JPH01503515A - 脈管抗凝固性タンパク質、それらをコードするｄｎａ、それらの製造方法及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 脈管抗凝固性タンパク質、それらをコードするＤＮＡ、それらの製造方法及びそ れらの使用〔技術分野〕 本発明は生物活性タンパク質、それらをコードするＤＮＡ分子、それらの製造方 法及びそれらの使用に関する。

〔背景技術〕

補乳動物の大部分には凝固抑制作用を有するタンパク質がある。

これらのタンパク質は異なる活性機構に基き３つの群に分けることができる。

１　凝固因子と複合体を形成して凝固因子を不活性にするタンパク質、これらは 以下のタンパク質を包含するニＣ）　αｚ−マクログロフ゛リン（Ａｎｎ、Ｒｅ ｖ、Ｂｉｏｃｈｅｓ、　５２．６５５２ｉ固因子をタンパク質加水分解により切 断して凝固因子を不活化するタンパク質、過去記述されたこの種のタンパク質は プロティンＣ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５１．３５５−３６３　（１９７６ ））のみである。

３　負に荷電したリン脂質を遮蔽し及び／または加水分解して血液凝固機構のリ ン脂質依存性反応を抑制するタンパク質、これまでに種々のタイプの蛇毒から単 離されたホスホリパーゼのみが記述されている（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １上１．２５−３２　（１９８０））。

一段階ずつ進行する凝固系は近年精力的に研究されてきた。この系は酵素がチモ ーゲンを活性形態に変換する種々の連鎖性のタンパク質加水分解反応の自己強化 型多段階系であることが理解されている（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｃ，Ｍ、、Ｎｅｍｅ ｒｓｏｎ　Ｙ、、＾ｎｔ＋、Ｒｅｖ、Ｂｔｏｃｂｅｍ、　−４−二６−１７６５ −８１１　（１９８０））、この反応の速度はリン脂質及び他のコファクター例 えばＶａ因子及びＶＩＩ［ａ因子の存在により明白に増加する。生体内では、前 凝固反応は凝固カスケードのわずかな活性化の後の爆発的に血栓性の損傷（ａｎ 　ｅｘｐｌｏｓｉｖｅｌｙｔｂｒｏｍｂｏｔｉｃ　ｔｒａｕｍａ）を防ぐ種々の 抑制機構によって調節されている。

抗凝固機構は以下のごとく分けることができる（　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ。

Ｒ，Ｄ、　、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｓ、　、　Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｎ ｖｅｓｔ、ユ土、１−６　（１９８４））　：１　セリン−プロテアーゼ因子Ｘ ａ及びトロンビンは抗トロンビン■または抗トロンビン／ヘパリン複合体への結 合の結果不活性化される。プロトロンビン活性化及びフィブリンの生成は共にこ のようにして抑制することができる。抗トロンビンｍに加えてそれらの活性が時 間に依存するα茸−マクログロブリン及び抗トリプシン等の種々の他の血漿プロ テアーゼ阻害剤がある。

２　プロティンＣの発見は別の抗凝固機構の発見を導いた。プロティンＣが一旦 活性化されると、タンパク質コファクターであるＶａ及びＶｌｌｌａ因子の選択 的タンパク質加水分解によりて抗凝固として働き、それによってプロトロンビナ ーゼ、及びＸ因子を変換する酵素が不活化される。

３　プラスミンはフィブリノーゲンに対するトロンビンの作用の産物である単量 体フィブリンを切断し、不溶性フィブリンの生成を防止する（Ｎｏｓｓｅｌ、Ｈ ，Ｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、　１ｉＬｓ　１６５−１６７（１９８１））。

上記凝固プロセスに含まれる生来のタンパク質のうち目下のところ抗トロンビン ｍのみが臨床上の使用に供せられている。しかしながら、このタンパク質の使用 は出血傾向を増大させる重大な欠点があることが分った。

抗凝固剤として従来用いられてきた物質は生来的性質のものであれ合成的性質の ものであれあるやり方で凝固因子を不活性にし、それによって凝固プロセスに不 利な影響を与える副作用をもたらす。

