JPH01501282A - 肺胞疎水性界面活性物質関連タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 肺胞疎　面活性物−閃」し本ｚ！寝こπ背−−景 本出願は肺胞疎水性界面活性物質関連タンパク質（“５ＡＰｓ”）ならびにそれ の分離および使用に関するものであり、とりわけ５ＡＰ（Ｖａｌ）の分離方法と 使用方法とに関するものである。

乳幼児によく見られる透明膜疾患（“ＨＭＤ”）は拡散アテレクテシス（ａｔｅ ｌｅｃｔｅｓｉｓ）、低酸素、および結果として生じる呼吸不全に関連づけられ る。より詳細に言えば、ＨＭＤは肺胞の気道の表面張力を減らすに必要な活力に 満ちた肺胞物質の不足に関係がある。その結果として、ＨＭＤをわずらう患者の 肺胞もしくは抹消呼吸気のうは常時虚脱状態にある。かつＨＭＤ患者の気体・液 体インタフェースにおける表面張力は高められるので、患者の肺胞もしくは抹消 呼吸気のうをふくらませることは非常な困難を伴う、したがって、ＨＭＤはとり わけ乳幼児の場合には著しい疾病率と死亡率を伴う。

）ＩＭＤに対する現在の治療法としては正圧力または機械的換気による、または それらの併用による高濃度酸素を使った十分な酸素添加が行われる。この種の治 療法は酸素や圧力に関係する危険性、および気管内チューブを経て気道に機械的 に接近する必要から生じる傷害のために厄介である。

ＨＭＤおよびその他肺胞の界面活性物質不足に関係づけられる症候群の別途の治 療法として肺胞界面活性物質の交換がある。

肺胞界面活性物質の不足に関係づけられるその他の症候群には外傷、化膿症、煙 の吸入、心筋梗塞などに原因する成人の呼吸苦痛症候群（“ＡＲＤＳ″）が含ま れる。肺胞界面活性物質の不足に関係づけられるものとして、さらにまた肺の慢 性傷害、肺炎、または肺胞のタイプ■細胞の破損に原因するその他の異常がある 。

肺胞界面活性物質の不足に関係する症候群の治療法にはエアゾル化かたは液体の 合成リン脂質混合物、天然の肺胞界面活性物質、および動物の肺からつくられた 各種の界面活性物質標品が使用できる。天然物質をもとにした標品は、表面張力 低酸能力において合成脂質標品よりも一般的に良好である。この種の標品には修 飾した牛の界面活性物質の使用も提冨されている。

しかしながら、人や動物の肺胞の標品にはパンチごとの変異性、感染のおそれ、 免疫リスクなどの問題が伴う。

）１！’ＩＤ患者を治療するときは、治療の結果としての逆免疫の可能性を防止 するため必要な活性物質のみを使用することがたいせつである。残念ながら、利 用できる天然の肺胞界面活性物質や標品は天然のままのかたちであるため、特定 しにくくかつ大きな免疫リスクを伴なう。

天然の肺胞活性物質は、主としてリン脂質と界面活性物質関連タンパク質または アポリポタンパク質とから成る複合物質である。リン脂質、主としてホスファチ ジルコリン（ＰＣ）　、ディスアチニレーテッドホスファチジルコリン（ＤＳＰ Ｃ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）は天然肺胞界面活性物質が肺胞 内の表面張力を截らすという正常な機能を果たすために特に重要なものである。

ＤＳＰＣが主な要素であるリン脂質はタイプ■上皮細胞の小胞体内で合成され、 ラメラポデー内へ詰込れ、その後エキソサイトチッププロセスによって肺胞スペ ース内へ分泌される。リン脂質のいくつかは異化されも再合成もされずにそっく りそのままの分子として再利用されると信じられ、またそれらが天然肺胞界面活 性物質の主要な構成要素になっていると信じ界面活性に関係づけられるタンパク 質またはアポリポタンパク質に関しては、それらの本質および効用についてかな りの見解の相違が存在する。それでもなおかつ、肺の界面活性リン脂質に加えて 、少な（ともある種のアポリタンバク質は天然界面活性物質の全生物学的活動に より肺胞内の表面張力を減らすためにきわめて重要であることへの同意が増えつ つある。

界面活性に関連するタンパク質またはアポリポタンパク質は血清特効タンパク質 と肺特効タンパク質との両者を含んでいる。

Ｋｉｎｇらによって肺胞面活性物質内に確認されたＭｒ・３０−４０．０００ダ ルトンの肺特効界面活性関連タンパク質、バーム」■牡旦、。

２４４、７８８−７９５（１９７３）、はグリシン含有量が多く、かつヒドロキ シプリンに冨むコラーゲンのような分野をも含んだ糖タンパク質である。このタ ンパク質、５ＡＰ−３５と呼ぶ、は気道内で検出される大オリゴマーを形成する ためにグリコジル化、プロリン残基のヒドロキシル化、およびスルフヒドリル依 存架橋に耐えるＭｒ−２０−３０，０００ダルトンの翻訳生成物から合成される 。　５ＡＰ−３５のタンパク質分解フラグメントは、肺胞プロテイノシス患者の 器官洗浄吐出物から分離され、また分子量の小さいタンパク質のように移動する その他の哺乳類界面活性物質から分離されるタンパク質標品中に見出される。

（Ｗｈｉ　ｔｓｅｔｔ他、Ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｒｅｓ、、１９．５０１−５０８ 　（１９８５））　−塘タンパク質５ＡＰ−３５はリン脂質を結合して管状ミニ リンの構造組織を界面活性脂質へ授与するが、 ５ＡＰ−３５は界面活性物質の生物物理的活性にとって必要でないかも知れない 、　Ｋｉｎｇ他−Ｊ、　Ａ　１．　Ｐｈ　５ｉｏ１．、４２．４８３−４９０１ ９７７）を参照。

より分子量の小さい肺特効界面活性関連タンパク質も各種の哺乳類界面活性物質 から同定される。肺胞界面活性物質内には１０．０００−１２，０００ダルトン のタンパク質が存在するかもしれない。

（Ｋｉｎｇ他、Ａ＋＋＋、　Ｊ、　Ｐｈ　５ｉｏ１．２２３　７１５−７２６　 （１９７２）　）　、現在、このタンパク質は主要本店タンパク質５ＡＰ−３５ のフラグメントであろうと信じられている。小分子量の界面活性関連タンパク質 は各種の動物の肺胞洗浄吐出物中に存在し、その分子量は犬やウサギで約１０， ０００ダルトン、ネズミでｔｏ、５００−１４，０００ダルトン、豚で１１．５ ００−１６，５００ダルトン、乳牛で１０，０００ダルトンであろう。

これら各種の小分子量界面活性物質関連タンパク質とより分子量の大きいタンパ ク、質、すなわち５ＡＰ−３５やそのフラグメント、との本性ならびに相互の関 係は未だ確認されていない、鈴木他、止、１ｂ状も一カじよ、益、　５３−６１ 　（１９８２）、は豚の肺胞洗浄吐出物中の小分子量タンパク質（１５，０００ ダルトン）は脂質への親和力が５ＡＰ−３５より大きいと示唆しているが、鈴木 他はこのタンパク質を５ＡＰ−３５またはそのフラグメントから同定しておらず 、かつ精製状態での界面活性特性の証明も行っていない、それどこらか、鈴木他 はこの１５，０００ダルトンのタンパク質はおそらく肺胞リン脂質のクリアラン スのための生理的な調節を行うものであろうと示唆するにすぎない、ある小分子 量タンパク質は、エーテル／エタノール処理、クロロホルム／メタノール抽出、 およびケイ酸カラムからのクロロホルム／メタノール溶出を含んだ分離方法を使 って分離すべきことと、培養タイプ■上皮細胞によってリポソームの溶解を早め ることが報告されている。

〔フライプール他、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　７４．６７７−６８ ４　（１９８４））ソング他、Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、、　４４．１０２４　（摘 要）（１９８５）　、はウサギの肺の界面活性物質に含まれた２種類の別々な小 分子量タンパク質、１つはエタノールに溶解、他の１つはエーテル／エタノール に溶解する、について述べている。しかし、これらのタンパク質は精製も特性づ けもされておらず、かつ界面活性のような活性も確認されていない、ソング他は これらの小分子量タンバク質は界面活性物質の再生利用に関係があるかも知れな いと指摘する。上述した小分子量タンパク質類は分子量がより大きい５ＡＰ−３ ５のタンパク質フラグメントとして生じるのかも知れない。しかしながら、天然 の哺乳類肺胞界面活性物質へ生物物理的活性を加える能動要素となるのは５ＡＰ −３５なのか、１種以との小分子タンパク質なのか、それとも全てのタンパク質 の協力によるものであるかは明らかでない。

田中他、Ｃｈｅｌｌｌ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、、　３１．４１００−４１ ０９　（１９８３）は細かく切り刻んだ牛の肺のフラクションをクロロホルム抽 出して分離した１０，０００分子量のタンパク質につい゛ζ記述している。

胚原他、肛匹植Ｌ」扱吐■工旺り舌幌−エ超５　５２７−５３２（１９８６）、 は生物物理的テストにもとづいて分離したｓ、ｏｏｏダルトン分子量のプロテオ リビドはリン脂質と混ぜたとき界面活性をもつかも知れないと報告している。し かしながら、胚原他はこのタンパク！十分な特性づけを行っていない、報告され たアミノ酸成分−生の界面活性物質抽出物から分離されたｎｒ・５．０００の疎 水性、小分子量タンパク質の−は本発明による界面活性物質関連タンパク質５Ａ Ｐ（Ｖａｌ）−そのアミノ酸配列は／’％イナンバーのバリン残基によって同定 される−と類似してはいるが、報告されたアミノ酸組成内のバリン残基の不足に よって５ＡＰ（Ｖａｎ）と区別される。〔田中他、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　 ２３６．８５−８５（１９８６）、　）先に“界面活性物質アポリポタンパク質 Ｂ”と命名されたタンパク質〔キング他、Ａｍ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　 ２２４．７８８−７９５（１９７３）　）と一致する組成を有する小分子量タン パク質は５ＡＰ−３５のＣ−末端領域として同定される（Ｒｏｓｓ他、Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、＋２６１、１４２８３−１４２９１　（１９８６）　）　 、　リン脂質と３５，０００ダルトンの界面活性関連タンパク１ｓＡＰ−３５ま たはそのフラグメントとの混合物は、界面活性プロテオリピドＭｒ・６，０００ −１４．０００に較べると表面活性特性が比較的劣ることが報告されている（ｋ ｈｉｔｓｅｔｔ他、Ｐｅｄｅａｔｒ、　Ｒｅｓ、、　２０．４６０−４６７　（ １９８６）；およびＲｏｓｓ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

趣、、　２６１．１４２８３−１４２９１　（１９８６））。

Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ他、ＰＣＴ出願番号ＷＯ３６１０３４０８には人の３５，０ ００ダルトンタンパク質および人間以外の１０．０００ダルトンタンパク質につ いて記述されている。　Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ他は界面活性リン脂質へ十分な生物 物理的活性を授けるためには両者のクラスのタンパク質が必要となるかもしれな いと述べている。また、３５，０００ダルトンのタンパク質をエンコードする完 全なりＮＡ配列、１０，０００ダルトンの人間以外のタンパク質月の＼Ｈ２末端 アミノ酸配列、および１０，０００ダルトンタンパク質用の人のｃＤ〜八ク八日 −ロン！備（８１ｂｐ）部分配列を明らかにしている。犬の１０，０００ダルト ン配列と人の８１ｂｐ配列とは、本発明にしたがう人のＳＡＰ　（Ｐｈｅ）の配 列とかなりの領域で一致する。

Ｔａｅｕｓｅｈ、　ＰＣＴ出願番号−０８７１０２０３７には約３５ｋｄの分子 量をもつ２種類のタンパク質と約５．５−９Ｍの分子量をもつ２種類のタンパク 質とが特性づけられている。約６ｋｄの２種のタンパク質は、アミノ酸の組成に おいてたがいにかなり相違しており、また田中、Ｃｈｅｗ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂ ｕｌｌ、、　３１１．４１００　（１９８３）に記載されたタンパク質ともかな りに異なっている。なおまた、人のＳＡＰ　（Ｐｈｅ）用のｃＤＮＡおよび推測 されるアミノ酸配列のための寒冷ブタノール不溶性６ｋｄタンパク質のＮ末端タ ンパク配列が明らかにされている。

肺胞界面活性タンパク質に対抗するモノクローナル抗体がＬｅｗｉｃｋｉ　、米 国特許番号４，５６２，００３で明らかにされている。

有機溶剤に溶ける疎水性小分子量タンパク質類が各種の哺乳界面性物質中に検知 できる［Ｐｈ１ｚａｃｈｅｒｌｙ他、Ｂｉｏｃｈｅ＋＊、　Ｊ、。

１８３、７３１−７３６　（１９７９）；　田中他、Ｃｈｅｗ、　Ｐｈａｒｍ、 　Ｂｕｌｌ、、　３１＋４１００−４１０９　（１９８３）：鉛末、ム」江可」 至、、−η工６２−６９　（１９８２）；Ｃ１ａｙｐｏｏｌ他、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ 、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　７４．６７７−６８４　（１９８４）；　Ｙｕ他、…匹 匡Ｌユニ２３６．８５−８９　（１９８６）；高橋他、影Ｊ旦Ｉニュ１暉迂工日 工Ｒｅｓ、Ｃｏ＋ＩＩｍｕｍ、、　１３５　５２７−５３２　（１９８６）；　 Ｗｈｉｔｓｅｔｔ他、Ｐｅｄｉａｔｒ。

Ｒｅｓ、、　２０．４６０−４６７　（１９８６）；　およびＷｈｉｔｓｅｔｔ 他、Ｐｅｄｉａｔｒ　Ｒｅｓ。

２０、７４４−７４９　（１９８６））　、　Ｍｒ　６．０００−１４．０００ のタンパク質として同定できる ５ＡＰｓは透明膜疾患の治療のため臨床用に使用される界面活性物質標品のエー テル／エタノール抽出物中に同定される。

（Ｗｈｉｔｓｅｔｔ他、Ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｒｅｓ、、　２０．４６０−４６７ 　（１９８６）　：　Ｗｈｉｔ−ｓｅｔｔ他、Ｐｅｄｉａｔｒ　Ｒｅｓ、、　２ ０．７４４−７４９　（１９８６）；藤原他、ｋ匹旦。

１、５５−５９　（１９８０）；Ｅｍｈｏｒｎｉｎｇ他、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ＋　７６＋　１４５−１５３（１９８５）　；およびＫｗｏｒ＋４他、Ｐｅｄｉ ａｔｒｉｃｓ、　７６、５８５−５９２　（１９８５））　＊これらのタンパク ｔａの１つであるＭｒ＝４０，０００前駆体からえられルＭｒ・７．５００ペプ チド、ヘエニルアラニンのアミン末端を有する人の界面活性物質プロテオリピド （以下“ＳＡＰ　（Ｐｈｅ）　”″と呼ぶ、を記号化するｃＤＮＡｓがＧｌａｓ ｓｅｒ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　５ｃｉ（ＬＩＳＡ）　８４． ４００７−４０１１（１９８７）およびＪａｃｏｂｓ他、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅａ＋、。

筐ム９８０８−９８１１　（１９８７）によって明らかにされている。　５ＡＰ （Ｐｈｅ）に対するある相同タンパク質、５Ｐ−１８を記号化するｃＤＮＡは犬 の肺から分離されることが報告されている（Ｈａｗｇｏｏｄ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＬｉＳＡ）、　８４．１６６−１７０　（ １９８７））　、合成リン脂質を有する小分子量界面活性物質タンパク質の再構 成は混合物へほとんど完全な界面活性物質のような特性−迅速な界面吸収と動的 圧縮中の表面張力の低減とを含む−を添加する（Ｙｕ他、Ｂｉｏｃｈｅｓ、　Ｊ 、、　２３６．８５−８９　（１９８６）　および高橋他、肛匹肚し１扱吐■工 販り工姐−ｍ、、　１３屓５２７−５３２　（１９８６）　）　。

２遭トυｉ！ 本発明の５ＡＰ（Ｖａｌ）およびＳＡＰ　（Ｐｈｅ）は分離された、十分に純粋 な、単分子！４．ｏｏＯ−７，０００ダルトンの疎水性界面活性物質関連タンパ ク質であり、動物のＭｉ織から分離されたとき各々の分子量が４，０００−７． ０００ダルトンである少くとも２種類の疎水性タンパク質から成り、またより分 子量の大きいそれのマルチマーを含むこともある疎水性界面活性物質関連タンパ ク質である。

５ＡＰ（Ｖａｌ）は刊行物内テＦｓＡＰ−６（Ｖａｌ）’、　”５ＰＬ（ＰＶＡ Ｌ）’　、および“５ｐ−ｃ”として引用される場合もある。同様に、５ＡＰ（ Ｐｈｅ）は刊行物内で”５ＡＰ−６（Ｐｈｅど、“５ＰＬ−（Ｐｈｅ）”　、お よび’５Ｐ−Ｂ”として引用される。

下文での５ＡＰ（Ｖａｌ）および５ＡＰ（Ｐｈｅ）に関する検討は分離；組換え 品種；マルチマー；化学的または酵素による合成品種；欠落、置換または付加類 似体；およびヒトロバシー・プロフィルにもとず（、または二次および三次構造 にもとずく類似体に適用することを意図するものである。

５ＡＰ（Ｖａｌ）およびＳＡＰ　（Ｐｈｅ）は、脂質と組合わされるとかなりの 肺の生物物理的界面活性活動をなし、ｌＦＤその他の天然の肺胞界面活性物質の 不足に関係した症候群の治療と予防に効果的に利用できる。現在ではＳＡＰ　（ Ｖａｌ）とＳＡＰ　（Ｐｈｅ）は肺に特効があると信じられているが、それらの 肺の生物物理的な界面活性活動は種特異的なものではないと信じられる。

したがって、５ＡＰ（Ｖａｌ）と５ＡＰ（Ｐｈｅ）は動物の組織、とりわけ犬、 乳牛、人、豚、ウサギ、ネズミなどの各種の動物から抽出した肺胞組織や羊水か ら精製するか、あるいはＤＮＡの組換え法や直接的なペプチド合成により作られ る。肺の組織や洗浄吐出物中の５ＡＰ（Ｖａｔ）とＳＡＰ　（Ｐｈｅ）の濃度は 羊水中のものより大きいであろう、動物のその他の組織や液体の場合には、ＳＡ Ｐ　（Ｖａｌ）やＳＡＰ（Ｐｈｅ）の存在はかなり少ないか、検知しがたいほど の低濃度であるか、もしくは全く存在しないものと思われる。

５ＡＰ（Ｖａｌ）やＳＡＰ　（Ｐｈｅ）を脂質と組合わせると、それらは脂質の 界面活性特性を増強させ、化合物にかなりの肺胞生物物理的界面活性活動をあた える。この着目すべき特性の結果として、この種の化合物は天然の肺胞界面活性 物質の交換や補足に非常に有効であり、また肺の内部の表面張力を低減したり正 常値を維持させる−特に生来の肺胞界面活性物質の不足によるＨ門りその他の症 候群に苦しむ愚者の肺の内部張力を−ために非常に有効である。　５ＡＰ（Ｖａ ｌ）や５ＡＰ（Ｐｈｅ）は動物の組織を高度に精製したもの、またはＤＮＡ　＆ ｌｌ換え技術もしくはペプチドの直接合成で作られるものであるため、これまで ＨＭＤや関連する症候群の治療や予防に使われてきた純度の低い製法に伴う免疫 リスクが大幅に減らせる。

用語“疎水性界面活性物質関連タンパク質”と”５ＡＰ（Ｖａｌ）または５ＡＰ （Ｐｈｅ）”とは以下の記述中で互換的に使われている。これらの用語が以下の 文中で使われる場合は、それらは界面活性物質のような活性を有し、ドデシル硫 酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル中で測定した羊分子量が４．０００ −７．０００ダルトンであり、かつプロテアーゼ酵素、エンドグリコシダーゼＦ 。

コラゲナーゼに対する耐性の大きい小分量の疎水性界面活性関連タンパク質を含 む意味に理解されるべきである。これらの用語はまたＤＮＡ０組換え法またはペ プチドの直接合成で作られ、疎水性界面活性関連タンパク質のアミノ酸配列から 成るか、またはタンパク質のまたはタンパク質の欠落、置換、付加類似体を暗号 化するＤＮＡ配列またはその一部の翻訳から成る、界面活性物質のような活性を 有するタンパク質またはポリペプチドを含む意味に理解さるべきである。

用語“ハイプリント形成”が以下の文中に使われる場合は、例６．７．１１．１ ２．１５．１６に明らかにされた条件に合致するかまたは大略等しい範囲内にあ る条件を包含する意味に理解さるべ本発明はさらにまた動物のＵ織から５ＡＰ（ Ｖａｌ）を分離する方法−動物の）ＪＩｍを粒子のフラクションと液体のフラク ションとに分離し、液体フラクションからかなり純粋な状態の５ＡＰ（Ｖａｌ） を抽出することを含む−に属する。この方法は従来ＨＭＤおよび関連の症候群の 治療や予防のため利用されてきた純度の低い調整品に伴うリスクをかなり改善す る。

