglich, durch Gelfiltration oder dergleichen weitere Mucopolysaccharidfraktionen zu gewinnen, die Verhältnisse von Yin-Wessler/USP-Titer von mehr als 1o und insbesondere im Bereich von 13 bis 16 und Yin-Wessler-Titer von mehr als 13o und vorzugsweise von 135 bis 16o Einheiten/mg aufweisen.

Es versteht sich, daß die obigen (und auch die insbesondere in den Beispielen folgenden) Angaben zum Molekulargewicht auf Messungen der Retentionszeit von Lösungen mit einem vorbestimmten Gehalt der untersuchten Substanz beruhen und bei Experimenten der Gelpermeation durch eine Gelsäule unter vorbestimmten Elutionsbedingungen ermittelt wurden, wobei die Logarithmen dieser Molekulargewichtsangaben die gleichen proportionalen Beziehungen zu den oben

030020/0859

angegebenen Messungen der Retentionszeit besitzen wie die Molekulargewichte von 4ooo, 65oo, 16 ooo bzw. 31 ooo von Polystyrol-natriumsulfonat-Standards, insbesondere jenen, die von der Firma CHROMPACK (Orsay-les-Ulis, Frankreich) erhältlich sind, in bezug zu ihren entsprechenden Retentionszeiten aufweisen, die in identischen Systemen und unter gleichen Gelpermeationsbedingungen ermittelt wurden.

Wenn die behandelten Fraktionen, unabhängig von dem erreichten Reinigungsgrad, in Form von physiologisch annehmbaren Metallsalzen, wie den Natriumsalzen, vorliegen, können sie auch in gemischte oder einfache Salze, die ein anderes physiologisch annehmbares Metall, wie Calcium, aufweisen, überführt werden, indem man Verfahrensweisen anwendet, die auf Heparinsalze anwendbar sind. Mit besonderem Vorteil ist es möglich, auf das Verfahren zurückzugreifen, das in der FR-PS 7 3 1358o vom 13. April 1973 der gleichen Anmelderin beschrieben ist. Dieses Verfahren besteht im wesentlichen darin, beispielsweise von einem Natriumsalz des Heparins auszugehen, dieses mit einem andersartigen Salz eines anderen physiologisch annehmbaren Metalls, beispielsweise Calciumchlorid, in Lösung in Kontakt zu bringen, dann die nicht an das Heparin gebundenen Metallionen abzutrennen (beispielsweise durch alkoholische Fällung oder Dialyse) und dann, wenn das erzielte Substitutionsverhältnis nicht ausreicht, das bei der Kontaktbehandlung erhaltene gemischte Heparinsalz in Lösung mit einer weiteren Menge eines anderen Salzes, namentlich Calciumchlorid, in Kontakt bringt, bis das angestrebte Substitutionsverhältnis erreicht ist.

Man kann eine weitere bevorzugte erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion aus einer oder den anderen oben beschriebenen Fraktionen erhalten, welche weiteren Fraktionen da-

030020/0888

durch gekennzeichnet sind,

daß sie bei der Gelfiltration auf einer mit Polyacrylamid- und Agarose-Gel in Kugelform des Typs, der im Handel unter der Bezeichnung ULTROGEL AcA 44 erhältlich ist, beschickten Säule nach der Elution eines Volumens von 2,5 1, Totvolumen nicht eingeschlossen, eluiert werden, wenn man die Gelfiltration bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2oo ml/h in einer Säule mit einem Durchmesser von 1oo rom und einer Länge von 1 m durchführt und die Konzentration des auf die Säule aufgetragenen Mucopolysaccharids 5o mg/ ml und das auf die Säule aufgetragene Volumen der Lösung 37,5 ml betragen, wobei die wesentlichen Anteile dieser Fraktion insbesondere in den 1,51 des Eluats enthalten sind, die dann eluiert werden; und daß sie eine Retentionszeit im Bereich von 5,7 bis 7,5 und insbesondere von 6,6 bis 7,ο min in einem Gelpermeationssystem auf einer Säule mit einer Länge von 25o mm und einem Durchmesser von 9 mm, die mit Siliciumdioxid mit einer Korngröße von 1o bis 1oo,um beschickt ist, wenn man 5O/Ul einer Lösung von 1,3 mg/ml dieser Fraktion in eine, o,o2 m Na₀SO.-Puffer auf diese Säule aufträgt und dann die Elution dieser Fraktion bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml/min bewirkt, besitzen.

Bevorzugte erfindungsgemäße Fraktionen sind insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß sie einerseits eine bestimmte Affinität in bezug auf Antithrombin III besitzen, die sich in ihrer Fähigkeit an das letztere fixiert oder gebunden zu werden manifestiert, insbesondere in einem Systern, das darin besteht, die Fraktionen mit einem an einem Trägermaterial, wie Agarose, fixierten Antithrombin III in einem o,2 m NaCl/o,o5 m Tris-HCl-Puffer bei einem pH-Wert von 7,5 in Kontakt zu bringen; und andererseits ein Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer (YW/ USP-Titer) von mindestens 6 und einen Yin-Wessler-Titer

030020/0860

von mindestens 3oo Einheiten/mg aufweisen.

Bevorzugte erfindungsgemäße Fraktionen und Verbindungen sind jene, die ein YW/USP-Verhältnis von mehr als 18 bei einer Yin-Wessler-Aktivität von mehr als 9oo Einheiten/mg aufweisen.

Besonders bevorzugt sind jene erfindungsgemäßen Fraktionen und Verbindungen, die YW/USP-Verhältnisse von mehr als 5o aufweisen.

Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen zeichnen sich dadurch aus, daß sie ein YW/USP-Verhältnis von mehr als 65 bei einer Yin-Wessler-Aktivität von mehr als 13oo Einheiten/mg besitzen.

Die besondere Affinität der erfindungsgemäßen Fraktionen für Antithrombin III ist eine wesentliche Eigenschaft, die für die Herstellung solcher stark angereicherter Fraktionen herangezogen werden kann, insbesondere ausgehend von den oben angegebenen Fraktionen, welches Verfahren darin besteht, daß man eine selektive Bindung der erfindungsgemäßen stärker angereicherten Fraktionen oder Produkte an Antithrombin III bewirkt, insbesondere dadurch, daß man die Ausgangsfraktionen mit immobilisiertem Antithrombin III, das vorzugsweise auf einem Trägermaterial, insbesondere Agarose, vorliegt, in einem Puffer, wie einem o,2 m NaCl/o,o5 m Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 in Kontakt bringt und dann die fixierte Fraktion mit einem Puffer höherer Ionenstärke, der die Desorption zu bewirken vermag, insbesondere mit einem 2 m NaCl/o,o5 m Tris-HCl-Puffer eluiert.

Natürlich sind die Ausgangsmaterialien, aus denen die zuletzt erwähnten Fraktionen oder Verbindungen gewonnen

030020/0858

werden können, nicht auf die definierten ersten erfindungsgemäßen Fraktionen beschränkt. Insbesondere kann man sie in beliebiger anderer Weise gewinnen, insbesondere aus dem rohen Ausgangsmaterial, dessen Eigenschaften oben angesprochen wurden und aus denen die genannten ersten Fraktionen ihrerseits gewonnen wurden.

Gegenstand der Erfindung sind daher auch die im wesentlichen homogenen Verbindungen mit wesentlicher Reinheit, die offenbar das wesentliche aktive Prinzip der erfindungsgemäßen Fraktionen darstellen.

Diese Verbindungen sind durch kernmagnetische Resonanzspektren (NMR) gekennzeichnet, die unter Einhaltung der nachstehend angegebenen Bedingungen aufgezeichnet wurden und die in den Fig. 11, 12, 14 und 15 dargestellt sind.

Insbesondere zeigt das Protonen-( H)-Kernresonanzspektrum der erfindungsgemäßen Verbindungen, das in Lösungen dieser Verbindungen in deuteriertem Wasser bei 35°C mit einer Strahlung von 27o MHz aufgezeichnet wurde, als charakteristisches Element Resonanzsignale, die bei einer chemischen Verschiebung im Bereich von 4,8 und 5,2 ppm wesentlich schwächer als das Resonanzsignal sind, das man auch bei einer chemischen Verschiebung im Bereich von 5,4 ppm beobachtet (wobei das Referenzsignal für die Verschiebung durch Natrium-3-trimethylsilyl-propionat 2,2,3,3-d, (TSP) erzeugt wird).