驚くべきことにこれらのタンパク質に加え、特定の条件下に望ましい凝固抑制作 用を発揮するが出血の危険性を増大せしめない、身体に固有の他の物質を単離す ることが今や可能となった。かなりの出血が生ずるとき、これらのタンパク質は 凝固抑制活性を失い、かかる場合に生存に必要な凝固プロセスを妨害しない、こ れらのタンパク質は強度に脈管化された組織からはじめて単離されたので、「脈 管抗凝固性タンパク質」（νａｓｃｕｌａｒ　ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ ｐｎｏｔｅｉｎｓ）　、’Ｖ　Ａ　Ｃとして知られている。ＷＲ帯管（ｕｍｂｉ ｌｉｃａｌｃｏｒｄ　ｖｅｓｓｅｌｓ）　、胎盤等の強度に脈管化された組織（ ｓｔｒｏｎｇｌｙｖａｓｃｕｌａｎｉｓｅｄ　ｔｉｓｓｕｅ　）から単離された タンパク質は約７０Ｘ１０８、約６０Ｘ１０”、約３４Ｘ１０”及び約３２ｘｌ Ｏ”の分子量を有し、３４及び３２Ｘ１０”の分子量を育する物質はそれぞれ単 一のポリペプチド鎖よりなフている。これらのタンパク質の正確な生化学的特徴 づけ、及びそれらの単離及び精製はＥＰ−Ａ−０１８１４６５（１９８６年５月 ２１日）に見い出される。

ＶＡＣ活性を存するタンパク質は血液凝固カスケードに２つの点で干渉する天然 の血液凝固抑制剤である。

最初の場合においては、それらはＩＸａ及びＶｍａ因子によって触媒される因子 ＸからＸａへの活性化に対する阻害作用を有し、第２の場合においてはそれらは 因子Ｘａ及びＶａによって仲介されるプロトロンビンの切断によるトロンビンの 生成を防止する。

再活性化工程に共通なものはそれらがカルシウムイオン及びリン脂質を必要とす る事実である。明らかにＶＡＣタンパク質もリン脂質と相互作用することができ 、この結合作用によって凝固因子の活性化工程を阻止することができる。

これらの性質はこれらのタンパク質を興味深いそして薬理的に非常に価値ある活 性物質にする。しかしながら、高度に精製された形態で利用できる十分な量のそ れらのタンパク質を得るには天然組織からのタンパク質の精製以外の方法によっ てそれらを生産することが必要である。解決は遺伝子操作法によってなされると 思われる。

ゆえに本発明の目的は遺伝子操作によってＶＡＣ活性を有するタンパク質を生産 することである。

この目的は強度に脈管化された組織から単離され高度に精製されたＶＡＣ活性保 ’４ｉｆタフ）：’）質（ＥＰＡＯ１８１４６５）の部分アミノ酸配列を明らか にし、これらの配列を用いて合成りＮＡプローブを製造し、そのｃＤＮＡライブ ラリーを捜索することによって達成された。そのプローブとハイブリッドするｃ ＤＮＡＯ単離、配列決定及び適当な操作（＋ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）の後、 このｃＤＮＡを適当な宿主系、例えば殺菌、酵母もしくは哺乳動物細胞中で形質 発現させた。

精製したタンパク質のひとつはトリプシンで酵素的に切断した。

生成ペプチドを分離し、選ばれた断片を配列決定した。しかしなから、Ｎ−末端 の配列は、最初のアミノ酸が明らかにブロックされているので直接分析すること はできなかうた。

配列情報を図０．１に示す。

適当なりＮＡプローブは基本的に３つの方法によって生産することができる。タ ンパク質のかなり長い部分（ｒｅｇｉｏｎ）　、大ざっばにいうて３０以上のア ミノ酸長が知られていると、哺乳動物で好ましく用いられるコドンを考慮に入れ て、対応するｍＲＮＡ部分（ｒｅｇｉｏｎ）のかなり確実な配列を確立すること ができる。この種のプローブは最悪の場合実際の配列と約６０％相同である（６ ６％ｂｏ＠ｏｒｏｇｏｕｓ　）　、これが非緊縮条件下で（ｕｎｄｅｒ　ｂｏａ −ｓｔｒｉｎｇｅｒ＋ｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）ハイブリッドすることができる ためにはプローブは比較的長くなければならない理由である。

第２の可能性は短い、大ざっばにいって６〜７アミノ酸長のペプチド部分に対す るオリゴヌクレオチドのすべての考えられる変種（ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）を合 成することである。かかる複雑な混合物（ｃｏｍｐｌｅｘ　ｍ１ｘｔｕｒｅｓ） をｃＤＮＡライブラリーの調査（ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　）に用いる場合 には比較的多数の「誤った」陽性に応答するクローン（”　ｆａｌｓｅ”　ｐｏ ｓｉｔｉｖｅ−ｒｅａｃｔｉｎｇ　ｃｌｏｎｅｓ）が単離されるかもしれない、 しかも完全に和合する（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）単一のオリゴヌクレオチドは全 混合物のほんの小さな部分しか構成しないのでハイブリダイゼーションシグナル は非常に弱くなるかもしれない。