本発明の方法はさらにまた分子量のより大きい、新しい疎水性マルチマーから、 例えばゲル電気泳動などの適切な技術を用いて５ＡＰ（Ｖａｌ）を分離する方法 に関する。

５ＡＰ（Ｖａｌ）と５ＡＰ（Ｐｈｅ）を記号化する遺伝子を分離する方法、およ びＤＮＡ組換え法やペプチド直接合成法により５ＡＰ（Ｖａｌ）を作る方法も記 述する。

この発明にしたがって、５ＡＰ（Ｖａｌ）や５ＡＰ（Ｐｈｅ）はＤＮＡ０組換え 法でも作れる。例を以下に示す。コピーが大腸菌内のラムダベクトルへ実質的に クローン化された相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を合成するための鋳型としては人 の肺のポリ（Ａ）”　Ｒ１；Ａを使用した。

５ＡＰ（Ｖａｌ）やＳＡＰ　（Ｐｈｅ）を記号化する遺伝子のｃＤへＡコピーが 同定され、ＤＮＡ配列の分析によって特徴づけられた。これらのＤＮＡ配列がさ らにまた５ＡＰ（Ｖａｌ）と５ＡＰ（Ｐｈｅ）両者のアミノ酸配列と比較するこ とによる５ＡＰ（Ｖａｌ）や５ＡＰ（Ｐｈｅ）の一層の特徴づけを可能にした。

加えて、ＳＡＰ　（Ｐｈｅ）を記号化するｃＤＮＡは大腸菌β−ガラクトサイダ ス（１ａｃＺ）遺伝子を有する融合生成物として発現され、その結果として発現 された遺伝子生成物が５ＡＰ（Ｐｈｅ）に特異なポリクロナール抗血清に反応す ることにより抗原性を示した。

ポリペプチドは、表２と表３に示す〜Ｈ８−末端アミノ酸配列および図５と図６ に示すＤＮＡ配列の翻訳を含んだ配列にもとず（化学合成または酵素合成により 作ることができる。これらの化学合成ポリペプドは５ＡＰ（Ｖａｌ）または５Ａ Ｐ（Ｐｈｅ）のアミノ酸配列のレプリカ、５ＡＰ（Ｖａｔ）や５ＡＰ（Ｐｈｅ） を記号化するＤＮＡ配列もしくは配列の一部の翻訳のレプリカ、あるいはそれら レプリカの欠落、付加、置ＨＡＭ似体を含む０合成ポリペプチド脂質と組合わさ れて界面活性物質標品にできる。これらの合成ポリペプチドはその分子量が動物 の組織から分離された５ＡＰ（Ｖａｔ）や５ＡＰ（Ｐｈｅ）分子量よりも小さい が、以下に使用する用語“５ＡＰ（Ｖａｌ）と”５ＡＰ（Ｐｈｅ）”はこれらの 合成ペプチドを包含するものであることを理解さるべきである０本発明によって ＳＡＰ　（Ｐｈｅ）または５ＡＰ（Ｖａｌ）の暗号化領域の全部にわたらない特 殊な合成ペプチド、７５％未満のより特殊な合成ペプチド、および５０％未満の きわめて特殊な合金ペプチドが供給される。

本発明には、生来の肺胞界面活性物質の不足に関連したＨＭＤその他の症候群に 苦しむ人や動物を治療するための新しい薬物、標品、および使用法をも含む、　 ５ＡＰ（Ｖａｌ）や５ＡＰ（Ｐｈｅ）を対象とする抗体や血清が本発明にしたが って生成できる。

」皿至旦庫食見旦 図１は牛の肺から分離した５ＡＰ（Ｖａｌ）の５ＩＩＳ−ＰＡＧＥｔｔ、品の図 解である。

図２は人、犬、牛の肺から生成した５ＡＰ−６の５Ｏ５−ＰＡＧＥｉ品の図解で ある。

図３は５ＡＰ（Ｐｈｅ）を暗号化する部分ｃＤＮＡクーロンのヌクレオチド配列 および推測されるアミノ酸翻訳である。

図４は本発明による５ＡＰ（Ｖａｌ）ｃＤＮＡクーロンの構造の概略である。

図５は完全５ＡＰ（Ｖａｌ）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推測されるアミ ノ酸翻訳である。

図６は完全ＳＡＰ　（Ｐｈｅ）　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推測される アミノ酸翻訳である。

図７はＩａｃＺ／５ＡＰ−６−Ｐｈｅ融合生成品の構成の流れ図である。

図８Ａは５ＡＰ（Ｐｈｅ）遺伝子の組織の図解であり、ＩＥＩ８ＢはＳＡＰ　（ Ｐｈｅ）を暗号化するゲノムクーロンのヌクレオチド配列である。

図９は制限マツプであり、２つの５ＡＰ（Ｎａｌ）遺伝子の組織を示す。

図１０はＳＡＰ　（Ｖａ　Ｉ）を暗号化するゲノムクーロンのヌクレオチド配列 である。

図１１は５ＡＰ（Ｖａｌ）のノーザンブロソトの図解である。

図１２はＳＡＰ　（Ｖａ　ｌ）のハイブリッド阻害翻訳法の結果を示す。

図１３はＣＫＳ　ｓよびＣＫＳ／５ＡＰ（Ｖａｌ）融合タンパク質の５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥの図解である。

図１４は初期精製後のＣＫＳ／５ＡＰ（Ｖａｌ）融合タンパク質の５Ｏ３−ＰＡ ＧＥの図解である。

図１５は、肺の成熟を予報するだめの人の羊水標本の５ＡＰ（Ｐｈｅ）に対する ポリクローナル抗体を使用する競合エライザ（ＥＬＩＳＡ）検定法からえられた 懐胎年令期間と対比した５ＡＰ（Ｐｈｅ）４度のグラフである。

図１６は５ＡＰ（Ｖａｌ）前駆タンパク質のアミノ酸配列のヒトロバシーのグラ フである。

詳亙星脱所 以下の詳細な説明は動物の組織から、とりわけ肺の！Ｊｌｌ織や羊水から分離さ れた５ＡＰ（Ｖａｌ）またはＤＮＡ組換え法もしくはペプチドの直接合成法で作 られた５ＡＰ（Ｖａｌ）、ならびに５ＡＰ（Ｖａｔ）のもとづく新しい薬物、新 しい抗体や抗血清ならびにそれらの調整方法や使用法を明示する。

各々の分子量が約４，０００−７，０００ダルトンである少くとも２種類の小分 子量疎水性界面活性物質関連タンパク質（以下”５ＡＰ（Ｖａｌ）または５ＡＰ （Ｐｈｅ）モノマーと呼ぶ）が動物の組織から分離される。　５ＡＰ（Ｖａｌ） やＳＡＰ　（Ｐｈｅ）は大分子量の疎水性タンパク質マルチマーとしても生成す る。この大分子量マルチマーは５ＡＰ（Ｖａｌ）および／またはＳＡＰ　（Ｐｈ ｅ）モノマーの共有結合または非共有結合の凝縮体であり、５ＯＳ−ＰＡＧＥを 使ったサイズ評価にもとづいて約１４．０００ドルトン、約２０，０００ドルト ン、および約２６，０００ドルトンである（以下、”５ＡＰ（Ｖａｌ）及び／ま たは５ＡＰ（Ｐｈｅ）マルチマー”と呼ぶ。）その他のマルチマーあるいは密接 な関係のある　ペプチドも存在するかも知れないが、より小さいか検知できない ４度にすぎないであろう。以下で“単分子量”という用語は、マルチマー用反復 ビルデイングブロノクとして役立つスルフヒドリル還元後の最小のポリペプチド 鎖となるべきと考えられる分子量を示す。

分子量を決定し、より大きいマルチマーから七ツマ−を分離するために、例えば ５ＤＳ−ＰへＧＥ内の５ＡＰ（Ｖａｌ）およびＳＡＰ　（Ｐｈｅ）モノマーなら びに５ＡＰ（Ｖａｌ）および５ＡＰ（Ｐｈｅ）マルチマーを分離しかつ分子量を 決定するためには約３−２７％のポリアクリルアミド、とりわけ約１５％のポリ アクリルアミドを有し、かつ約２％のＳＤＳを含むゲルが使える６図１に、ここ に述べるように精製・脱脂し、β−メルカプトエタノールの欠乏状態で１０−２ ０％のＳＤＳ　−ＰＡＧＥへ加えた５ＡＰ（Ｖａｌ）を図解する０図１で、レー ンＢはＭｒ＝６．０００．１４，０００．２０，０００および２６．０００で移 入された銀染色法で検知された約２マイクログラムの５ＡＰ（Ｖａｌ）を表わす 。比較のために、トリプシンインヒビター（６，２００）　、リゾチーム（１４ ，０００）、β−ラクタルブーミン（１８，４００）、α−キモトリプシン（２ ５，７００）、オボアルブミン（４３，０００）などの低分子量のタンパク質マ ーカー類が使用できる。これらはメリーランド州ＢｅｔｈｅｓｄａＯＢＲＬ社か ら入手できる。β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）のよ うなスルフヒドリル還元剤の欠乏状態で５ＡＰ（Ｖａｎ）のゲル分離が実施され たとき、あるいは還元・アルキ化後には、５ＡＰ（Ｖａｌ）または５ＡＰ（Ｐｈ ｅ）モノマーより大きい５ＡＰ（Ｖａｌ）または５ＡＰ（Ｐｈｅ）マルチマーの 増加が観察される。目下のところ、スルフヒドリル結合、非スルフヒドリル凝集 、および／または５ＡＰ（Ｖａｌ）もしくは５ＡＰ（Ｐｈｅ）のフラクシヨンの インターペプチド結合がより大きい疎水性マルチマーを生成すると説明される。

還元剤の欠乏状態においては、全ての標本ＳＡＰ　（Ｐｈｅ）はＭｒ　−１８， ０００以上で移入し、免疫反応物質の大部分は、５ＡＰ（Ｖａｌ）であると思わ れ、５ＡＰ（Ｖａｌ）のいくつかの集合体はより高いＭｒで移入するが、５ＡＰ （Ｖａ　１　）は主としてＭｒ＝５，０００−６，０００で移入する０分子量は 相対移入にもとすく推定にすぎず、より正確な分子量決定のために別途の適切な 技術を使用してもよいことが理解さるべきである。

以下で使用する用語“疎水性”とは、疎水性の電荷を有しないアミノ酸に冨んだ 溶媒−３：ｌのエーテル／エタノール、クロロホルム、３：１その他さまざまな 比率のクロロホルム／メタノールなどの溶媒内での溶解度を指す。用語“界面活 性物質関連タンパク質”は、等浸透液内での遠心中に哺乳類の界面活性物質のリ ン脂質成分との結合または協同精製に関連づけられるタンパク質を指す。

５ＡＰ（Ｖａｎ）やＳＡＰ　（Ｐｈｅ）はさらにプロテアーゼ酵素類（トリプシ ン、キモトリプシン、およびスタフＶ−８）　、エンドグリコシダーゼＦ、およ びコラゲナーゼに対してなかりの耐性を有すると特徴づけられる。　５ＡＰ（Ｖ ａｌ）や５ＡＰ（Ｐｈａ）は分解されず、そのサイズ異種はこれらの酵素によっ てそれほど変更されず、したがって５ＡＰ−３５およびそのフラグメントとは種 類が異なっていることが明らかにされた。

５ＡＰ（Ｖａｌ）やＳＡＰ　（Ｐｈａ）をより特徴づけるために、それらを各種 の哺乳動物の肺組織内とりわけ肺胞タイプ■細胞と肺界面活性物質中に、同様に 人の懐胎末期に近い羊水中に局所化した。

５ＡＰ（Ｖａｌ）は、例えば動物の組織や羊水、細胞、培養細胞などから、また ＣＬＳＥや界面活性物質−ＴＡのような利用可能な肺胞界面活性物質交換標品、 またはその他のものから精製できる。したがって、以下に使用する用語“動物の 組織°は全ての適切な５ＡＰ（Ｖａｌ）源−動物の組織や羊水、細胞、培養細胞 、ならびに肺胞界面活性物質交換標品（ＣＬＯ３ＥやＴＡなど）を含みかつそれ のみ゛に限定されない−広い意味を持つ、しかしながら、動物の＆ｌＩ織から５ ＡＰ（Ｖａｌ）を分離するときは動物の肺組織または羊水から分離することがよ り望ましく、とりわけ人の肺組織または培養細胞からの分離が最も望ましい。

５ＡＰ（Ｖａｌ）を含む溶液は、ＳＡＰ　（Ｖａ　Ｉ）が生成する動物の組織の 抽出によってえられる０例えば、哺乳類の肺を切除したときは望ましい気管をカ ニュール（ｃａｎｎｕｌａｔｅ）　Ｌ、０．９χＮａｃｌ　（ｐＨ７，０−７， ４）のような緩和溶液の水で冷やした通りで繰返し洗って肺胞から界面活性物質 を取り出す。洗い出した液に低速の遠心力、例えばｌ　、　０００　Ｘ　ｇで１ ０分間を加え、必要ならば繰返して汚染血液、ホワ°イトセル、マクロファージ を除去する。全ての手順はなるべく約２−４°Ｃで行うべきである。こうしてえ た界面活性物質に高速の遠心力、約１０，０００Ｘｇで約３０分間以上を、加え て粒子状物質を沈でんさせる。生成したベレットをなるぺ（なら、上記のような 緩和？８液の中で、遠心分離および音波処理または凍結解凍を必要に応じた回数 繰返すことによって再度懸濁、洗浄を行い、均一に懸濁された物質をえる。

生成物である白色の界面活性物質を遠心分離でペレット化し、水分を除き、約２ ：１エーテル／エタノール、３：ｌのクロロホルム／メタノール、またその他の 適当な有機溶媒の約１０−１０００ボリユームを使って約−３０°Ｃで抽出して ＳＡＰ　（−”ａｌ）を含んだ上澄みを生成する。抽出はひと晩かかって行なう 、生成物質を約１０、０００　Ｘ　ｇで約２０分間以上遠心分離する０分離され た液体フラクシヨンには脂質を含みまた本発明の５ＡＰ（Ｖａｌ）を含む。その 後は、例えば有機溶媒、クロロホルムその他の適当な有機溶媒、中に漂うｈ２気 流を使って液体フラクシヨンを乾燥（濃縮）し、室温でクロロホルム、その他の 適当な有機溶媒を使って予め平衡化した約５０ｃｍ　Ｘ　２．５ｃｍのケイ酸カ ラムまたはＬＨ−２０カラムへ当てることができる。その後カラムを、例えば５ ０対２００ｍ　ｌのクロロホルムとメタノールのようアルコールとの混合液を使 って、アルコールの濃度を０χから約１００χへ段階的にまたは徐々に増やしな がら溶出させる。　５ＡＰ（Ｖａｌ）は約４０′＆から約１００χの濃度、とり わけ約４０χから約８０χまでの濃度のアルコールを含んだ溶媒中に溶出される 。ＳＡＰ　（Ｖａｌ）中に存在する脂質の大部分はタンパク質から分離される。

クロロホルム／メタノール、または酸性にした（０．　ＩＮ）Ｉｃ　１　）クロ ロホルム／メタノール中の透析を行えばリン脂質がさらに除去され、タンパク質 は一層精製される。

技術の熟練者ならば本発明の５ＡＰ（Ｖａｌ）のケイ酸カラムからの溶出はその 他の適当な溶媒を使っても可能となることをＤＺさるべきである。

裏施■土 ２　の／−ｉｔ ５ＡＰ（Ｖａｌ）を屠殺した成人や乳牛から得た肺臓の洗浄吐出物から分離する 。　５ＡＰ（Ｖａｌ）はまた人の剖検後の遺体や承諾をえた成人の肺臓洗浄吐出 物からえた人の界面活性物質からも分離できる。動物の場合、気管をカニュール し、肺を氷で冷やした０、９χＮａｃ　ｉ！　、　５０５Ｍ　ＮａＪＰＯａ、お よび５ｍＭ　ＥＤＴＡ、、ｐＨ７，２の適量で３回洗浄吐出する。細胞と破片を ８０Ｘｇ、約１０分間の遠心分離（２回）で除去し、上澄みをさらに４°Ｃで約 ３０分間４０．ＯＯＯＸｇの遠ｒ＋４［にかける、ペレット状になった物質を上 記の絞衡−４，（ＩＩＩ　Ｍフェニルメチ−ルーフッ化スルフォニルを添加して もよい）で再度Ｑｉし、ブランマン・ソニファイアを使って１０秒間音波処理す る。４℃で約３０分間４０．０００　Ｘ　ｇの遠心分離を繰返して界面物質をベ レット状にする。

実施Ｉ Ｓ　から　した疎　５ＡＰ（〜！ａｌ）の簿−１界面活性物質ベレットを、約３ ０゛Ｃに保った約３：１のエーテル／エタノールまたはクロロホルム／メタノー ル中で約１６時間かけて抽出する。５ＡＰ（Ｖａｌ）を含んだエーテル／エタノ ールまたは、クロロホルム／メタノール抽出液をＮ２ガスを使って蒸発し、クロ ロホルムを使って再度溶解する。クロロホルムに溶は込んだ残分をＢＩＯ５ＩＬ −）ＩＡカラム（カリフォルニア州、リッチモンドのバイオランド社（Ｂｉｏ− Ｒａｄ）から入手できる２、　５ｃｍ　Ｘ　４０ｃｍのケイ素カラム）へ当て、 クロロホルム中で平衡化する。脂質・タンパク質フラクションは、クロロホルム とメタノールの混合液（各２００ｍ　ｌ　）を使い、クロロホルム中のメタノー ルの濃度を段階的（１０χ間隔）に増やすことによって回収される。クロロホル ムとメタノールの比率が３：２から１＝４になる間に、言い換えればクロロホル ム中のメタノール濃度が約４０χから約８０χに増大する間に５ＡＰ（Ｖａｌ） が溶出する。

本発明の５ＡＰ（Ｖａｌ）を含むフラクションは例えばフルオレサミン検定法及 び染色（銀染色法またはクーマシーブリリアントブルー染色法）を伴うゲル電気 水泳動移入によって評イ６できる。

この時点で分離された５ＡＰ（Ｖａｌ）は十分に純粋かつ均一であると見なされ る。以下で°十分に純粋”と言うときは、５ＡＰ（Ｖａｌ）タンパク質が本質的 に不純＃ｙＪ（細胞、細胞の破片、ＤＮＡ　、　Ｉ’ｌＮＡ、主要な界面活性本 店タンパク質またはその破片）のないことを意味する。この°十分に純粋”な５ ＡＰ（Ｖａｌ）内にはいくらかの脂質は残存することを認識すべきである。質重 において、３．０００分子サイズのカットオフを有するセルロース透析バッグ内 の２％クロロホルム／メタノールまたは酸性のクロロホルム／メタノールで透析 することはＳＡＰ　（Ｖａｌ）の一層の脱脂にを効である。最も好ましいすがた では、十分に純粋な５ＡＰ（Ｖａｎ）は約１０Ｘ以下の不純物しか含まない。

希望する場合は、分離された十分に純粋な５ＡＰ（Ｖａｌ）　（本質的にＳＡＰ 　（Ｖａ　ｌ）モノマーとより大きいマルチマーで構成される）をより一層脱脂 するために、溶出した５ＡＰ（Ｖａｌ）を含んだフラクションをできればプール し、蒸発乾燥し、室温で、セルロース透析バッグを使って再度透析する（例えば 、約１００−５００容量の約２：１クロロホルム／メタノールまたはその他の適 切な混合液内でまたはＨｃｌその他の酸で酸性にしたクロロホルム／メタノール 混合液内で）、この方法を５ＡＰ（Ｖａｌ）の汚染脂質がほとんど無くなるまで 行うべきである。この十分に純粋なＳＡＰ　（Ｖａ　Ｉ）を、フルオレサミン検 定法およびゲル電気泳動移入によって再評価する。上記の脱脂目的を達成するた めに別の通切な脱脂手順も使用できることを了解すべきである。大略のアミノ酸 組成も決定でき、クーマシーブリリアントブルー、銀染色、その他の標準染色技 術を使ってページ（ＰＡＧＥ）後にタンパク質を固定できる。

５ＡＰ（Ｖａｌ）を適当な源から分離し、脱脂するために他の適切な溶媒や手段 を使用してもよいことを確認さるべきである。　５ＡＰ（Ｖａｌ）　と５ＡＰ（ Ｐｈｅ）タンパク質についての論議は−ｈｉｔｓｅｔｔ他、Ｐｅｄｉａｔｒ、　 Ｒｅｓ、、　２０．４６０−４６７（１９８６）およびＷｈｉｔｓｅｔｔ他、Ｐ ｅｄｉａｔｒ。

Ｒｅｓ、、　２０．７４４−７４９（１９８６）に見られ、関係する条項を以下 に引用する。

災血医主 ５ＡＰ（Ｖａｌ）とＳＡＰ　（Ｐｈｅ）の１−づけ５ＡＰ（Ｖａｌ）と５ＡＰ（ Ｖａｌ）のアミノ酸組成の決定のために、精製された標本を２つの異なる方法で 加水分解する。第１の方法では、０．３χフエノールと０．１χβ−メルカプト エタノールを含む５．７ＮＨｃｌを１１０℃に常時沸騰させ、真空下で約２４時 間および４８時間かけて標本を加水分解する。第２の方法では、０．３χフエノ ールを含んだ１２ＮＨｃ　ｊ！　／　）リフルオロ酢ｆｉ（２：１）の中で、１ ５０°Ｃ１真空下、２時間、６時間、２４時間、４８時間かけて同じ標本を加水 分解する。これらの標本のシスティン組成を、過ギ酸酸化後のシスティン酸とし て別途に定量する。つぎに酸化した標本を０．３％フェノールを含む１２ＮＨｃ 　１　／　）リフルオロ酢酸（２：１）の中で１５０°Ｃで３時間かけて加水分 解する。　５ＩＣＡ　７０００Ａインテグレー夕を使ってベックマン（Ｂｅｃｋ 　ｍａｎ）６３００アミノ酸アナライザでアミノ酸を定量する。