Die bei chemischen Verschiebungen von 5,4, 5,2 und 4,8 ppm beobachteten Signale entsprechen den Signalen, die im Fall eines herkömmlichen Heparins, dessen Kernresonanzspektrum unter den gleichen Bedingungen aufgezeichnet wurde, charakteristisch sind für:

das anomere Proton in der 1-Stellung der N-sulfatierten

030020/0858

Glucosamin-Einheiten des Heparins (Signal G₁); das anomere Proton in der 1-Stellung der 2-0-sulfatierten Iduronsäure-Einheiten (Signal I₁); und das Proton in der 5-Stellung der 2-0-sulfatierten Iduronsäure-Einheiten (Signal I₅).

Bei üblichen Heparinen besitzen sämtliche drei Signale (G-), (I₁) und (I₅) Intensitäten gleicher Größenordnung.

Der Einfachheit halber wird im folgenden auch bezüglich der erfindungsgemäßen Fraktionen oder Verbindungen auf die Signale (G₁), (I₁) und (I₅) Bezug genommen, um Signale anzusprechen, die in bezug auf die entsprechenden chemischen Verschiebungen beobachtet werden (unabhängig davon, ob es sich um das Protonenresonanzspektrum oder das

1 3

C-Resonanzspektrum handelt)·

Diese Äquivalenz der Bezeichnung erstreckt sich auch auf die NMR-Spektren, die unter anderen Bedingungen und unter Anwendung andersartiger Referenzsignale erzeugt wurden.

Insbesondere zeigt das Kohlenstoff 13-( C)-Kernresonanzspektrum der erfindungsgemäßen Verbindungen, das in Lösungen dieser Verbindungen in deuteriertem Wasser unter Bestrahlung mit einer Frequenz von 2o MHz aufgezeichnet wurde, als charakteristische Elemente des Spektrums (wobei als Standard Tetramethylsilan (TMS) verwendet wurde) die folgenden Eigenschaften:
die praktische Abwesenheit des Resonanzsignals, das für die Anwesenheit von Hydroxylgruppen am primären Kohlenstoffatom (in der 6-Stellung) der Glucosamin-Einheiten, die in den erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktionen enthalten sind, charakteristisch ist, zusätzliche Signale im Bereich der (I₁)- und (G₁)-Signale in Bereichen, die chemischen Verschiebungen in der Größen-

030020/0868

29 U 7

Ordnung von 1oo ppm entsprechen,

ein zusätzliches (G₂)-Signal in der Nähe des G_-N-Sulfatsignals in dem Bereich von 6o ppm und die Anwesenheit eines Resonanzsignals im Bereich von 75 ppm (dem normalerweise kein Resonanzsignal der NMR-Spektren entspricht, die man unter ähnlichen Bedingungen mit üblichem Heparin erhält) (wobei die oben angegebenen chemischen Verschiebungen in bezug auf die Methylgruppe der N-Acetylglucosamingruppen abgeschätzt sind, die in der erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion enthalten sind (25 ppm-Bereich in den in den Zeichnungen dargestellten Spektren)).

Die in praktisch gereinigtem Zustand vorliegenden homogenen erfindungsgemäßen Verbindungen, die sämtliche oben beschriebenen Eigenschaften im Hinblick auf ihre USP- und ihre Yin-Wessler-Aktivitäten und ihre spezifischen Aktivitäten für Antithrombin III aufweisen, sind weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem homogenen Oligosaccharid bestehen, das die folgenden zusätzlichen Eigenschaften besitzt:

es enthält 8 bis 12, insbesondere 1ο Monosaccharid-Einheiten;

sämtliche primären Positionen der Glucosamin-Einheiten dieses Oligosaccharids sind sulfatiert; dieses Oligosaccharid enthält eine N-Acetylglucosamin-Einheit pro 2 2-0-Sulfatiduronsäure-Einheiten _und pro 2 N-SuIfat-glucosamin-Einheiten, während die anderen Saccharide anderer Art sind und andersartige Substituenten aufweisen.

Die Molekulargewichte mindestens bestimmter erfindungsgemäßer Oligosaccharide liegen im Bereich von etwa 2ooo bis etwa 3ooo und insbesondere bei etwa 25oo, insbesondere was die Dekasaccharide betrifft.

030020/0858

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Polysaccharide mit den oben angegebenen allgemeinen Eigenschaften, nämlich insbesondere ihrer USP- und Yin-Wessler-Eigenschaften einerseits und ihrer Af finität für Antithrombin III andererseits, wobei diese Fraktionen ein höheres Molekulargewicht aufweisen und in ihrer Struktur auch eine Oligosaccharideinheit des oben angegebenen Aufbaus besitzen.

Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung der Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen.

In der Zeichnung zeigen

Fig. 1 ein charakteristisches Elutionsdiagramm einer bevorzugten erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion ;

Fig. 2 bis 7 vergleichende biologische Eigenschaften erfindungsgemäßer Mucopolysaccharidfraktionen und eines herkömmlichen Heparins mit hoher Antikoagulanswirkung (ausgedrückt als USP-Titer);

Fig. 8 ein schematisches Elutionsdiagramm einer erfindungsgemäßen Fraktion, das bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der selektiven Abtrennung dieser Fraktion von einer Fraktion, die auch andere Bestandteile enthält, ermittelt wurde;

Fig. 9 ein repräsentatives Elutionsdiagramm, das für eine andere bevorzugte erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion charakteristisch ist;

Fig. 1o das Protonen-( H)-Kernresonanzspektrum eines herkömmlichen Heparins;

030020/0858

Fig. 11 und 12 das Protonen-( H)-Kernresonanzspektrum verschiedener erfindungsgemäßer Fraktionen;

Fig. 13 das zu Vergleichszwecken aufgezeichnete Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum eines üblichen Heparins;

Fig. 14 das Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum einer erfindungsgemäßen Fraktion; und

Fig. 15 eine Vergrößerung eines Teils des in der Fig. 14 dargestellten Kernresonanzspektrums.

Beispiel 1

Man verwendet als Ausgangsmaterial 1oo g eines injizierbaren Heparins mit einem Titer von 17o I.E./mg (USP-Einheiten) .

Zu diesen 1oo g Heparin gibt man 25oo ml Alkohol mit einem Titer von 58° GL. Nach sehr heftigem Rühren während 15 min setzt man das heftige Rühren während 15 Stunden fort. Dann zentrifugiert man die Suspension während 1 Stunde bei 7ooo min und gewinnt 24oo ml der überstehenden Flüssigkeit.

Zu dieser überstehenden Flüssigkeit gibt man 8o ml einer gesättigten Natriumchloridlösung und dann 24oo ml eines Alkohols mit einem Titer von 1oo GL.

Man gewinnt das ausgefällte Produkt, wäscht es mit Alkohol und trocknet es. Man erhält das Material in einer Menge von 2,1 g. Seine Eigenschaften sind die folgenden: USP-Titer = 45 I.E./mg
Anti-Xa-Titer = 16o Einheiten/mg Das Anti-Xa/USP-Verhältnis beträgt somit 3,55.

030020/0858

- 3ο -

Beispiel 2

Man verwendet als Ausgangsmaterial die Subfraktionen, die beim Reinigen von handelsüblichem Heparin zum Zweck der Bildung von injizierbarem Heparin anfallen. Man erhält das Material insbesondere in Form der überstehenden Flüssigkeit, die bei der Zugabe von o,6 bis o,7 Volumen eines Alkohols mit einem Titer von 1oo° GL zu einer wäßrigen Heparinlösung, die 1o bis 2o g Natriumchlorid/l enthält, anfällt, wobei das ausgefällte gereinigte Heparin dann zur weiteren Reinigung gewonnen wird. Das hierin verwendete Ausgangsmaterial enthält weiterhin verschiedene Rückstände der Reinigung von Heparin, die mit dem Zweck durchgeführt wird, injizierbares Heparin von Spuren anorganischer Salze zu befreien, insbesondere jene Materialien, die bei der alkoholischen Fällung anfallen.

