DE3021006A1 - Neues oberflaechenaktives material, verfahren zur herstellung desselben und dieses material enthaltendes pharmazeutisches mittel gegen hyalin-membran-erkrankung - Google Patents
Neues oberflaechenaktives material, verfahren zur herstellung desselben und dieses material enthaltendes pharmazeutisches mittel gegen hyalin-membran-erkrankungInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein oberflächenaktives Material, ein Verfahren zur Herstellung desselben und
ein pharmazeutisches Mittel, das dieses wirksame Material enthält und gegen Hyalin-(im Original: hyline-)
Membran-Erkrankung geeignet ist.
Die Lunge von Säugetieren übt, wie allgemein bekannt ist, die Respirationsfunktion aus, bei der Luftsauerstoff
in das Blut der Lunge aufgenommen und Kohlendioxid aus diesem durch die Zellen abgegeben wird, die
innerhalb der Oberfläche einer Vielzahl von Lungenalveolen (d.h. dem Hohlraumteil der Lunge) vorliegen,
welche mit der Trachea oder dem Luftweg verbunden sind. Viele umfangreiche Untersuchungen in den letzten Jahren
in bezug auf die Lungenphysiologie, insbesondere Respirationsstörungen bei Frühgeburten mit kurzer Gestationsdauer,
haben deutlich gemacht, daß ein spezifisches Material in Lungenalveolen vorhanden ist, das zu der
Stabilität von Flüssigkeit-Luft-Grenzfläche darin führt (im allgemeinen pulmonares oberflächenaktives Mittel
genannt), wobei ein Mangel an diesem Material Respirationsfunktionsstörungen, die sogenannte Hyalin-Membran-Erkrankung
(nachfolgend HMD abgekürzt) zur Folge hat. Es sind jedoch etwas unterschiedliche Meinungen über
die genaue chemische Natur, insbesondere die chemische Zusammensetzung, von solchem pulmonaren oberflächenaktiven
Mittel, das einem lebenden Körper entnommen worden ist, vertreten worden.
Zur Behandlung der besagten HMD ist bisher die sogenannte kontinuierliche positive Luftwegdruckmethode angewendet
worden, bei welcher Luft oder Sauerstoff durch
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ein dünnes Polyvinylrohr gedrückt wird; ein Verfahren zur Förderung der Entwicklung der Festuslunge besteht
darin, daß der Mutter spezifische Steroidverbindungen verabreicht werden, und kürzlich ist über ein Verfahren
berichtet worden, bei dem Phosphatidylcholin und Phosphatidylglycerin, die sich als Hauptkomponenten
des pulmonaren oberflächenaktiven Mittels erwiesen haben, durch langsames Einflößen in den Luftweg zugeführt
werden (vgl. Summary of Lecture Meeting of Pediatric Research Society, Atlantic City, 1970,
S. 84; Pediatrics, 48, 547, 1971; Pedriatic Research, 11. 573, 1977). Obwohl diese konventionellen Methoden
zur Behandlung von HMD einen gewissen Effekt gezeigt haben, werden sie dennoch nicht als solche angesehen,
die einen fundamentalen Effekt ergeben.
Andererseits enthalten pulmonare oberflächenaktive Mittel, die von der Lunge von Säugetieren aber nicht
von Menschen extrahiert worden sind, unvermeidlich eine erhebliche Menge von sogenannten fremden Proteinen
und sind im allgemeinen mit vielen Mikroorganismen verunreinigt, so daß derartige oberflächenaktive
Mittel zur klinischen Behandlung von menschlicher HMD nicht verabreicht werden können.
Es ist im allgemeinen angenommen worden, daß die chemische Zusammensetzung der konventionellen pulmonaren
oberflächenaktiven Mittel 10-20% Protein und 80-90% Lipoid, bezogen auf das gesamte oberflächenaktive
Mittel entspricht, wobei das Lipoid aus etwa 10% neutralem Lipoid (z.B. Triglycerid, Cholesterin)
und etwa 90% Phospholipoid, bezogen auf die besagte Substanz, besteht, während der Phosphatidylcholin-
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Q3■»' 5fä^ ^Όίώίώΐ INSPECTED
gehalt, bezogen auf das gesamte Phospholipoid, 86% beträgt. (In dieser Beschreibung und den Ansprüchen
beziehen sich "%" und "Teil" auf das trockne Material, falls es nicht anders angegeben ist).
Das bei klinischen Behandlungen von HMD beim Menschen verwendbare Material ist im Rahmen der Erfindung untersucht
worden, und es ist gefunden worden, dass das oberflächenaktive Material, das aus dem Lungengewebe
von Säugetieren unter Anwendung einer kombinierten Behandlung mit Aceton und Behandlung mit einem Gemisch
organischer Lösungsmittel extrahiert worden war, und zwar nicht nach den konventionellen Verfahren
des Differenz-Zentrifugierens, Dichtegradient-Zentrifugierens
und der Dialyse, und das eine neue chemische Zusammensetzung aufwies, in-dem der Proteingehalt
geringer und ein hoher Gehalt an Phosphatidylcholin mit zwei Resten von gesättigter Fettsäure
gegeben war, eine signifikante Verringerung der Oberflächenspannung beim Lungenalveolarraum beim
Menschen zeigte, so daß ein klinischer Effekt bei HMD gegeben war, ohne daß der Patent unter fremden
Proteinen zu leiden hatte.
Dementsprechend wird gemäß der Erfindung ein oberflächenaktives Material vorgeschlagen, das aus
dem Lungengewebe von Säugetieren extrahiert worden ist und eine derartige chemische Zusammensetzung besitzt,
daß der Phospholipoidgehalt 75,0-95,5%, der Gehalt an neutralem Lipoid 1,8-14,0%, der Gehalt
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SPKTTEP
an vollständigem Cholesterin 0,0 -3,0%, der Kohlenhydratgehalt
0,1-1,5% und der Proteingehalt 0,5-5,0%, jeweils auf das Trockengewicht des oberflächenaktiven
Materials bezogen, beträgt.
Gemäß der Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend definierten oberflächenaktiven
Materials vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man kleine Lungenstücke von einem
Säugetier mit einer Elektrolytlösung in Berührung bringt, ein rohes oberflächenaktives Material aus
dem erhaltenen Extrakt gewinnt und eine erforderliche Menge von Phospholipoid zusetzt, so daß der
Phospholipoidgehalt 75,0-95,5%, bezogen auf das gesamte aktive Material ausmacht.
Gemäß der Erfindung wird außerdem ein pharmazeutisches Mittel vorgeschlagen, das zur Behandlung von HMD
geeignet ist und das vorstehend definierte oberflächenaktive Material enthält.
Die Figur 1 gibt die Vergleichsdia-gramme (oder sogenannte
Hysteresiskurven) von Oberflächenspannung-Oberflächenbereich von bei diesem Test verwendeter
physiologischer Kochsalzlösung wieder, wobei der schraffierte (mit schrägen Strichen versehene) Teil
in dieser Figur den Bereich angibt, in den die Hysteresiskurven fallen, wenn das aktive Material der
Erfindung tropfenweise zu der Oberfläche von physiologischer Kochsalzlösung in einer Menge von 0,3-0,8
/Ug je cm Oberflächenbereich gegeben worden ist
(die darin befindliche fett ausgezogene Linie stellt
030062/0686 ofliGiNÄL Inspected
ein Beispiel für solche Hysteresiskurven dar, wenn kein aktives Material zugegeben worden ist; und die gestrichelte
Linie in dieser Figur stellt die Hysteresiskurve dar, wenn 0,5 /Ug von Dipalmitoylphosphatidylcholin-Phosphatidylglycerin-Gemisch
(Gewichtsverhältnis 9:1) tropfenweise Je cm Oberflächenbereich
zugegeben worden ist, wobei die Oberflächenspannung bei 15-250C gemessen und unter Benutzung eines Acoma
Wilhelmy-Oberflächenspannungsmessers und X-Y-Schreibers, Modell F-3D (hergestellt von Acoma Igaku Kogyo Co.,
Ltd. und Riken Denshi Co., Ltd.) registriert worden ist.
Die Figur 2 gibt das Infrarotabsorptionsspektrum des aktiven Materials der Erfindung wieder, gemessen in
einem KBr-Täfeichen mit einem Infrarotspektrophotometer
(Hitachi 295-Modell).
Die Figur 3 erläutert das Ultraviolettabsorptionsspektrum des aktiven Materials der Erfindung, gemessen in
einer 0,l%igen (Gewicht/Volumen) Lösung des Materials
in einem Cyclohexan-Äthanol-Gemisch (Volumenverhältnis 1:1) mit einem selbstschreibenden Spektrophotometer
(Hitachi 340-Modell).
Eine vorteilhafte Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung des neuen oberflächenaktiven Materials
gemäß der Erfindung wird nachfolgend im einzelnen erläutert:
(a) Die aus einem normalen Säugetier herausgeschnittene Lunge wird in faustgroße Stücke zerkleinert, welche
dann nach dem Entfernen der unerwünschten Blutgefäße
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Luftröhre, Fettmassen und des Bluts mit einer Fleischhackmaschine oder Homogenisiermaschine fein zorhackt
werden. Als Säugetier werden geeigneterweise Rinder, Pferde, Schafe, Schweine, Hunde, Katzen oder Kaninchen
verwendet. Wenn die zerhackte Lunge lyophilisiert wird, ist es möglich, sie aufzubewahren, ohne daß sie eine
Qualitätsänderung erleidet oder einer Fäulnis unterliegt.
(b) Eine Elektrolytlösung, wie z.B. eine physiologische Kochsalzlösung, wird zu der zerhackten und wie
vorstehend zubereiteten Lunge gegeben, und das erhaltene Gemisch wird bei 0-1O0C für 30-120 Minuten
gerührt. Das Gemisch wird entweder unter Druck filtriert oder bei einer geringen Geschwindigkeit von 500-1500
r.p.M. zentrifugiert, um einen Extrakt zu erhalten.
(c) Der Extrakt wird dann bei hoher Geschwindigkeit von 12 000-16 000 r.p.m. bei 0-100C zentrifugiert,
so daß ein "rohes Sediment" erhalten wird. In dem "rohen Sediment" verbliebene Fragmente von zerhackter
Lunge können durch erneutes Suspendieren des "rohen Sediments" in einer Elektrolytlösung und anschließendes
Zentrifugieren der Suspension bei einer niedrigen Geschwindigkeit von 500-1500 r.p.m. entfernt werden.