表１に、アミノ酸アナライザで定量した牛と犬の５ＡＰ（Ｖａｌ）のアミノ酸組 成を示す。

ベックマン（Ｂｅｃｋ　ｍａｎ）６３００アナライザを使って定量しているので 、表１にタンパク質の１分子当りとして記載されたアミノ酸残基組織はこの分析 技術にもとづく推定値にすぎないことを技術熟練者は理解すべきである。もっと はっきり言えば表１に示す組織は整数をえるために一般的に２で割り切れる数で あり、かつその後のアミノ酸配列決定データは表１に示す残基の約半分の割合と なるので、報告された結果は５ＡＰ（Ｖａｌ）の二量体を表すか、もしくは５Ａ Ｐ（Ｖａｌ）七ツマ−のそれぞれの組成値の少なくとも２倍を表わすことが事実 かも知れない。

推定分子量　６５８８．０　６６２０．０＊加入水分解でえられた最大値 表２に示すのは牛、犬、人の５ＡＰ（Ｖａｌ）について定量された一Ｈ２−末端 アミノ酸残基の初めの２５基（牛）、初めの２３基（大）、初めの１９基（人） の配列である。

表３に示すのは牛、大、人のＳＡＰ　（Ｐｈｅ）について定量されたＮＨ２−末 端アミノ酸残基の初めの６基（牛）、初めの７基（犬）、初めの１４基（人）配 列である。

表−Ｉ ＳＡＰ（Ｖａｌ） ＮＨ７−ｒアミノ″：に配置 牛　Ｌｅｕ　−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−ＯＰｒｏ−Ｖａ　Ｉ−Ａｓｎ −１１ｅ−Ｌｙｓ　−Ａｒｇ−犬　１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ− ５ｅｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ４１ｅ−Ｖ ａｌ−シａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ下部にかっこに入れた別のアミノ酸を有 するアミノ酸は上記の方法で潜在的に定量可能な別のアミノ酸を示す。例えば、 人のＮＨｔ−末端は現在はｃ＋ｙであると信じられているが、ＮＨ２−末端とし てＧｌ）’　、　ＩｌｅまたはＬｅｕをもつ配列（ＮＨＫ−末端の可変タンパク 質処理の結果として潜在的にえられる）も”人”５ＡＰ（Ｖａｌ）中に含まれる 。

スニ−１ ＳＡＰ（Ｐｈｅ） ＮＨ−ｔアミノ−配置 牛　Ｐｈｅ−Ｐｏ−１１ｅ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｐｒ。

人　Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ　−Ｔ ｒｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ 表２と表３に示す配列は、最初に５ＡＰ（Ｖａｌ）またはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）標 本を水へ透析するエドマン配列分析法によって生成された。標本はメタノールに 溶解され、ポリブレン処理されたガラス繊維フィルタへ通用される。分析はＡｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　５ｙｔｅ＋＋ｓモデル４７０Ａガス相タンパク質シーケン サを使って行われる。生じたフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）の分析は高圧 液体クロマトグラフィー　（ＨＰＬＣ）を使って５０°ＣでＡ　１　ｔｅｘ逆相 ＰＴＨ−Ｃ＋　ｍカラム上で行われる。酢酸アンモニアおよび緩衝されたアセト ニトリル、ｐＨ４，５から成るバイナリ緩衝液系を使用する。

クロマトグラフィーは、約１０％のアセトニトリルを含む緩衝液Ａと約９０％の アセトニトリルを含む緩衝液Ｂを使って行われる。クロマトグラフィーの初期条 件は緩衝液Ａが７０％、緩衝液Ｂが３０％の割合で、毎分流量１．０＋ｌＮであ る。注入の１分後に、緩衝液Ｂの濃度を３分間かけて直線的に５０％へ増大させ 、その濃度に８分間保つ、それから、緩衝液Ｂの濃度を１分間かけて３０％に減 らす、約１０分間を要する再平衡化ののちに、他のＰＴＨ標本が注入される。こ の分離方法の論議は以下に引用するＭｅｕｔｈ他、ハｍ１Ｌｔｉｃａｌ　Ｂｆｏ ｃｈｅｍ、、　１５４．４７８−４８４（１９８６）により詳細にわたって記さ れている。

犬、牛、人のＳＡＰ　（Ｖａｌ）のＮＨｔ−末端アミノ酸残基の配列は前記のよ うにたがいに類似しているが、３つの種の全てについて５ＡＰ（Ｐｈｅ）のＮＨ ３−末端アミノ酸残基配列とはかなりちがいがあるように見える。同様に、３つ の種の全てについてＳＡＰ　（Ｐｈｅ）のＮＨ！−末端アミノ酸残基配列はたが いに類似しているが、５ＡＰ（Ｖａ　ｌ　）配列とはかなりちがっている。さら に、５ＡＰ（Ｖａｎ）がβ−メルカプトエタノールの欠乏したゲル電気泳動移入 にさらされたとき、スルフドリル還元剤、メジャーおよびマイナー量のタンパク 質が現われる。これは図１を参照すればより理解しやすい０図１で銀染色したタ ンパク質の大量が６．０００と１４，０００の分子量移入領域に存在し、反対に 銀染色された小景のタンパク質のみが２０，０００と２６．０００分子量移入領 域に存在する。３番目に、アイソレートがβ−メルカプトエタノールの存在する ゲル電気泳動移入にさらされたとき、銀染色されたタンパク質は図２に示すよう に６．０００および１４，０００分子量移入領域のみに現われる。

図２には以下に述べる方法で精製され、脱脂され、β−メルカプトエタノールの 存在のもとに１０−２０％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気 泳動ゲルに通用した５ＡＰ（Ｖａｌ）のゲル電気泳動を示す、各レーンは、銀染 色法で検知された各タンパク質約２マイクログラムを表わす、Ｈ＝人、Ｄ＝犬、 Ｃ＝牛のＳＡＰ　（Ｖａｌ）　はＭｒ＝６．０００と１４．０００で移入された 。β−メルカプトエタノール人為結果もＭｒ＝６５，０００−７０，０００で観 察された。

標準分子量標識は右側に見られる。　５ＡＰ（Ｐｈｅ）は６．０００と１４，０ ００分子量領域の間に移入する可能性があり、これは前駆タンパク質の分解の結 果として生じるかもしれない、そこで、ＳＡＰ　（Ｐｈｅ）と５ＡＰ（Ｖａｌ） 両前駆物質の可変タンパク質分解プロセシングを反映して６．０００と１４，０ ００分子Ｎ　ｉｌｌ域の間で品種のわずかな異類混交があるかも知れない。

したがって、そこに存在する少なくとも２つの別個の４，０００−７．０００ダ ルトンＳＡＰモノモーは連れだって溶出し、ゲル電気泳動移入を経てともに精製 され、ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル内で定量される約 ４．０００−７．０００ダルトンの類似分子量を持ち、類似の生物物理学的界面 活性物質的な活動性を持ち、かつ類似の酵素耐性を持つと信じられる。さらに、 より大きいマルチマー、すなわちＭｒ干１８．０００及び２６，０００が、１つ 以上の５ＡＰ（Ｖａｌ）及び／またはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）モノマーがβ−メルカ プトエタノールの欠乏または存在のもとてのそれらの移入のためのスルフヒドリ ル結合によって１つに結合されて生しる可能性もあると信じられる。（図１と図 ２）したがって、４，０００−７、０００ダルトンの疎水性界面活性物質関連タ ンパク質である５ＡＰ（Ｖａｌ）と５ＡＰ（Ｐｈｅ）とは本発明の企図に十分収 まる。

叉崖土１ 工且Σへ■迫班 ＲＮＡは死亡直後の婦人の肺臓組織から抽出された。＆［Ｉ織はワシントン州ワ シントンのＮａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｉｎｔｅｒｃ ｈａｎｇｅによって供給された。　ＲＮＡはＣｈｉｒｇｗｉｎ他、Ｂｉｏｃｈｅ ＋ｓ　１８．５２９４−５４９９　（１９７９）に示された方法で抽出された。

ポリ（Ａ）”　ＲＮＡは、Ｍａｎｉ−ａｔｉｓ他、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏ ｎｉｎ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋　ＮｅｗＹｏｒｋ　（１９８２）　（以後はＭａ ｎｉａｔｉｓ他と略する）で説明されているのと本質的に同じオリゴ（ｄＴ）カ ラムクロマトグラフィーによって精製された。　Ｙｏｕｎｇ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）＋　８０＋１１９４４１９８（１ ９８３）に記述されたように、ｃＤＮＡライブラリがλｇｔ１１内に構成された 。

スｍ ｃＤＮＡ−イプーリの　スクリーニング多クーロン性ウサギの抗血清は、牛の肺 臓の界面活性物質のクロロホルム／メタノール抽出でつくられた牛の界面活性物 質プロテオリピド（Ｎｏｔｔｅｒ他、Ｃｈｅｗ、　Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ、 　２Ｌ　６７−８０（１９８０）参照〕に対して高められ、またＥ、　ｃｏｌｉ タンパク質への非特異性バンクグランドを最小にするためにスクリーニング法に よる事前吸収が施こされた。事前吸収は下記の方法で行われた。　Ｅ、　ｃｏｌ ｔ　ａ　Ｙ１０９０細胞溶解物（ｌｙｓｏＬｅ）をＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）を使 用する処理とそれに続く氷上音波処理（ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）ソニファ イアが発する６つのバースト、各１０秒間、５０ワツトをあてる）によって分裂 させる。音波処理物を低速の遠心分離機にかけ、上澄みを作る。この上澄みを上 記の抗血清を使って４８時間、４°Ｃで加温放置され、その後抗体／抗原複合体 を取り除くため遠心分離にかけられた。

このライブラリを１５（１＋＋＋ｍディツシュ当たり２０，０００ｐｆｕの割合 でＥ、　ｃｏｌｉ株Ｙ１０９０　ヘ塗り、４２°Ｃで５時間育成し、その後１０ ｍＭイソプロピルチオがラクトシト（ＩＰＴＧ）中に浸したニトロセルロース・ フィルタへ吸収させた。フィルタを一晩中３７℃に温間し、その後４℃の５０１ トリスＨｃｌ、　ｐＨ７，４，１５０ｍＭ　ＮａｃＪ！　（ＴＢＳ）、　５０ｇ ＩＩル粉ミルク内で１時間遮断した。−次抗体反応は、１／１０００希釈で、フ ィルムを４°Ｃで一晩中加温放置して行った。フィルタは、それから１／３００ ０に希釈したＧＡＲ−ＨＲＤをつかって４℃で１６時間加温放置した。カラーは ４−クロロ−１−ナフトールを使って３−５分間発生し、反応は蒸溜水中で連続 洗しようすることで終結された。二次および三次スクリーニングは、分離された 溶菌斑を確認するため１０分の１、および１００分の１のファージで行われた。

ス新ｌ辻灸 オリゴヌクレオチド′査　の入 混合配列のオリゴヌクレオチドは、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉおよび」肛肛封煕より− Ｌ−ルーＣｈｅｗ、　Ｓ＋匹よ、刊振３１８５−３１９１　（１９８１）の方法 で、応用バイオシステムＤＮＡシンセサイザモデル３８０Ａを使って行われた。

探査子の配列は、Ｎがデオキシチジンかデオキシイノシンのいずれかである（Ｇ ＴＮ）　６Ｇであった。　［Ｗｏｏｄ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’Ｉ　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、５２１５８５−１５８８（１９８５））この配列は、表 ２に示すように人・犬・牛の５ＡＰ（Ｖａｌ）ＮＨｚ−末端アミノ酸配列中に見 られるバリン残基の伸張にもとづいた。　５ＡＰ（Ｖａｌ）内のバリン伸張の特 色から、ＣＤＮＡライブラリのスクリーニングにおいて着目すべき選択性かえら れた。この領域内のコドンの重複性のため、デオキシイノシンを使用せず、また 第３の位置に望ましいベースとして、デオキシチジンを選択せずに、探査子の鋳 型としてこの領域は使用に通していなかったのであろう。

第２のオリゴヌクレオチド探査子は、表２に見られる人の５ＡＰ（Ｐｈｅ）のＮ Ｈ，−末端配列の９アミノ酸の逆翻訳に相当して合成された。この探査子の配列 は５′−ＣＣ−・・ＡＡ−３“であった。ここにＩはデオキシイノシンを表わす 。

尖旅孤エ オリゴヌクレオチド′　をイ　るスクリーニング牛の界面活性物質ポリクローナ ル抗血清を使って選択された正のクローンが、Ｅ、　Ｃｏ１１株Ｙ１０９０　（ Δｌａｃυ１６９　ｐｒｏ　Ａ”　Ｉｏｎａｒａ　０１３９５ｔｒＡ　５ＵＰＦ 　（ｔｒｐＣ２２：　ＴｎｌＯ）　ｐＭＣ９）（カリフォルニア州、Ｐａ１ｏ　 ＡｌｔｏのＣ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のローン上にファー ジ上澄みのｌｕｌを点滴することによって塗布された。プレートは４２℃で５− ６時間加温放置されたのち、ニトロセルロースフィルタでおおわれた。フィルタ を取外して、それを１．５９　！１ａｃｌ。

０．５　Ｍ　ＮａＯＨ中で１分間変性し、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０， １，５Ｍ　Ｎａｃｌ中で５分間中和し、２　Ｘ５ＳＰＥ　（２０ＸＳＳＰＥ＝３ ．６Ｍ　Ｎａｃｌ、　２００ｍＭＮａＨｚ　ＰＯ４，２０１１Ｍ　ＥＤＴＡ、　 ｐＨ７，４）中でリンスし、空気乾燥した。

それから、真空炉中でフィルタを８０°Ｃで１時間焼いた。フィルタを、前ハイ ブリッド形成緩衝液（５Ｘ５ＳＰＥ％　５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ。

５０ｍＭ　リン酸ナトリウムｐＨ７，０、ｌｄピロン酸ナトリウム、１１００ｕ 　ＡＴＰ　、５０ｕｇ／ａｎの煮沸した蛙の精子ＤＮＡ）中で４５℃で６時間前 ハイブリッド形成した。フィルタが前ハイブリッド形成される間に、例６に述べ た５ＡＰ（Ｖａｌ）オリゴヌクレオチド探査子を、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、”Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｍａｎｕａｌ’、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇＨａｒｂａｒ、二ニーヨーク州（１９８２）に記述された方法と本質的 に同じ＜Ｔ、ポリヌクレオチドキナーゼとα−”Ｐ−ＡＴＰを使って末端標識し た。　５ＡＰ（Ｖａｌ）探査子を、約１２ｎｇ／ｍｌの濃度の前ハイブリッド形 成緩衝液へ加え、フィルタを追加し、３０°Ｃで一晩中加温放置した。それから 、ｏ、２　ｘｓＳＰＥ、　０．１χドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）中にフィ ルタを浸して、室温で３０分間洗浄し、それから新鮮な洗浄溶液中に３２°Ｃで ４５分間浸した。フィルタを空気乾燥してからオートラジオグラフィーへかけた 。同じ方法を、例６に述べた５ＡＰ（Ｐｈｅ）探査子を使用する２番目のフィル タセットにも適用した。

５ＡＰ（Ｖａｎ）と５ＡＰ（Ｐｈｅ）両探査子とも上記の手順が修了したとき、 ５ＡＰ（Ｐｈｅ）探査子のみがいかなるクローンにもハイブリッド形成されるこ とが判明した。この理由は明らかではないが、ｃＤＮＡのライブラリのスクリー ニングに使用した抗血清が、ＳＡＰ　（Ｐｈｅ）を検知する感度性しか持たなか ったものと理論上想定される。

これは、免疫化に使用した牛の肺胞界面活性物質標品中に５ＡＰ（Ｖａｌ）が免 疫遺伝応答を引きだすために十分な量だけ存在していなかったため、もしくはＳ ＡＰ　（Ｖａｌ）の免疫原がＳＡＰ　（Ｐｈｅ）よりも少なかったためであろう 、技術の熟練者ならすでに了解されたように、このことはポリクローナル抗血清 を使用前に精製およびスクリーニングすることによって、もしくは特異的モノク ローナル抗体を使用することで克服可能であろう。

使用された別のアプローチは、前述のように末端標識をつけた例６の５ＡＰ（Ｖ ａｔ）オリゴヌクレオチドを使って５ＡＰ（Ｖａｌ）を暗号化するクローンのた めにｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリを単に直接選抜することであった。　ｃＤＮＡラ イフ゛ラリは１５０＋ａｍディツシュ当り約３０，０００ｐｆｕの割合で塗布さ れた。プレートは３７°Ｃで一晩中加温放置され、その後取外され、ニトロセル ロースのフィルタで覆われた。

１番目のフィルタ・セットを取り去ったのち、各プレート複製リフトが作られた 。フィルタの両セットを前述した方法に下記の変更を加えて処理した。前ハイブ リッド形成は、５ＸＳＳＰＥ、９０ｍＭクエン酸ナトリウムｐｏ　７．６、Ｉ　 ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、および５００ｕｇ／ｍ　ｅの煮沸した鮭の精子ＤＮＡ の中で３７℃で５時間かけて行った。ハイブリッド形成は、６　Ｘ５ＳＰＥ、Ｉ 　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５０ｕｇ／ａｉ　Ｉｔの煮沸した鮭の精子ＤＮＡ中 で濃度１．５ｏｇ／ａｎの探査子を使って行った。フィルタ類は５５°Ｃで１時 間、その後は３７°Ｃで１晩かけてハイブリッド形成した。フィルタ類を室温で ２回と３７℃で２回洗浄した。フィルタの両セット上の探査子ヘハイブリッド形 成することが判ったクローンを分離し、より低い濃度で再び塗布し、スクリーニ ングすることによって精製した。

ス屓ｌ汁比 ５ＡＰ（Ｖａｌ）とＳＡＰ　（Ｐｈｅ）　ｃＤＮＡクローンの特性化５ＡＰ（Ｖ ａｌ）または５ＡＰ（Ｐｈｅ）のいずれかの探査子を使ってハイブリッド形成す ることが判明したいくつかのクローンを、より特性化する目的でε、　Ｃｏ１１ 　Ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｕ　Ｃ１９（Ｙａｎｒｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ他、Ｇｅｎｅ 、３３．１０８−１１９（１９８５）に記述された）のＥｃｏＲ１部位へ縫代ク ローン化した。　５ＡＰ（Ｐｈｅ）探査子を使って選択したクローンを制限分析 によって位置決めしたのち、配列分析によってより特性体するため１つのクロー ンを選択した。選択したクローンを？ＩＩ３配列決定ベクター（Ｍｅｓｓｉｎｇ 他・ル■加鎮しユＬ上昭Ａ凹力述り一１０Ｌ７０−７８（１９８３）　Ｅ内へ継 代クローン化し、標準方法論（Ｓａｎｇｅｒ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　７４．５４６３−５４６７（１９７７）　〕 にしたがい！１１３オリゴヌクレオチドプライマーを使って配列した。ＰｌｉＣ プラスミドとＭ１３ファージ継代クローンの増殖にはＥ。

ｃｏｌｉ　ＪＭＩ０３　ｏｆ　ＪＭ１０９にュージャーシー州Ｐｉｓｃａｔａｈ ｙのＰｈａｒｍａ−ｃｉａ社）を使用した。このＳＡＰ　（Ｐｈｅ）クローンの 配列を圓３に示す。図中でアンダーラインされているのは表３に示した人の５Ａ Ｐ（Ｐｈｅ）のＮＨ２−末端アミノ酸配列に相当する部分である。

３３４．２に指定された０、３キロヘースの１つの５ＡＰ（Ｖａｎ）のヌクレオ チド配列分析は、人のタンパク質から直接定量されるアミノ酸配列に対する精密 な同定を予言する開放読み枠を含み、図４に図解した同じｃＤＮＡライブラリか ら他のクローン類を分離するため使われた。９つの非反覆クローンの配列分析は より大きいポリペプチド前駆体を予言する共通配列を生じた。

”　図４で、クローン３３４．２は初期５ＡＰ（Ｖａｎ）単離であり、ｃＤＮＡ ライブラリの再スクリーニング用の探査子として使われた。クローン３１１．３ 　と１３−１とはクローンＴＰ９−１やＴＰＩＩ−２には見られない１８塩基対 欠失をもつ。図４のなかで切れ目つきボックスはバリンに冨んだ５ＡＰ（Ｖａｌ ）クローンの疎水性領域を示す；“Ａ″はＡｐａＬｌ−λフアージＤＮＡをまれ に切断し５ＡＰ（Ｖａｌ）のバリンに冨んだ領域の発端に切りつける制限エンド ヌクレアーゼ−を書味し：　Ｐ・Ｐｓｔｌ　；　Ｓ＝Ｓｍａｌ　；“Ｃは５’Ｓ へＰ（Ｖａｌ）オリゴプライマーを使用して人の肺のｍＲＮＡ指導ジデオキシ配 列決定を示す。

図５には、オーバーラツプｃＤＮＡクローン３１１．３．１３−１、ＴＰＩＩ− ２、ＴＰ９−１　、ＲＪ２−１を使って決定したヌクレオチド配列を示す。

切れ切れのアンダーラインは、５ＡＰ（Ｖａｌ）ゲノムクローンＶＧ５１９の初 期構造配列からのプレゼントである。プライマーとしてＲＪ２−１を使ったｍＲ ＮＡ指導ジデオキシ配列決定からの配列を示す。

連続したアンダーラインで示すアミノ酸配列は人の５ＡＰ（Ｖａｌ）タン白質に 基づいて直接えられた。予言された配列と手に入れた配列とは１６か１７種類の アミノ酸で一致し、　相違はＡｓｎに代わる旧ｓ３ｔである。オーバーライン（ 上線）を施したＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡクローン３１１．３と１３−１が欠けて いるｔｇｂｐ配列である。