Zu 1o kg dieses Ausgangsmaterials gibt man 3o Volumen (3oo 1) Alkohol mit einem Titer von 58° GL. Man dispergiert und rührt die Suspension während 15 min heftig, worauf man das heftige Rühren während 12 Stunden fortsetzt. Dann läßt man das Material während 48 Stunden stehen, um die Ausfällung des nichtgelösten Ausgangsmaterials zu bewirken. Die schwach trübe überstehende Flüssigkeit wird abgezogen und durch Zentrifugieren gereinigt.

Zu der überstehenden Flüssigkeit (die ein Volumen von 28o 1 besitzt) gibt man Io 1 einer gesättigten Natriumchloridlösung und dann 1 Volumen (28o 1) Alkohol mit einem Titer von 1oo° GL. Der erhaltene Niederschlag, der die Mucopolysaccharidfraktion enthält, wird mit Alkohol mit einem Titer von 1oo° GL gewaschen und dann getrocknet.

Man erhält 66o g einer Fraktion mit einem Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer von mehr als 2 (Fraktion P194HH,.. ) .

030020/0858

Dann bewirkt man eine zusätzliche Fraktionierung dieser Fraktion, indem man die 660 g der Fraktion in 132oo ml Wasser löst.

Zu der gebildeten Lösung gibt man 264 g Natriumchlorid und dann 1,5 Volumen (19,8 1) Alkohol mit einem Titer von 1oo° GL. Man sammelt das ausgefällte Produkt, wäscht es mit Alkohol und trocknet es. Man erhält 64o g der Fraktion P194HH,-,» mit den folgenden Eigenschaften: USP-Titer = 31 I.E./mg

Yin-Wessler-Titer = I00 Einheiten/mg.

Die überstehende Flüssigkeit enthält auch aktive Mucopolysaccharidfraktionen (deren Gewinnung wird in Beispiel 4 beschrieben).

Die Fraktion Ρ194ΗΗ,_η. enthält weiterhin eine relativ große Menge von Substanzen mit hohem Molekulargewicht, insbesondere Heparitin-sulfate, ohne Antikoagulanswirkung sowohl bei dem USP-Test als auch bei dem Yin-Wessler-Test.

Nach dem Auflösten in einem o,5 m NaCl/o,1 m Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 in einer Konzentration von 5o mg/ml bewirkt man eine Gelfiltration eines VoIumens von 15o ml der Lösung auf einem Gel (AcA44) in einer Säule mit einem Durchmesser von 215 mm und einer Länge von 1 m bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 800 ml/h. Die Substanzen mit hohem Molekulargewicht, bei denen es sich überwiegend um Heparitin-sulfate handelt, werden mit den ersten 1o 1 des Eluats, Totvolumen nicht eingeschlossen, eluiert.

In den nächsten 6 1 des Eluats erhält man eine Mucopolysaccharidfraktion mit einem höheren Yin-Wessler-Titer und einem Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer im

030020/0858

29U792

Bereich von 4 bis 8.
Beispiel 3

Dieses Beispiel verdeutlicht eine Modifizierung der Aufarbeitung der Fraktion P194HH. . von Beispiel 2. Nachdem man das Material in einer Konzentration von 5o mg/ml in einem o,5 m NaCl/o,1 m Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst hat, unterwirft man das Material einer 1ο Gelfiltration auf ULTROGEL AcA 44 in einer Säule mit einem Durchmesser von Io cm und einer Länge von 1oo cm. Man arbeitet bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 2oo ml/h.

Man fängt das Eluat in Fraktionen von 5o ml auf, deren Mucopolysaccharidgehalt man wie folgt bestimmt: Zu 1oo ml der Fraktion gibt man 2 ml Alkohol mit einem Titer von 1oo° GL. Nach dem Stehenlassen während 2 min bestimmt man die Trübung der Mischung bei 66o nm mit Hilfe eines Spektrophotometers (Vorrichtung zur Bestimmung der optischen Dichte). Dieser Trübung ist direkt proportional dem Mucopolysaccharidgehalt der untersuchten Lösung.

Die in dem letzten Drittel des vierten Liters des Eluats, Totvolumen nicht eingeschlossen, enthaltene Fraktion C1o wird gewonnen. Das Verhältnis des Yin-Wessler-Titers zu dem USP-Titer der Fraktion C1o beträgt 5o/6.

Beispiel 4

Man versetzt die in dem Beispiel 2 zuletzt anfallende überstehende Flüssigkeit mit 19,8 1 Alkohol mit einem Titer von 1oo° GL und läßt die Suspension dann während 24 Stunden stehen. Man gewinnt den gebildeten Niederschlag, wäscht ihn mit Alkohol (1oo° GL) und trocknet ihn. Man erhält 6 g der Fraktion P194HH._pl mit den folgenden Kenndaten:

030020/0858

USP-Titer = 7 I.E./mg

Yin-Wessler-Titer - 46 Einheiten/mg.

Beispiel 5
5

Man löst die Fraktion P194HH,_p. erneut in einem ο,5 m Tris-HCl/3o g/1 NaCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 in einer Konzentration von 5o mg/ml.

Man unterzieht die Lösung der Gelfiltration auf einer mit ULTROGEL AcA 44 beschickten Säule (Pharmacia K loo/loo, Volumen: 7 1, Länge: I00 cm, Durchmesser: 1o cm) unter Anwendung einer Elutionsgeschwindigkeit von 2oo ml/h.

Das erhaltene Elutionsdiagramm ist schematisch in der Fig. 1 dargestellt und zeigt die Änderung des Materialgehalts (anhand der bei 660 nm gemessenen optischen Dichte) in Abhängigkeit von dem eluierten Volumen (in Litern).

Nach dem Hindurchlaufen eines Flüssigkeitsvolumens, das dem Totvolumen der Säule entspricht, fängt man die aufeinanderfolgenden Fraktionen K, J, I, G, F, E, D, C, B und A auf, deren Volumen über die Länge der Abszissensegmente in der Fig. 1 dargestellt sind.

Jede dieser Fraktionen besitzt die in der nachstehenden Tabelle I angegebenen Analysenwerte:

030020/0853

TABELLE I Analysenwerte der erhaltenen Fraktionen

Fraktion	A	Gewicht	USP-Titer	Anti-Xa-Titer	Anti-Xa V£.rhailnll-
Nr.	B	(mg)	(I.E.)	(Einheiten)	„ςρ veinaitnis
C	12o	3,7	44,4	12
D	12o	4,5	72	16
E	25o	6	54	9
F	15o	9	135	15
G	3oo	9	144	16
H	4 oo	11	143	13
I	3oo	11,5	161	14
J	2 oo	13	143	11
K	5o	13	91	7
2 oo	7	14	2
35oo	O	O	/

Es ist festzuhalten, daß man die Fraktionen in vier Typen einteilen kann:

a) die Fraktionen A, B und C, deren Elutionsvolumen bei der oben beschriebenen Verfahrensweise im wesentlichen dem vierten eluierten Liter entspricht und deren USP-Titer weniger als 1o und deren Yin-Wessler-Titer weniger als 8o beträgt und deren Molekulargewichte höchstens etwa 4ooo betragen;

b) die Fraktionen D, E, F, G und H, deren USP-Titer weniger als 1o betragen und deren Yin-Wessler-Titer sehr hoch sind, nämlich 135 bis 161 Einheiten. Diese Fraktionen besitzen auch die günstigsten Verhältnisse von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer von 13 bis 16 und finden sich im wesentlichen in dem dritten Liter des Eluats. Sie besitzen Molekulargewichte von 4ooo bis 1o ooo und insbesondere von 4ooo bis 8ooo;

030020/0868

c) die Fraktionen I und J, deren Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer ungünstig ist und die wahrscheinlich bereits mit der nachstehenden Fraktion K verunreinigt sind; und

d) die Fraktion K, die im wesentlichen Heparan-sulfate enthält, die keine Antikoagulanswirkung ausüben.

In der nachstehenden Tabelle II sind die Molekulargewichte bestimmter Fraktionen angegeben, die über die durch die Gelpermeation gemessene Retentionszeit im Vergleich zu den oben angesprochenen Polystyrol-sulfonaten bekannten Molekulargewichts abgeschätzt wurden. Die Fraktion F ist durch eine Hauptbande, die eine Retentionszeit von 6,6 min und eine Schulter, die eine Retentionszeit von 6,1 min entspricht, gekennzeichnet, was auf die Anwesenheit eines Bestandteils hinweist, dessen Molekulargewicht in bezug auf das angewandte Vergleichssystem etwa 72oo beträgt.