(d) Das erhaltene obige "rohe Sediment" wird in Wasser suspendiert, und die Dichte der Suspension wird durch
Lösen von Natriumchlorid in dieser Suspension auf einen Wert von 1,07-1,20 eingestellt. Die eingestellte
Suspension wird bei mittlerer Geschwindigkeit von 4 000-10 000 r.p.m. bei .0-100C für 20-180 Minuten zentri-
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- li -
fugiert, so daß sie in drei Schichten zerlegt wird, von denen die oberste emulgierte Schaumschicht (nachfolgend
kurz "oberste Schicht" genannt) dann abgenommen wird. Die Reinheit (der Gehalt an erwünschtem
oberflächenaktiven Material) der "obersten Schicht" kann durch erneutes Suspendieren der Schicht in einer
9,3- bis 26,0-%igen (Gewicht/Volumen) wässrigen Lösung
von Natriumchlorid und nachfolgendes Zentrifugieren der Suspension bei einer mittleren Geschwindigkeit
von 4 000- 10 000 r.p.m. verbessert werden.
(e) Die obige "oberste Schicht" wird in Wasser suspendiert und die Suspension wird durch eine geeignete
semipermeable Membran bei 4-100C für 12-48
Stunden der Dialyse unterworfen, wodurch die anorganischen Salze, wie z.B. Natriumchlorid, und in der
besagten Schicht zurückgebliebene wasserlösliche organische Verbindungen in äußeres Wasser abgeführt werden.
e
Als semipermable Membran können mit Vorteil Cellophan-,
Als semipermable Membran können mit Vorteil Cellophan-,
Collodion- und Blasenmembranen verwendet werden.
(f) Die an der Innenseite der Membran zurückgebliebene
Suspension, die die bei der obigen Dialyse nichtdialysierten Materialien enthält (nachfolgend kurz
"nicht-dialysierte Suspension genannt), wird bei hoher Geschwindigkeit von 12 000-16 000 r.p.m. bei
0-100C für 5-30 Minuten zentrifugiert, um ein "reines Sediment" zu erhalten, dessen Reinheit weiter verbessert
werden kann, indem das "reine Sediment" erneut in einer Elektrolytlösung suspendiert und auf
einer wässrigen 0,25-0,80 M-Saccharoselösung der
Flotation unterworfen wird, wonach dann die der FIo-
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tation unterworfene Suspension bei einer ultrahohen Geschwindigkeit von 18 000-40 000 r.p.m. bei 0-60C
für 1-24 Stunden zentrifugiert wird. Dieses vorstehend beschriebene Verfahren zur Verbesserung der Reinheit
kann in wirksamer Weise bei den zuvor beschriebenen Verfahrensstufen durchgeführt werden, bei denen die
"oberste Schicht" oder die "nicht-dialysierte Suspension" erhalten wird. Das so gewonnene "reine Sediment"
wird dann unter vermindertem Druck getrocknet oder lyophylisiert.
(g) Ein Teil des getrockneten "reinen Sediments" wird in 100-300 Teilen Aceton suspendiert, und die Suspension
wird nach dem Stehen bei -10 + 10°C für 30-60 Minuten filtriert, so daß ein in Aceton unlösliches
Material erhalten wird, aus dem in dem "reinen Sediment" verbliebene übermäßige Mengen von neutralem
Lipoid und das vollständige Cholesterin selektiv entfernt worden sind. Das in Aceton unlösliche
Material wird unter vermindertem Druck getrocknet, und ein Teil des getrockneten Materials wird in
100-300 Teilen eines Gemisch von organischen Lösungsmitteln suspendiert. Die Suspension wird nach dem
Stehen für 10-20 Minuten filtriert, um ein "gereinigtes Filtrat" zu erhalten, aus dem der größte Teil
des fremden Proteins, das in dem in Aceton unlöslichen Material zurückgeblieben ist, selektiv entfernt
worden ist. Als Gemisch von organischen Lösungsmitteln wird geeigneterweise ein Gemisch von Cloroform-Methanol
(2:1) (Volumenverhältnis; nachfolgend ebenfalls), Chloroform-Äthanol (2:1), Chloroform-
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Isopropanol(l:l) oder Äthyläther-Äthanol (1:3) verwendet. Das obige erhaltene "gereinigte Filtrat"
wurde dem in der Pharmacopeia of Japan, 9. überarbeitete Ausgabe, B Seite 232 vorgeschriebenen
Sterilitätstest unterworfen, um eine Bestätigung der Sterilität zu erhalten, und die nachfolgenden
Verfahrensschritte wurden dann unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
(h) "Gereinigtes Filtrat" wird mit sterilem Wasser vermischt, und nach dem Stehen für 1-24 Stunde(n)
r wird das Gemisch der Filtration unteworfen, und das
Filtrat wird dann unter vermindertem Druck konzentriert, so daß ein fester Rückstand erhalten wird.
Der feste Rückstand hat im allgemeinen die gleiche chemische Zusammensetzung wie die des oben beschriebenen
oberflächenaktiven Materials der Erfindung, und dieser Rückstand kamlyophilisiert werden, um
schließlich das gewünschte Material zu erhalten. In dem Fall jedoch, daß der Phospholipoidgehalt, bezogen
auf den besagten festen Rückstand, unter 75,0% liegt, was gelegentlich vorkommt, wird das gleiche
Lipoid gesondert zugegeben, so daß der Phospholipoidgehalt
75,0-95,5% beträgt. Wenn das Phospholipoid zugesetzt werden soll, wird geeigneterweise
Phosphatidylglycerin, Phosphatidylcholin mit zwei Resten von gesättigter Fettsäure (z.B. Dipalmitoylphosphatidylcholin)
oder ein Gemisch davon verwendet.
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030062/oeeo
Die chemische Zusammensetzung, die physikalischchemischen Eigenschaften und physiologischen Eigenschaften
(einschließlich der Toxizität, der Fähigkeit zur Verringerung der intraalveolaren Oberflächenspannung
und des klinischen Effektes) des nach obiger Beschreibung hergestellten oberflächenaktiven
Mittels der Erfindung werden nachfolgend im einzelnen erläutert:
I. Chemische Zusammensetzung
Das aktive Ma -erial enthält Phospholipoid, neutrales Lipoid, vollständiges Cholesterin, Kohlenhydrat und
Protein, wobei diese Substanzen alle aus dem Lungengewebe des Säugetieres herstammen. In der Tabelle I
werden die Anteile (%) von diesen Komponenten, bezogen auf das gesamte aktive Material, das Verhältnis von
Phospholipoidanteil zu Proteinanteil, die einzelnen Phospholipoidanteile (%), bezogen auf das gesamte
Phospholipoid, und der Anteil (4) von Phosphatidylcholin mit zwei Resten von gesättigter Fettsäure,
bezogen auf das gesamte Phosphatidylcholin, angegeben. Außerdem werden in der Tabelle I das
Verhältnis von Phospholipoidanteil zu Proteinanteil und der Anteil {%) von Phosphatidylcholin mit zwei
Resten von gesättigter Fettsäure, bezogen auf das gesamte Phosphatidylcholin, jeweils nach Berechnung
anhand der in der Literatur angeführten Werten zum Vergleich angegeben.
Dabei wurden die Bestimmungen der einzelnen Komponentenanteile auf folgende Weise durchgeführt:
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ORIGINAL INSPECTED
Der Phospholipoidanteil wurde durch Bestimmen seines
Phosphorgehaltes nach der Methode von King u.a.
und nachfolgendes Multiplizieren des erhaltenen Wertes mit 25 ermittelt. Der Anteil von neutralem
Lipoid wurde nach der kolorimetrischen Methode mit Acetylaceton aber unter Berechnung gemäß dem Glycerintrioleatäquivalent
ermittelt. Der Gehalt an vollständigem Cholesterin wurde nach der Methode von Rosenthal aber unter Berechnung gemäß dem Cholesterinäquivalent
ermittelt, und der Kohlenhydratanteil wurde nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode
aber unter Berechnung gemäß dem Glucoseäquivalent ermittelt, während der Proteinanteil nach der Methode
von Lowry u.a. aber unter Berechnung gemäß dem Rinderserumalbuminäquivalent ermittelt wurde. Der
Wassergehalt wurde nach Karl Fischer'S Methode bestimmt (vgl. Biochemical Journal, 26, 292, 1932;
Clinica Chimica Acta, 22, 393, 1968; Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 50, 318, 1957;
Analytical Chemistry, 28, 350, 1956 und Journal of Biological Chemistry, 193, 265, 1956.
Die einzelnen Phospholipoidanteile wurden in der Weise bestimmt, daß das gesamte Phospholipoid mittels
zwei-dimensionaler Dünnschichtchromatographie mit einer Dünnschicht aus Silikagel 60 (0,25 mm dick,
20 χ 20 cm groß; hergestellt von Merck Co.) unter
Verwendung eines Chloroform-Methanol-Wasser-Gemisches (Volumenverhältnis von 65:25:4) als ertes Laufmittel
und eir.es Chloroform-Methanol-7N wässrige Ammoniaklösung-Gemischs (VoIumenverhältnis 230:90:15)
als zweites Laufmittel und Jod als Farbentwickler
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der Fraktionierung unterworfen wurde und dann die Phospholipoidanteile in entsprechenden Dünnschicht-Fraktionen
unter Anwendung der gleichen Methode zur Bestimmung des Phospholipoidanteils, wie oben beschrieben
ist, bestimmmt wurden. Der Anteil an Phosphatidylcholin mit zwei Resten von gesättigter Fettsäure
wurde in der Weise bestimmt, daß das gesamte Phosphatidylcholin der Fraktionierung nach der Methode
von Shimojo u.a. (vgl. Journal of Lipid Research, 15,
525, 1974) unterworfen wurde und dann der Phosphatidylcholinanteil
in der Dünnschichtfraktion, die das Phosphatidylcholin mit zwei Resten von gesättigter
Fettsäure enthielt, nach der gleichen Methode zur Bestimmung des Phospholipoidanteils, wie sie oben
beschrieben ist, bestimmt wurde.
- 17 Tabelle
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Oberflächenaktives Material der Erfindung
konventionelles pulmonales
oberflächenaktives Mittel
Zusammensetzung des Materials
Phospholipoid
neutrales Lipoid
vollständiges Cholesterin
Kohlenhydrat
Protein
Wasser
75,0-95,5% 1,8-14,0% 0,0-3,0% 0,1-1,5% 0,5-5,0%
1,7-6,0%
Verhältnis von Phospholipoid anteil
zu Ptroteinanteil
zu Ptroteinanteil
15,0 oder größer
2,8-6,0
-s)
Zusammensetzung von Phospholipoid
Phosphatidylcholin
Phosphatidylglycerin
Phosphatidyläthanolamin
Sphingomyelin
Phosphatidylinosit und)
Phosphatidylserin )
Phosphatidylserin )
Lysophosphatidylcholin
andere Verbindungen
andere Verbindungen
63,0-85,5% 3,0-12,0% 2,5-7,7%
5,7-7,0%
5,7-7,0%
2,4-7,4%
0,5-2,1%
nicht mehr als 1,0%
0,5-2,1%
nicht mehr als 1,0%
Anteil von Phosphatidylcholin mit zwei
Resten von gesättigter Fettsäure, bezogen
auf das gesamte Phosphatidylcholin 67,5-90,3%
44,5-59,1%
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Wie aus den in der Tabelle I angegebenen Werten klar ersichtlich ist, hat das oberflächenaktive Material
der Erfindung die Eigenschaften eines niedrigen Proteingehalts und eines hohen Gehalts an Phosphatidylcholin
mit zwei Resten von gesättigter Fettsäure, wobei die Fettsäure dieses Phosphatidylcholins überwiegend
Palmitinsäure ist.