明らかに第３の方法はオリゴヌクレオチドプローブの変化性（ｖａｒｉａｂｉｌ ｉｔｙ　）をうまくさけはしない（ｄｏｅｓ　ｎｏｔ　ｇｅｔ　ｒｏｕｎｄ）が 、特定のヌクレオチドトリホスフェ−）　（ＩＴＰ）の選択によって該プローブ のすべての分子をめるｃＤＮＡ（または「誤まったＪｃＤＮＡ）に結合させるこ とができる。かくしてトリプシンペプチド（Ｐ　３０／Ｔ）に対応する２３塩基 長のオリゴヌクレオチドがイノシントリホスフェートを用いて合成された。

すでに述べたごとく、ＶＡＣタンパク質は強度に脈管化されたｍ織から単離する ことができる。理想的な組織は請帯管及び胎盤である。従って、及び、他の特定 組織と対照して、殆どすべての遺伝子は胎盤で形質発現されるので、上記ＤＮＡ プローブを胎盤組織からそれ自体公知の手法で製造した胎盤ｃＤＮＡライブラリ ーを調査してＶＡＣタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子を見つけ出すのに用い た。

ＶＡＣタンパク質をコードするｃＤＮＡをめて該ｃＤＮＡライブラリーを捜索す るために、トリプシンペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅ　）　Ｐ　１６ 　／　ｎの配列に対応する２つのオリゴヌクレオチドを合成し、５ｔａｐｈ　Ａ ペプチドＰ２０／Ｉ／６の配列に対して１つのオリゴヌクレオチドを合成した（ 図１）、これらのオリゴヌクレオチドは各々対応ｍＲＮＡのあらゆるコードの可 能性を考慮に入れたすべての変種（νａｒｊａｎｔｓ）の混合物である。ＥＢＩ −３８６は２０ヌクレオチドの鎖長を存する５１２の変種（ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｓ）をもち、５ｔａｐｈ−ＡペプチドＰ２０／ｌ／６に和合する。トリプシンペ プチドＰ１６／ｎに対するオリゴヌクレオチド中の変動（νａｒｉａｔｉｏｎ　 ）を低く保つために、２つのオリゴヌクレオチド（２０−＊ｅｒｓ）を合成した ：ＥＢＩ−３８７：１２８変種及びＥＢｒ−３８８＝６４変種。

さらに「ゆうぎ」の位置にある塩基としてデスオキシイノシン（ｄｅｓｏｘｙｉ ｎｏｓｉｎｅ　）を用いてトリプシンＶＡＣペプチドＰ３０／■に対応する２つ のオリゴヌクレオチドＥＢＩ−１１８及びＦＢＩ−１１９を合成した（図２）、 この置換は　Ｅ、０ｈｔｓｕｋａらは、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、２６０１５　（１９８５）　、　ＰＰ、　２６０５−２６ ０８　、及びＹ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、　（１９８５）　ｐｐ、、　１９３１−１９３５に記述されている。イノシ ンはシトシンとよく塩基対をつくるが、他のヌクレオチドがパートナ−として提 供される場合も二重らせんの形成を殆ど妨害しない。

これらのオリゴヌクレオチドの各々に公知の手法で放射標識した後、ファージプ レートからの抽出物を公知の手法によってそれとハイブリッドする。

ＥＢＩ−３８６，３８７及び３８８とのハイブリダイゼーションによってλファ ージ（ラムダファージ）−ＰＩ　１／３、λファージ−Ｐ６１５及びλファージ −Ｐ６／６が生産された。ＥＢＩ−１１８及び１１９とのハイブリダイゼーショ ンはλファージ−Ｎ、１５、λファージ−Ｎ、１９及びλファージ−Ｎ、２２を 与えた。

ファージから単離されたＤＮＡはＥｃｏＲＩで切断され、生産された断片を単離 した。

λ−ｐＨ／３、λ−Ｐ６１５及びλ−Ｐ６／６クローンのｃＤＮＡ挿入物（ｃ　 Ｄ　Ｎ　Ａ　１ｎｓｅｒｔｓ）は約１３００〜１４００ｂｐの大きさを有してい た。配列分析は３つのクローンがすべて１つの同じｍＲＮＡから導かれたことを 示した。しかしながら−ＲＮＡの５′末端はｃＤＮＡではなくなっていた。λフ ァージ−Ｎ７１５、λファージ−Ｎ、１９及びλファージ−Ｎ２２２の挿入物は 約１６００．１１００及び１０００ｂｐの長さを有していた。配列分析はほぼ完 全なｃＤＮＡを示した。