Die Messungen erfolgten durch Gelpermeation (mit Hilfe eines SPECTRAPHYSICS 35oo Chromatographen) unter Verwendung von Säulen (25ο χ 9 mm), die mit Siliciumdioxid mit einer Korngröße von 1o bis 1oo ,um gefüllt sind (insbesondere die unter der Bezeichnung LICHROPHOSPHER erhältlichen Materialien) von Lösungen dieser Fraktionen in Mengen von 1,3 mg des Mucopolysaccharidraaterials/ml in einem o,o2 m Na-SO.-Puffer (wobei das anfänglich auf die Säule aufgetragene Volumen 5o ,ul beträgt) unter Anwendung einer Elutionsgeschwindigkeit von 3 ml/min. Der Nachweis des Materials erfolgte UV-spektrophotometrisch (2oo ityum ). 3o

030020/0858

- 36 -

TABELLE II

Produkt	Retentionszeit (min)	Molekulargewicht in bezug auf Polystyrole
P194HH(A)	7,ο	26oo
P194HH(B)	6,9	29oo
P194HH(C)	6,8	33oo
P194HH(F)	6,6	41 oo
P194HH(F)	6,1 +)	72oo +)
Polystyrol sulf onat (1)	6,6	4ooo
(2)	6,2	65oo
(3)	5,4	16ooo
(4)	4,7	31000

+) Schulter

Beispiel 6

Ausgangsmaterial:

Man verwendet als Ausgangsmaterial die Nebenprodukte, die bei der Herstellung von Calciumheparinat aus rohem Heparin anfallen, welch letzteres aus Tiergewebe (insbesondere der Magen-Darm-Schleimhaut von Rindern oder Schweinelungen) extrahiert wurde. Dieses Ausgangsmaterial besitzt die folgenden Eigenschaften: Gewicht: 252 kg

USP-Titer: 82 I.E./mg

Yin-Wessler-Titer: I00 Einheiten/mg.

Dann führt man die folgenden Verarbeitungsschritte durch:

Extraktion mit Alkohol mit einem Titer von 58° GL: Man dispergiert die 252 kg des Ausgangsmaterials unter

030020/0858

heftigem Rühren in 6000 1 Alkohol mit einem Titer von 58° GL. Man trennt dann die unlösliche Phase durch Dekantieren und Zentrifugieren ab und gewinnt die lösliche Fraktion durch Zugabe von Natriumchlorid und Alkohol mit einem Titer von 1oo° GL. Man erhält 23o kg einer unlöslichen Fraktion, die man bei dem nächsten Herstellungsvorgang wiederverwertet,und 2o,6 kg einer löslichen Fraktion mit einem USP-Titer von 21 I.E./mg und einem Yin-Wessler-Titer von 9o Einheiten/mg.

Extraktion einer Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht

aus dieser Fraktion;

Man löst die in Alkohol mit einem Titer von 58° GL lösliche Fraktion in 512 1 (2o Volumen) Wasser. Dann gibt man 1o,24 kg Natriumchlorid und dann 1,5 Volumen (768 1) Alkohol mit einem Titer von 1oo° GL zu. Man gewinnt die ausgefällte Fraktion, entwässert sie mit Alkohol und trocknet sie. Man erhält 19 kg der Fraktion mit einem USP-Titer von 22 I.E./mg und einem Yin-Wessler-Titer von 89 Einheiten/mg.

Man bewahrt diese Fraktion auf und reinigt und überführt sie anschließend in ein injizierbares Calciumsalz.

Man versetzt die bei der Ausfällung erhaltenen 1,5 Volumen der überstehenden Flüssigkeit mit 1,5 Volumen (768 1) Alkohol. Man gewinnt die ausgefällte Fraktion, entwässert sie mit Alkohol und trocknet sie. Man erhält 7oo g eines Produkts mit einem USP-Titer von 6 I.E./mg und einem Yin-Wessler-Titer von 4o Einheiten/mg.

Diese Fraktion mit einem Gewicht von 7oo g besteht aus einer Mischung aus Mucopolysacchariden mit einem niedrigen Molekulargewicht, wenig sulfatiertem Mucopolysaccharid mit hohem Molekulargewicht und mehr oder weniger stark

030020/0863

abgebauten Nucleinsäuren.

Abtrennung der Nucleinsäuren von der Fraktion mit niedri-

gem Molekulargewicht:

Man entfernt den überwiegenden Anteil der Nucleinsäuren durch Ausfällung mit Manganchlorid wie folgt:

Man löst die 7oo g der Fraktion in 7 1 Wasser. Dann gibt man unter Rühren 1 1 einer 1o %-igen MnCl₂~Lösung zu. Es bildet sich ein erheblicher Niederschlag (der aus den unlöslichen Mangansalzen der Ribonucleinsäure und der Desoxyribonucleinsäure besteht), den man durch Zentrifugieren abtrennt. Das aus der klaren überstehenden Flüssigkeit gewonnene Mucopolysaccharid wird durch Ausfällen mit Alkohol gewonnen. Man erhält 48o g des Produkts mit einem USP-Titer von 8 I.E./mg und einem Yin-Wessler-Titer von 54 Einheiten/mg.

Isolierung der Fraktionen mit sehr niedrigem Molekulargewicht durch Gelfiltration:

Man trennt die Produkte mit sehr niedrigem Molekulargewicht durch Gelfiltration auf ULTROGEL AcA 44 ab.

Man behandelt 25 g des Materials in einer Säule mit einem Durchmesser von 2oo mm und einer Länge von 1 m. Das hierbei erzielte Elutionsdiagramm ist in der Fig. 8 dargestellt.

Man gewinnt drei Fraktionen (Fraktionen (1) bis (3) mit den folgenden Eigenschaften (bezogen auf die als Ausgangsmaterial eingesetzten 25 g):

Fraktion (1): Gewicht = 16 g, USP-Titer = 12 I.E./mg,

Yin-Wessler-Titer = 3o Einheiten/mg Fraktion (2): Gewicht = 7 g, USP-Titer =6,5 I.E./mg,

Yin-Wessler-Titer = 7o Einheiten/mg,

Fraktion (3): Gewicht = 2 g, USP-Titer = 2,1 I.E./mg, Yin-Wessler-Titer = 6o Einheiten/mg.

030020/0859

29U792

Chromatographie auf immobilisiertem Antithrombin III:

Man unterwirft die obige Fraktion (3) einer Chromatographie über an Agarose fixiertem Antithrombin III. Mit Hilfe einer 1oo ml-Säule ist es möglich, 7oo mg der Fraktion (3) zu behandeln. Man bewirkt die Absorption in einem o,2 m NaCl/o,o5 m Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5.

Man bewirkt die Elution mit Hilfe eines 2 m NaCl/o,o5 m Tris-HCl-Puffer.

Der nichtgebundene Anteil (6oo bis 65o mg) besitzt einen USP-Titer in der Nähe von 1 bis 2 I.E./mg und einen Yin-Wessler-Titer von 1o bis 2o Einheiten/mg.

Der gebundene Anteil (1o bis 3o mg) besitzt einen USP-Titer von 1o bis 2o I.E./mg und einen Yin-Wessler-Titer von 1ooo bis 14oo Einheiten/mg.

2oBeispiel7

Man vereinigt die Fraktionen A, B und C des Beispiels 5 zu einer einzigen Fraktion, die man dann einer zusätzlichen Fraktionierung durch selektive Bindung an einer Agarose/Antithrombin III-Säule unter Anwendung der in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen unterwirft.

Man eluiert die gebundene Fraktion und erhält die Fraktion P194HPA, die einen Yin-Wessler-Titer von 31o Einheiten/mg und einen USP-Titer von 4o I.E./mg aufweist.

In gleicher Weise vereinigt man die Fraktionen E und F des Beispiels 5. Dann führt man die Trennung der aktivsten Fraktionen durch die oben beschriebene Bindungs/Elutions-Technik mit Hilfe der Agarose/Antithrombin III-Säule durch.