II Physikalisch-chemische Eigenschaften
(a) Fähigkeit zur Verminderung der Oberflächenspannung
Gemäß der Methode von Wilhelmy wurde das aktive Material der Erfindung tropfenweise zu der Oberfläche von physiologischer
Kochsalzlösung in einer Menge von 0,3-0,8 /Ug je cm Oberflächenbereich bei einer Temperatur von
15-25°C gegeben, und es wurde ein Mindestoberflächenspannungsbereich von 2,1-8,8 dyn/cm und ein Maximaloberflächenspannungsbereich
von 48,2-58,0 dyn/cm erhalten (vgl. die Figur 1). Diese Werte zeigen, daß die Oberflächenspannung
von physiologischer Kochsalzlösung bei
Zugabe des Materials der Erfindung etwa nur das 1/34,3-1/1,2-fache
der Oberflächenspannung von physiologischer Kochsalzlösung im Kontrolltest beträgt. Der Stabilitätsindex
(vgl. Archives of Environmental Health, 2, 280, I96I) des Materials war 1,40-1,86, während der
durch die Hysteresiskurve desselben begrenzte Bereich 52 ί 3,2 cm betrug. Die Kompressibilität bei 15 dyn/cm,
die durch die Neigung der Kurve (im Original: "solpe
constant") bei dem Punkt A. in der Figur 1 ausgedrückt wird, war 0,002-0,033.
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lÄ& INSPECTED
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Optische Aktivität
Die spezifische Drehung des Materials der Erfindung betrug nach der Bestimmung mit einem automatischen
Polarimeter, DIP.180 (hergestellt von Nihon Bunko Co.,
Ltd.) -6 : + 1,0 + 8,1 (C p,2 Benzol).
D
(c) Löslichkeit
Jeweils 10 mg von dem Material wurden zu 10 ml eines jeweiligen Lösungsmittels gegeben, und das erhaltene
Gemisch wurde für etwa 10 s gerührt. Die Löslichkeit wurde als positiv (+) bezeichnet wenn das Material
optisch gelöst worden war oder als negativ (-) bezeichnet, wenn es nicht optisch gelöst worden war. Es soll
erwähnt werden, daß wäßrige Suspensionen des Materials neutral oder schwach sauer waren.
Lösungmittel Volumenverhältnis Löslichkeit
Chloroform +
Benzol +
¥asser
Methanol
Äthanol
Aceton
Cyclohexan-Äthanol 1:1 ' +
Äthyläther-Methanol 1:1 +
Petroläther-Äthanol 1:1
Aceton-Methanol 1:1
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INSPECTED
(d) Absorptionsspektren
Die Infrarot- und Ultraviolettabsorptionsspektren des Materials waren, wie sie in den Figuren 2 und 3 angegeben
sind.
III Toxizität
(a) Test auf akute Toxizität
Das Material der Erfindung wurde mänlichen ICR-Mäusen
und männlichen Wistar-Ratten, beide Tierarten 5 Wochen alt, oral bzw. intraperitoneal verabreicht, und es
wurde festgestellt, daß bei Mäusen die orale LDc0 nicht
weniger als 3 g/kg betrug und die intraperitoneale LDcq nicht unter 2 g/kg lag, während bei Ratten die
orale LD50 nicht weniger als 4 g/kg betrug und die
intrapertoneale ΙΑ-λ nicht unter 2,5 g/kg lag.
(b) Test auf subakute Toxizität
Das Material wurde ausgewachsenen Wistar-Ratten in einer täglichen Dosis von 500 mg/kg Körpergewicht
für eine Dauer von einem Monat intraperitoneal verabreicht. Irgendwelche Änderungen im Körpergewicht traten
Jedoch nicht auf, und irgendwelche nicht normalen Befunde bei optischen und histologischen Überprüfungen
der Lungen sowie auch anderer Hauptorgane wurden nicht ermittelt. Darüberhinaus wurden keine systemischen
Abnormitäten, die auf fremde Proteine zurückzuführen wären, beobachtet.
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030062/0660 λ7ΤΓ^**«*$ is*9fmmAL INSPECTED
-Zl-
IV Intra-alveolare Oberflächenspannung verringernder
Effekt.
(a) Test auf Vermögen zur Erhaltung des Alveolarvolumens
Unter Benutzung von 7 Kaninchenfeten, die nach 27-tägiger Gestation entnommen worden waren, wurde das
Vermögen zur Erhaltung des Alveolarvolumens bei nach und nach abnehmenden endotrachealen Drücken getestet.
D.h., der Hals von jedem Fetus wurde aufgeschnitten, um die Trachea freizulegen, mit der ein Wassermanometer
dann direkt verbunden wurde, und beginnend nach 5 Minuten nach Behandlung mit dem Material, wurden das Alveolarvolumen
und der endotracheale Druck kontinuierlich mit dem besagten Manometer gemessen. Die Einstellung
des endotrachealen Drucks wurde unter Verwendung einer unabhängigwirkenden 2-Kanalinjektionsspritzpumpe Nr.
940 (hergestellt von Harward Inc.) erzielt, welche
direkt mit der Trachea verbunden war. Die Behandlung mit dem Material wurde durchgeführt, indem 0,4-0,5 ml
einer 1,0- bis l,5-%igen (Gewicht/Volumen) Suspension
des Materials in physiologischer Kochsalzlösung langsam in die Trachea eingeträufelt wurde. Das Alveolarvolumen
wurde in Form des Wertes je kg Körpergewicht ausgedrückt, und das Alveolarvolumen in der aus 7 Feten
bestehenden Kontrallgruppe wurde in der gleichen Weise, wie vorstehend dargelegt ist, gemessen mit der Ausnahme,
daß nur physiologische Kochsalzlösung anstelle der Suspension des Materials verwendet wurde.
Die Ergebnisse des Tests werden in der Tabelle III angegeben.
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ORIGINAL INSPECTED
|
at
ca |
30 | |
| Γ ■ ■■'' | O | 25 |
| O | a | |
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| IGIN/ | O | 20 |
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| Oy | ||
| ■ό | ||
| m | ||
| O | 10 | |
| H | ||
| ΓΠ | ||
| Ό | ||
| 5 | ||
| 0 | ||
Endotrachealer Druck Alveolarvolumen (ml/kg)
(cm H2O) Mit dem Material behandelte Gruppe Kontrollgruppe
55 - 2 13-2
49 i 3 9*3
47 ί 3 8*3
44 * 3 6*2
39 * 4 4 ± 2
25 * 3 2*2
17 * 4 0
Den in der Tabelle III angegebenen Werten ist klar zu entnehmen, daß bei einem endotrachealen Druck von
30 cm HpO das Alveaolarvolumen der behandelten Gruppe
nicht weniger als 4,2-mal so groß ist wie das der Kontrollgruppe. Auch bei einem extrem niedrigen endotrachealen
Druck von 5 cm H«0 ist das Alveolarvolumen bei der behandelten Gruppe noch groß, und zwar 25 ml/kg,
während das der Kontrollgruppe sehr klein ist.
(b) Test auf Fähigkeit zur· Verringerung des intraalveolaren
Drucks
Unter Benutzung von 5 Kaninchenfeten, die nach 27-tägiger Gestation entnommen worden waren, wurde der endotracheale
Druck, der zur Aufrechterhaltung des Ventilationsvolumens je Respiration bei 10 ml/kg Körpergewicht
unter künstlicher Respiration erforderlich war, mit einem Respirometer MFP-IlOO (hergestellt von Nihon
Koden Co., Ltd.) gemessen. Die Messung wurde 5 Minuten nach dem Einflößen von 0,4 ml einer l,O-96igen (Gewicht/
Volumen) Suspension des Materials in physiologischer Kochsalzlösung in die Trachea durchgeführt. Der endotracheale
Druck bei der aus 5 Feten bestehenden Kontrollgruppe wurde in der gleichen Weise, wie vorstehend
beschrieben ist, gemessen mit der Ausnahme, daß nur physiologische Kochsalzlösung anstelle der Suspension
des Materials verwendet wurde.
Aus dem Ergebnis des obigen Tests war ersichtlich, daß im Durchschnitt ein niedriger Druck von etwa 12 cm HpO
für die behandelte Gruppe ausreichend war, während für die Kontrollgruppe ein hoher Druck von 45 cm HpO erforderlich
war, der etwa dem Vierfachen des ersteren entsprach.
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030062/0660 ORiQINAL INJECTED
V Klinischer Test
5 neugeborene Kinder mit schwerer HMD, deren Gestationsalter 28-32 Wochen betrug, wurden ein- oder
zweimal mit dem Material der Erfindung behandelt, und nach einer Dauer von 6 Monaten wurden das Schicksal der Kinder und ein Vorhandensein oder Fehlen von
Lungenstörungen bei ihnen verfolgt bzw. ermittelt.
Die Behandlung mit dem Material wurde durchgeführt, indem eine l-%ige (Gewicht/VoIumen) Suspension des Materials in physiologischer Kochsalzlösung direkt in die Tracheen eingeträufelt wurde, so daß das eingeträufelte Material je kg Körpergewicht bei jeder Behandlung 100 mg entsprach, und gleichzeitig wurde die weiter oben beschriebene konventionelle kontinuierliche positive Luftwegdruckmethode angewendet. Die Testergebnisse werden in der Tabelle IV angegeben, wobei die dort angegebene "Schwere von HMD"
anhand von radiographischen Befunden des Brustkastens, ausgedrückt in fünf Graden nach den Kriterien von
Matsumura u.a. (vgl. Shonika, 15, 89, 1974, beurteilt wurde, während sich der "Behandlungszeitpunkt"auf
den Zeitpunkt nach der Geburt bezieht.
zweimal mit dem Material der Erfindung behandelt, und nach einer Dauer von 6 Monaten wurden das Schicksal der Kinder und ein Vorhandensein oder Fehlen von
Lungenstörungen bei ihnen verfolgt bzw. ermittelt.
Die Behandlung mit dem Material wurde durchgeführt, indem eine l-%ige (Gewicht/VoIumen) Suspension des Materials in physiologischer Kochsalzlösung direkt in die Tracheen eingeträufelt wurde, so daß das eingeträufelte Material je kg Körpergewicht bei jeder Behandlung 100 mg entsprach, und gleichzeitig wurde die weiter oben beschriebene konventionelle kontinuierliche positive Luftwegdruckmethode angewendet. Die Testergebnisse werden in der Tabelle IV angegeben, wobei die dort angegebene "Schwere von HMD"
anhand von radiographischen Befunden des Brustkastens, ausgedrückt in fünf Graden nach den Kriterien von
Matsumura u.a. (vgl. Shonika, 15, 89, 1974, beurteilt wurde, während sich der "Behandlungszeitpunkt"auf
den Zeitpunkt nach der Geburt bezieht.