大きいポリペプチドの読み枠内に見られる１ｉｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓペプ チドは、アミン末端およびカルボキシ末端の両者での前駆体タンパク質の分解プ ロセシングからＭｒ・４　、０００−７　、０００の疎水性タンパク質が生じて いることを暗示している。

全長のｃＤ〜Ａｓはこの人の肺臓ライブラリ内では検知されなかった。従ってＲ ＮＡ配列決定とゲノムＤＮＡの分析とが完全ＳＡＰ（Ｖａｌ）ｍＲＮＡを予言す るために使われた。

ＳＡＰ　（Ｖａ　１）ＲＮＡの直接ヌクレオチド配列が人の肺ｆｆＲＮＡかえら れた。ジデオキシヌクレオチドＲＮＡの配列決定はＧｅｌ　１ｅｂｔｅｒ他、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　８３．３３７１ −３３７５（１９８６）に記述された１つの方法の修飾によって行われた。　５ ＡＰ（Ｖａｌ）ｃＤＮＡの５゛末端に特異なオリゴヌクレオチド・プライマーが 合成され、末端標識された。　Ｐｏ１ｙ（Ａ）’　ｍＲＮＡ（６ｙｇ）および（ ｆｆ２ｐ　）標識がっけられたプライマー（５ｎｇ）が、１０μ！のアニーリン グ緩衝液（０，２５Ｍｋｃｆ、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ８，３）の中で ８０°Ｃで３分間加熱され、それから５０°Ｃで４５分間除冷再対合された。

ＲＮ＾鋳型ニプライマー溶液（２μ１１が、５ユニツトのＡＭＶ逆転考酵素（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ）および１μｌの１−３リン酸ジデオキシヌクレオチド（０，５ 剛Ｍ　ｄｄＧＴＰ、　０．２８５ｅＭ　ｄｄＡＴＰ　、　１．ＯｍＭ　ｄｄＴＴ Ｐ　、または０．１５＋＊ＭｄｄＣＴＰ）を含む転写緩衝液（２４ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ　ｐＨ８，３，１６ｍ！ＩＭｇｃ　ｆ、８＋Ｍジチオトレイトール、０．４ｍ １（ｄＡＴＰ、　０．４ｍＭ　ｄＣＴＰ。

０．４ｄ　ｄＴＴＰ、　０．８ｍＭ　ｄＧＴＰ、　１００　μｇ／ｍｌアクチノ マイシンＤ）３．３μ！へ加えられた０反応は５０℃で４５分間加温放置され、 ローディング緩衝液（１０ｄ　ＥＤＴＡ、０．２χグロモフエノールブルー、１ ００χホルムアミド内の０．２χキシレン・シアツル）中で３分間８０°Ｃに加 熱し、それから配列決定ゲルヘローディングされた。

オートラジオブラフイー後の分析で、Ｒλへ配列はＣＤＮＡ配列とオーバーラツ プし、かつある透明末端で終わっていることが明らかになった。

抗体スクリーニングとオリゴヌクレオチド・ハイブリッド形式で分離されたＳＡ Ｐ　（Ｐｈｅ）　ｃＤＮＡクローンは５゛末端と３′末端とで不完全であった。

これらのｃＤＮＡクローンのいくつかはライブラリーから付加ｃＯＮＡクローン を分離するためハイブリッド形式探査子として使われた。これらのクローンの１ つの配列分析によって、そのクローンは５゛末端と３゛末端の両者が完全である べきことが示された。この配列を図６に示す、　５ＡＰ（Ｐｈｅ）転写は約４２ キロダルトンの前駆体タンパク質を暗号化する。

転写の正確な５゛末端を決める目的で、例１１に述べる５ＡＰ（Ｐｈｅ）ゲノム クローンの５′末端からのフラグメントを使ってＳｌヌクレアーゼ地図作成が行 われた。　Ｋｅｙ他、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　６゜３１３４−３１ ４３　（１９８６）に述された方法で探査子が作られ、Ｓ１ヌクレアーゼ保護が 行われた。さらに、成人の肺のｐｏｌｙ（Ａ）”　ＲＮＡが前記のように直接配 列決定された。Ｓ！地図作成と直接ＲＮＡ配列決定の両者で図６に示す５゛末端 が確認された。

図３と図５で括弧に入れて示されたＳＡＰ　（Ｐｈｅ）と５ＡＰ（Ｖａｌ）の疎 水領域はある程度相同である。これらの２つのタンパク質は別個の遺伝子で暗号 化されているが、それらは構造的に関連があるものと信じられる。したがって、 これらのタンパク質はリン脂質を結合し、界面活性物質の置換療法や診断に役立 つ関連タンパク質の家族の構成員であろう。

実施■工 ＬａｃＺ／５ＡＰ（Ｐｈｅ）　”　ンバク　のＥ、ｃｏｌｉ　での　現図３に示 すＳＡＰ　（Ｐｈｅ）　ｃＤＮＡクローンは皿遺伝子と同し配向にＥｃｏＲ１部 位へ挿入された。

読み枠は、限定酵素５ａｉ１を使ってプラスミドＤＮＡを切断しＴ４重合酵素と デオキシヌクレオチドを使って末端を埋めることによって変えられた。これはＳ ＡＰ　（Ｐｈｅ）　ｃＤＮＡを使って融解の部位から上流側にある匡遺伝子内へ ５つのヌクレオチドの挿入を生じた。これは、ＳＡＰ　（Ｐｈｅ）遺伝子生成物 のＮＨｚ末端に約２４００ダルトンの１ａｃＺを含むＩａｃＺ／ＳＡＰ　（Ｐｈ ｅ）融解生成物の生成につながった。

図７はこの構造の略図を示す。

叉施五上立 ５ＡＰ（Ｐｈｅ）ポリクローナル−だｇ　７　ンバク　の号例９に記述したプラ スミドを含むＥ、ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９を、６００ｍｍでの光学濃度が０．５に 達するまで３７°Ｃで増殖し、ＩＰＴＧを加えて１ｍＭの濃度とした。さらに３ 〜４時間３７℃で細胞を成長させ、１／１５容量溶解緩衝液（６２，５ｍＭ丁ｒ ｉｓ　ｐＨ６，８，２χＳＤＳ、　ＩＯＸグリセロール、５χβ−メルカプトエ タノール、０．１　ｍｇ／ｍ　Ｅブロムフェノールブルー）中でベレット化し再 度懸濁させた。標本を５分間煮沸してから１２．５χＬａｅ＋＊ｓｌｉ電気泳動 ゲル（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ、Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．６８０−６８５（１９７０ ）にロードした。ゲルがｒｕｎされたのち、７ｏｗｂｉｎ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ｔ！ＳＡ）、亜、４３５０−４３５４　（１ ９７９）の記述と本質的に同一の方法によりタンパク質をニトロセルロースへＥ Ｈ訳シタ。

ニトロセルロースフィルムを室温で１時間かけて５０ｇ＋ｗ／ｆの粉ミルクを含 んだＴＢＳ中で予遮断し、それから予め吸収された例５に示す抗血清を使って、 １／１０００希釈、室温で一晩中加温放置した。その後、フィルタをＴＢＳ中で ２回洗い、１／２０００に希釈したＧＡＲ−ＨＲＰを使って室温で１時間加温度 放置した。

例５に述べた色彩反応が生した。この試験の結果を図７に示す、レーンＢには１ ａｃＺ／５ＡＰ（Ｐｈｅ）融解タンパク質が含まれる。

レーンＡには例９で述べたように未だ“充填（「１ｌｌ−ｉｎ）“を受けていな かったプラスミドを含んだ細胞からのタンパク質が含まれる０例５のＳＡＰ　（ Ｐｈｅ）抗血清を使って、ＳＡＰ　（Ｐｈｅ）クローンの開放読み枠からの翻訳 生成物の予測寸法に１ａｃＺの２４００ダルトン部分を加えたものに一致する分 子量３２．０００−３４，０００のタンパク質が認められた。

尖旅■土土 ５ＡＰ（Ｐｈｅ）゛ツムクローン 人の胎児性腎臓の細胞ゲノムライブラリをλベクターＥＭＢＬ３（Ｆｒｉｓｃｈ ａｕｆ他、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１７０．８２７−８４２（１９８３ ）　）中で組み立てた。これらの細胞から分離したＤＮＡはＭｂｏｌで部分的に 消化され、寸法が２０ｋｂより大きいフラグメントのアガロースゲルに選択され 、λベクターのＢａ＋ｍＨ１部位へ結合された。このライブラリをＳＡＰ　（Ｐ ｈｅ）　ｃＤＮＡクローンで作られたハイブリッド形成探査子を使って選抜した 。ＳＡＰ　（Ｐｈｅ）ｃＤ！；Ａ探査子に、Ｐｈａｒｌｌａｃｉａ社（ウィスコ ンシン州Ｍｉ１ｗａｕｋｅｅ）から入手できるキットを使ってラムダムオリゴヌ クレオチドプライマー標識づけ法で１ｍづけした。ライブラリをプレート当り４ ０．０ＯＯｐｆｕの濃度で上ＩＣｏｎ株ＮＭ５３９に塗布し、ニトロセルロース フィルターへ吸い取らせた。フィルターを、２　ＸＳＥＴ（２０ＸＳＥＴ＝３Ｍ 　Ｎａｃｌ　、　ＩＭ　Ｔｒｉｓ　。

２０ａＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ７，８）　、５ｋＭリン酸ナトリウム、０．５Ｘ 　ＳＤＳ、５Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄ　ｔ’　ｓ　溶液、０．１　ｍｇ／ｍｌ変性鮭 の精子ＤＮＡ中で５５°Ｃで５時間かけて前ハイブリッド形成した。その後フィ ルターを３ＸＳＥＴ　、　５０ｍＭリン［ナトリウム、０．５　ｍｇ／ｗ　ｊ！ 　ヘパリン、Ｏ，１ｍｇ／ｍｌ！変性蛙の精子ＤＮＡ　、３０χホルムアミドに 約１０”ｃｐｍ／ｖａ　１２の標識づけした探査子を加えた中で５０°Ｃで一晩 中かけてハイブリッド形成した。その後、フィルターを６０’Ｃ）０．２ＸＳＥ Ｔ　、０．１ＸＳ［ｌＳ中で３０分づつ２回洗った。空気乾燥したのちＫｏｄａ ｋ　ＸＡＲフィルムへ露光した。ハイプリント形成するクローンを分離するため により低い濃度で２回目と３回目の選抜が行われた。

５ＡＰ（Ｐｈｅ）遺伝子を含んだ１２の独立したクローンを分離し、精製し、制 限分析とサチンプロット法で特性づけた。これらの方法による特性づけで、１２ クローンの全てが同じ遺伝子または同じ遺伝子の一部分を暗号化したことが明ら かにされた。これらのクローンの１つを例日に記述した配列分析し、約１０．５ キロベ一ス以内の５ＡＰ（Ｐｈｅ）暗号化領域全体を含むことが判った。クロー ンはまた、約２ｋｂの５°フランキング領域および約３ｋｂの３゛フランキング 領域をも包含した１ｌＮ８Ａに５ＡＰ（Ｐｈｅ）遺伝子の構造を示す０図８Ｂに 、熟練技術者に知られている標準的な配列決め技術によりえられたゲノムＳＡＰ 　（Ｐｈｅ）　ＤＮＡ用のヌクレオチド配列を示図８Ａにおいて、Ｂ＝Ｂａａ＋ 旧；　Ｅ＝ＥｃｏＲＩ　；　Ｈ＝旧ｎｄＩ［［；　５＝ＳａｃＩ　；黒く塗られ た部分はエキソンの翻訳された領域であり、けば塗りされた部分はエキソンの翻 訳されなかった領域。

ゲノム配列はクローンへの能力を助長し、ＳＡＰ　（Ｐｈｅ）遺伝子を発現させ る（例えば、発現を制御するため特に有効な調節配列を与えることによって）と の確信かえられた。

叉施■土又 ５ＡＰ（ｖａｌ）゛ツムクローン ３３４．２と呼ぶ５ＡＰ（Ｖａｌ）ｃＤＮＡに、ニック翻訳試薬キット　（メリ ーランド州ＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇのＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使ってａ 　（”Ｐ　）　ｄＣＴＰで標識づけした。この探査子を使って、λＥＭＢＬ３（ カリフォルニア州Ｐａｌ。

Ａｌｔｏ所在Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）中で大のリンパ 球ライブラリの選抜を行った。プレート当たり３０．０００ｐｆｕの初期塗布密 度で約２Ｘ１０’のクローンが選抜された。フィルターは重複して選抜した。２ 番目と３番目の選抜はそれぞれ１０倍希釈と１００倍希釈で行ったａ　Ｍａｎｉ ａｔｉｓ他、５ｕｐｒａ　、　３７１−３７２に記述されたと本質的に同じ方法 でファージＤＮＡを準備した。

５ＡＰ（Ｖａｌ）配列を含んだゲノム断片を同定するために、各種の制限エンド ヌクレアーゼを使った消化後のゲノムＤＮＡのサザンプロット分析に前述のｃＤ ＮＡを使用したサザンプロット分析にはランダムプライマー標識づけ（ウィスコ ンシン州Ｍｉ　Ｉｗａｕｋｅｅ所在Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で標識づけた任意プ ライマー探査子を使用して６５℃で５　Ｘ５ＳＣｓ　５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ ｓ溶液、０．１ｘＳＯＳ中のＤＮＡでハイブリッド形成した。ニトロセルロース フィルターを室温の２　Ｘ５ＳＣ、ｏ、１ｘＳＤＳ中で５分間づつ２回洗ったの ち、６５℃の２ＸＳＳＣ、０，１ｘＳＤＳ中で２回（各回２０〜３０分間）と６ ５°Ｃで０．２×ＳＳＣ、０，１！ＳＤＳ中で４回（各回２０〜３０分間）洗っ た。　ＤＮＡ破片はジデオキシ配列決定用のＭ１３ベクター中へサブクローンし た。

オーバーラツプ配列にもとづいたオリゴヌクレオチドを合成して５ＡＰ（Ｖａｌ ）を暗号化するゲノムＤＮＡから５°エキソンの位置を突きとめるために使用し た：　５’Ａ−Ｇ−Ｃ−＾−Ａ−Ｇ−八−Ｔ−ＧへＧ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ −Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−３’　、ゲノムクローンλＶＧ５１９　（７）５’に始まる 暗号領域の配列は直接ＲＩＪＡ配列および５’ｃＤＮＡ配列と精確にオーバーラ ツプした。このゲノム配列は、さらに５ＡＰ（Ｖａｔ）ＲＮＡの５°未翻訳領域 を同定する共通ＴＡＴＡＡ配列から３０塩基対下流側に位置する５ＡＰ（Ｖａｌ ）遺伝子の１番目のエキソン内にある。

５ＲＮＡの５゛未翻訳部分は、哺乳類リポソーム結合部位用の標準に合う潜在的 開始部位を含む。ｍＲＮＡの５゛末端に２つの潜在的ＡＴＧ開始部位（塩基２６ と５３）があり、なおまた選抜基準に厳密に合った３°末端にある。いくつかの ｃＤＮＡｓの３°末端は５ＡＰ（ｖａｌ）ＲＮＡの末端を予測するボデアゾニレ −ジョン付加配列を証明している。５ＡＰ（Ｖａｌ）活性領域を暗号化する２つ の別個のｃＤＮＡのクラスが分離されたが、予測された＋ｌｌＲＮＡは、３゛か ら活性Ｍｒ＝４，０００〜７．０００ペプチドまでの暗号領域において異なって おり、その領域での１８の塩基対の欠落は２つの別個のポリペプチド前駆体が６ つのアミノ酸だけ異なっている結果かも知れない、しかしながら、この欠落は５ ＡＰ（Ｖａｌ）用に分離された２種類のゲノムクローン内のヌクレオチド差から は生じていない０両クローンとも１つクラスのｃＤＮＡ内に欠落している１８の 塩基対を含んでいる。

ゲノムクローン内の１８の塩基対の直前直後には、イントロン・エキソンスプラ イス部位に合致する配列が２セント存在するので、この欠落はスプライシングの 選択によって発生するのかも知れない。

欠落配列は、エキソン５の開始点に突きとめられ、エキソン４の末端にも見られ る６つのヌクレオチド（ＴＴＣＣＡＧ）に先行される。エキソン５の５゛基部末 端の配列は介在配列の末端を信号しているジヌクレオチダＡＧを従えた１０〜１ ５の塩基対ポリピリミジン系から成るイントロン。

エキソンスプライス部位に合致する２セツトの配列を示す。塩基対（ＣＴＣＡＣ ＴＴＣＣＴＡＣＡＴＴＣＣ）は主要なｃＤＮＡ種のＡＧに先行する１７の塩基対 系から成る。欠落した１８の塩基対配列の末端のＡＧに先行する２番目の配列（ ＴＧＣＴＣＴＣＴＧＣ）は２つの観察された５ＡＰ（Ｖａｌ）ｃＤＮＡクローン の原因となる選択スプライス部位を表わしているかも知れない、もしスプライシ ングが走査機構により生じるものであるならば、この下流側の選択部位は不利で あり、１８ｂｐのｃＤＮＡが不足する小種が結果するかも知れない、ｃＤｈＡク ローン化中に検知される９つの５ＡＰ（Ｖａｌ）ｃＤＮＡのうち２つのみがこの １８の塩基対欠落を含んでいた。要約すれば、１８ｂｐｃＤＮＡの欠落は選択的 スプライシングから生じることが明らかである。１８の塩基対が今回の研究では 検知されない５ＡＰ（〜ａｌ）遺伝子の対立遺伝子に存することは可能である。

５ＡＰ（Ｖａｌ）ｃＤＮＡクローン３３４．２を使ったハイブリッド形成により 同定された１２のクローンの制限エンドヌクレアーゼ地図作成でＤＮＡ破片の２ つの異なるバアーンが示された。７つのクローンはクローンλＶＧ５１９で表わ され、５つのクローンはクローンλＶＧ５２４で表わされた。　５ＡＰ（Ｖａｌ ）暗示化領域を含む制限エンドヌクレアーゼ破片がそれらをｃＤＮＡクローン３ ３４．２でバイブリッド形成することによって同定された。別個の１．８ｍｋｂ 　Ｈｉｎｄ　ｍ／ＥｃｏＲＩハイブリッド形成フラグメントがクローンλ％’Ｇ ５１９中で同定され、４ｋｂ　）ＩｉｎｄＩ［［ハイブリッド形成フラグメント がクローンλＶＧ５２４中で同定された９両バンドとも、ＡｐａＬｌ（能動疎水 性ペプチドを暗号、ｆヒする領域内でＳＡＰ　（Ｖａ　］）　ｃＤＮＡｓを切断 する）を使った消化後に２５０ｂｐだけ還元された。そこで、これらの予備分析 はＳＡＰ　（Ｖａｌ）を暗号化する制限エンドヌクレアーゼ破片の輪郭を描き、 ５ＡＰ（Ｖａｌ）を暗号化するｃＤＮＡクローンの制限分析と一致した。

図９に２つの５ＡＰ（Ｖａｌ）クローンの制限地図と組織とを示す。

図９で、１番目と２番目のラインはλＶＧ５１９とλ％’Ｇ５２４の制限エンド ヌクレアーゼ地図であり、ゲノムクローンから同定された制限エンドヌクレアー ゼパターンの２つのクラスを表わしている。３番目のラインは２番目のラインか ら拡張されたものでλνＧ５２４用遺伝子内および近辺の配列を表わす、ライン 上部の囲み部は５ＡＰ（Ｖａｌ）ｃＤＮＡ探査子（エキソン２〜５）をハイブリ ッド形成する配列を同定している。　ＡｐａＬＩ制限部位はボＩＪバリン頒域を 同定している。制限エンドヌクレアーゼ部位は次のアルファベットで表わされて いる：　Ａ＝ＡｐＬ１　；　Ｈ＝）ｆｉｎｄ　ｍ：　Ｂ＝Ｂａ＋ｍＨＩ；　Ｅ＝ ＥｃｏＲＩ　；　Ｘ＝Ｋｐｎｌ　；　Ｓ＝Ｓｍａ＋、ラインＣはＳＰＬ　（Ｖａ ｌ）のエキソンの相対位置を示す。白抜きブロックは未翻訳エキソンを示し；黒 塗ブロックは翻訳ずみエキソンを示す。

ゲノムクローンの側面にある領域にはＳ＋ａａ　Ｉ、旧ｎｄｎｌ、Ｂａ５ＨＩ制 限酵素を使って同定された制限部位差を含んでいた。２つのクラスの５ＡＰ（Ｖ ａｌ）遺伝子の制限地図はこの分析で容易に区別できた。両者の５ＡＰ（Ｖａｌ ）遺伝子とも、　ＴＡＴＡＡから６番目のエキソンの末端までの６つのエキソン と５つのイントロンから成り立っていた。２つの５ＡＰ（Ｖａｌ）遺伝子は、図 １０に示すようにヌクレオチド配列中の僅かではあるが明りょうな相違を示した 。

図１０を作成するために、Ｂｒｕｎｎｅｔ他、肛匹匡紅ｌ■＋　２５＋５０２８ −５０３５　（１９８６）に記述されたようにヌクレオチド配列分析が行われた 。塩基対には上記のように同定された転写開始部位をの印を、ヌクレオチド５“ には（＝）の印を付けである。