030020/0858

- 4ο -

Schließlich erhält man die Fraktion P194HHPF mit einem Yin-Wessler-Titer von 9oo Einheiten/mg und einem USP-Titer von 82 I.E./mg.

Die Fraktionen P194HHPA und P194HHPF werden einer Protonen- ( H) -Kernresonanzanalyse unterworfen. Das gleiche be wirkt man mit herkömmlichem Heparin (7o21HH).

Man bewirkt die Kernresonanzanalyse der Produkte, die man zuvor in deuteriertem Wasser in Mengen von 14 bis 62 mg/ ο,35 ml gelöst hat, bei 27o MHz in einer BRUKER-Vorrichtung, die mit einem FOURIER-Transformationssystem ausgerüstet ist und die Speicherung der Spektren ermöglicht. Man bestimmt die chemische Verschiebung gegenüber dem Referenzsignal von TSP, wie es oben angegeben ist.

In der Fig. 1o ist das Kernresonanzspektrum des herkömmlichen Heparins dargestellt. Die Fig. 11 und 12 sind für die Kernresonanzspektren der Fraktionen P194HHPF und P194HHPA repräsentativ.

Ein Vergleich der Kernresonanzspektren läßt erkennen, daß die Signale (I₁) und (I₅) der erfindungsgemäßen Fraktionen wesentlich weniger intensiv sind als das Signal (G₁), während diese Signale bei dem Heparin-Vergleichsspektrum im wesentlichen die gleiche Intensität besitzen.

Beispiel 8

Durch Anwendung der in den Beispielen 6 und 7 gegebenen Verfahrensweisen auf andere Ausgangsmaterialien erhält man in ähnlicher Weise die folgenden Fraktionen:

Fraktion P 219 HH: USP-Titer = 14 I.E./mg Yin-Wessler-Titer = 135o Einheiten/mg Fraktion P 225 HH: USP-Titer = 17 I.E./mg

Yin-Wessler-Titer = 132o Einheiten/mg

030020/0858

Fraktion P 231 HH: USP-Titer = 16,2 I.E./mg

Yin-Wessler-Titer = 14oo Einheiten/mg Fraktion P 194 HH A: USP-Titer = 82 I.E./mg Yin-Wessler-Titer = 9oo Einheiten /mg Fraktion P 242 HH A: USP-Titer = 16 I.E./mg

Yin-Wessler-Titer = 18oo Einheiten/mg Fraktion P 255 HH A: USP-Titer = 36 I.E./mg

Yin-Wessler-Titer = 2145 Einheiten/mg

Man unterwirft die Fraktion P 242HHA der Kohlenstoff-13-

( C)-Kernresonanzanalyse (Fig. 14 und 15). Man unterwirft auch übliches Heparin der Referenz 7o71HH dieser Kernresonanz ana Iy se (Fig. 13). Man ermittelt die Spektren der Fraktionen, die man in Mengen von 1oo mg in jeweils 1 ml deuteriertem Wasser (D_0) gelöst hat unter Verwendung eines bei 2o MHz betriebenen Meßgeräts (VARIAN CFT-2o), das mit einem FOURIER-Transformationssystem ausgerüstet ist (wobei man als Referenzsignal für die chemische Verschiebung Tetramethylsilan (TMS) verwendet). 2o

Man beobachtet:

die praktische Abwesenheit eines Resonanzsignals, das für die Anwesenheit von Hydroxylgruppen an dem primären Kohlenstoffatom (in der 6-Stellung der in den erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktionen enthaltenen Glucosamin-Einheiten) charakteristisch ist;

zusätzliche Signale (die in dem NMR-Spektrum des als Vergleichsmaterial verwendeten Heparins im Bereich der Signale (I₁) und (G.) nicht enthalten sind) in Bereichen, die einer chemischen Verschiebung von etwa 1oo ppm entsprechen;

ein zusätzliches Signal im Bereich von 6o ppm, das ir. der Nähe des Signals (G ) liegt;

die Anwesenheit eines ResonanzSignaIs im Bereich von 75 ppm (dem normalerweise kein Resonanzsignal des un-

030020/0868

ter gleichen Bedingungen aufgezeichneten NMR-Spektrums des herkömmlichen Heparins entspricht);

(die oben angegebenen chemischen Verschiebungen sind auf die Methylgruppe der N-Acetylglucosamin-gruppen bezogen, die in dem erfindungsgemäßen Mucopolysaccharid enthalten sind (siehe den Bereich von 25 ppm in den Spektren der Fig. 14 und 15)) .

Signale, die den erfindungsgemäßen Fraktionen oder Verbindüngen eigen sind, sind in den Fig. 14 und 15 mit einem Sternchen gekennzeichnet.

Die Fig. 15 enthält weiterhin eine Cl-Integrationskurve, aus der zu erkennen ist, daß

die untersuchte Verbindung homogen und damit praktisch rein ist,

daß sie die Eigenschaften eines Dekasaccharids besitzt und

daß sie eine N-Acetylglucosarain-Einheit pro zwei 2-0-Sulfatiduronsäure-Einheiten und pro zwei N-SuI-fat-glucosamin-Einheiten

aufweist.

Die Erfindung ermöglicht somit die Herstellung von Mucopolysaccharidfraktionen mit einer hohen Anti-Xa-Wirkung, die in bezug auf den Faktor Xa eine bemerkenswerte Selektivität im Rahmen der nacheinander ablaufenden enzymatischen Reaktionen, die für den Blutgerinnungsprozeß charakteristisch sind, zeigen.
3o

Diese bemerkenswerte Aktivität und Selektivität wird auch durch die Ergebnisse von pharmakologischen Untersuchungen verdeutlicht, die nachstehend angegeben sind und die mit der Fraktion P188CH durchgeführt wurden, die nach der Um-Wandlung der Fraktion P194HHC des Beispiels 1, die in Form

030020/0858

des Natriumsalzes vorlag, mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens in das Calciumsalz überführt worden ist.

Diese Ergebnisse werden durch die Kurven der Fig. 2 bis verdeutlicht, die den Vergleich der Antikoagulationswirkung der erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion einerseits mit der eines herkömtilichen Heparins (mit einem USP-Titer von 17o Einheiten/mg) andererseits verdeutlichen.

Die Kurven der Fig. 2 bis 5 zeigen die in vitro beobachtete Veränderung der Koagulationszeit in Humanblutplasma in Abhängigkeit von der Steigerung der Dosis eines herkömmlichen Heparins einerseits und der erfindungsgemäßen Fraktion P188CH andererseits (wobei die den Fig. 4 und 5 entsprechenden Tests mit blutplättchenfreiem Plasma, das demzufolge an dem Faktor XI verarmt ist, durchgeführt wurden) .

Die Fig. 6 und 7 verdeutlichen die in vivo am Kaninchen ermittelten Vergleichsergebnisse mit der gleichen Fraktion P 188CH (Fig. 6) und dem Vergleichsheparin (Fig. 7) (wobei die angegebenen Ergebnisse an Gruppen von jeweils fünf Kaninchen ermittelt wurden). Jedem Kaninchen wurden 5oo Yin-Wessler-Einheiten pro kg der zu untersuchenden Substanz gegeben.

Die Fig. 2 bis 5 zeigen die durch die verabreichten Materialien, insbesondere der Mucopolysaccharidfraktion . (Kurven a., a~, a und a.) und des Vergleichsmaterials Heparin (Kurven b₁, b_, b_ und b.) erreichte zeitliche Änderung (in s)
des Thrombingehalts (Fig. 2).
des Kephalin-Kaolin-Gehalts (Fig. 3) und der Koagulation in Gegenwart von konzentriertem Thromboplastin (Fig. 4) und von verdünntem Thromboplastin (Fig. 5)

030020/0859

in Abhängigkeit von den Dosierungen, die jeweils in USP-Einheiten/mg angegeben sind.