Fall
Behandlungszeitpunkt Ergebnisse (Stunden)
Nr. Körperge- Schwere 1. 2. Schicksal Lungenwicht (kg) von HMD störungen
| 1 | 1,4 | V | 13 | 65 | überlebte | keine |
| 2 | 1,1 | III | 7 | 68 | überlebte | keine |
| 3 | 1,1 | V | 4 | - | überlebte | keine |
| 4 | 1,8 | V | 15 | - | überlebte | keine |
| 5 | 1,4 | V | 6 | 14 | überlebte | keine |
030062/OeeO
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Der obigen. Tabelle IV ist zu entnehmen, daß auch die
neugeborenen Kinder mit kurzer Gestationsdauer mit schwerer HMD durch die Behandlung mit dem oberflächenaktiven
Material der Erfindung überlebt haben. Im Gegensatz dazu ist bekannt, daß bei konventionellen Behandlungsmethoden
alle neugeborenen Kinder mit HMD vom Schweregrad V innerhalb von 72 Stunden nach der Geburt
starben.
Die chemische Zusammensetzung, die physikalischchemischen Eigenschaften und die physiologischen Eigenschaften
des oberflächenaktiven Materials der Erfindung, die im einzelnen oben beschrieben worden ist bzw. sind,
zeigen, daß das Material der Erfindung ein neues Material mit geeigneten medizinischen Wirkungen bei HMD
und einem hohen Sicherheitsgrad ist.
Dementsprechend wird ein pharmazeutisches Mittel, das das aktive Material der Erfindung enthält, als geeignetes
Arzneimittel bei HMD angesehen. Das pharmazeutische Mittel der Erfindung wird je Behandlung in
einer solchen Dosis angewendet, daß das Mittel z.B. bei neugeborenen Kindern mit HMD 50-400 mg, vorteilhafterweise
100-200 mg des oberflächenaktiven Materials der Erfindung enthält. Das Mittel wird im allgemeinen
in 5-20 ml, vorteilhafterwexse in 6-10 ml eines geeigneten Lösungsmittelmediums suspendiert, und die Suspension
wird direkt in die Trachea des Patienten innerhalb von 72 Stunden nach seiner Geburt eingeträufelt.
Die Anzahl von Behandlungen entspricht im allgemeinen einer oder zwei, erforderlichenfalls kann jedoch dreimal
oder mehrfach behandelt werden. Die angegebene
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030062/0680 ORIGINAL INSPECTED
3021008
Dosis und die Behandlungsmethode können je nach dem
Zustand des Patienten modifiziert werden, und es können gleichzeitig andere Drogen und/oder Behandlungsmethoden
angewendet werden.
Wenn das pharmazeutische Mittel der Erfindung in Suspensionsform hergestellt wird, können geeignete Zusätze
zur Verbesserung der Dispersion und Erhöhung der Stabilität des aktiven Materials zugegeben werden.
Wenn das pharmazeutische Mittel in flüssiger Form hergestellt wird, können Stabilisatoren, Konservierungsmittel,
Mittel zur Regulierung des osmotischen Drucks, Puffer und Suspendiermittel der Flüsigkeit zugegeben
werden. Gewünschtenfalls können auch Germizide als Zusatz verwendet werden. Wenn das Mittel in Pulverform
hergestellt wird, das bei der Anwendung in Form einer Suspension in einem Lösungsmittel zu benutzen
ist, können außer den oben genannten Zusätzen geeignete Excipientien, Bindemittel und dergl. zugesetzt
werden. Zu geeigneten Suspensionsmedien gehören Wasser und physiologische Kochsalzlösung.
Das pharmazeutische Mittel der Erfindung kann in hermetisch abgeschlossenen Behältern, wie z.B. Glasfläschchen
und Ampullen, abgepackt und steril gehalten werden.
Das Verfahren zur Herstellung des pharmazeutischen Mittels der Erfindung wird nachfolgend anhand von
Beispielen erläutert:
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030062/0660
INSPECTED
100 mg des aktiven Materials der Erfindung und 6 ml physiologische Kochsalzlösung wurden unter sterilen
Bedingungen in ein 10-ml-Glasfläschchen eingetragen,
und das Glasfläschchen wurde mit einem mit Metallschelle verklammerten Gummistopfen verschlossen, so
daß ein pharmazeutisches Mittel in Suspensionsform zur Verfügung stand.
7 500 mg des aktiven Materials wurden zu 520 ml destilliertem Wasser gegeben, und das Gemisch wurde mittels
eines Ultraschallgenerators zur Bildung einer gleichmäßigen Suspension gerührt. Jeweils 10 ml der Suspension
wurden in 50 einzelne 30-ml-Glas-Fläschchen unter
sterilen Bedingungen eingetragen und lyophilisiert, und dann wurden die Glasfläschchen mit einem mit Metallschelle
verklammerten Gummistopfen unter sterilen Bedingungen verschlossen. Jedem Galsfläschchen wurden
9 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung beigegeben, um bei der Anwendung damit eine Suspension
herstellen zu können.
150 mg des aktiven Materials und 50 mg Glucose wurden in eine 10-BQ.-Ampulle nach der üblichen Pulvereinfülltechnik
eingetragen, und die Ampulle wurde unter sterilen Bedingungen verschlossen. Der Ampulle wurden
10 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung beigegeben, um bei der Anwendung damit eine Suspension
herstellen zu können.
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030062/0660
OHiUiNAL INSPECTED
Die Erfindung soll nun durch die folgenden Beispiele erläutert werden; die Angaben in diesen Beispielen
sind jedoch nicht als Begrenzungen aufzufassen, weil im Rahmen der Erfindung viele Änderungen in den Einzelheiten
möglich sind.
32,0 kg Lungen, welche 10 Rindern entnommen worden waren, wurden mit Wasser gewaschen, um anhaftendes unkoaguliertes
oder koaguliertes Blut und dergl. zu entfernen. Diese Lungen wurden in faustgroße Stücke zerteilt, von
unnötigen Blutgefäßen, Luftröhren und Fetteilen unter Benutzung von Messern, Scheren oder dergl. befreit und
erneut mit Wasser gewaschen. Die Stücke wurden mit einer Fleischhackvorrichtung sehr fein zerkleinert und
dann lyophilisiert, um getrocknete zerkleinerte Lunge (4,6 kg) zugewinnen.
520 g von der wie vorstehend gewonnenen getrockneten zerkleinerten Lunge wurden zu 18,0 1 physiologischer
Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei 4° C gerührt. Das Gemisch wurde mit einer
hydraulischen Presse unter einem Druck von etwa 100 kp/ cm filtriert, um einen Extrakt zu erhalten (16,2 1).
Während der Extrakt in einer Zentrifuge mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 6,2 1 je Stunde eingespritzt
wurde, wurde er bei einer hohen Geschwindigkeit von 14 000 r.p.m. bei 5°C kontinuierlich zentrifugiert,
um ein "rohes Sediment" abnehmen zu können, das dann
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030062/0880
jJgjP*· »NSPECTED
ml
in 980/physiologischer Kochsalzlösung mit einem Homogeriisator suspendiert wurde. Die Suspension wurde bei einer niedrigen Geschwindigkeit von 1 000 r.p.m. bei 4°C zentrifugiert, um irgendwelches Sediment aus restlichen Fragmenten von Lungengewebe und dergl. zu entfernen. Zu der oberen Suspensionsschicht (880 ml), die der vorstehenden Zentrifuge entnommen worden war, wurden 230 g Natriumchlorid gegeben, um die Dichte der Suspension auf etwa 1,20 einzustellen, und die eingestellte Suspension wurde bei einer mittleren Geschwindigkeit von 5 000 r.p.m. bei 4 C für 30 Minuten zentrifugiert, so daß eine "oberste Schicht" entnommen werden konnte. Die "oberste Schicht" wurde erneut in 400 ml einer 26-%igen (Gewicht/ Volumen) wässrigen Natriumchloridlösung suspendiert und dann bei einer mittleren Geschwindigkeit von 5 000 r.p.a. bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert, wodurch die Reinheit der "obersten Schicht" verbessert wurde. Die gereinigte "oberste Schicht" wurde in destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspension wurde einer Dialyse mit einer Cellophanmembran unterworfen, um die enthaltenen anorganischen Salze in äußeres destilliertes Wasser abzuziehen. "Nicht-dialysierte Suspension" wurde entnommen und bei einer hohen Geschwindigkeit von 14 000 r.p.m. bei 4°C für 20 Minuten zentrifugiert, so daß ein "reines Sediment" erhalten wurde, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute 5,2 g). Das getrocknete "reine Sediment" wurde in 1,2 1 Aceton bei 6°C suspendiert und nach dem Stehenlassen für 60 Minuten wurde die Suspension durch Filterpapier filtriert und ein in Aceton unlösliches Material gewonnen.
in 980/physiologischer Kochsalzlösung mit einem Homogeriisator suspendiert wurde. Die Suspension wurde bei einer niedrigen Geschwindigkeit von 1 000 r.p.m. bei 4°C zentrifugiert, um irgendwelches Sediment aus restlichen Fragmenten von Lungengewebe und dergl. zu entfernen. Zu der oberen Suspensionsschicht (880 ml), die der vorstehenden Zentrifuge entnommen worden war, wurden 230 g Natriumchlorid gegeben, um die Dichte der Suspension auf etwa 1,20 einzustellen, und die eingestellte Suspension wurde bei einer mittleren Geschwindigkeit von 5 000 r.p.m. bei 4 C für 30 Minuten zentrifugiert, so daß eine "oberste Schicht" entnommen werden konnte. Die "oberste Schicht" wurde erneut in 400 ml einer 26-%igen (Gewicht/ Volumen) wässrigen Natriumchloridlösung suspendiert und dann bei einer mittleren Geschwindigkeit von 5 000 r.p.a. bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert, wodurch die Reinheit der "obersten Schicht" verbessert wurde. Die gereinigte "oberste Schicht" wurde in destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspension wurde einer Dialyse mit einer Cellophanmembran unterworfen, um die enthaltenen anorganischen Salze in äußeres destilliertes Wasser abzuziehen. "Nicht-dialysierte Suspension" wurde entnommen und bei einer hohen Geschwindigkeit von 14 000 r.p.m. bei 4°C für 20 Minuten zentrifugiert, so daß ein "reines Sediment" erhalten wurde, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute 5,2 g). Das getrocknete "reine Sediment" wurde in 1,2 1 Aceton bei 6°C suspendiert und nach dem Stehenlassen für 60 Minuten wurde die Suspension durch Filterpapier filtriert und ein in Aceton unlösliches Material gewonnen.