オーバーラインを付けた配列ＴＧＡＣＧＴＣＡは溜在ｃＡＭＰ認識配列を表わす ；共通プロモータと共通配列を表わす配列ＴＣＡＣＣＴＣＴとＴＡＴＡＡとにオ ーバーラインしである。エキソン５の５゛末端の供与／受容選択スプライシング 配列にオーバーラインしである。

λＶＧ５１９とλＶＧ５２４との間の配列の差はλνＧ５１９の上部につけた星 印、ダッシュ、および文字でヌクレオチドの挿入、欠落、置換をそれぞれ示す、 。

５ＡＰ（Ｖａｌ）の１番目のエキソンと５番目のエキソンの一部、および６番目 のエキソンの全体は翻訳されていない。Ｍｒ・２２．０００ポリビブチド前駆体 はエキソン２．３．４、及び５で暗号化されている。ペプチドの疎水性領域（Ｎ Ｔｏ−［Ｌｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−〜！ａ１．．．で始まる）の 大部分は４４のアミノ酸のペプチドを暗号化するエキソン２のうちに位置してい る。

５ＡＰ（Ｖａｌ）を暗号化する完全なｃＤＮＡｓは同定されなかったので、利用 できるｃＤＮＡ配列から転写開始部品までのヌクレオチド配列を同定するために ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ配列決めを行った。　ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ配列 分析中に強い逆転写が検知された。これは転写開始の部位を示すものと推測され る。

ＳＡＰ　（Ｖａ　ｌ）遺伝子の５゛未翻訳エキソンと上流側フランキング配列を 同定するために、拡大ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ配列の５’−ｍｏｓｔ　ｃＤＮ Ａおよび８つの塩基対を埋めるオリゴヌクレオチド（３’−ＣＡＧＣＣＡＧＡＴ ＧＧＡＴＧＴＧＧＧＣＡＧ−５’　）を合成し、λＶＧ５１９とλＶＧ５２４　 ノサザンプロット分析に使用した。　Ｋｐｎｌおよびにｐｎ＋／）ｆｉｎｄ　Ｉ ＩＩを使った消化後にこのオリゴヌクレオチドを使って両クラスのゲノムクロー ン内に同一の制限フラグメントパターンが検知された。　１．８ｋｂ　Ｋｐｎｌ と１．１ｋｂ　Ｋｐｎ　Ｉ／ＨｉｎｄＩ［［フラグメントが配列決定され、５’ −ｍｏｓｔｃＤＮＡクローン（クローンＲＪ２−１）からのヌクレオチド配列と ｍＲ）；Ａ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ配列分析で引き出された５゛ヌクレオチド配を含 むことが判明した。

共通促進因子配列ＴＡＴＡＡは、両クローン内の予測された転写開始部位へ位置 する３０の塩基対５°であった０本出願中に使用するとき、距離は論議されてい る配列の３″末端の位置に関して与えられる。配列ＴＣＡＣＣＴＣＴは、Ｂｒｅ ａｔｎａｃｈ他、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｄｃｈｅｍ。

５０、３４９（１９８１）に述べられた７つのうち６つのヌクレオチドの共通真 核促進因子配列ＴＣＡＡＴＣＴにほとんど調和する。この配列は転写開始部位か ら５５のヌクレオチドスだけ上流側に位置する。

配列ＴＧＡＴＧＴＣＡは転写開始部位から５０４の塩基対だけ上流側に位置し、 ８つのうち７つの塩基対内の配列ＴＧＡＣＧＴＣＡに調和する。

この後者のエレメントはあらかじめｃＡ！ｌＰの応答性と関係づけられたある配 列から成る（Ｍｏｎｔｍｉｎｙ他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 。

旦旦）、」ムロ６８２−６６８６（１９８６）　）　、胎児の肺の器管培養中に グリココルチコイドが５ＡＰ（Ｖａｌ）発現を促進させたが、コルチコステロイ ド応答性エレメントとして予め認識された共通配列はこれらのクローン内には検 知されなかった。

λＶＧ５１９とλＶＧ５２４とで暗号化されたエキソンの予測されたタンパク質 配列は全く同一であった。　５ＡＰ（Ｖａｌ）遺伝子の初めから５つのエキソン 内には差は認められず、未翻訳である６番目のエキソン内に３つのヌクレオチド の相違が検知された。　５ＡＰ（Ｖａｌ）遺伝子の介在配列の内にさえも１χを 越えることのない高度の均一性が見られた。

予測されたＳＡＰ　（Ｖａ　ｌ）前駆体ペプチドのヒトロバシー分析は、Ｍｒ・ ２２．０００前駆体タンパク質の疎水性、潜在的膜関連領域が両５ＡＰ（Ｖａｌ ）遺伝子の２番目のエキソン内に含まれることを示している。３番目と４番目の エキソンから引出された予測されたぺミノ酸に冨んでいる。　５ＡＰ（Ｖａｌ） ペプチドのＣ末端の位置はＭｒ＝４　、０００〜７，０００の標識の移入と、そ れらの全２が主と１２２番目のエキソンで暗号化されたペプチドからの派生した ことで一致している脂質の関連と有機溶媒への融解度を含んだ疎水特性とによっ て暗示されている。

アミノ末端とカルボキシ末端との両者のタンパク質分解プロセシングは、肺胞界 面活性物質内に検知される小ペプチドの発生を説明するかも知れない。

５ＡＰ（Ｖａｎ）の５′領域と発表された５ＡＰ−３５ゲノムクローンとの間に は相同性は認められなかった。

λＶＧ５１９とλνＧ５２４のヌクレオチド配列は全てアミノ酸暗号化領域内に 保存された。ゲノム配列は、その中ではロイシンはｃＤＮＡ中に観察されるＴＴ ＧよりもむしろＣＴＧによって暗号化されるというエキソン内での単一のヌクレ オチド差を除いては５ＡＰ（Ｖａｔ）　ｃＤＮＡと全く同一であった。又ヌクレ オチド差は、３“未翻訳領域を暗号化するエキソンのみに認められた。ヌクレオ チド配列差の頻度（１〜２χ）は介在配列の両者と分析のため利用できる５゛及 び３′フランキング配列とで類似（ＴＡＴＡＡから約５００塩基対）していた、 λＶＧ５１９の５’−＋＊ｏｓｔフラグメント（６００ｂｐ　Ｈｉｎｄ　ｍフラ グメント）は、その領域でのフランキング配列の差を示しているサザンプロット 法ハイブリッド形成によってはλＶＧ５２４中に存在しなかった。

エキソン内のヌクレオチド配列のほぼ完全な保存、イントロン内の小分岐性、お よび３′と５°領域の制限地図内の差は、５ＡＰ（Ｖａｌ）ゲノムクローンが５ ＡＰ（Ｖａｌ）を暗号化する２つの別の遺伝子座を表わす翻訳とよく一致する。

しかしながら、これらの差ン、ＲＮＡ配列決定、およびゲノムＤＮＡから推測さ れた。前駆体は、２１，０００ダルトンのポリペプチドを表わすＮ末端メチオニ ンの割当次第で１８８または１９７のアミノ酸（あるいは欠落を入れて１８２ま たは１９１）で成り立つ、予測されたポリペプチドの寸法はハイブリッドを選択 されたＭｒ・２２，０００の翻訳生成物の寸法と一致する。アミノ末端には認識 できるシグナルペプチドは存在せず、前駆体ポリペプチドはアスパラギン連鎖グ リコジル化部位を含まない点で、１つまたは２つの潜在アスパラギン連鎖グリコ ジル化部位を有しているＳＡＰ　（Ｐｈａ）前駆体との対照を示す。

５ＡＰ（Ｖａｌ）のペプチドはＧ１３１２５またはｌ１ｅｚａに始まり、アミノ 酸Ｌｅｕｓｔから５ｅｒｉ＋　までを含んだ領域は膜関連または２５のアミノ酸 で埋まった領域と一致する。この領域には反覆バリン残基を含んでいる。５ＡＰ （Ｖａｌ）の精密なＣ末端は直接同定されておらず、牛や犬のプロテオリピドの タンパク質分解またはＣＮＢｒフラグメントを分離する多くの試みも成功に到達 していない。

しかしながら、牛の５ＡＰ（Ｖａｌ）のＮ？ＩＲ研究からＣ−末端は旧５−Ｔｈ ｒである、換言ずれば５ＡＰ（Ｖａｌ）はＧｌｙまたはＩｌｅから旧ｓ　（６５ ）まで合計４０または４１のアミノ酸で成り立つという仮設がたてられる。

牛や大のプロテオリビド標品のＮ−末端アミノ酸配列は、何度もの測定の結果９ ０χ５ＡＰ（Ｖａｌ）よりも大きかった０人のｃＤＮＡからのＭｒ−４，０００ 〜７，０００ペプチドの予測アミノ酸配列はフェニルアラニンとチロシンが欠乏 した疎水性ペプチドを予測する。対照的に、人の５ＡＰ（Ｐｈａ）の小分子量の 疎水性界面活性タンパク質のアミノ酸配列にはチロシンやフェニルアラニンが存 在する。

フェニルアラニンとチロシンの不足は５ＡＰ（Ｖａｌ）をＳＡＰ　（Ｐｈａ）か らを発想すると信じられる０例えば発現と調節するためとりわけ有効である制御 配列をもたせることでより一層の遺伝子の発現かえられる。

ス五１１ＬＩ ＳＡＰ（Ｖａｌ）Ｐｏｔ　（Ａ”　ＲＮＡの　ｉ゛オリグヌクレオチドハイブリ ツド形成より分離された５ＡＰ（Ｖａｌ）　ｃＤＮＡクローンは５°末端と３゛ 末端が不完全であった。ノ飄イブリッド形成探査子用の５ＡＰ（Ｖａｌ）ｃＤＮ Ａを使って付加クローンが分離された。あるものは３゛末端は完全であるが、５ ゛末端は不完全なことが判明した。配列分析により、あるｃＤＮＡでは３”暗号 化領域内に１８のヌクレオチドが無いことで区別される２つの異なるクラスの５ ＡＰ（Ｖａｌ）ｃＤＮＡが検知された。成人の肺臓のＰｏ１ｙ（Ａ）’ＲＮＡを 直接配列決定することにより、またＳＡＰ　（Ｐｈａ）の場合について述べたよ うな５ＡＰ（Ｖａｌ）からの５゛フラグメントのＳ１ヌクレア一ゼ地圀作成によ って完全な５′配列が決定された。これらの２つの方法で同定された、５゛末端 を含む完全な配列を図５に示す。

５ＡＰ（Ｖａｔ）転写は約２１キロダルトンの前駆体タンパク質を暗号化する。

災五孤上土 ５ＡＰ（ｖａｌ）′　云　の仇　（亡１（３２ｐ　）標式の５ＡＰ（Ｖａｔ）ｃ ＤＮＡクローンをマウス人染色体パネルからとったＤＮＡと対合させた。［３２ ｐ）標式の５ＡＰ（Ｖａｌ）クローンを以前に特性化したところによる全人染色 体を含むマウス人染色体雑種とハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成はス １」（Ｌｉ ＳへＰ（Ｖａｌ）ノーザン・プロット ポリ（＾）”　ＲＮＡを妊娠１９週の胎児肺ならびに人間の成人肺から貧（ｄＴ ）セルローズ色相分析法により作成し分離した。成人および胎児肺の組織を４Ｍ チオレアン酸塩グアニジン、０．５χＮローロイル・サスコシン、２０ＩＩＭク エン酸ナトリウム、０．１−β−メルカトエタノール、０．１χ泡止剤Ａを含む 　緩衝内で均一化した。

５．７Ｍ塩化セシウムのクッションを通してＲＮＡを遠心分離により抽出した［ Ｈｓｕ等、Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｘｔｏｃｈｅｍ、２９，５７７−５８０ （１９８１）　）ＲＮＡのベレットを水に溶解し、フェノールとクロロフォルム により抽出処理を行い、かつエタノールにより沈陣処理を行った。

水溶液中のＲＮＡ０量は光学密度法により２６０ｎｍと測定された。

ＲＮＡ　（５量ｇ）を１．２χａｇａｒｏｓｅ、７χフオルムアルテヒト・ケル 上テ分離し、ニトロセルローズに転移して（３２ｐ　）　５ＡＰ（Ｖａｌ）ＤＮ Ａクローン３３４．２　（１，４Ｘ１０’ｃｐｍ／ｎｕ、概略比活ｉｔ　４　Ｘ １０’ｃｐｍ／ｕｇ　）と交配し、洗浄したうえ一７０°ＣでコダックＸＡＲフ ィルムに一晩暴露した。

図１１に示したＳＡＰ　（Ｖａ　Ｉ）　ｃＤＮＡプローブを用いた人肺ＲＮＡの ノーザン・プロット分析によって約０．９キロベースのＲＮＡが検出され、５Ａ Ｐ（Ｐｈｅ）または５ＡＰ−３５との相違を示した〔グラソセ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、、　Ｓｃｉ、　（ｔｌｓＡ）、　８４．４００７−４ ０１１　（１９８７）；ならびにホイットセット等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ Ｉｌｌ、、　２６２．５２５６−５２６Ｈ１９８７））。

ＳＡＰ　（Ｖａ　１）ＲＮＡは、成人肺に比べて人間の胎児の肺（妊娠約１９〜 ２０週）のほうが少なかった。　５ＡＰ（Ｖａｌ）用のＲＮＡが発生面で調節さ れるという結論は、出生時における空気呼吸への出土時適応に必要な表面活性機 能においてＳＡＰ　（Ｖａ　１）が果たしている可能性ス去’ＩＬＬ旦 ハイブリット阻害４８ ＥｃｏＲ１抑制５ＡＰ（Ｖａｌ）ｃＤＮＡ約５ｕｇを１００°Ｃで１０分間熱変 性を行い、８０！フオルムアミド、１０ｗＭ　Ｐｉｐｅｓ（ｐＨ６，４）、０． ２５ｍＭ　ＥＤＴＡ。

０．４！’Ｉ　Ｎａ（／！内で５０°Ｃにおいて２時間５ｕｇの人肺ＲＮＡとハ イブリツド形成させた。このハイブリッド形成は、２００ｕ　１のＨｚＯならび に２５ｕｇのイーストｔＲＮＡを添加すことにより終えた。？８液を２つの標本 に分け、そのうち１つを１分間１００°Ｃで溶解した後急冷した。またもう１つ は雑種の形で保存した。両方の標本をエタノール内で沈腎し、小麦麦芽転写分析 装置（プロメガ・〕くイオテノク・インコーポレイテッド社）に５ＱｕＣｉ　（ ３５ｓ　）メチオニン（二ニー・イングランド・二二一りレア）を用い翻訳した 。

これらの蛋白を１１χ５ＤＳ−ＰＡＧＥ処理した耐牛界面活性プロテオリピッド 抗血清で免疫沈降させ、ニトロセルローズに転移し、オートラジオグラフィに当 てた。

ハイブリッド阻害翻訳法ならびに牛のプロテオリピドに対し発生させた抗血清に よる免疫沈降の結果、図１２に示したオートラジオグラフ・ゲルによって証明さ れる通り単一のＭｒ＝２２，０００ポリペプチドは、完全に阻害された。人肺Ｒ 〜Ａのハイブリ・ノド阻害翻訳法により検出したＭｒ・２２，０００ペプチドは 、ｃＤＮＡコード化５ＡＰ（Ｖａｌ）から予測したところと−敗し、さらにそれ ぞれＭｒ・４０．０００およびＭｒ−２６，０００の５ＰＬ（Ｐｈｅ）と５ＡＰ −３５のポリペプチド前駆体との違いを示している。

実施燃上ｌ ５ＡＰ（Ｖａｌ）の　の　想 る〔ゴールドマン等、Ｌ紅蛙」熊鶴、」旦、　１５８３１−１５８３５（１９８ ６）　）　。

このベクトルを１９８７年９月２５日にメリーランド州ロンクビル市パークロー ンドライブ、１２３０１　、ジ・アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクショ ンにＡＴＣＣ受諾〜α６７５１７として５ＡＰ（ＶａＩ）挿入片を含めて寄託し た。プラスミドはｐＫ！１１１１のｇＩ体である〔マンデツキ等、這猛予、邦、 １３１−１３８（１９８６）　）　、この誘導体からプロモータ、オペレータ、 リポソーム結合部位、Ｃ５Ａ遺伝子を含むＥｃｏＲｌ−Ｈ４ｎｄ　ＩＬＩ断片を 取り、これをＣＫＳ用の該当するものと置換している。　ＣＫＳ遺伝子は、ワイ ルド・タイプのラック・オペレータならびにラックＰ−７９−Ｄという名称の修 飾ラック・プロモータの制御下におく、−９の位置はＧからＴに移動させ、−３ ５から−１０の間のスペーサ部内に１ヌクレオチドの欠失がある。このプラスミ ドはまたｔｒｐＡ　Ｒｈｏ独立転写ターミネータ〔クリスティ等、Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　（ＬＩＳＡ）＋ユ４１８０−４１８４（ １９８１）　）をＣＫＳ遺伝子の３”末端に含んでいる。さらにＣＫＳ遺伝子の ３′末端には、リンカ一部があり、これはフレーム内Ａｓｐ−Ｐｒ。

はもちろん複数の制限部位を含んでいる。ＡｓｐとＰｒｏ間のペプチド結合は、 ラントン、３旦工且■懸１．」互１４５−１４９　（１９７７）により説明され た通り酸不安定である。挿入片がない状態での誘導条件（１ｍＭ　ＩＰＴＧ）下 においてＣＫＳ蛋白は、図１３、レーン４に示したように総細胞蛋白の〉５０ｚ レヘルまで体積する。

図１３においてクーマッシ・ブリリアント・ブルーで染色した１０χＳＤＳ　Ｐ ＡＧＥを示したが、この図においてレーン１にはあらかじめ染色した高分子量標 準が入っている（ＢＲＬ・ライフ・テクノロジ、ガイザーバーグ、メアリーラン ド）、レーン２には大腸菌総細胞溶解物（プラズミド無し）が入っており、レー ン３にている。

ＳＡＰ　（ＶａＩ）ｃＤＮＡを含むＤＮＡフラグメントをｆＪｓ遺伝子の３゛末 端のこのベクトルの多クローン化部位に挿入した。これら２つのコード化部は同 一フレーム内にあるため、発現は、ＣＫＳ蛋白と全５ＡＰ（Ｖａｌ）タンパクを 含む融合蛋白になる。この融合蛋白は、４８．７ｋＤａｌでこのうちＣＫＳから ２７．４ｋＤａｌ、　５ＡＰ（Ｖａｌ）から２１．３ｋＤａｌ来ている。　ＣＫ Ｓと５ＡＰ（Ｖａｌ）の間の溶融結合部にＡｓｐ−Ｐｒｏが１つあり、また１つ は５ＡＰ（Ｖａｌ）のＣ末端からアミノ酸の数で２０個内側に配置される。この プラスミドを含む細胞の培養を誘導条件下で成長させた場合、ＣＸＳ／５ＡＰ（ Ｖａｌ）蛋白が図１３、レーン３に示したように総蛋白の約２〜５χになる。こ れらの細胞は各種の方法で溶解することができるが、１例をあげれば、リゾチー ム、デオキシコール酸塩ナトリウムならびにマーストン等のＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏ■、　２．８００−８０４　（１９８４）で述べたところよる音波処理を 利用する方法がある。この方法で溶解した場合、ＣＸＳ／５ＡＰ（Ｖａｌ）蛋白 は、不溶解ベレット内に入れ、大腸菌蛋白の本体から精製できる。　ＣＸＳ／５ ＡＰ（Ｖａｌ）蛋白は、図１４のレーン２および３に示したように総軍溶解蛋白 の〉６ｏｚを示している。

図１４には、クーマッシ・ブリリアント・ブルーで染色した１２５χＳＤＳ　Ｐ ＡＧＥを示したが、ここでレーン１は持前染色高分子量標準（ＢＲＬライフ・テ クノロジ、ゲイザーズバーグ、メアリーランド）を含み、レーン２は不溶解蛋白 標品ｌｕｌを含み、レーン３には不溶解蛋白標品５ｕｆを含んでおり、矢印はＣ ＸＳ／５ＡＰ（Ｖａｌ）融合ｌ０を示している。

Ａｓｐ−Ｐｒｏ結合部の酸開裂条件の一部については、５ｚｏｋａ等の金な長さ の５ＡＰ（Ｖａｌ）タンパクは不溶解性であり、かつ有機系溶剤で抽出により回 収できる。

５ＡＰ（Ｖａｔ）またはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）の活性領域のみを利用して同様の構 造を作ることができる。

例えば、５ＡＰ（Ｖａｌ）活性領域の場合、回５のヌクレオチド１００−２２２ によりコード化したように合成オリゴヌクレオチドを用いて構築し、ＣＫＳ発現 ベクトルに挿入することができる。この構造は活性領域のＮ末端にＡｓｐ−Ｐｒ ｏを用い設計できる。この結合の酸開裂があるとＮ末端部にある余分なＰｒｏを 含む５ＡＰ（Ｖａｌ）が生じる０代替案として最初のアミノ酸３個がＧｌｙ−１ １ｅ−Ｐｒｏであると仮定した場合、Ｇａｙ−１ｉｅをＡｓｐに置き換えること により酸開裂を最初のアミノ酸２個を差し引いた５ＡＰ（ＶａＩ）活性領域とな るようにすることができる。ヒドロキシルアミンを用いたもう１つの開裂法もま た採用できる。このヒドロキシルアミンと０う薬品はボーンスタイン等の傾止、 堕■鯰１．４７　１３２−１４５（１９７７）で検討されているように、Ａｓｎ とＧｌｙの間のペプチド結合にお０て開裂する。　５ＡＰ（Ｖａｔ）　Ｎ末端ア ミノ酸かｃｌｙと仮定した場合、この開裂法により無傷の５ＡＰ（Ｖａｌ）が生 じる。