Die Thrombin-Zeit und die Cephalin-Kaolin-Zeit stellen Messungen dar, die die Wirkung der untersuchten Verbindungen auf die Inhibierung des aktivierten Faktors II bzw. die Gesamtkoagulation widerspiegeln. Die Kurven der Fig. 2 und 3 zeigen in dieser Hinsicht deutlich, daß die erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion im Vergleich zu der Vergleichssubstanz Heparin eine wesentlich geringere Wirkung auf die Inhibierung der Inaktivierung des Prothrombine und auf das Ausmaß der Gesamtkoagulation ausübt. Im Gegensatz dazu zeigen die Fig. 4 und 5, die repräsentativ für die Phänomene sind, die direkter mit dem Ablauf der enzymatischen Reaktionen verbunden sind, die für die exogene (extrinsic) Koagulation charakteristisch ist (insbesondere in bezug auf die Abwesenheit des Faktors Ha) , einen deutlichen Vorteil der erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion gegenüber der Vergleichssubstanz Heparin.

Die erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion verursacht unter diesen Bedingungen eine langsamere Koagulation der Blutprobe.

In der Fig. 6 sind die Änderungen der bei einem Kaninchen gemessenen Aktivitäten in Abhängigkeit von der Zeit in Stunden dargestellt, dem 5oo Yin-Wessler-Einheiten einer erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion verabreicht worden waren. Zur Bewertung dieser Aktivitäten wurde auf die Änderung der Yin-Wessler-Titer (Kurve YW ) und der Cephalin-Kaolin-Titer (Kurve CKT₅) (I.E./ml Plasma) in Abhängigkeit von der Zeit in Stunden Bezug genommen.

Die gleichen Messungen wurden mit der Vergleichssubstanz Heparin durchgeführt. Die entsprechenden Änderungen der Aktivitäten sind in den Kurven YW, und CKT, der Fig. 7

D O

dargestellt.

030020/0858

Aus der Fig. 6 ist zu erkennen, daß die Verabreichung von 5oo Yin-Wessler-Einheiten des erfindungsgemäßen Mucopolysaccharide zu einer beträchtlichen Anti-Xa-Wirkung führt, im Vergleich zu der gesamten Koagulationswirkung, ausgedrückt in CKT-Einheiten, die relativ gering ist. Es ist beispielsweise festzuhalten, daß die Yin-Wessler-Aktivität in der zweiten Stunde o,85 Einheiten/ml beträgt, während die CKT-Aktivität lediglich o,15 I.E./ml ausmacht. Im Gegensatz dazu verursacht die Verabreichung von 5oo Yin-Wessler-Einheiten pro ml der Vergleichssubstanz Heparin einen über den CKT-Titer ausgedrückten Effekt, der wesentlich größer ist im Vergleich zu der über den Yin-Wessler-Titer meßbaren Anti-Xa-Aktivität. Insbesondere ist festzuhalten, daß in der zweiten Stunde die Anti-Xa-Aktivität o,55 Einheiten/ml entspricht, während die gesamte Antikoagulanswirkung als CKT-Titer gemessen o,38 I.E./ml beträgt. Die Differenz zwischen diesen beiden Titern ist damit wesentlich geringer als bei dem erfindungsgemäßen Mucopolysaccharid. Das Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu dem CKT-Titer verändert sich somit von einem Wert von weniger als 2 bei der Vergleichssubstanz Heparin zu einem Wert von mehr als 5 bei der erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion.

Die in vitro- und die in vivo-Tests zeigen somit eine deutlich selektivere Wirkung der erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion, insbesondere in bezug auf die Inhibierung des Faktors Xa, im Vergleich zu der Vergleichssubstanz Heparin.

Die erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktionen sind frei von toxischen Wirkungen. Die Verabreichung von 1o ooo Einheiten/kg (Yin-Wessler-Titer) irgendwelcher erfindungsgemäßer Fraktionen verursacht beim Kaninchen weder irgendwelche toxischen Reaktionen noch irgendeine pyrogene Wir-

030020/0858

kung bei dem Pyrogenitätstest am Kaninchen nach der Methode der französischen Pharmacopoe.

Gegenstand der Erfindung sind daher insbesondere Mucopolysaccharidfraktionen der beschriebenen Art, die insbesondere eine Aktivität von mindestens 4o und noch bevorzugter mindestens 5o und am bevorzugtesten von mindestens 1oo Einheiten/mg (Yin-Wessler-Titer) aufweisen. Fraktionen mit einem Yin-Wessler-Titer von mehr als 3oo und insbesondere von mehr als 9oo Einheiten/mg sind noch stärker bevorzugt.

Gegenstand der Erfindung sind daher auch pharmazeutische Zubereitungen oder Arzneimittel ähnlicher Aktivität, die frei von pyrogenen Substanzen sind und die erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktionen in Kombination mit üblichen pharmazeutischen Bindemitteln, Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffen enthalten. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere injizierbare, sterile, konzentrierte Lösungen dieser Fraktionen, die in der Therapie zur Steuerung der Blutgerinnung verwendet werden können, welche Lösungen 1ooo bis 1oo ooo, vorzugsweise 5ooo bis 5o ooo und insbesondere 25 ooo Einheiten/ml (Yin-Wessler-Titer) der Mucopolysaccharidfraktion enthalten,wenn diese Lösungen durch subcutane Injektion verabreicht werden sollen,, und welche Lösungen beispielsweise 5oo bis 1o ooo und insbesondere 5ooo Einheiten/ml der Mucopolysaccharidfraktion enthalten, wenn sie durch intravenöse Injektion oder durch Perfusion gegeben werden sollen.

Die erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion liegt mit Vorteil in Form eines Salzes mindestens eines physiologisch annehmbaren Metalls, wie Natrium und/oder Calcium vor. Mit Vorteil liegen diese erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen in Form von einmal verwendbaren Injektions-

030020/0858

spritzen vor, die jederzeit angewandt werden können.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen sind insbesondere für die (vorbeugende oder heilende) Beeinflussung der Blutkoagulation oder Blutgerinnung am Menschen oder beim Tier geeignet, insbesondere in jenen Fällen, wenn bei dem Organismus das Risiko der Hyperkoagulierbarkeit besteht, insbesondere in jenen Fällen, bei denen eine Störung der oben angesprochenen exogenen Phase vorliegt, beispielsweise als Folge der Freisetzung von Thromoplastin durch den Organismus, beispielsweise von Gewebethroroboplastin (chirurgische Operationen, atheromatöse Prozesse, Tumorentwicklung, Störungen des Koagulationsmechanismus durch bakterielle oder enzymatische Aktivatoren etc.). Lediglieh zur weiteren Verdeutlichung der Erfindung und ohne daß dadurch der Schutz in irgendeiner Weise eingeschränkt werden soll, sei im folgenden beispielsweise die Dosierung angegeben, die in der Humantherapie angewandt werden kann: Diese Dosierung umfaßt beispielsweise die Verabreichung von 1ooo bis 25 ooo Einheiten auf subeutanem Wege zwei- bis dreimal täglich in Abhängigkeit von dem Hyperkoagulationsrisiko oder dem thrombotischen Zustand des Patienten; oder von 1ooo bis 25 ooo Einheiten/24 Stunden auf intravenösem Wege bei diskontinuierlicher Verabreichung in regelmäßigen Intervallen oder bei kontinuierlicher Verabreichung durch Perfusion; oder von 1ooo bis 25 ooo Einheiten (dreimal wöchentlich) bei intramuskulärer Verabreichung (wobei die angegebenen Einheiten sich auf den Yin-Wessler-Titer beziehen). Die Dosierungen sollten natürlich bei jedem Patienten in Abhängigkeit von den Ergebnissen der zuvor durchgeführten Blutanalysen, der Art der Störung, an der der Patient leidet, und ganz allgemein seinem Gesundheitszustand eingestellt werden.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Anwendung der

030020/0853

erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktionen als biologische Reagenzien, die im Laboratorium verwendet werden können, insbesondere als Vergleichsmaßstab für die Untersuchung anderer Substanzen, deren Antikoagulierwirkung untersucht werden soll, insbesondere im Hinblick auf die Inhibierung des Faktors Xa.