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030062/0660 ORIGINAL INSPECTED
Das in Aceton unlösliche Material wurde unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet und
dann in 1 1 Chloroform-Methanol-Gemisch (Volumenverhältnis von 2:1) suspendiert. Die erhaltene Suspension
wurde für 10 Minuten stehengelassen und dann durch ein Glasfilter filtriert, um ein "gereinigtes
Filtrat" zu gewinnen. Eine von dem "gereinigten FiI-trat" entnommene Probe wurde dem Sterilitätstest
unterworfen, um die Sterilität derselben festzustellen. (Die nachfolgenden Verfahrensschritte wurden
unter sterilen Bedingungen durchgeführt; dieses gilt auch für alle nachfolgenden Beispiele.)
Das obige "gereinigte Filtrat" wurde durch Vermischen mit 170 ml sterilem Wasser bei 60C gewaschen, und
das erhaltene Gemisch wurde dann über Nacht stehengelassen. Die organische Lösungsmittelschicht wurde
abgenommen und unter vermindertem Druck zu einem festen Rückstand (3,4-g) konzentriert. Eine von dem
festen Rückstand entnommene Probe wurde lyophilisiert und dann analysiert, und es wurde festgestellt, daß
der Phospholipoidgehalt 71,0% betrug. Dementsprechend wurden 1,6 g Dipalmitoylphosphatidylcholin und 0,3 g
Phosphatidylglycerin zu dem Rest des Rückstandes gegeben, und das Gemisch wurde in destilliertem
Wasser suspendiert und dann zu einem weißen Pulver aus dem oberflächenaktiven Material der Erfindung
lyophilisiert (5,2 g). Die chemische Zusammensetzung des vorliegenden aktiven Materials wird in der weiter
unten folgenden Tabelle V angegeben (wie auch für alle nachfolgenden Beispiele).
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030082/0680
800 g von der in dem Beispiel 1 gewonnenen getrockneten zerkleinerten Lunge wurden zu 34,0 1 physiologischer
Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde bei 80C für 1,5 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde,
während es in eine Zentrifuge mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 8,1 1 je Stunde gespritzt wurde, bei
einer niedrigen Geschwindigkeit von 1 000 r.p.m. bei 8°C kontinuierlich zentrifugiert, und es wurde ein
Extrakt (300 1) gewonnen. Dann wurde der Extrakt, während er in ähnlicher Weise in eine Zentrifuge mit
einer Strömungsgeschwindigkeit von 4,7 1 je Stunde gespritzt
wurde, bei einer hohen Geschwindigkeit von 16 000 r.p.m. bei 20C kontinuierlich zentrifugiert,
um ein "rohes Sediment" zu gewinnen, das dann mit 1,2 1 Wasser vermischt und in diesem mit einem Homogenisator
suspendiert wurde. Zu der erhaltenen Suspension wurden 250 g Natriumchlorid gegeben, um deren
Dichte auf etwa 1,15 einzustellen, und die Suspension wurde dann bei einer mittleren Geschwindigkeit von
4 000 r.p.m. bei 60C für 150 Minuten zentrifugiert,
um eine "oberste Schicht" zu gewinnen. Diese "oberste Schicht" wurde in destilliertem Wasser suspendiert,
und die Suspension wurde mit einer Cellophanmembran der Dialyse unterworfen, um vorhandene anorganische
Salze in das äußere Wasser abzuziehen. Die gewonnene "nicht-dialysierte Suspension" wurde auf einer wässrigen
0,70 M-Saccharoselösung der Flotation unterworfen
und dann bei einer ultrahohen Geschwindigkeit von 20 500 r.p.m. bei 4°C für 90 Minuten zentrifugiert.
Die milchige Schicht, die sich an der Grenze zwischen der Schicht aus wässriger Saccharoselösung und der
"obersten Schicht" beim Zentrifugieren gebildet hatte, wurde abgenommen und erneut mit einer Cellophanmembran
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der Dialyse unterworfen, um enthaltene Saccharose in äußeres destilliertes Wasser zu entfernen. Die
gewonnene "nicht-dialysierte Suspension" wurde dann bei hoher Geschwindigkeit von 12 000 r.p.m. bei 2°C
für 15 Minuten zentrifugiert, und es wurde ein "reines Sediment" erhalten, das dann lyophilisiert wurde
(Ausbeute von 7,3 g). Das getrocknete "reine Sediment" wurde in 1,0 1 Aceton bei-10°C gelöst, und die Suspension
wurde nach dem Stehen für 30 Minuten durch ein Glasfilter filtriert, um ein in Aceton unlösliches
Material zu gewinnen. Das in Aceton unlösliche Material wurde unter vermindertem Druck bei
200C getrocknet und dann in 1,5 1 Chloroform-Äthanol-Gemisch
(Volumenverhältnis 2:1) suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde für 10 Minuten stehengelassen
und dann durch ein Glasfilter filtriert, um ein "gereinigtes Filtrat" zu gewinnen. Das "gereinigte FiI-trat"
wurde durch -Vermischen mit 300 ml sterilem destilliertem Wasser gewaschen, und dann wurde das
erhaltene Gemisch bei 40C für 3 Stunden stehengelassen.
Die organische Lösungsmittelschicht wurde abgenommen und unter vermindertem Druck konzentriert
und anschließend lyophilisiert, wodurch ein steriles weißes Pulver aus dem oberflächenaktiven Material
der Erfindung erhalten wurde (4,8 g).
80 g von der in dem Beispiel 1 gewonnenen getrockneten zerkleinerten Lunge wurden zu 2,8 1 physiologischer
Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde bei 00C für 2 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde mit
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0300G2/06B0
ORIGINAL
3021QQ6
Gaze mittels Schwerkraft filtriert, und die Gaze wurde ausgequetscht, um einen Extrakt zu erhalten
(2,3 1). Der Extrakt wurde bei einer Geschwindigkeit von 1 500 r.p.m. bei 8°C für 10 Minuten zentrifugiert,
um irgendwelches Sediment aus restlichen Fragmenten von Lungengewebe und dergl. zu entfernen. Die obere
Suspensionsschicht wurde entnommen und erneut zentrifugiert, aber bei einer Geschwindigkeit von
12 000 r.p.m. und bei 00C für 20 Minuten, um ein
"rohes Sediment" zu gewinnen, das dann in 130 ml physiologischer Kochsalzlösung mit einem Homogenisator
suspendiert wurde. Zu der erhaltenen Suspension wurden 8,1 g Natriumchlorid gegeben, um deren Dichte
auf etwa 1,07 einzustellen, und die eingestellte Suspension wurde bei einer Geschwindigkeit von
10 000 r.p.m. bei O0C für 180 Minuten zentrifugiert,
um eine "oberste Schicht" zu gewinnen. Diese "oberste Schicht" wurde erneut in 130 ml einer l4,0-%igen
(Gewicht/Volumen) wässrigen Natriumchloridlösung suspendiert und dann bei einer Geschwindigkeit von
5 000 r.p.m. bei O0C für 90 Minuten zentrifugiert.
Dieses Aufreinigungsverfahren wurde zweimal wiederholt. Die gerreinigte "oberste Schicht" wurde in
destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspension wurde der Dialyse mit einer Cellophanmembran unterworfen,
um die vorhandenen anorganischen Salze in äußeres destilliertes Wasser abzuziehen. Die
"nicht-dialysierte Suspension" wurde bei einer Geschwindigkeit von 16 000 r.p.m. bei 60C für 5 Minuten
zentrifugiert, um eine "reines Sediment" zu gewinnen, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute von 930 mg).
Das getrocknete "reine Sediment" wurde in 270 ml Aceton bei 0 C suspendiert, und die Suspension wurde nach
dem Stehen für 40 Minuten durch ein Glasfilter fil-
- 34 030082/0660
triert, um ein in Aceton unlösliches Material zu gewinnen. Das in Aceton unlösliche Material wurde
unter vermindertem Druck getrocknet und dann in 210 ml Äthyläther-Athanol-Gemisch (Volumenverhältnis
1:3) suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde für 15 Minuten stehengelassen und dann durch
ein Glasfilter filtriert, um ein "gereinigtes Filtrat" zu gewinnen. Das obige "gereinigte Filtrat"
wurde unter vermindertem Druck zu einem Konzentrat konzentriert. Der Phospholipoidgehalt des Konzentrats
betrug 73,0%. Daher wurden 410 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin
und 120 mg Phosphatidylglycerin dem Konzentrat zugegeben, und das Gemisch wurde in destilliertem Wasser suspendiert und dann
lyophilisiert, wonach ein steriles weißes Pulver aus dem oberflächenaktiven Material der Erfindung
(1,071 mg) erhalten wurde.
30 g von der in dem Beispiel 1 gewonnenen getrockneten zerkleinerten Lunge wurden zu 1,3 1 physiologischer
Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde bei 20C für eine Stunde gerührt. Das Gemisch
wurde mit Gaze filtriert, die dann von Hand ausgequetscht wurde, um einen Extrakt zu gewinnen (1,1 1).
Der Extrakt wurde bei einer Geschwindigkeit von 15 r.p.m. bei 40C für 15 Minuten zentrifugiert, um ein
"rohes Sediment" zu gewinnen, das dann in 60 ml physiologischer Kochsalzlösung mit einem Homogenisator
suspendiert wurde. Die Suspension wurde bei einer Geschwindigkeit von 1 500 r.p.m. bei Raumtemperatur
für 10 Minuten zentrifugiert, um irgend-
030062/0680
ORIGINAL WSPECTEQ
welches Sediment aus restlichen Fragmenten von Lungengewebe und dergl. zu entfernen. Zu der entnommenen
oberen Suspensionsschicht (56 ml) wurden 14 g NAtriumchlorid
gegeben, um die Dichte der Suspension auf etwa 1,20 einzustellen, und die Suspension wurde dann bei
einer Geschwindigkeit von 6 000 r.p.m. bei 40C für
6o Minuten zentrifugiert, um eine "oberste Schicht" zu gewinnen. Die Reinheit der "obersten Schicht" wurde
verbessert durch erneutes Suspendieren der Schicht in 6o m?_ einer 25,0-%igen (Gewicht/Volum en) wässrigen
Natriumchloridlösung und nachfolgendes Zentrifugieren
der erhaltenen Suspension bei einer Geschwindigkeit von 6 000 r.p.m/ 40C für 60 Minuten, um erneut eine
"oberste Schicht" zu gewinnen. Dieses Aufreinigungsverfahren wurde dreimal wiederholt. Die gereinigte
"oberste Schicht" wurde in destilliertem Wasser suspendiert und dann der Dialyse mit einer Cellophanmembran
unterworfen, um die enthaltenen anorganischen Salze in äußeres destilliertes Wasser abzuführen. Die
"nicht-dialysierte Suspension" wurde bei einer Geschwindigkeit von 15000 r.p.m. bei 20C für 15 Minuten
zentrifugiert, um ein "reines Sediment" zu gewinnen, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute von 302 mg).
Das getrocknete "reine Sediment" wurde in 60 ml Aceton bei 20C suspendiert, unddie Suspension wurde nach dem
Stehen für 30 Minuten durch ein Glasfilter filtriert, um ein. in Aceton unlösliches Material zu gewinnen.