実施桝土主 ５ＡＰ（Ｖａ　）　５ＡＰ（Ｐｈｅ）の　類　での５ＡＰ（Ｖａｌ）または５Ａ Ｐ（Ｐｈｅ）ゲノムあるいはｃＤＮＡは、例えば、単純ヘルペス・タイプ／　（ Ｏ５ν）シミジン・キナーゼ（ｔｋ）プロモータに隣接する哺乳類発現プラズミ ドに挿入することができる。

このプラスミドを次に１−２のＨｅＢ５　（８ｇ＠／ｊ！　ＮａＣｌ２．０．３ １ｇ−１Ｉｔｋｃｊ！、０．２５ｇｍ／ｊ！　ＮａｚＨＰＯａ−１２ＨｇＯ，１ ｇｗｘ／ｌデキスラーゼ、５一方、このＣａＣｊ！　ｔを添加中に混合体に穏や かな空気流を発泡させ、さらに３０秒間続ける。その後ＤＮＡを室温で３０分間 沈澱させた後、［ｌＮＡ懸濁液０．５１ａ　ｌ　ｓを例えばベビー・ハムスタの 腎臓細胞２５ｃｄの皿に加える、あるいはその他の選定した哺乳類の細胞に同様 に添加する。　ＤＮＡ添加添加後間時間培養媒体を除去し、δχ牛脂児血清（Ｅ Ｃ−５）を含むイーグル社の媒体で１回洗浄し、ＨｅＢ５内のｂｓｊ！２５χジ メチル・スルフオキシド（Ｄ！ｌ５Ｏ）を各々の皿に室温で４分間添加する。２ ５ズＤＳＭＯを次に除去し、皿をＥＣ−５で２回洗浄し、その後細胞をＥＣ−５ に温間する。　ＤＮＡ添加後２４時間して細胞をＨ８ν（１０ｐｆｕ／細胞）に 感染させ、この感染が４８時間続くようにする０発現した５ＡＰ（Ｖａｌ）また はＳＡＰ　（Ｐｈｅ）蛋白をその後、例えば、免疫沈降により培養液やら分離し 、例えば５ＤＳ−ＰＡＧＥにより検定を行う。

５ＡＰ（Ｐｈｅ）またはＳＡＰ　（Ｖａｌ）をコード化する遺伝子もまた本技術 に習熟した人々には良く知られた適切な発現系に於いて発現させることもできる 。このような発現系の実施例には、大！、バシラス、イースト菌、バクロビール ス、その他の哺乳類細胞発現系が含まれる。

図３．６．８Ｂ、１０に示した配列はＳＡＰ　（Ｐｈｅ）と５ＡＰ（Ｖａｌ）が 大きい方の前駆体蛋白から誘導されていることを示している０分子１７５００〜 ７８００ダルトンという現在量もよい概算値を基準にして図６のかっこ内に示し たヌクレオチド部がＳＡＰ　（Ｐｈｅ）のより大きい前駆体蛋白のうち７５〜８ ０の残留活性部分をコード化するものと考えられている。同様にＮＭＲ（ＮＯＥ ＳＹ−ＣＯＳＹ）の牛５ＡＰ（Ｖａｌ）の分析を基準にした場合Ｎ末端部をＩｌ ｅまたｃｒｙとして割り当てる従って、本技術に習熟している人々にとって５Ａ Ｐ（Ｖａｎ）または５ＡＰ（Ｐｈｅ）のいずれの発現がより大型の前駆体蛋白を コード化し、続いて更にこれらの蛋白の活性部分を分離する処理手順を踏むＤＮ Ａの発現を通して達成することができるのは、明らかなはずである。

代替法として、５ＡＰ（Ｖａｌ）あるいはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）蛋白を製造するも う１つの方法は、これらより大型の前駆体蛋白の一部分をコード化するＤＮＡの より小さな領域を発現させることであると本技術に習熟している人は認識する０ 例えば、図６のかっこ内に示したヌクレオチド６２７−８５１を包囲する部分は ７５アミド酸ポリペプチドの発現のために指定でき、このポリペプチドはＮＨ， 末端において５ＡＰ（Ｐｈｅ）と同族であり、かつ概略分子量は７５００ダルト ンである。

これもまた、本技術に習熟している人々にとっては明らかなことであるが、５Ａ Ｐ（Ｐｈｅ）または５ＡＰ（Ｖａｌ）をコード化する遺伝子あるいはこれらの遺 伝子の部分は化学的あるいは酵素の合成により作成することができる。さらに明 らかにすべき点として、これらの遺伝子あるいはその一部の削除、置換または追 加＠位体は本技術に習熟している人々によく知られた手法により作成することが できる。従って５ＡＰ（Ｖａｌ）またはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）染色体もしくはその 一部は、ゲノムあるいはｃＤＮＡライブラリから分離されているか、あるいは化 学的合成により作成されているかを問わず本発明の範囲によく入り、同時にこれ らの遺伝子の発現から生ずる蛋白質も同じくその範囲によく収まることを理解す べきである。

次に配列、即ちＮＨｔ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓ ｅｔ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−＾ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１ｅ−ＣＯＯＨを もつポリペプドを合成し、犬の５ＡＰ（Ｖａｌ）の初期１３ＮＨ！末端アミノ酸 残留分のレプリカを準備し、かつ潜在的なＩ！Ｓｌで標識化を考慮し、末端トリ オジン残留物を含めた。このポリペプチドをバラ二等のザ・ペプチド、叢、グロ ス等のｅｄｓ　、アカデミツク・プレス、ニューヨーク、１２８４（１９８０） に記載された一般的な要領に従って、逐次固相合成法（カルボキシ末端残留物で 開始）により樹脂製支持台上で構築した。　ＢＯＣ−Ｌ４１ｅ−ＯＣＨｔ−Ｐａ −樹脂を応用バイオシステム合成装置４３０角型上の反応容器に移した。

保護処理を施したアミノ酸をあらかじめ形成した対称無水化学法により樹脂の支 持台に結合した。ただしアルジニンを添加する場合は除いた。アルジニンの添加 に際してはＤＣＣ／）ＩＯＢＴプロトコル〔コニ−等、Ｃｈｅｗ、　Ｂｅｒ、、 　１０３．７８８−７９８（１９７０））を用いた。　ＮＨｚ末端残留物総てを もプチルロキシ・カルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）連鎖により保護を行い、各種アミノ 酸残留物の側鎖は次のグループで保護した。　Ｔｙｒ＋　２−Ｂｒ−ＺＨＣｙｓ ＋　４ＭｅＢｚｌ；　Ｓｓｒ＋　Ｂｚｌ＋、Ｌｙｓ＋２−ＣＩ−Ｚ、ならびにＡ ｒｇ＋　Ｔｏｓ。

前面的に保護処理を行ったペプチド樹脂（７９０ＩＩｇ）は５分間塩化メチレン （ＣＨｇＣｈ）内で膨張できるようにした。Ｎα−Ｂｏａ保護グループは６０χ 　トリデカンニ酸（ＴＦＡ）／Ｃ１ｈＣｈ保護除去、ＣＨｚＣｈ洗浄剤、１０χ 洗浄剤Ｎ、Ｎジイソプロビレチルアミン、（ＤＩＥＡ）／ＣＨＩＣ１ｇ中和なら びに最終的にｃＨ，ｃｔ、で洗浄を行う方法で除去した。樹脂は真空状態で乾燥 を行い、このようにして得たペプチド樹脂をｐクレゾール０．５ｍｆとｐチオク レゾール０．５ｇを０°Ｃ自由ペプチドと樹脂を１５ｓｊ！つづに分割したジエ チルエーテルで３回洗浄し、ペプチドを４０χ水性酢酸１５＋ｓｆを用いて３回 抽出法により抽出した。この水性抽出物を組み合せ、ジエチルエーテル１０ａ＋ ｆの分割量で３回洗浄し、その時点で水性層を凍結乾燥し、精製を行うため粗ポ リペプチドを準備した。

この粗ポリペプチドは、分析（Ｖｙｄａｃ−２１４−ＴＰ５４　、Ｖｙｄａｃセ パレーション・グループ、ヘスペリア、カリフォルニア）には流量１−ｌ７分あ るいは半調整（Ｖｙｄａｃ−２１４−ＴＰ５１０）は、流量３Ｉｌｌ／分で溶媒 系として０．１χＴＦＡ／水（Ａ）ならびに１００χアセチ−トリル（Ｂ）の傾 斜を用いて０４カラム上で逆相ＨＰＬＣにより精製した。

この傾斜は３０χＢで開始し、１分間に３０χＢまで落とす前に２０分間にわた り直線的に５５χＢまで増大した。

ポリペプチドの存在を監視し、２２５ｎ−と２８０ｎｓ＋と判明した。

このポリペプチドの成分は真空状態で２時間にわたり１５０°Ｃで６Ｎ塩酸（Ｈ Ｃｆｆｉ）１０．３χフエノール内で加水分解により確認し、かつ続いてベック マン６３００アミノ酸分析装置により分析した。

災茄■呈立 ５ＡＰ（Ｖａｌ）に基づくポＩ慟１ 次の配列、即ちＮＨｔ−Ｌｅｕ−１ｉｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−シ ミｌ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｖ ａ　１−Ｖａ　１−　Ｖａ　ｌ　−Ｖａ　ｌ−Ｖａ　１−　Ｖａｌ　−Ｖａ　１ −Ｃnｏ）ｌ を有するポリペプチドを合成し、牛５ＡＰ（Ｖａｌ）の初期２２　Ｎｏ、末端ア ミノ酸残基のレプリカを準備し、実施例１９の要領に従って構築、精製ならびに 分析を行った。ただし水性層は非常に濁り、かつエーテルによる洗浄中直ちにエ マルジョンを形成した。こに添加した。白色の粉状固形物が沈澱した。この固形 物を遠心分離処理した復水で３回洗浄し、かつエーテルで３回洗浄を行った。こ のようにして得た白色の粉状ポリペプチドを分析し、シリカ・カラム上で精製し た（パーティシル？Ｉ９１０１５０、ホワットマン、インコーホレイテッド、ク リフソン、ニュージャージ；　Ｖｙｄａｃ　Ｈ５５４）　、使用した溶媒傾斜系 は、０．１％　ＴＦＡノ）ｉ２０および１００χＣ）１３ｃＮ（Ｂ）であった。

災旌握主上 込玉ザ易グＵ茎」ヒしくポリづブチドｑ金虞次に配列ＮＨｚ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ− １１ｅ−Ｐｒｏ−］　］１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ　−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｃ ＯＯＨを存するポリペプチドを合成し、人ＳＡＰ　（Ｐｈｅ）の初％、ｕ１ｏ　 ｌ１ｌ（を末端アミノ酸残基のレプリカを？ｌ備した。ただし位置５において、 ＬｅｕではなくＩｌｅを選択した。

このペプチドは、実施例１９の一般的な方法に従って構築した。

この合成に使用した側鎖保護グループは、Ｔｒｐ　、　ＣＩ（０；　Ｔｙｒ　。

２−Ｂｒ−Ｚ　；　Ｃｙｓ、　４−ＭｅＢｚｌであった。充分に保護処理をした ペプチド樹脂（６１０ｍｇ）は５分間ＣＨｔｉ、内で膨張できるようにした後Ｎ α−ＤＯＣグループを実施例１９で説明したように除去した。

乾燥処理済のペプチド樹脂を無水ＨＦ（２，５ｍｊ２）；　Ｐクレゾール（０， ５ｍｊり　；チオクレゾール（０，５ｇ）　；　硫化ジメチール（ＤＭＳ）（６ ，５ｍｆ）の混合物を用い０°Ｃで６０分間処理を行った。　ＤＭＳと１（Ｆは ０°Ｃで真空状態で蒸留させた。新しい無水ＨＦ９ｍ　１．を０°Ｃで反応容器 内に蟇留した後０°Ｃでさらに６０分間撹拌した。この）ＩＦを０℃で真空状態 で蒸留した。開裂状態の自由ペプチドと樹脂２０分かけて直線的に増大する以外 は前に説明したのと同様に分析し、逆相ＨＰＬＣ上で精製した。その後これを１ 分間で２５χＢに戻した。精製処理済のペプチドは、既に説明し１このと同様に アミノ酸成分の分析を行った。

叉斑拠２２ ＳＡＰ（Ｐｈｅ）のＤＮＡ６１の　３に　づ　ポリペプチドのへ次の配列 ＮＨ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔ ｒｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａ　Ｉａ−Ｌｅｕ−ｌｉｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ− ＋　１ｅ−Ｇ　ｌｎ−Ａ　ｌａ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｙ− Ａ　Ｉａ　−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａ　ｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｖ ａｌ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ａ　Ｉａ −Ｇ　Ｉｙ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ− Ｇ　ｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｖａ　ｌ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓ ｐ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ。

を有するポリペプチドを合成し、図６に示したＤＮＡ配列の一部の翻訳に基づき 、またさらに５ＡＰ（Ｐｈｅ）の近偵分子量に基づいて人ＳＡＰ　（Ｐｈｅ）の ＮＨｔ末端部におけるＳＡＰ　（Ｐｈｅ）に同族のレプリカを準備した。この充 分に保護処理をしたポリペプチドは、実施例１９で説明したように逐次固相合成 （カルボキシル末端残基で開始）により樹脂製支持台上に構築した。ＢＯＣ−Ｌ −Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−０ＣＨｚ−Ｐａｍ樹脂を反応容器に移した。次のアミノ酸 ９を既に説明したように標準連結プロトコルに従って逐次連結させた。ただし二 重連結プロトコルをアミノ酸Ｌｅｕ　、　ｌｉｅ　、Ｖａｌ用に使用した。

デカペプチド樹脂（残留物５ｌ−６０）が構築された後、ペプチド樹脂を少量取 り出しサリン等のハ旦ム旦虹」圏並叩、、　１１７．１４７−１５７（１９８１ ）による定量的ニンヒドリン分析を行った。この樹脂逐次合成を次に残りのデカ ペプチド樹脂に関し二重連結プロトコルを用いて継続した。最初の連結において 保護処理をし″たアミノ酸は０ＡＰ内に入れたあらかじめ形成済の対称無水化物 と連結した。２番目の対称無水化物の連結はＣＬＣＬ内で実施した。アミノ酸グ ルタミンは上記のＤＣＣ／ＨＯＢＴプロトコルを用いて連結した０位置２１に於 けるメチオニンの取込み後、インドール（１２、Ｗ／Ｖ）とエタネテイチオール （０，１Ｘ　、Ｖ／Ｖ）をＴＦＡ　ニ添加した。その後Ｎα−ＢＯＣ保護グルー プを除去する作業総てに使用したのがこの修飾溶液であった０合成を終了する時 点で乾燥処理済のペプチド樹脂の重量は２．７２ｇであった。各種アミノ酸残留 の側鎖機能グループは、次のグループで保護した；　Ｔｙｒ　、２Ｂｒ−Ｚ　； 　Ｃｙｓ　、　４ＭｅＢｚｌ；　Ｓｅｒ　、　Ｂｚｌ　；　Ｔｈｒ　、　ＢｚＩ 　；　Ａｓｐ　；　０Ｂｚｌ　；Ｇｌｕ　、　０Ｂｚｌ　；　Ｌｙｓ、、２Ｃ１ −Ｚ　；　Ａｒｇ　５ＴＯＢ樹脂支持台上の構築済ペプチド配列の一体性につい ては気体相シークエンサにより固相配列決定により検証した〔サリン等、紅Ｕ旦 紅虹」江妨堕、、　１５４．５４２−５５１（１９８６）　）　、配列決定運転 を２９回まで実施し、平均予見１ステップ当り０．５〜０．８１で構築済のペプ チド連鎖の配列を確認した。この配列決定の結果は、また位置１７と１８で各々 アルギニンとイソレクチンの連結に問題があることを示したが構築した連鎖の大 部分には期待された配列が含まれていた。

充分保護したペプチド樹脂（６１０ｍｇ）を５分間ＣＨｚＣ１ｚ内で膨張させた 。Ｎα−ＢＯＣ保護グループは、実施例１９で既に説明したよう、に１χインド ールと０．１χＥＤＴを含むＴＦＡを用いて除去した。

ペプチド樹脂をその後０°Ｃで６０分間ｐクレゾール１．０＊ｊ！、　ＤＭＳＴ ＦＡを用いてペプチドを抽出し、その後実施例２０で説明したように白色の固型 物として沈降させた。このようにして得た粗ペプチドを既に説明したように溶剤 として０．１χＴＦＡ／水および１００χアセトニトリルを用いてＣ４カラム（ Ｖｙｄａｃ−２１４−ＴＰ５４）上で逆相ＨＰＬＣにより分析し、精製した。た だし、調整上の目的で採用したカラムはＶｙｄａｃ−２１４−ＴＰＬＯ２２で、 流蓋は毎分１２ｍｊ！であった。

傾斜は４０χＢで開始し、５分後に２０分かけて８５χまで直線的に増大した。

この傾斜を次↓こ２分間で４０χまで減少した。

ペプチドの存在はこれを監視し、２２５ｍｍと２８０１１Ｉ１１を確認した。

精製したペプチドの組成は真空状態で４時間、１５０°Ｃで酸化水分解（１２Ｎ 　ＨＣＬ’ＴＦＡ、　２　：　１．５χチオグリコ−リンク酸）により測定した 後、ベックマン６３００アミノ酸分析装置により分析した。

この合成中、樹脂の標本をアミノ酸位置４０　（３４６＋ｍｇ乾燥）と２２　（ ５００ｍｇ乾燥）で採取した。これらの２つのペプチド樹脂標本は残基が２１（ 残基４０〜６０）および３９（残基２２〜６０）の中間ペプチドを出した。

ここに示した配列に基づく他のペプチドは本技術に習熟した人々にとって既知の 方法により合成を行いかつ試験を行うことができる０例えば、ここで開示したハ イドロパシシティプロフィールに基づく配列をもったペプチドならびに５ＡＰ（ Ｐｈｅ）あるいは５ＡＰ（Ｖａｌ）の二次的あるいは三次的構造に基づくペプチ ドはここに一般的に述べた活量に関し合成を行い、試験を行うことができる。

充分に保護処理をしたペプチド樹脂を実施例１９〜２２に説明したとうりステッ プ毎の個相合成法により樹脂支持台上で構築した。　Ｂｏａ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＣ Ｈ２−ＰａＩＩ＋樹脂を反応容器に移した。

次の２８アミノ酸をアミノ酸ｌｉｅとＶａｌを除き、既に説明した標準単一連結 プロトコルに従って連結処理を施した。アミノ酸１１ｅとＶａｌ　は二重連結プ ロトコルを採用した０位置４７におけるメチオンニンの取込みを行った後、イン ドール（１χ、Ｗ／Ｖ）とエタンエディチオール（０，２５χ、ν／Ｖ）をＰＦ Ａに添加した。Ｎα−ＢＯＣ保護グループをその後除去する作業総てに用いたの がこの修飾溶液である。２８残基ペプチドを構築した後、樹脂０．６６ｇを取り 出した。

逐次合成は、実施例２２に説明した合成全期間を通じて二重連結プロトコルを用 いてペプチド樹脂の残りに関しその後継続した。このペプチド樹脂の少量を再び 位置１９にアミノ酸Ｖａｌを取り込んだ後取り出した０合成の終了時における乾 燥ペプチド樹脂の重量は２．５３ｇであった。この合成においてメチオニンを保 護しない状態で使用した。ただし、硫化物として保護した形式でも使用できる。

各種アミノ酸の側鎖機能は既に述べたように保護処理を行った。アミノ酸旧Ｓの 処理はＴｏｓｙｌグループにより行った。樹脂上に構築済のペプチド配列の一体 性については、既に説明したように固相配列決定法によって点検した。

開裂状態のペプチドと樹脂をゲルチルエーテルで３回洗浄した後、ペプチドを４ ０χ水性酢酸１ｋｆｆｉＸ５で抽出した。この水性抽出物を連結乾燥して粗ペプ チドを作った。これを分析し、溶媒系として０．１χＴＦＡ／水と１０ｏｚアセ トンドライド（ａｃｅｔｏｎｔｒｉｄｅ）を用いてＣ４カラム（Ｄ−０４−１０ １０、Ｌｏｔ−３７１００、ブラウンリ研究所、サンタクララ、カリフォルニア ）上で逆相ＨＰＬＣにより精製した。粗ペプチドをコラム上で射出する前に約７ ５χの水性ＴＦＡに溶解した。流量は毎分３ｍｊ２．傾斜は１０χＢで開始した 。１分後この傾斜を２０分かけて９０２Ｂまで増大した後、１分間で１ｏχＢま で減少した。

ペプチドの存在監視結果は２２５ｎｍと２５４ｒ＋ｓ＋であった。精製処理済の ペプチドの組成は、密封したチューブ内で真空状態において４．８．２４．４８ 時間１５０″Ｃで酸加水分解（１２Ｎ　ＨＣｎ　：　ＴＦＡ、２：１）により測 定し、つづいてヘックマン６３００アミノ酸分析装置上で分析を行った。

２旌±又土 本発明による下記のポリペプチドは、実施例１９〜２３に全般的に説明したとこ ろよる手順に従って合成を行うことができる。

ＳＡＰ　Ｖａｌ（１−３１）　の八 本発明による下記のペプチド、大ＳＡＰ　（Ｖａ［１−３１）　］は下記この合 成は、実施例２３で全般的に説明したとうりの方法で実上記のポリペプチドは、 他の実施例のポリペプチドについて説明した通り、を用な界面活性剤としての属 性を有している可能性がある。