Es versteht sich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf diese Anwendungszwecke und Ausführungsformen beschränkt ist. Sie umfaßt im Gegenteil auch sämtliche Abänderungen, insbesondere jene im Hinblick auf das oben definierte wäßrig-alkoholische Extraktionsmedium, das auch aus einer Mischung aus Wasser und einem von Äthanol verschiedenen Alkohol, wie beispielsweise einem anderen aliphatischen oder aromatischen Alkohol, vorzugsweise einem cyclischen oder acyclischen gesättigten aliphatischen Alkohol, wie einem primären Alkohol mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, bestehen kann, wobei es sich versteht, daß in jedem Fall die Wasser/Alkohol-Verhältnisse des Mediums durch einfache Rou-

tineuntersuchungen bestimmt werden sollten, die zu einer Extraktion der Mucopolysaccharidfraktion führen, die derjenigen äquivalent ist, die man mit einer Wasser/Äthanol-Mischung mit einem Titer von 55 bis 6o° GL erhält.

03002U/Q8S3

Leerseite

Claims (29)

1. Patentanwälte Dipl.-In»;. H. Vkickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

   Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H. Liska

   SOOO MÖNCHEN 16, DEN

   POSTFACH 860120

   MDHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 3921/22

   HtM/cb

   PL-O365 79 o5

   CHOAY S.A.

   48, Avenue Theophile-Gautier 75782 Paris Cedex 16, Frankreich

   Mucopolysaccharidfraktion, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel

   Patentansprüche

   Mucopolysaccharidfraktion erhältlich aus Heparin oder Heparinbestandteilen mit Molekulargewichten von 2ooo bis 50 000 enthaltenden Fraktionen, dadurch gekennzeichnet , daß sie in einem wäßrig-alkoholischen Medium (Wasser/Äthanol) mit einem Titer von 55 bis 61° GL löslich ist, daß sie in einem Wasser/Äthanol-Medium mit einem höheren Alkoholgehalt zur Unlöslichkeit neigt, daß sie in reinem Alkohol unlöslich ist und daß sie ein Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer von mindestens 2, insbesondere von mindestens 3

   030020/0858

   und vorzugsweise von mehr als 6 aufweist.
2. 2. Mucopolysaccharidfraktion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß sie ein Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer von mehr als 1o und vorzugsweise von mehr als 16 aufweist.
3. 3. Mucopolysaccharidfraktion nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß sie im wesentliehen aus Bestandteilen mit Molekulargewichten von weniger als 1OOOO besteht.
4. 4. Mucopolysaccharidfraktion nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß sie im wesentlichen aus Bestandteilen besteht, deren Molekulargewichte zwischen etwa 2ooo und etwa 8ooo liegen.
5. 5. Mucopolysaccharidfraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man sie bei der Gelfiltration auf einer mit Polyacrylamid- und Agarose-Gel in Kugelform, des Typs, der im Handel unter der Bezeichnung ULTROGEL AcA 44 erhältlich ist, beschickten Säule in den 1,5 Litern des Eluats erhält, die der Elution eines Volumens von 2,5 Liter, Totvolumen nicht eingeschlossen, folgen, wenn man die Gelfiltration bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2oo ml/h in einer Säule mit einem Durchmesser von 1oo mm und einer Länge von 1 m durchführt und die Konzentration des auf die Säule aufgetragenen Mucopolysaccharids 5o mg/ml und das auf die Säule aufgetragene Volumen der Lösung 37,5 ml betragen.
6. 6. Mucopolysaccharidfraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß sie der Fraktion entspricht, die bei einem Gelpermeationssystem auf Säulen mit einer Länge von 25o mm und einem

   030020/0868

   Durchmesser von 9 mm, die mit Siliciumdioxid mit einer Korngröße von 1o bis 1oo,um beschickt sind, eine Retentionszeit im Bereich von 5,7 bis 7,5 min, insbesondere von 6,6 bis 7,ο min, in einer solchen Säule aufweist, wenn man 5o.ul einer Lösung von 1,3 mg/ml dieser Fraktion in einem o,o2 m Na₃SO₄-PUffer auf diese Säule aufträgt und dann mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml/min eluiert.
7. 7. Mucopolysaccharidfraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß sie ein Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer von mehr als 1o, insbesondere im Bereich von 13 bis 16, und einen Yin-Wessler-Titer von mehr als 13o Einheiten/ mg und insbesondere von 135 bis I60 Einheiten/mg aufweist.
8. 8. Mucopolysaccharidfraktion, dadurch gekennzeichnet , daß sie

   in einem wäßrig-alkoholischen Medium (Wasser/Äthanol) mit einem Titer von 55 bis 61° GL löslich ist; in einem Wasser/Äthanol-Medium mit einem höheren Alkoholgehalt zur Unlöslichkeit neigt und in reinem Alkohol unlöslich ist;

   einen Yin-Wessler-Titer von mehr als 13o Einheiten/mg aufweist;

   ein Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer von mehr als 13 besitzt;
   im wesentlichen aus Bestandteilen mit Molekulargewichten von weniger als I0000 und insbesondere zwischen etwa 2ooo und etwa 8000 besteht;

   daß man sie bei der Gelfiltration auf einer mit Polyacrylamid- und Agarose-Gel in Kugelform, des Typs, der im Handel unter der Bezeichnung ULTROGEL AcA 44 erhältlich ist, beschickten Säule in den 1,5 Litern des Eluats erhält,

   030020/0858

   die der Elution eines Volumens von 2,5 Liter, Totvolumen nicht eingeschlossen, folgen, wenn man die Gelfiltration bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2oo ml/h in einer Säule mit einem Durchmesser von 1oo mm und einer Länge von 1 m durchführt und die Konzentration des auf die Säule aufgetragenen Mucopolysaccharids 5o mg/ml und das auf die Säule aufgetragene Volumen der Lösung 37,5 ml betragen; und
   daß sie der Fraktion entspricht, die bei einem Gelpermeationssystem auf Säulen mit einer Länge von 25o mm und einem Durchmesser von 9 mm, die mit Siliciumdioxid mit einer Korngröße von 1o bis 1oo,um beschickt sind, eine Retentionszeit im Bereich von 5,7 bis 7,5 min, insbesondere von 6,6 bis 7,ο min, in einer solchen Säule aufweist, wenn man 5o.ul einer Lösung von 1,3 mg/ml dieser Fraktion in einem o,o2 m Na-SO.-Puffer auf diese Säule aufträgt und dann mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml./min eluiert.
9. 9. Mucopolysaccharidfraktion nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß sie ein Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer im Bereich von 13 bis 16 und einen Yin-Wessler-Titer von 135 bis 16o Einheiten/mg aufweist.
10. 10. Mucopolysaccharidfraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß sie die Fähigkeit besitzt, vbn Antithrombin III fixiert zu werden.
11. 11. Mucopolysaccharidfraktion nach Anspruch 1o, dadurch gekennzeichnet , daß sie die Fähigkeit besitzt, in einem o,2 m NaCl/o,o5 m Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 an an einem Träger, wie Agarose, gebundenen Antithrombin III fixiert zu werden und daß sie

    030020/08E8

    29A4792

    ein Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer (YW/üSP-Verhältnis) von mindestens 6 aufweist und daß sie einen Yin-Wessler-Titer von mindestens 3oo Einheiten/mg besitzt.
12. 12. Fraktion nach Anspruch 1o oder 11, dadurch gekennzeichnet , daß sie ein YW/USP-Verhältnis von mehr als 18 und eine Yin-Wessler-Aktivität.von mehr als 9oo Einheiten/mg aufweist.
13. 13. Fraktion nach einem der Ansprüche 1o bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein YW/USP-Verhältnis von mehr als 5o aufweist.
14. 14. Fraktion nach Anspruch 13, dadurch g e k e η η zeichnet, daß sie ein YW/USP-Verhältnis von mehr als 65 und eine Yin-Wessler-Aktivität von mehr als 13oo Einheiten/mg besitzt.
15. 15. Fraktion oder Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1o bis 14, dadurch gekennzeichnet , daß sie

    in Form einer Lösung in deuteriertem Wasser bei 35°C ein bei 27o MHz ermitteltes Protonen-( H)-Kernresonanzspektrum aufweist, das als charakteristische Elemente Resonanzsignale aufweist, die bei einer chemischen Verschiebung im Bereich von 4,8 und 5,2 ppm wesentlich schwächer sind als das Resonanzsignal, das für eine chemische Verschiebung im Bereich von 5,4 ppm beobachtet wird (wobei als Standard für die Messung der Verschiebungen Natrium-3-trimethylsilylpropionat 2.2,3.3-d. eingesetzt wird).
16. 16. Fraktion oder Verbindung nach einem der Ansprüche 1o bis 15, dadurch gekennzeichnet , daß das in einer Lösung dieser Verbindung in deuteriertem Wasser mit einer Strahlung von 2o MHz ermittelte Kohlen-