Das in Aceton unlösliche Material wurde unter vermindertem Druck getrocknet und dann in 50 ml Chloroform-Methanol-Gemisch
(Volumenverhältnis von 2:1) suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde nach dem
Stehen für 15 Minuten durch ein Glasfilter filtriert, um ein "gereinigtes Filtrat" zu gewinnen, das dann
- 36 030062/0660
s; QRIGiNAL^INSPECTEQ
3021
unter vermindertem Druck zu einem festen Rückstand konzentriert wurde. Der Phospholipoidgehalt des
Rückstandes betrug 71,0%. Daher wurden dem Rückstand
150 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin und 34 mg
Phosphatidylglycerin zugegeben, und das Gemisch wurde in sterilem destilliertem Wasser suspendiert, wonach
die Suspension lyophilisiert wurde, um ein steriles weißes Pulver aus dem oberflächenaktiven Material der
Erfindung zu gewinnen (357 mg).
4,5 kg Lunge, welche einem Pferd entnommen worden war, wurden wie in dem Beispiel 1 behandelt, um getrocknete
zerkleinerte Lunge zu erhalten (750 g). Unter Verwendung von 30 g der getrockneten zerkleinerten Lunge
wurden die in dem Beispiel 4 beschriebenen aufeinanderfolgenden Verfahrensschritte durchgeführt, um einen
festen Rückstand zu erhalten. Der Phospholipoidgehalt des Rückstandes betrug 68.5%. Zu dem Rückstand wurden
280 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin und 28 mg Phosphatidylglycerin gegeben, und das Gemisch wurde mit
Hilfe eines Ultraschallgenerators in destilliertem Wasser suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde
zu einem sterilen weißen PulTer aus dem oberflächenaktiven Material der Erfindung lyophilisiert (448 mg).
1,1 kg Lungen, die zwei Schafen entnommen worden waren,
wurden wie in dem Beispiel 1 behandelt, um die getrocknete zerkleinerte Lunge zu erhalten (147 g). Unter Verwendung
von 30 g der getrockneten zerkleinerten Lunge wurden die gleichen aufeinanderfolgenden Verfahrens-
- 37 030062/0680
schritte durchgeführt, die in dem Beispiel 4 beschrieben
sind, um einen festen Rückstand zu gewinnen. Der Phospholipoidgehalt des Rückstandes betrug
70j6%. Dem Rückstand wurden 149 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin
und 21 mg Phosphatidylflycerin zugegeben, und das Gemisch wurde in destilliertem
Wasser mit einem Ultraschallgenerator suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde lyophilisiert, und
es wurde ein steriles weißes Pulver aus dem aktiven Material der Erfindung erhalten (314 mg).
2,7 kg Lunge, die einem Schwein entnommen worden war, wurden wie in dem Beispiel 1 behandelt, um die
getrocknete zerkleinerte Lunge zu erhalten (385 g). Unter Verwendung von 30 g der getrockneten zerkleinerten
Lunge wurden die gleichen aufeinanderfolgenden Verfahrensschritte durchgeführt, die in dem Beispiel
4 beschrieben sind, um einen festen Rückstand zu gewinnen. Der Phospholipoidgehalt des Rückstandes
betruf 69,4 %. Dem Rückstand wurden 207 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin
und 34 mg Phosphatidylglycerin zugegeben, und das Gemisch wurde in destilliertem
Wasser mit einem Ultraschallgenerator suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde lyophilisiert, und es
wurde ein steriles weißes Pulver aus dem aktiven Material der Erfindung erhalten (365 mg).
330 g Lunge, die einem Hund einer Mischrasse entnommen worden war, wurden wie in dem Beispiel 1 behandelt,
um die getrocknete zerkleinerte Lunge zu erhalten (37 g).
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Unter Verwendung von 30 g der getrockneten zerkleinerten
Lunge wurden die gleichen aufeinanderfolgenden Verfahrensschritte durchgeführt, die in dem
Beispiel 4 beschrieben sind, um einen festen Rückstand zu gewinnen. Der Phospholipoidgehalt des
Rückstandes betrug 63,3 %. Dem Rückstand wurden 174 mg Dipaimitoylphosphatidylcholin und 28 mg Phosphatidylglycerin
zugegeben, und das Gemisch wurde in destilliertem Wasser suspendiert. Die erhaltene Suspension
wurde lyophilisiert, und es wurde ein schwach-gelbes Pulver aus dem aktiven Material der Erfindung erhalten
(370 mg).
3,0 kg Lunge, die einem Rind entnommen worden war, wurden wie in dem Beispiel 1 behandelt, um die zerkleinerte
Lunge zu erhalten (2,6 kg). Die zerkleinerte Lunge wurde zu 15,0 1 physiologischer Kochsalzlösung
gegeben, und das Gemisch wurde bei 100C für eine
Stunde gerührt, wonach eine Druckfiltration mit einer hydraulischen Presse unter einem Druck von annähernd
120 kp/cm durchgeführt wurde, um einen Extrakt zu gewinnen. Der Filtrationsrückstand wurde mit 2,0 1
physiologischer Kochsalzlösung vermischt und zur Gewinnung eines zweiten Extraktes erneut druckfiltriert.
Das Gesamtvolumen der obigen beiden Extrakte betrug 15,3 1. Während der Extrakt in eine Zentrifuge mit
einer Strömungsgeschwindigkeit von 3,5 1 je Stunde eingespritzt wurde, wurde er kontinuierlich bei einer
hohen Geschwindigkeit von 15 000 r.p.m. bei 6°C zentrifugiert, um ein "rohes Sediment" zu gewinnen, das
dann in 1 500 ml physiologischer Kochsalzlösung mit
v*
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einem Homogenisator suspendiert wurde. Die erhaltene Suspension wurde bei einer niedrigen Geschwindigkeit
von 1 500 r.p.m. bei Raumtemperatur für 10 Minuten zentrifugiert, um irgendwelches Sediment aus restlichen
Fragmenten des Lungengewebes zu entfernen. Zu der oberen Suspensionsschicht (l 350 ml), die bei
dem vorstehenden Verfahrensschritt erhalten worden war, wurden 230 g Natriumchlorid gegeben, um die
Dichte auf annähernd 1,13 einzustellen, und die Suspension wurde dann bei einer mittleren Geschwindigkeit
von 4 000 r.p.m. bei 100C für 120 Minuten zentrifugiert,
um eine "oberste Schicht" zu erhalten. Die Reinheit der "obersten Schicht" wurde durch erneutes Suspendieren
der Schicht in 900 ml einer 25,0-%igen (Gewicht/Volumen) wässrigen Natriumchloridlösung und
nachfolgendes Zentrifugieren der erhaltenen Suspension bei einer mittleren Geschwindigkeit von 5 000 bei
8°C für 60 Minuten verbessert. Die gereinigte "oberste Schicht" wurde in destilliertem Wasser suspendiert,
und die Suspension wurde entsalzt, indem sie der Dialyse mit einer Cellophanmembran gegen äußeres
destilliertes Wasser unterworfen wurde. Die "nichtdialysierte Suspension" wurde bei einer hohen Geschwindigkeit
von 13 000 r.p.m. bei 3°C für 15 Minuten • zentrifugiert, um ein "reines Sediment" zu gewinnen,
das in 780 ml Aceton bei O0C suspendiert wurde, und
die Suspension wurde dann nach dem Stehen für 45 Minuten durch ein Glasfilter filtriert, um in Aceton
unlösliches Material zu erhalten. Das in Aceton unlösliche Material wurde unter vermindertem Druck bei
100C getrocknet und dann in 800 ml Chloroform-Isopropanol-Gemisch
(Volumenverhältnis von 1:1) suspendiert.
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030062/0660
ORIGINAL INSPECTED
Die erhaltene Suspension wurde für 10 Minuten stehengelassen und dann durch ein Glasfilter filtriert, um
ein "gereinigtes Filtrat" zu erhalten. Das "gereinigte Filtrat" wurde nach dem Waschen durch Vermischen mit
150 ml sterilem destilliertem Wasser und anschließendes Stehenlassen des Gemischs bei O0C für 12 Stunden
unter vermindertem Druck konzentriert und dann unter Erhalt eines sterilen weißen Pulvers aus dem oberflächenaktiven
Material der Erfindung (2,7 g) lye—
philisiert.
4,4 kg Lunge 3 ^'.i·elche einem Pferd entnommen worden
war, wurden wie in des Beispiel 1 behandelt, um
die zerkleinerte Lunge zu erhalten (399 kg). Die zerkleinerte
Lunge wurde in der- gleichen aufeinanderfolgenden Verfahrensweise wie in dem Beispiel 9 be-'
handelt, um ein steriles weißes Pulver aus dem oberflächenaktiven Material der Erfindung zu gewinnen (3,4g)
120 g von der wie in dem Beispiel 1 hergestellten getrockneten zerkleinerten Lunge wurden zu 4,0 1 physiologischer
Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde bei 5°C für 2 Stunden gerührt. Während das Gemisch
in eine Zentrifuge mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 7,5 1 je Stunde eingespritzt-wurde, wurde es bei
einer niedrigen Geschwindigkeit von 1200 r.p.m. bei 5 C
zentrifugiert, um einen Extrakt zu gewinnen (3,5 1).
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030062/0680
Der Extrakt wurde erneut zentrifugiert, aber bei einer hohen Geschwindigkeit von 14 000 r.p.m. bei 60C für
30 Minuten, um ein "rohes Sediment" zu erhalten, das dann in 150 ml Wasser mit einem Homogenisator suspendiert
wurde. Zu der erhaltenen Suspension wurde Natriumchlorid gegeben, um deren Dichte auf etwa 1,17
einzustellen, und die Suspension wurde dann bei einer mittleren Geschwindigkeit von 6 000 r.p.m. für 60
Minuten zentrifugiert. Die bei dem vorstehenden Zentrifugieren erhaltene "oberste Schicht" wurde abgenommen
und auf einer wässrigen Saccharoselösung mit steigender Konzentration von 0,25-0,80 M der Flotation
unterworfen und dann bei einer ultrahohen Geschwindigkeit von 22 000 r.p.m. bei 40C für 120 Minuten zentrifugiert,
um eine milchige Suspensionsschicht zu erhalten. Die milchige Suspensionsschicht wurde in
destilliertem Wasser suspendiert und dann der Dialyse mit einer Cellophanmembran unterworfen, um vorhandene
Saccharose, Salze, und dergl. in das äußere destillierte Wasser abzuziehen. Die "nicht-dialysierte Suspension"
wurde bei einer hohen Geschwindigkeit von 12 000 r.p.m. bei 2°C für 15 Minuten zentrifugiert,
um ein "reines Sediment" zu gewinnen, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute von 1,1 g). Das getrocknete
"reine Sediment" wurde in 200 ml Aceton bei O0C
suspendiert, und die Suspension wurde nach dem Stehen für 30 Minuten durch ein Glasfilter filtriert, um ein
in 'Aceton unlösliches Material zu erhalten. Das in Aceton unlösliche Material wurde unter vermindertem
Druck bei Raumtemperatur getrocknet und dann in 150 ml Chloroform-Äthanol-Gemisch (Volumenverhältnis
2:1) suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde für 10 Minuten stehengelassen und dann durch ein Glasfilter
mittels Saugwirkung filtriert, wodurch ein
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030062/06B0
ORIGINAL INSPECTED
"gereinigtes Filtrat" erhalten wurde. Dieses "gereinigte Filtrat" wurde durch Vermischen mit 400 ml
sterilem Wasser und nachfolgendes Stehenlassen des Gemischs bei 40C für 6 Stunden gereinigt und dann
unter vermindertem Druck bis zu einem festen Rückstand konzentriert. Der feste Rückstand wurde in sterilem
destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspension wurde zu einem sterilen weißen Pulver aus dem aktiven
Material der Erfindung lyophilisiert (530 mg).