２施■又工 ５ＡＰ（Ｐｈｅ入　ペプチド 本発明による下記のポリペプドは、実施例２３に一全般的に説明したところによ る手順に従って合成できる。

上記のポリペプチドは、他の実施例のポリペプチドに関して説明したように有用 な界面活性剤としての属性を有する可能性がある。

ス１」ＬＬ団 ５ＡＰ（Ｖａｌ）ないしは５ＡＰ（Ｐｈｅ）　クローン−の−！Ｉ告５ＡＰ（Ｖ ａｌ）ないしはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）のもう１有用性は抗体あるいは免疫血清の調 整にある。

これらの抗体あるいは免疫血清を次に５ＡＰ（Ｖａｌ）ないしＳＡＰ　（Ｐｈｅ ）の検出、測定あるいは精製のために使用できる０例えば、抗体および免疫血清 を用いて抗原プロット免疫反応検出ならびにＥＬＩＳＡ分析、免疫学的検出なら びに定量化、その他色疫学的検定に使用することができる。免疫学的方法による ５ＡＰ（Ｖａｌ）ないしはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）の検出ならびに測定もまた診断上 重要である。

５ＡＰ（Ｖａｌ）ないしはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）抗体および免疫血清の取得は次の ように行った。実施例１で説明したように取得した生柿洗浄物吐出物を抽出し実 施例２で説明した通り、精製した後乾燥してエタノールに再懸濁した。この懸濁 は、フロイアントの完全アジュバントと１：１で混合し、白皮症のラビットに注 射した。

これらのラビットは離れた部位４個所に注射を行い、３セツトの注射を行った後 有用な免疫血清が得られた。注射に使用した生柿洗浄吐出物は５ＡＰ（Ｖａｌ） ないしはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）のモノマを含み、かつ−次元的５Ｏ３−ＰＡＧＥの 後、銀染色分析により評価した５ＡＰ（Ｖａｌ）ないしは５ＡＰ（Ｐｈｅ）の多 量体を少量含んでいた。所望の場ス、１ＬＬ７− ５ＡＰ（Ｖａｌ）ないしは５ＡＰ（Ｐｈｅ）に・ｔ６巣？　ｌ：ｌニア　折体Ｏ ”’Ｉ’５ＳＡＰ　（Ｖａｌ）ないしはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）蛋白に対抗する単ク ローン抗体の製造に関し、分ＭＳＡＰ（Ｖａｌ）ないしは５ＡＰ（Ｐｈｅ）によ り免疫処置を施したマウスからとったリンパ球をコーラとミルスタイン、Ｎａｔ ｕｒｅ、　２５６．４９５−４９７（１９７５）の手法に全体的に従って、例え ば、ポリエチレン・グリコールが存在する状態でマウスの骨髄腫細胞を融合させ ることができる。この手法については、本書内では参考のために取り入れる。そ の後、生き残っている雑種（ハイブリット）を固相エライザ（ＥＬＩＳＡ）によ り選抜し、抗５ＡＰ（Ｖａｌ）あるいは抗５ＡＰ（Ｐｈｅ）またはＳＡＰ　（Ｖ ａｌ）および５ＡＰ（Ｐｈｅ）に反応する抗体交雑種を作る細胞のみを得た。こ れらのＭＡｂｓは、例えば組織試料における５ＡＰ（Ｖａｌ）ないしはＳＡＰ　 （Ｐｈｅ）の検出のための免疫検定手法に採用することができる。このような抗 体は、５ＡＰ（Ｖａｌ）もしくは５ＡＰ（Ｐｈｅ）を混合物に結合、あるいは、 これらを混合物から沈降させる場合、ないしは５ＡＰ（Ｖａｔ）もしくは５ＡＰ （Ｐｈｅ）の沈澱速度を速める。またはゲル濾過の際に５ＡＰ（Ｖａｌ）ないし は５ＡＰ（Ｐｈｅ）の溶出特性を修飾する場合及び、５ＡＰ（Ｖａｌ）ないしは ５ＡＰ（Ｐｈｅ）をある標本から識別もしくは定量化することができる。

スｆｌ 鎚ムハＵ土書μＭバカ凪澄栽ペプチドに・　る　クローン生製這 多クローン抗体は、実施例１９〜２１に説明した５ＡＰ（Ｖａｌ）ならびン法を 用い直接注射するか、もしくはまず初めにキーホール・リンペット・ヘモシアニ ン（ＫＬＨ）（カルビオケム）と連結させたペプチドは１：１でフロイアントの 完全アジュバントと組合せ約２週間間隔で３回モルモットまたは白皮痘うビ、ト に注射した。最初の注射にはＫＬＨを入れたが、その後の注射には入れていない 。

蛋白約ｌａｇをその都度注射した。３回目の注射で有用な滴定量を得たが、非連 結ベプチ、ドを用いて上昇を続けた。人合成５ＡＰ（（Ｐｈｅ）　（１〜６０） 　）に対し飼育した抗体を用いてＳＡＰ　（Ｐｈｅ）蛋白の識別、分離ならびに 精製を行うことができ、また当然診断を目的として使用できる。

犬嵐例且 ５ＡＰ（Ｖａｌ）と５ＡＰ（Ｐｈｅ）体の診断にｒする　１．５ＡＰ（Ｖａｔ） とＳＡＰ　（Ｐｈｅ）は通常は、例えば肺の組織、肺洗浄や羊水のような一部動 物の組織内に見られるため５ＡＰ（Ｖａｌ）ないしはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）の定量 的または定質的計測を診断、監視あるいは予後経過の手段としても利用できる。

ある条件下では、例えば）ＩＭＯ２ＡＲＤＳ、その他肺胞界面活性物質の不足に 伴うその他の症候部の状態においてＳＡＰ　（Ｖａｌ）ないしは５ＡＰ（Ｐｈｅ ）は、利害のあるＩＪＩ織には現われない、あるいはそのような組織に濃度が変 った状態で現われるものである０例えば、図１７に示したようにＳＡＰ　（Ｐｈ ｅ）　−５ＡＰ（Ｖａｌ）のレベルは競合するＥＬＩＳＡ内の実施例５のアンチ プロテオリビド多クローン免疫血清を用いてさまざまな妊娠期間で得た人の羊水 で概算されており、相対的な活量は幼児の肺の成熟時期と相関関係があるように 思われる。

スＷ止 のＳＡＰ　Ｖａｌ（１〜４１） 本発明による下記のポリペプチドは、実施例２３に概要を説明したところによる 要領に従って合成できる。

Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａ　ｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ −Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ −Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｖａｌ −Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ −３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ　。

のＳＡＰ　Ｖａｌ（１２〜３１） Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１ｉｅ−シａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ− Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−Ａｌａ− Ｌｅｕ−ＬｅｕのＳＡＰ　Ｖａｌ（２１〜４１） 上記のポリペプチドは、他の実施例のポリペプチドについて説明したように有用 な界面活性物質の属性を有している可能性がある。

ｌ１」し」工 活性蛋白人５ＡＰ（Ｖａｌ）ならびにＳＡＰ　（Ｐｈｅ）をより大型の前駆体蛋 白から誘導している。これらの活性蛋白の前駆体部から配列に該当する一部のペ プチドは、−ｉに実施例２３に説明した手順によって合成できる。下記の前駆体 ペプチドは既に合成済みである。

ＳＡＰ　Ｖａｌ　（−２３〜−１） Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−シａｌ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ− Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ａ　ｌａ−Ａ　１ ａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｒｇ−ＰｈｅＳＡＰ　Ｐｈｅ　（−５７〜 −２９） Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐｒｏ−Ｇ　１　ｕ− Ｇｌｎ−Ｇ　ｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−３ｅｒ−＾ｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ −Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ −Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＬｅｕＳＡＰ　Ｐｈｅ　（−２８〜−１） Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａ　Ｌ　Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａ　Ｉ−Ｌｅ ｕ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａ　Ｉａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ −Ｇ　１ｙ−Ｐｒｏ−Ｈｔｓ−Ｔｈｒ−Ｇ　ｌｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｇ ｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ 上記のポリペプチドは、前駆体あるいは活性蛋白を意識する、あるいはその一部 を認識するための抗体発生に利用でき、かつ界面活性物質の活量を得ることがで きる。

災旌±工呈 白　ヒ　°ム体の器　と量 ＳＡＰ　（Ｖａｌ）あるいはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）が単量体か多量体の形、あるい は動物組織から分離されているか、もしくは組換えＤＮＡ法、または人、その他 の動物ヌクレオチドまたアミノ酸配列に基づく直接ペプチド合成によるかを問わ ず脂質と混合する場合、その界面活性物質に類似した活量はその混合体の有意な 肺の生物物理学的界面活性物質の活量に対し分与すると考えられている。こ少あ るいは維持するために自然の肺胞界面活性物質を置換もしくは補足するのに非常 に有用である。

５ＡＰ（Ｖａｌ）もしくは５ＡＰ（Ｐｈｅ）や脂質からなる医薬品用に標品を作 成する場合、分離した５ＡＰ（Ｖａｌ）ないしはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）は脂質によ る再構成に先たち約−３０℃の窒素もしくは空気の下でクロロフォルム内に貯蔵 できる。標品の作成はアルコール類を用いて行うことができる。脂質はこれらの 標品内に使用する場合、中性、その他の脂質ならびにリン脂質を含めて多数の適 切なリン脂質、例えばファスファチジルユリン、不飽和化フォスファチジルコリ ン、フォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、 ファスファチジルリノトールやその混合物、コレステロール、あるいはコレステ ロールエステルやその混合物等のようなリン脂質から誘導することができる。

例えば、精製処理済みの５ＡＰ（Ｖａｌ）ないしはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）を、例え ば約６５χのジパルミトイルフォアチジルコリン、約フォスファチジルグリセロ ールや約１０χのパルミチン酸のような合成リン脂質と約０．１〜約２．０χΦ 量混合することができる。所望の場合この混合物をさらに約０．５〜約１　、５ ｆｆｉＭ塩化カルシウム、その他の適切な医薬品的に受け入れられている担体の 有無にががゎらない０．９χ塩化ナトリウムからなる生理学的緩衝液を含むこと ができる。再構築もしくは混合後、この物質は音波処理あるいは渦流処理を行い 、かつウェルヘルム台秤、その他の表面張力測定装置で表面張力低下能力や吸着 の試験を行うことができる。

吸着に関する研究はノック等、Ω叩工肚■２■旺並、　３３．６７−８０　（１ ９８３）ならびにロス等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２１６　１４２８ ４−１４２９１（１９８６）等が開示している方法によっても行うことができる 。この標品は、本技術に習熟している人にとって明らかな方法により調整するこ とができる。ニー等、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈカ１」■」仇戸工紅田、、ユ邦、　３７ −４７　（１９８４）　；　たなが等、ム」江旦」並、、工４７５−４８５　（ １９８６）　；　ノック等、Ｐｅｄ、　Ｒｅｓ、、　１６．５１５−′５ｉ１９ 　（１９８２）：　レバツク等、ハ、ム」照吐ム」圏、、　１３４．１２５８− １２６５　（１９８６）ならびにすずき等、ｈムム」並剋ム」圏、、」扛３３６ −３４５　（１９８６）により説明されているのと類似した各種の方法を用いて 脂質、脂肪酸、グリセロール誘導体、コレステロールあるいは１価または２価金 属イオン塩付きのコレステロール・エステルの混合物を調整できる。

本技術に習熟している人にとって明らかなこととしてさまざまな処方を適切な活 性界面活性物質を調整するために、蛋白質あるいはペプチドとの組合せでリン脂 質、脂質、脂肪酸、トリグリセリド、ヂグリセリド、金属塩、中性脂肪クラス等 からの成分を用いて作成することができる。例えば適切な混合物が４０〜７５Ｘ ジパルミトイルフオスフアチジルコリン、Ｏ〜４ｏχフォスファチジル、グリセ ロール、０〜５χコレステロール、０〜１０χバルミチン酸や０〜１０χ　トリ パルミチン酸に０．１〜１ｏχ５ＡＰ（Ｖａｌ）またはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）蛋白 質またはペプチドを加えたものから構成することができる。このような混合物の 調整は、蛋白質またはペプチドならびに選択した脂質クラスを適切な溶媒内で溶 解し、これら各種溶液を適切な比率で混合し、溶媒を蒸発させて結果として生じ た混合物をできれば単価または２価金属イオン、例えばナトリウムあるいはカル シウム等の塩化塩を用いて整理学的な状態に適切に緩衝処理した水性媒体内に分 散することによって完成できる。

−ル（２：１〜５：１）、ギ酸（５０〜８８χ）、トリフルオロアセチインク（ 水内で２５〜１００χ）、ジメチル、フォルムアミドあるいはジメチルスルフオ キシドの中で溶解し、必要なリン脂質、脂質、脂肪酸、トリグリセリド、ジグリ セリド、コレステロールとそのエステル等と混合し、これを適切な時間ならびに 温度条件下で上記の説明のとうり適切な溶媒内で溶解した後、真空状態または、 例えば窒素のような「不活性」ガスのいずれかで３５〜７５℃に温ためることに よ、り溶媒を蒸発させる。残った蛋白脂質混合物を次に可変速度式渦流ミキサま たは超音波浴（ブランリン・ウルトラソニック・クリーナ、Ｂ３２型、ジェルト ン、コネチカット）内で概略生理的な濃度の１価または２価金属塩、例えば０． ９χ塩化ナトリウムないしは１．５ａｌｌ塩化カルシウムを均一に分散させる目 的で含む水性媒体内で撹拌して分散させる。

界面活性ペプチドの生物理学的試験の一方法において、約６８χジパルミトイル フアスフアチジルコリン（ＤＰＰＣ）、約２２χフオフフアチジルグリセロール ならびに約１０１パルミチン酸を含むリン脂質混合物を脱脂処理したＳＡＰ　（ Ｖａｌ）もしくは５ＡＰ（Ｐｈｅ）と組み合せ、ウェルヘルム台秤で試験を行う 、　５ＡＰ（Ｖａｎ）もしくは５ＡＰ（Ｐｈｅ）リン脂質混合物は表面張力を５ ダイン／　ｃｄ未満に減少させ、急速に吸着されてリン脂質混合物よりもより活 性があることが判明している。

本発明による５ＡＰ（Ｖａｌ）ないしは５ＡＰ（Ｐｈｅ）は自然に発生する蛋白 質またはその一時変異、あるいは説明したペプチドまたはその一時変異に基づく か否かを問わず有用な「界面活性物質様」あるいは「界面活性関連」活量を持つ と考えられている。ここで使用するかぎりにおいて「界面活性物質様」あるいは 「界面は空気と液体のインターフェース部において表面張力の緩和を行う能力を いい、５ＡＰ（Ｖａｔ）ないしはＳＡＰ　（Ｐｈｅ）が単量体が多量体かの形式 を問わず、あるいは動物組織から分離されているが、あるいは組換えＤＮＡ法に よるかもしくは直接ペプチド合成によって作るかを問わず脂質と混合した場合、 その界面活性物質様もしく°は界面活性関連活量が混合物の有意生物物理学的界 面活性活量に分与するものと考えられている。

このような活量を有する混合物は、肺、特にＩＩＭＤや自然の肺胞界面活性物質 の欠如または量の不足に関連して起るその他の症候群に罹患している動物の肺内 における正常な表面張力の緩和もしくは維持のために自然な肺胞界面活性物質を 置換ないしは補足するうえで非常に有用である。

適切な界面活性物質の標品の基本的な特性は、当該表面活性物質がサブフェイズ から流体空気インターフェースまでの間に吸着し、かつ表面積の力学的圧縮およ び拡大のもとで当該インターフェース上で表面張力を緩和する能力のあることで ある。

力学的条件下における表面張力の一般的な測定方法は、バルセイティング・バブ ル・サーフアクトメータ（ＰＢＳ）　（エンホーニング、ム」肚、ハ…ｉｏ１． ４３．１９８−２０３　（１９７７）　）であり、また改造ウィルヘルミサーフ ェース・バランス（ＷＳＢ）　［ノック、固］’１１詠！、Ｃｈ、　２　、ロバ ートリフ等、ｅｄｓ　、エルサイバ、オランダ（１９８４）　）の使用による。

いずれの方法も出る情報は類似しているが、改造ＷＳＢは界面活性物質の行動を より詳細に示してくれる。明記した実験条件下における表面張力の実質的な現象 は適切な生体内治世にとっ生物物理学的活量を実証する物質の混合に使用される 特殊な条件は次のとうりである。

固相合成により調整した実施例２２０人５ＡＰ（Ｐｈｅ）蛋白質２．５ｍｇを濃 度０．２蒙ｇｅｍ　１０株溶液を準備するに足りるクロロフォルム内で溶かし、 ジパルミトイルフオスファチジルコリン２５（１ｍｇ　（シグマ・ケミカル・カ ンパニ）を濃度５０ＩＩｇ／−１，の株ン容量を準備するのに足りるクロロフォ ルム：メタノール＜２：１）内で溶解し、クロロフォルム濃度１０ＩＩＩｇ／１ ｍｌのフオスファチジル・グリセロール（シグマ・ケミカル・カンパニ）を直接 使用し、コレステロール（シグマ・ケミカル・カンパニ）１２．５１１Ｉｇを濃 度０．２ｍｇ７ｍ　ｌの株溶液をＹＩＬ備するのに足りるクロロフォルム内で溶 かし、パルミチン酸（シグマ・ケミカル・カンパニ）　３３ｍｇを濃度３．３ｍ ｇ／ｍｌＯ株ン容液を＄備するのに足りる量のクロロフオ）レム：メタノール（ ２：１）内で溶かし、かつトリパルミチン（シグマ・ケミ力）Ｌｔ−カンパニ） ３３＋ＩＩｇ／ＩＩＩＶ、を濃度３．３ｍｇ／ｍ　１２の株溶液を準備するのに 足りるクロロフォルム；メタノール（２：１）内で溶解した。

その後、蛋白株溶液（蛋白ｔｏ、２５ｍｇ）／ｍ　ｌならびにフオスファチジチ ル・グリセロール株溶液０．６３ＩＩＩ！（フオスファチジチル・グリセロール ６．３ｍｇ）をフラスコ内で混合し、１時間４５°Ｃに温ため室温まで冷却した 後、ジパルミトイルフオスファチジルコリン株溶液０．３１ａｊ！　（ジパルミ トイルフオスファチジルコリン１５．５ｍｇ）　、コレステロール株溶液０．４ ｓｆｆｉ　（コレステロール０．１ｍｇ）、パルミチック酸株溶液０．４２ｍ　 ｌ　（ハルミチック酸１．４ｍｇ）ならびにトリバルミチン株溶液０．４２Ｉｌ Ｎ（トリパルミチン１．４ａ＋ｇ）を蛋白フォスファチジル・グリセロール溶液 混合物に添加し、可変速度渦流ミキサ上で３０〜６０秒軽く混合し、溶媒の痕加 し、結果として生ずる混合物を可変速度渦流ミキサ上で約１分間混合し、エタノ ールを４５°Ｃで真空状態で蒸発させ、その復水０．５〜１幣ｌを加えて真空状 Ｂ４５°Ｃで蒸発をつづける。結果として生ずる混合物を１ｍｇ分散できるだけ の０．９χ塩化ナトリウム溶液内で分散させる。この材料を１．３分間渦流によ り、かつ１〜５分間４０〜４５°Ｃの超音波浴を用いて均一に分散する０本技術 に習熟している物にとって明らかなことであるが、各種分散条件を用いて均一な 分散を行うことができる。

生分離蛋白を脂質と混合する同様の方法を用いて蛋白分離物をクロロフォルムま たはクロロフォルム／エタノール（２：１）　溶液のいずれかにおいて溶解した 。

表４のデータは、また他の蛋白質ならびにポリペプチドに間する同様の混合物内 での研究結果を示している。一部の蛋白質またはポリペプチドで調整した混合物 は他のもので調整したのに比べてそれ程力学的な表面張力の緩和は示していない が、本技術に習熟している者にとって明らかなこととしてその原因は、蛋白質ま たはポリペプチドの特性にあるのではなく、脂質の混合比率を正確に精製するこ とが相対的に不足しており、かつ混合条件に可変要素があるため当然である。脂 質の組成に対し変更を行った場合、同じ蛋白質またはポリペプチドを用いた力学 的表面張力の緩和の結果は大きく改善されることが、本技術に習熟している者に とって明らかである。脂質の組成、混合上の可変要素、蛋白質の濃度等を改善し た時点で、本発明で開示される蛋白質ならびにポリペプチドは総て適切な活量を 実証していると信じられる。

界面活性物質混合物に関し表４に示したデータは、改造−ＢＳｄ当り約１．５マ イクログラムのフェスフォリビド混合物を添加しながら、約１回３分で２．５倍 の表面積に拡大し、圧縮した。゛典型的には、数回これを行った後、最も小さい 表面張力が１０ダイン／　ｃｉ以下になることは然るべく性能を発揮している表 面活性物質の分散について観察される。さらに表面張力の最大値はｄ当り４５ダ イン未満になり、表面活性物質がｃｄ当り１０ダインの表面張力を示すパーセン ト面積は６０％以上の拡大になる。

表４に示した吸着データはノック等、Ｃｈｅｗ、　Ｐｈ　ｓ、　Ｌｉ　ｉｄｓ。

３３、６７−８０　（１９８３）の方法に類似した方法で得た。電子台秤、セン サ・プレートならびにインキュベータは、改造−ＳＢのものを使用した。　０． ９２塩化ナトリウム溶液のサブフェーズを撹拌し、サブフェーズ溶液量で希釈し た混合標品的５Ｂを添加した０表面張力は混合物がサブフェーズ表面に吸着する 時間に合せて連・続して監視した。典型的には吸着測定値は１０分〜２０分以内 で、表面張力が３５ダイン／１を出しているが、これは有用な界面活性物質であ ることを示している。