    1 3

    stoff-13-( C)-Kernresonanzspektrum als charakteristische Elemente (wobei als Vergleichsstandard für die Ver-

    030020/0858

    29U792

    Schiebungen Tetramethylsilan verwendet wird) folgendes aufweist:

    die praktische Abwesenheit von Resonanzsignalen, die für die Anwesenheit von OH-Gruppen am primären Kohlenstoffatan (in der 6-Stellung) der Glucosamin-Einheiten, die in der Mucopolysaccharidfraktion enthalten sind, charakteristisch sind,

    zusätzliche Signale im Bereich der (I₄)-und (G₁)-Signale in Bereichen, die der chemischen Verschiebung in der Größen-

    Ordnung von 1oo ppm entsprechen,

    ein zusätzliches Signal (G₃), das dem N-sulfatierten G₃-

    Signal im 60 ppm-Bereich benachbart ist, und die Anwesenheit eines Resonanzsignals in dem 75 ppm-Bereich.
17. 17. Fraktion oder Verbindung nach einem der Ansprüche 1o bis 16, dadurch gekennzeichnet , daß sie ein NMR-Spektrum aufweist, das mindestens einem der Fig. 11, 12, 14 und 15 entspricht.
18. 18. Fraktion oder Verbindung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet , daß sie aus einem homogenen Oligosaccharid besteht, das die folgenden zusätzlichen Kenndaten aufweist:

    es besitzt 8 bis 12, insbesondere 1o Monosaccharideinheiten;

    sämtliche primären Positionen der Glucosamin-Einheiten dieses Oligosaccharids sind sulfatiert; dieses Oligosaccharid enthält eine N-Acetylglucosamin-Einheit pro 2 Einheiten der 2-0-Sulfatiduronsäure und pro 2 N-SuIfat-glucosamin-Einheiten, während die anderen Saccharide anderer Natur sind und unterschiedliche Substituenten aufweisen.
19. 19. Fraktion oder Verbindung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , daß sie ein Molekulargewicht

    030020/0858

    von etwa 2ooo bis etwa 3ooo, insbesondere von etwa 25oo aufweist.
20. 20. Fraktion oder Verbindung, dadurch g e k e η η zeichnet, daß sie aus einem homogenen Oligosaccharid besteht, das die folgenden zusätzlichen Eigenschaften aufweist:

    es enthält 8 bis 12, insbesondere 1o Monosaccharid-Einheiten;

    sämtliche primären Positionen der Glucosamin-Einheiten dieses Oligosaccharids sind sulfatiert; dieses Oligosaccharid enthält eine N-Acetylglucosamin-Einheit pro 2 2-0-Sulfatiduronsäure-Einheiten und pro 2 N-SuIfat-glucosamin-Einheiten, während die anderen Saccharide anderer Art sind und andere Substituenten aufweisen;

    sie übt in vitro und in vivo eine selektive Inhibierung des Xa-Faktors aus; und
    sie wird an Antithrombin III fixiert.
21. 21. Fraktion oder Verbindung nach Anspruch 2o, dadurch gekennzeichnet , daß sie in Form einer Lösung in deuteriertem Wasser bei 35°C ein bei 27o MHz ermitteltes Protonen-( H)-Kernresonanzspektrum aufweist, das als charakteristische Elemente Resonanzsignale aufweist, die bei einer chemischen Verschiebung im Bereich von 4,8 und 5,2 ppm wesentlich schwächer sind als das Resonanzsignal, das für eine chemische Verschiebung im Bereich von 5,4 ppm beobachtet wird (wobei als Standard für die Messung der Verschiebungen Natrium-3-trimethylsilylpropionat 2.2,3.3-d, eingesetzt wird).
22. 22. Fraktion oder Verbindung nach Anspruch 2o oder 21, dadurch gekennzeichnet , daß das in einer Lösung dieser Verbindung in deuteriertem Wasser mit ei-

    1 3 ner Strahlung von 2o MHz ermittelte Kohlenstoff-13-( C)-

    030020/0868

    Kernresonanzspektrum als charakteristische Elemente (wobei als Vergleichsstandard für die Verschiebungen Tetramethylsilan verwendet wird) folgendes aufweist: die praktische Abwesenheit von Resonanzsignalen, die für die Anwesenheit von OH-Gruppen am primären Kohlenstoffatom (in der 6-Stellung) der Glucosamin-Einheiten, die in der Mucopolysaccharidfraktion enthalten sind, charakteristisch sind,
    zusätzliche Signale im Bereich der (I₁)- und (G )-Signale

    in Bereichen, die der chemischen Verschiebung in der Größenordnung von 1oo ppm entsprechen, ein zusätzliches Signal (G₂), das dem N-sulfatierten G_- Signal im 6o ppm-Bereich benachbart ist, und die Anwesenheit eines Resonanzsignals in dem 75 ppm-Bereich.
23. 23. Fraktion oder Verbindung nach einem der Ansprüche 2o bis 22, dadurch gekennzeichnet , daß sie ein Molekulargewicht von etwa 2ooo bis 3ooo und insbesondere von etwa 25oo aufweist.
24. 24. Mucopolysaccharidfraktion nach einem der Ansprüche

    1 bis 23, dadurch gekennzeichnet , daß ihre Bestandteile in Form von Salzen mindestens eines physiologisch annehmbaren Metalls, wie Natrium oder Calcium, vorliegen.
25. 25. Verfahren zur Herstellung einer Mucopolysaccharidfraktion mit einem hohen Yin-Wessler-Titer und einem niedrigen USP-Titer, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substanz auf der Grundlage von Heparin oder Heparinbestandteilen, deren Molekulargewichte insbesondere im Bereich von 2ooo bis 5oooo liegen, welche Substanz einen verminderten Gehalt an anorganischen Salzen von vorzugsweise weniger als 1 Gew.-% aufweist, in einem wäß-

    030020/0858

    rig-alkoholischen Medium des Wasser/Äthanol-Typs mit einem Titer zwischen etwa 55 und etwa 61 GL, vorzugsweise mit einem Titer von etwa 58° GL suspendiert; die unlösliche Fraktion abtrennt; und die Lösung, die die gelöste Mucopolysaccharidfraktion enthält, gewinnt, aus der die Mucopolysaccharidfraktion gewonnen wird, insbesondere durch alkoholische Fällung.
26. 26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man die nach dem Verfahren von Anspruch 24 erhaltene wäßrige Lösung einer Gelfiltration unter solchen Bedingungen unterwirft, daß man Fraktionen mit noch höheren Verhältnissen von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer erhält.
27. 27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet , daß man eine weitere Anreicherung dadurch bewirkt, daß man irgendwelche der zuvor erhaltenen Fraktionen mit immobilisiertem Antithrombin III in Kontakt bringt, um eine selektive Fixierung der aktivsten Fraktionen im Hinblick auf die Yin-Wessler-Aktivität zu bewirken, und die letzteren durch Elution mit einem Puffer, der die Desorption zu bewirken vermag, gewinnt.
28. 28. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend die Mucopolysaccharidfraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 24 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Bindemittel und/oder Hilfsstoff.
29. 29. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 28 in Form von Dosiseinheitsformen, dadurch gekennzeichnet , daß sie in Form einer sterilen, injizierbaren, konzentrierten Lösung dieser Fraktion vorliegt, die in der Therapie für die Steuerung der Blutkoagulation verwendet werden kann, welche Lösung 1ooo bis 1oo ooo Ein-

    030020/0858

    29U792

    - 1ο -

    heiten (Yin-Wessler)/ml der Mucopolysaccharidfraktion, vorzugsweise 5ooo bis 5o ooo Einheiten/ml und insbesondere 25 ooo Einheiten/ml aufweist, wenn diese Lösungen für die subcutane Injektion verwendet werden sollen, oder die beispielsweise 5oo bis 1o ooo und insbesondere 5ooo Einheiten/ml der Mucopolysaccharidfraktion enthalten, wenn diese auf intravenösem Wege oder durch Perfusion verabreicht wird.

    030020/0858