Die gleichen Verfahrensschritte wie in dem Beispiel 11 wurden durchgeführt, und 150 ml der eingestellten Suspension
von "rohem Sediment" mit einer Dichte von annähernd 1,17 wurden hergestellt. Die Suspension wurde
bei einer mittleren Geschwindigkeit von 5 000 r.p.m. für 90 Minuten zentrifugiert, um eine "oberste Schicht"
zu gewinnen. Die "oberste Schicht" wurde in destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspension wurde entsalzt,
indem sie der Dialyse mit einer Cellophanmembran gegenüber äußeren destillierten Wasser unterworfen
wurde. Die "nicht-dialysierte Suspension" wurde bei einer Geschwindigkeit von 14 000 r.p.m. bei 2°C zentrifugiert,
um ein "reines Sediment" zu gewinnen. Das "reine Sediment" wurde erneut in destilliertem Wasser
suspendiert, und die Suspension wurde auf einer 0,55 M wässrigen Saccharoselösung der Flotation unterworfen
und dann bei einer ultrahohen Geschwindigkeit von 28 000 r.p.m. bei 2°C für 90 Minuten zentrifugiert,
um eine milchige Schicht zu gewinnen, die sich an der Grenze zwischen der Schicht aus wässriger Saccharoselösung
und der "obersten Schicht" gebildet hatte. Die milchige Schicht wurde den gleichen aufeinanderfol-
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3Q21006
genden Verfahrensschritten unterworfen, wie sie in dem Beispiel 11 beschrieben sind, um ein steriles
weißes Pulver aus dem aktiven Material der Erfindung zu gewinnen (470 mg).
35 kg Lungen, die 10 Hindern entnommen worden waren,
wurden wie in dem Beispiel 1 behandelt, um die getrocknet,,* zarkleinerte Lunge zu gewinnen (5,1 kg).
5 kg der getrockneten zerkleinerten Lunge wurden zu 200 1 physiologischer Kochsalzlösung gegeben, und das
Gemisch v/ur^.e nach dem Rühren bei 1O0C für 80 Minuten
in fünf ungefähr gleiche Teile geteilt, und jeder dieser Teile wurde unter Anwendung von hydraulischem Druck
unter einem Druck von annähernd 110 kp/cm druckfiltriert, um einen Extrakt zu gewinnen. Das Gesamtvolumen
der Extrakte betrug 186 1. Während der vereinigte Extrakt in eine Zentrifuge mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von 10 1 je Stunde eingespritzt wurde, wurde er bei einer hohen Geschwindigkeit von 15 000 r.p.m. bei 20C
kontinuierlich zentrifugiert, um eine "rohes Sediment" zu gewinnen, das dann in 12,0 1 physiologischer Kochsalzlösung
mit einem Ultraschallgenerator suspendiert wurde. Die erhaltene Suspension wurde bei einer niedrigen
Geschwindigkeit von 1 500 r.p.m. bei 20C kontinuierlich
zentrifugiert. Zu der abgenommenen oberen Suspensionsschicht (10,8 1) wurde Natriumchlorid gegeben,
um deren Dichte auf etwa 1,20 einzustellen. Die Suspension wurde bei einer mittleren Geschwindigkeit von
7 500 r.p.m. bei 40C für 60 Minuten zentrifugiert,
und es wurde eine "oberste Schicht" entnommen, deren Reinheit dann durch erneutes Suspendieren der Schicht
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030082/0660
ORIGINAL INSPECTED
in 5,0 1 einer 26,0-%igen (Gewicht/Volumeη)
wässrigen Natriumchloridlösung und Zentrifugieren der erhaltenen Suspension bei einer mittleren
Geschwindigkeit von 7 500 r.p.m. bei 40C für
Minuten verbessert wurde. Die gereinigte "oberste Schicht" wurde in destilliertem Wasser suspendiert,
und die Suspension wurde der Dialyse mit einer Cellophanmembran gegenüber äußerem destilliertem
Wasser unterworfen. Die "nicht-dialysierte Suspension" wurde bei einer Geschwindigkeit von 12
r.p.m. bei 20C für 30 Minuten zentrifugiert, um
ein "reines Sediment" zu gewinnen, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute von 47,6g). Das getrocknete
"reine Sediment" wurde in 10,0 1 Aceton bei 1O0C suspendiert, und die Suspension wurde
nach dem Stehenlassen für 60 Minuten mittels Saugwirkung durch ein Glasfilter filtriert, um
ein in Aceton unlösliches Material zu gewinnen. Das in Aceton unlösliche Material wurde unter vermindertem
Druck bei Raumtemperatur getrocknet und dann in 8,5 1 Chloroform-Methanol-Gemisch (Volumenverhältnis
von 2:1) suspendiert. Die Suspension wurde für 10 Minuten stehengelassen und dann
mittels Saugwirkung durch ein Glasfilter filtriert, um ein "gereinigtes Filtrat" zu gewinnen. Dieses
"gereinigte Filtrat" wurde durch Vermischen mit 1,5 1 destilliertem Wasser und Stehenlassen des
erhaltenen Gemischs bei 5°C für 24 Stunden gewaschen. Danach wurde das "gereinigte Filtrat"
unter vermindertem Druck zu einem festen Rückstand (38,4 g) konzentriert. 30 g des festen Rückstandes
wurden in sterilem destilliertem Wasser mit einem
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030062/0660 ORIGINAL INSPECTED
3021Q06
Ultraschallgenerator erneut suspendiert und dann zu einem sterilem weißen Pulver aus dem aktiven Material
der Erfindung lyophilisiert (28,7.g).
450 g von der wie in dem Beispiel 1 hergestellten getrockneten zerkleinerten Lunge wurden zu l6,o 1 physiologischer
Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde für 2 Stunden gerührt. Während das Gemisch in eine
Zentrifuge mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5,0 1 je Stunde eingespritzt wurde, wurde es bei einer
niedrigen Geschwindigkeit von 1 200 r.p.m. zentrifugiert, um einen Extrakt (13,5 1) zu erhalten. Während der
Extrakt in eine Zentrifuge gleichfalls mit einer
Strömungsgeschwindigkeit von 5,0 1 je Stunde eingespritzt wurde, wurde er bei einer hohen Geschwindigkeit
von 15 000 r.p.m. zentrifugiert, um ein "rohes Sediment" zu gewinnen, das dann in 700 ml Wasser
mit einem Ultraschallgenerator suspendiert wurde. Zu der erhaltenen Suspension wurde Natriumchlorid gegeben,
um deren Dichte auf etwa 1,20 einzustellen, und die Suspension wurde dann bei einer mittleren Geschwindigkeit
von 7 000 r.p.m. bei 20C für 50 Minuten zentrifugiert, um eine "oberste Schicht" zu gewinnen,
deren Reinheit durch erneutes Suspendieren der Schicht in 0,7 1 einer 26,0-%igen (Gewicht/Volumen) wässrigen
Natriumchloridlösung und nachfolgendes Zentrifugieren der erhaltenen Suspension bei einer Geschwindigkeit von
7 000 r.p.m. bei 2°C für 50 Minuten verbessert wurde.
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030062/0660 ORfQlNAL INSPECTED-
Das Aufreinigungsverfahren wurde viermal wiederholt.
Die gereinigte "oberste Schicht" wurde in destilliertem Wasser suspendiert und dann der Dialyse mit einer
Cellophanmembran gegen äußeres destilliertes Wasser unterworfen. Die "nicht-dialysierte Suspension" wurde
bei einer Geschwindigkeit von 15 000 r.p.m. bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert, um ein "reines Sediment"
zu gewinnen, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute von 4,3 g). Das getrocknete "reine Sediment" wurde
in 1,3 1 Aceton bei O0C suspendiert, und die Suspension
wurde nach dem Stehenlassen für 30 Minuten durch ein Glasfilter filtriert, um ein in Aceton unlösliches
Material zu gewinnen. Das in Aceton unlösliche Material wurde unter vermindertem Druck bei 100C
getrocknet und dann in 1,1 1 Chloroform-Äthanol-Gemisch (Volumenverhältnis von 2:1) suspendiert. Die erhaltene
Suspension wurde für 15 Minuten stehengelassen und dann durch ein Glasfilter filtriert, um ein "gereinigtes
Filtrat" zu gewinnen. Dieses "gereinigte Filtrat" wurde unter vermindertem Druck zu einem festen Rückstand
konzentriert (2,7 g). Weil der Phospho_-lipoidgehalt des Rückstandes 74,0% betrug, wurden 75 mg Phosphatidylglycerin
zu 1 000 mg des festen Rückstandes gegeben, und das erhaltene Gemisch wurde in sterilem destilliertem
Wasser suspendiert, wonach die Suspension zu einem weißen Pulver aus dem aktiven Material der Erfindung
lyophilisiert wurde (949 mg).
100 g der wie in dem Beispiel 1 hergestellten getrockneten zerkleinerten Lunge wurde zu 4,0 1 physiologischer
Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde bei 60C für eine Stunde gerührt. Das Gemisch wurde bei
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INSPECTED
einer niedrigen Geschwindigkeit von 1 000 r.p.m. bei A-0C zentrifugiert, um einen Extrakt zu gewinnen
(3,6 1). Dann wurde der Extrakt bei einer hohen Geschwindigkeit von 15 000 r.p.m. bei 2°C für 15
Minuten zentrifugiert, um ein "rohes Sediment" zu erhalten, das dann mit 120 ml Wasser in einem Homogenisator
suspendiert wurde. Zu der erhaltenen Suspension wurde Natriumchlorid gegeben, um deren
Dichte auf etwa 1,15 einzustellen, und die Suspension wurde dann bei einer mittleren Geschwindigkeit
von 8 000 r.p.m. für 80 Minuten zentrifugiert, um eine"oberste Schicht" zu gewinnen. Die Reinheit
der "obersten Schicht" wurde durch erneutes Suspendieren der Schicht in 110 ml einer 20,0-%igen
(Gewicht/Volumen) wässrigen Natriumchloridlösung
und nachfolgendes Zentrifugieren der Suspension bei einer Geschwindigkeit von 6 000 r.p.m. bei 0°C
für 80 Minuten verbessert. Die gereinigte "oberste Schicht" wurde in destilliertem Wasser suspendiert,
und die Suspension wurde mit einer Cellophanmembran gegen äußeres destilliertes Wasser der Dialyse unterworfen.