表４において：　ＤＰＰＣ：　ＰＧ　：　＋　−ＤＰＰＣＨＰＧ　；　ＰＡ・６ ８　；　２２；　１０　、　ＤＰＰＣ、ＰＧ　、　”　Ａ　＝　ｎｐｐｃ　、　 ＰＧ　、　ＣＨＯＬＥＳＴＥＲＯＬ　、　ＰＡ　。

ＴＰ　’＋　６２．７　、２５．５　；　０．４　；　５．７　；　５．７　、 ならびにＤＰＰＣ；　ＰＧ　：　”Ｂ　＝　ＤＰＰＣ、ＰＧ　、　Ｃｌ０ＬＥＳ ＴＥＩＩＩＯＬ　、　ＰＡ　、　ＴＰ　＝５６．６　；　４１．６　；　０．６ 　、０．６　、０．６　、また表４においてＳＡＰ　（Ｐｈｅ）ｔ＝　６０　ｔ ａｅｒ　（実施例２２に説明した通り）固相合成、５ＡＰ（Ｖａｎ）　＝６０ａ ｖｅｒ（実施例２３に説明した通り）固相合成、ＳＡＰ　［Ｐｈｅ　（２１）） 　□２１　＠ｓｒ　（実施例２２で説明した通り）固相合成、ＳＡＰ　（Ｐｈｅ （３９））＝　３９　ｍａｒ　（実施例２２で説明した通り）固相合成、ＳＡＰ 　（Ｖａｌ（２０））＝　２０　ｓｅｔ　（実施例３０で説明した通り）固相合 成、ＳＡＰ　（Ｖａｌ（２２））質（実施例１〜２で説明した通り）、さらに表 ４においてＤＰＰＣ＝ジパルミトイルフォスファチジルコリン（Ｄｉｐａｌｍｉ ｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ　Ｃｈｏｌｉｎｅ）　；ＰＧ　＝フォスファ チジルグリセロール（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ　Ｇｌｙｃｅｒｏ＋）　：ＰＡ 　＝パルミチン酸　（Ｐａｌｍｉｔｉｃ　ａｃｉｄ）　；ＴＰ＝）リバルミチン （Ｔｒｉｐａｌｍｉｔｉｎ）　。

表１は、蛋白質またはペプチドを脂質混合物に適切に添加することにより吸着な らびに力学的表面張力の線図の特徴がその個別の成分の脂質混合物に比べて大き く変化していることを示している。これは表４に示した合成ペプチドについては 勿論、蛋白質分離物についても実証されている。

叉崖烈主盈 ヒトロバシイ・プロファイル ヒトロバシイ分析は、カイトおよびトウーリトル〔ハインバーグ等、Ａｎａｌ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋旦ムロー１３　（１９８３））の要領に従って５ＡＰ（Ｖ ａｌ）の全体的な予測アミノ酸配列に関し行い、その結果を図１８に示した。疎 水性は残留数Ｍｅｔ、からＣ末端１１ｅ＋ｑｔまでの係数として作図しである。

疎水性と疎水領域を示す値は、水平点線で示したように各々０．５を上下してい る。

５ＡＰ（’Ｖａｌ）ならびにＳＡＰ　（Ｐｈｅ）のヒトロバシイ図は、一般的な いくつかの機能を示しており、５ＡＰ（Ｖａｎ）とＳＡＰ　（Ｐｈｅ）のＮ末端 第１アミノ酸配列間に構造上の類似性が見られる。バリンが豊富な個所における ２つのペプチド間の相違の一部は単一ヌクレオチド配列の変化によって説明でき 、これらの界面活性ペプチド間に密接な関係があることを示している。興味深い のは５ＡＰ（Ｖａｌ）と５ＡＰ（Ｐｈｅ）の疎水領域のみが構造上類似している ことである。

アミノ酸またはヌクレオチドの配列にはほとんど、あるいは全く相同性が見られ ず、「活性」疎水性の優勢を示している。

５ＡＰ（Ｖａｌ）とＳＡＰ　（Ｐｈｅ）の両方の構造は、それらの蛋白質が表面 活性物質のリン脂質と疎水性の相互作用を支えており、従ってこにはっきりした 疎水性が見られることは、プロテオリピドと古典的に言われているものとの類似 した属性であり、かつ豚、ラット、牛の界面活性物質における疎水性蛋白質のこ れ迄の説明と一致している。疎水性界面活性蛋白ｆ標品を広範囲に透析した結果 、残留リン脂質がほとんどない蛋白質となっているが、共有結合リン脂質がこの 蛋白質と関連しているか否かは未だ充分に解明されていない０本発明による５Ａ Ｐ（Ｖａｔ）アミノ酸配列データを用いて作成したヒトロバシイ作図によりアナ ログのヒトロバシイ作図が実質的には図６に示したものと類似していること根拠 として５ＡＰ（Ｖａｌ）の置換、削除さらびに追加のアナログを選択することが できると考えられる。

実差Ｍ主↓ 細胞タイプ■ならびに３Ｔ３が脂質の取込みに与える影響についてＳＡＰ　［Ｐ ｈｅ　（１〜６０）　）　（実施例２２に説明した通り）　、５ＡＰ（Ｐｈｅ（ ４０〜６０）　）　（実施例２２で説明した通り）　、５ＡＰ（Ｖａｌ）分離物 （実施例１〜２で説明した通り）に関し検討した。

タイプ■の細胞ならびに二次融合３Ｔ３細胞をリン脂質２００ｕｇをリン酸緩衝 処理済み塩類液１ｍｊ！で音波処理した（上記実施例３２で定義したＰＣ、ＤＰ ＰＣ；　ＰＧ　、　ＰＩ　、ならびに比率は、１０：３５　、７．５　；　７． ５　；、Ｗ、Ｗ、Ｗ、誓）で３時間温間し、ＤＭＥＭ　８−２で希釈した。トレ ーサとして０．２５ｕＣｉ　の〔１４Ｃ）ＤＰＰＣを入れた。３時間経過後細胞 を無標識媒体で２回洗浄し、液体レンチレ、−ジョン計数により測定した。取込 み量はｕｇリン脂質／５ｇＤＮＡとして測定し、かつその結果は対照を１００χ として相対的に表５に脂質の取込み量として示した結果は対照の取込みによるリ ン脂質の取込み量のパーセンテージとして示している。これらの結果は、またリ ン脂質、そしてその結果、恐らく他の作因（例えば薬剤、ＤＮＡあるいは蛋白質 類）を呼吸上皮内に出す能力があることを実証している。

表５ 脂質取込み量 対　照　１００　２５ ＳＡＰ　（Ｐｈｅ　（１〜６０）　）　７８７　１．７００ＳＡＰ　（Ｐｈｅ　 （４０〜６０）　）　４１５　８１ＳＡＰ　（Ｖａｌ）　７０６　４２５ アルブミン　１１６　３１ ＨＭＤ　、その他の関連する疾病を治療するうえで５ＡＰ（Ｖａｌ）ないしはＳ ＡＰ　（Ｐｈｅ）を含む混合物で、かつ自然に発生する混合物あるいは合成脂質 を、例えば液体状態またはエアゾール、スプレとして投与量５ＡＰ（Ｖａｔ）な いしは５ＡＰ（Ｐｈｅ）約０．０１重量パーセントから約５．０重要パーセント で気管内に注入でき、この場合１ｋｇ当り約２０〜１００＋ｎｇのリン脂質がＨ ＭＤその他の関連する疾病の治療または予防用となっている。

本発明は勿論、その精神ならびに本質的な特性を外れることなくここに明記した 以外の他の特定用途で実施できる。従って、ｏ　ｏ　○　○　○　ｎ ０４　０Ｆ−１０ｔＪ　０（Ｊ −一−ｆ　％　１　Ｍ−−−１＃−蟲＾　＃　１ｒ’Ｊ（Ｊ Ｎ（Ｊ　Ｎ（５（’４　Ｕ　（’４べ Ｎべ　ベト ｊ　ｒ　％　−−− ｔ　）　ｅｒ”　ＬＪ　Ｏ＝ Ｎ　ｏｏ　○○　○○ ０ＲＩＧＩＮ ２．４− １．４− プ ０．３− ｋｂ　ａ　ｂ ＦＩＧ、１Ｉ ＦＩＧ、＋２ ８亡に゛シ二二二λなしン （残基数） ＦＩＧ、Ｉ６ 手続補正書（自発） 昭和６３年７月２０日 ／、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２５３６ ２、発明の名称 肺胞疎水性界面活性物資関連タンパク質３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名　ホイットセット、　ジエフリー　エイ、（ほか４名）国籍　アメリカ合衆 国 り１代　理　人 神戸市中央区東町１２３番地の１貿易ビル９階上記（ＩＸ２ＸＳ）　ｔ−別紙の 通り補正します。

ｆ蘭　町　！１）本　韻　牛 ＋、＋−−−＋−７４．ｅ１．−ｍ＋、−Ｈａ、ＰＣ７／（ＪＳ１１７１０２５ ３６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＳＡＰ（Ｖａｌ）をコード化する精製且つ単離したＤＮＡ配列。 ２．図５または図１０に示したところによるヌクレオチド配列で、図５または図 １０に示したヌクレオチド配列内の２０の配列ヌクレオチドからなるヌクレオチ ド配列と、図５または図１０に示したヌクレオチド配列内の２０の配列ヌクレオ チドにてハイブリッド形成させる核酸を説明したヌクレオチド配列と、 遺伝番号の重複を除き、図５もしくは図１０に示したヌクレオチド配列内の２０ の配列ヌクレオチドによりハイブリッド形成させる核酸を説明したヌクレオチド 配列と、図５または図１０に示したヌクレオチ配列内の１８の配列ヌクレオチド によりコード化されるエピトープをコード化するヌクレオチド配列と、 で構成されるグループから選択したヌクレオチド配列により説明される精製且つ 単離したＳＡＰ（Ｖａ１）核酸。 ３．請求の範囲２項の核酸からなる形質転換ベクター。 ４．請求の範囲３項に記載のベクターで形質転換した細胞。 ５．ＳＡＰ（Ｖａｌ）を発現させるために有利な培地ならびに条件下において、 請求の範囲４項に記載の細胞の培養と、前記培地の内容物からのＳＡＰ（Ｖａｌ ）の分離との手順からなる精製且つ単離したＳＡＰ（Ｖａｌ）を取得する方法。 ６．図５または図１０に示したところによる下記のヌクレオチド配列で、 図５または図１０に示したヌクレオチド配列内の２０の配列ヌクレオチドからな るヌクレオチド配列、ならびに図５または図１０に示したヌクレオチド配列内の １８の配列ヌクレオチドによりコード化されるエピトープをコード化するヌクレ オチド配列 からなるグループから選択したヌクレオチド配列により説明される精製且つ単離 した核酸によりコード化され、かつ実質的には他の人蛋白質がない精製且つ単離 したＳＡＰ（Ｖａｌ）。 ７．化学的または酵素的ペプチド合成により調整したＳＡＰ（Ｖａｌ）合成ポリ ペプチド。 ８．下記のアミノ酸配列をもつ請求の範囲７項に記載の合成ペプチド 【配列があります】９．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲７項に記載した 合成ペプチド 【配列があります】 １０．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲７項に記載したところによる合成 ペプチド 【配列があります】 １１．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲７項に述べた合成ペプチド 【配列があります】 １２．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲７項に述べた合成ペプチド 【配列があります】 １３．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲７項に述べた合成ペプチド 【配列があります】 １４．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲７項に述べた合成ペプチド 【配列があります】 １５．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲７項に述べた合成ペプチド 【配列があります】 １６．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲７項に述べた合成ペプチド 【配列があります】１７．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲７項に述べた 合成ペプチド 【配列があります】 １８．下記のアミノ酸配列有する請求の範囲７項に述述べた合成ペプチド 【配列があります】 １９．化学的あるいは酵素的ペプチド合成法により調整した合成ＳＡＰ（Ｐｈｅ ）ポリペプチド。 ２０．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲１９項に述べた合成ペプチド 【配列があります】 ２１．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲１９項に述べた合成ペプチド 【配列があります】 ２２．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲１９項に述べた合成ペプチド 【配列があります】 ２３．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲１９項に述べた合成ペプチド 【配列があります】 ２４．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲１９項に述べた合成ペプチド 【配列があります】 騨仙ｕ ２５．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲１９項に述べた合成ペプチド 【配列があります】 ２６．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲１９項に述べた合成ペプチド 【配列があります】 ２７．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲１９項に述べた合成ペプチド 【配列があります】 ２８．下記のアミノ酸配列を有する請求の範囲１９項に述べた合成ペプチド 【配列があります】 ２９．図６に示したようにＳＡＰ（Ｐｈｅ）内に残基（４１〜６０）により説明 したアミノ酸配列を有する請求の範囲１９項に述べた合成ペプチド。 ３０．図６に示したところによるＳＡＰ（Ｐｈｅ）内に残基（２２〜６０）によ り説明したアミノ酸配列を有する請求の範囲１９項に述べた合成ペプチド。 ３１．請求の範囲６項に述べたところによる実質的に純粋なＳＡＰ（Ｖａｌ）、 脂質ならびに医薬品的に受け入れられる担体からなる動物の肺胞内の正常な肺表 面張力を緩和もしくは維持する薬物で、前記ＳＡＰ（Ｖａｌ）ならびに前記脂質 が前記肺胞内の正常な肺表面張力を緩和もしくは維持できる有効量存在する薬物 。 ３２．さらにＳＡＰ（Ｖａｌ）からなる多量体から構成される請求範囲３１項に 述べた薬物。 ３３．請求範囲３１項に述べた薬物で、前記脂質が合成リン脂質、天然発生リン 脂質または、その混合物からなるグループから選択される薬物。 ３４．請求の範囲３１項に述べた薬物で、前記脂質がリン脂質、中性脂質、コレ ステロール、コレステロール・エステルならびにその混合物およびフォスファチ ジルコリン、不飽和化フォスファチジルコリン、フォスファチジルグリセロール 、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、フォスファチジルイノシトール、な らびにその混合物からなるグループから選択される薬物。 ３５．動物におけるＨＭＤまたはその他肺胞界面活性物質の不足に伴う症候群を 治療もしくは予防する方法で、請求の範囲１項に述べた分離ＳＡＰ（Ｖａｌ）な らびに脂質を正常な肺表面張力の緩和もしくは維持を行うために有効な投与量を 動物に投与することからなる方法。 ３６．請求の範囲３５項に述べた方法で、前記ＳＡＰ（Ｖａｌ）ならびに脂質の 動物に対する投与を脂質として、あるいはエアゾール・スプレとして行う方法。 ３７．請求の範囲６項で述べたＳＡＰ（Ｖａｌ）により免疫処置を施した動物か ら血清免疫グロブリン成分として取得した免疫学的に活性を有する抗ＳＡＰ（Ｖ ａｌ）ポクローン、もしくは単クローン抗体で、 ａ．前記免疫グロブリンがＳＡＰ（Ｖａｌ）を含む混合物からのＳＡＰ（Ｖａｌ ）と結合あるいは沈降させる能力。 ｂ．前記免疫グロブリンがＳＡＰ（Ｖａ１）の沈澱速度を速める能力ｃ．前記免 疫グロブリンがＳＡＰ（Ｖａｌ）の溶出特性を修飾する能力、ならびに ｄ．前記免疫グロブリンが１標本からのＳＡＰ（Ｖａｌ）を識別もしくは定量化 する能力。 等の属性を前記免疫グロブリンに付与することを特徴とする抗体。 ３８．ＳＡＰ（Ｐｈｅ）により免疫処置を施した動物から血清免疫グロブリン成 分として取得した免疫学的に活性を有する抗ＳＡＰ（Ｐｈｅ）ポリクローンまた は単クローン抗体で ａ．前記免疫グロブリンがＳＡＰ（Ｐｈｅ）を含む混合物とＳＡＰ（Ｐｈｅ）を 結合させる。あるいはこれを沈降させる能力。 ｂ．前記免疫グロブリンがＳＡＰ（Ｐｈｅ）の沈澱速度を速める能力ｃ．前記免 疫グロブリンがＳＡＰ（Ｐｈｅ）の溶出特性を修飾する能力、ならびに ｄ．前記免疫グロブリンが１標本からのＳＡＰ（Ｐｈｅ）を識別もしくは定量化 する能力。 等の属性を前記免疫グロブリンに付与することを特徴とする抗体。 ３９．下記の配列を有するＳＡＰ（Ｖａｌ）合成前駆体ペプチド【配列がありま す】 ４０．下記のアミノ酸配列を有するＳＡＰ（Ｐｈｅ）合成前駆体ペプチド 【配列があります】 ４１．下記のアミノ酸配列を有するＳＡ（Ｐｈｅ）合成前駆体ペプチド 【配列があります】 ４２，ＳＡＰ（Ｐｈｅ）をコード化するｃＤＮＡ内に見られないヌクレオチド配 列により説明される精製分離処理済みＳＡＰ（Ｐｈｅ）核酸で、該核酸が図８Ｂ に示したヌクレオチド配列、即ち図８Ｂに示したヌクレオチド配列のイントロン 部に２０の配列ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列。 図８Ｂに示したヌクレオチド配列の５′非コード化部において２０の配列ヌクレ オチドからなるヌクレオチド配列。 図８Ｂに示したヌクレオチド配列の３′非コード部において２０の配列ヌクレオ チドからなるヌクレオチド配列。 図８Ｂに示したヌクレオチド配列の非コード化部において２０の配列ヌクレオチ ドとハイブリッド形成させる核酸を説明したヌクレオチド配列からなるグループ から選択したヌクレオチド前列により説明される核酸。 ４３．単離し、且つ実質的に純粋な人ＳＡＰ（Ｖａｌ）で該人ＳＡＰ（Ｖａｌ） が脂質の界面活性物質様活量を強化し、単純分子量がドデシル硫酸ナトリウムを 含むポリアクリルアミド・ゲルで測定される約２，０００〜７，０００ダルトン の人ＳＡＰ（Ｖａｌ）でそのアミノ酸残基の配列が図５または図１０で示したヌ クレオチド配列における１８の配列ヌクレオチドによりコード化されたエピトー プからなる人ＳＰＡ（Ｖａｌ）。 ４４．単離し、且つ実質的に純粋な牛ＳＡＰ（Ｐｈｅ）で該牛ＳＡＰ（Ｐｈｅ） が請求の範囲３４項に述べた抗体を用いて分離可能であり、脂質の界面活性物質 様活量を強化し、ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミド・ゲルの測 定で単純分子量約４０００〜７０００グルトンと測定され、かつ当該牛ＳＡＰ（ Ｐｈｅ）のＮＨ２末端アミノ酸残基の配列が次のようになっている牛ＳＡＰ（Ｐ ｈｅ）。 【配列があります】 ４５．単離し、且つ実質的に純粋な犬ＳＡＰ（Ｖａｌ）で該犬ＳＡＰ（Ｖａｌ） が脂質の界面活性様活量を強化し、ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリル アミド・ゲル内で測定した単純分子量が約４０００〜７０００ダルトンあり、か つ前記犬ＳＡＰ（Ｖａｌ）ＮＨ２末端アミノ酸残基の配列が次のようになってい る犬ＳＡＰ（Ｖａｌ）【配列があります】 ４６．図５または図１０にコード化部によって示したところによるヒドロパシィ ・プロファイルを示す二次構造を有するＳＡＰ（Ｖａｌ）の類似物質。 ４７．請求の範囲３８項に述べた抗体に対する体液の標本を暴露する手順からな る体液内のＳＡＰ（Ｐｈｅ）の存在に関する検定法。 ４８．請求の範囲４７項に述べた検定法で、さらに標本をＳＡＰ（Ｐｈｅ）に暴 露する手順からなる検定法。 ４９．体液の標本をＳＡＰ（Ｐｈｅ）に暴露する手順からなる体液内ＳＡＰ（Ｐ ｈｅ）の存在に関する検定法。 ５０．請求の範囲４９項に述べた検定法で、前記ＳＡＰ（Ｐｈｅ）が請求の範囲 １９項に述べた合成ペプチドである検定法。 ５１．体液の標本を請求の範囲３７項に述べ暴露する手らなる体液内ＳＰＡ（Ｖ ａｌ）ｋ存在に関する検定法。 ５２．請求の範囲５１項に述べた検定法で４、さら前記標本をＳＡＰ（Ｖａ１） に暴露する手順からなる検定法。 ５３．体液の標本をＳＡＰ（Ｖａｌ）に暴露する手順からなる体液内ＳＡＰ（Ｖ ａｌ）の存在に関する検定法。 ５４．請求の範囲５３項に述べた検定法で、前記ＳＡＰ（Ｖａｌ）が請求の範囲 ７項に述べた合成ペプチドである検定法。 ５５．ＳＡＰ（Ｖａｌ）と１物質を組み合せ、かつＳＡＰ（Ｖａｌ）とその物質 の組合せを呼吸上皮細胞に適用する手順からなる前記物質を呼吸上皮細胞へ分与 する方法。 ５６．請求の範囲５５項に述べた方法で、さらに前記物質をリン脂質に組み合せ る手順からなる方法。 ５７．１物質をＳＡＰ（Ｐｈｅ）に組み合せ、かつＳＡＰ（Ｐｈｅ）と前記物質 の組合せを呼吸上皮細胞に適用する手順からなる当該物質を上皮細胞へ分与する 方法。 ５８．請求範囲５７項に述べた方法で、さらに前記物質をリン脂質に組み合せる 手順からなる方法。