Die "nicht-dialysierte Suspension" wurde bei einer Geschwindigkeit von 14 000 r.p.m. bei 30C
für 15 Minuten zentrifugiert, um ein "reines Sediment" zu erhalten, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute
von 1,1 g). Das getrocknete "reine Sediment" wurde in 300 ml Aceton bei O0C suspendiert, und die Suspension
wurde nach dem Stehenlassen für 30 Minuten durch ein Glasfilter filtriert, um ein in Aceton unlösliches
Material zu erhalten.DAs in Aceton unlösliche Material wurde unter vermindertem Druck bei
Raumtemperatur getrocknet und dann in 200 ml Äthyläther-Äthanol-Gemisch (Volumenverhältnis von 1:3)
- 48 -
030062/0660
— _
— _
suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde für 20 Minuten stehengelassen und dann durch ein Glasfilter
filtriert, um eine "gereinigtes Filtrat" zu gewinnen. Dieses "gereinigte Filtrat" wurde unter
vermindertem Druck zu einem festen Rückstand konzentriert. Weil der Phospholipoidgehalt des Rückstandes
68,3% betrug, wurden 820 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin zu 1 000 mg des festen Rückstandes
gegeben, und das Gemisch wurde in sterilem destilliertem Wasser suspendiert und dann zu einem
weißen Pulver aus dem aktiven Material der Erfindung lyophilisiert (l 730 mg).
- 49 - Tabelle V-
030062/0660 ORIGINAL INSPECTED
10 11
12
13 14 15
o ο
| Zusammensetzung des | 87,5 | 86,4 | 85,9 | 90,2 | 86,5 | 89,6 | 83,2 | 95,5 | 94,0 | 94,5 | 94,7 | 75,0 | 76,1 | 83,3 |
| Materials (%) | 5,2 | 7,1 | 7,8 | 3,0 | 4,2 | 3,6 | 10,9 | 1,8 | 1,1 | 2,0 | 1,6 | 14,0 | 10,8 | 7,9 |
| Phospholipoid 81,6 | 0,9 | 1,2 | 1,0 | 0,5 | 0,6 | 2,1 | 1,5 | 0,0 | 0,3 | 0,3 | 0,2 | 3,0 | 2,5 | 1,1 |
| neutrales Liuoid 10,6 | 0,2 | 1,1 | 0,9 | 0,9 | 0,7 | 0,2 | 0,4 | 0,2 | 0,5 | 0,1 | 0,1 | 0,7 | 1,5 | 0,8 |
| vollständiges Cholesterin 2,3 | 1,2 | 2,0 | 1,4 | 1,7 | 2,5 | 0,7 | 1,3 | 0,5 | 0,9 | 1,6 | 1,2 | 5,0 | 3,1 | 1,8 |
| Kohlenhydrat 1,2 | 5,1 | 2,1 | 3,5 | 4,0 | 5,2 | 3,8 | 2,8 | 2,9 | 3,8 | 1,7 | 2,0 | 3,3 | 6,0 | 4,6 |
| Protein 2,3 | ||||||||||||||
| Wasser 2,3 | 72,9 | 43,2 | 59,5 | 53,1 | 34,6 | 13,0 | 64,0 | 191,0 | 104,4 | 59,1 | 78,9 | 15,0 | ?4,5 | 46,3 |
| Verhältnis von Phospho- | ||||||||||||||
| linoidgehalt zu ,ς c Proteingehalt oz>'D |
||||||||||||||
| Phospholipoidzu- | 81,3 | 72,6 | 72,8 | 73,6 | 73,1 | 71,5 | 71,9 | 78,3 | 69,5 | 70,6 | 75.2 | 63,0 | 74,2 | 85,5 |
| sammensetzung (%) | 4,5 | 10,3 | 12,0 | 8,6 | 9,0 | 11,3 | 10,2 | 3,0 | 8,6 | 6,4 | 7,9 | 11,9 | 11,7 | 3,5 |
| Phosphattidylcholin 74,6 | 4,8 | 4,3 | 4,2 | 6,2 | 5,1 | 5,3 | 7,3 | 7,5 | 6,2 | 7,6 | 5,6 | 7,7 | 5,1 | 2,5 |
| Phosphattidylglycerin 10,6 | 5,7 | 5,9 | 5,7 | 6,0 | 6,5 | 5,7 | 6,0 | 6,5 | 6,0 | 7,0 | 6,3 | 7,0 | 6,3 | 5,9 |
| Phosphattidyläthanolamin 3,8 | ||||||||||||||
| Sphingomyelin 5,7 | 3,8 | 4,2 | 4,4 | 4,8 | 6,0 | 4,3 | 4,2 | 3,9 | 7,4 | 6,1 | 4,1 | 7,3 | 3,5 | 2,4 |
| PhosOhattidylinosit und | 0,5 | 2,1 | 0,6 | 1,3 | 0,8 | 0,6 | 0,5 | 1,2 | 2,1 | 0,8 | 2,1 | 0,5 | ||
| Phosphatidylserin 3,8 | 0,2 | 0,2 | 0,1 | 0,1 | 0,5 | 0,3 | 0,1 | 0^4 | 1,0 | 0,7 | 0,8 | 1,0 | 0,0 | |
| Lysophosphatidylcholin 0,8 | ||||||||||||||
| andere Verbindungen 0,3 | ||||||||||||||
| Gehalt von Phosphatidyl- | ||||||||||||||
| cholin mit zwei Resten | 88,6 | 89,2 | 86,2 | 83,3 | 82,1 | 84,3 | 88,6 | 79,£ | 78,8 | 83,1 | 80,6 | 67,5 | 86,2 | 90,3 |
| von gesättigter Fettsäu | ||||||||||||||
| re, bezogen auf das ge- q, c samte Phosphatidyl- o:>'D |
||||||||||||||
| cholin (<&) | ||||||||||||||
Gi P"!
Claims (15)
1. Oberflächenaktives Material mit einem Gehalt an Phospholipoid, neutralem Lipoid, vollständigem
Cholesterin, Kohlenhydrat und Protein, welche alle in dem Lungengewebe eines Säugetieres vorhanden
sind, dadurch gekennzeichnet, daß der Phospholipoidgehalt 75,0-95,5%, der Gehalt an
neutralem Lipoid 1,8-14,0%, der Gehalt an vollständigem Cholesterin 0,0-3,0%, der Kohlenhydratgehalt
0,1-1,5% und der Protsdngehalt 0,5-5,0% beträgt,
Jeweils bezogen auf das Trockengewicht des besagten Materials.
030062/0660
TELEX:
1-856 44
inven d
TELEGRAMM:
INVENTION
BERLIN
TEI BE; 030. 030/862 23
^G.
3686716000
POSTSCHECKKONTO: W. MEISSNER, BLN-W 122 82-109
ORtOI^It-INSPECTED
3021008
2. Oberflächenaktives Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Phospholipoidgehalt
durch Multiplizieren des Phosphorgehaltes mit 25 bestimmt ist und die einzelnen Gehalte an
neutralem Lipoid, vollständigem Cholesterin, Kohlenhydrat und Protein unter Berechnung gemäß
dem Glycerintrioleatäquivalent, Cholesterinäquivalent, Clucoseäquivalent und Rinderserumalbuminäquivalent
ausgedrückt sind.
3. Oberflächenaktives Material nach Anspruch 2,
dadurch gekernzeichnet, daß das Phospholipoid hauptsächlich aus Phosphatidylcholin und Phosphatidylglycerin
besteht und die Anteile davon 63,0-85,5% bzw. 3,0-12,0% entsprechen, jeweils bezogen auf das gesamte Phospholipoid.
4. Oberflächenaktives Material nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt an Phosphatidylcholin
mit zwei Resten von gesättigter Fettsäure, bezogen auf das gesamte Phosphatidylcholin,
67,5-90,3% entspricht.
5. Oberflächenaktives Material nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die gesättigte
Fettsäure vorherrschend Palmitinsäure ist.
6. Oberflächenaktives Material nach Anspruch. 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das
Säugetier aus der aus Rindern, Pferden, Schafen und Schweinen bestehenden Gruppe gewählt worden
ist.
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INSPECTED
7. Verfahren zur Herstellung des oberflächenaktiven Materials nach einem der vorstehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zerkleinerte Lungen von Säugetieren mit einer Elektrolytlösung
in Berührung bringt, ein rohes oberflächenaktives Material aus dem erhaltenen Extrakt gewinnt und eine erforderliche Menge
Phospholipoid zusetzt, so daß der Phospholipoidgehalt, bezogen auf das Material, 75,0-95,5%
ausmacht.
8. ' Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß man zerkleinerte Lungen verwendet, die lyophilisiert und dann haltbar gemacht worden
sind.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die zerkleinerten Lungen
mit Hilfe einer Fleischliackmaschine zubereitet.
10. Verfahren nach Anspruch 7, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrolytlösung physiologische
Kochsalzlösung ist.
11. Verfahren nach Anspruch 7, 8, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das als Zusatz zu verwendende
Phospholipoid aus der Gruppe wählt, die aus Phosphatidylglycerin, Phosphatidylcholin
mit zwei Resten von gesättigter Fettsäure und einem Gemisch davon besteht.
030062/0660
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die gesättigte Fettsäure vorherrschend
Palmitinsäure ist.
13. Zur Behandlung von HMD (Hyalin-Membran-Erkrankung) geeignetes pharmazeutisches Mittel,
dadurch gekennzeichnet, daß es ein oberflächenaktives Material enthält, welches Phospholipoid,
neutrales Lipoid, vollständiges Cholesterin, Kohlenhydrat und Protein enthält, die in dem Lungengewebe
eines Säugetieres vorhanden sind, und die einzelnen Anteile an Phospholipoid, neutralem Lipoid, vollständigem
Cholesterin, Kohlenhydrat und Protein in diesem Material 75,0-95,5%, 1,8-14,0%, 0,0-3,0%,
0,1-1,5% und 0,5-5,0%, jeweils bezogen auf das Trockengewicht des besagten Materials, entsprechen.
14. Pharmazeutsiches Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es für eine Anwendung
vorgesehen ist, bei der man es direkt in den Luftweg einflößt.
15. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es in Suspensionsform
vorliegt.
030062/0660
&if inspected
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6821179A JPS55160721A (en) | 1979-06-02 | 1979-06-02 | Pulmonary surfactant ta-546, its preparation, and remedy for pulmonary hyaline membrane syndrome comprising it as active constituent |
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ID=13367224
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| DE3021006A Expired DE3021006C2 (de) | 1979-06-02 | 1980-05-30 | Oberflächenaktives Material und dieses Material enthaltendes pharmazeutisches Mittel gegen Hyalin-Membran-Erkrankung |
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| JP (1) | JPS55160721A (de) |
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