２つのファージ群λ−ｐＨ／３、λ−Ｐ６１５及びλ−Ｐ６／６、及びλ−Ｎ、 １５、λ−Ｎ、１９及びλ−Ｎ、２２のｃＤＮＡは配列分析によって示されたご とく２つの異なるーＲＮ＾に由来している。３つのクローンλ−ｐＨ／３、λ− Ｐ６１５及びλ−Ｐ６／６のＥｃｏＲ１挿入物を単離し、ＥｃｏＲＩ切断プル− スクライプ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｂｅ）　Ｍ　１３″″ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ　 ｃｌｏｎｉＢＳｙｓｔｅｍｓ　社、　３７７０τａａｓｙ　５ｔｒｅｅｔ、Ｓａ ｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ　９２１２１．ｔｌＳＡ　）につないだ、得られたクロー ンをｐ　Ｐ　６１５、ｐＰ６／６及びｐＰ１１／３と名づけた。

３つのクローンλ−Ｎ、１５、λ−Ｎ１１９及びλ−Ｎ、２２のＥｃｏＲ１挿入 物を単離し、ＥｃｏＲＩ切断ブル切断ブルーデク５４１Ｍ１３−につないだ、得 られたクローンをｐＲＨ２０１％ｐＲＨ２０２及びｐＲＨ２０３と名づけた。

他のｃＤＮＡクローンを得るためにヒト胎盤λ−１ｔ１０ライブラリーをもう１ 度、今度は放射標識したｐＰ１１／３のＥｃｏＲＩ挿入物（ＥｃｏＲＩ　１ｎｓ ｅｒｔ　ｏｆ　ｐＰ１１／３）をプローブとして用いて捜索した。

全部で６９の陽性反応する（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ−ｒｅａｃｔｉｎｇ　）クロ ーンが％；）ｈた（λ−ＶＡＣＩ〜λ−ＶＡＣ６９）。

これらのクローンのうち１２は上記した小スケールで調製し、ｃＤＮＡ挿入物を ＥｃｏＲＩで遊離しくｗｅｒｅ　ｆｒｅｅｄ）　、単離した。

クローンλ−ＶＡＣＩＯの挿入物はＶＡＣタンパク質をコードする全読取り枠番 含んでいる。ＶＡＣ−α及びＶＡＣ−βをコードするｃＤＮＡを特徴づけるため にノーザンブロ７ト実験、配列分析及びゲノムサザンプロット分析を行りた。

結果を図３に示す、クローンｐＰ１１／３のｃＤＮＡは約１７００の塩基長のｍ ＲＮＡにバイブリフトしｒＶＡｃ−α」）、クローンｐＲＨ２０３のＣＤＮＡは 約２２００塩基長のｍＲＮＡにハイブリッドする（ｒＶＡｃ−β」）。

第１にトレース（ｔｒａｃｅ）あたりの放射能の量及び通用ｍＲＮＡの量はほぼ 等しく、第２に同じ溶液中のゲノムプロットのハイブリダイゼーシヨンは両方の ｃＤＮＡで同じ強度のバンド（ｂａＩＩｄｓ）を生じたので（下記参照）、胎盤 中にはより短いｍＲＮＡ　（シＡＣ−α）がより長いｍＲＮＡ　（ＶＡＣ−β） より多量に存在すると結論できる。

ＶＡＣ−αｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの配列分析については、クローンｐＰ６１５、ｐ　Ｐ 　６／６及びｐＰ１１／３のＣＤＮＡは全体的に配列決定され、クローンλ−Ｖ ＡＣ１〜１２のｃＤＮＡは部分的に配列決定された。結果を図４に示す、すべて において、１４６５塩基が配列決定された。１ｃＤＮＡは３２０のアミノ酸をコ ードできる長い読取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）を示す、こ のＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳する場合、トリプシン断片（ｔｒｙｐｔｉｃ ｆｒａε＋ｍｅｎｔｓ）のすべての配列決定されたペプチドをこの配列中に収容 することができる１（図５）、従って、このｃＤＮＡは対応するｍＲＮＡがＶＡ Ｃタンパク質をコードするｃＤＮＡである。第２の単ｊｌｃＤＮＡの配列は部位 のタンパク質ではあるがＶＡＣとは異なるタンパク質をコードするので、ＶＡＣ −αの名をここに導入する。

第１のＡＴＧコドン（塩基３′５〜３７）は同じ読取り枠中で停止コドンによ゛ って先行される。塩基３０〜３８は翻訳開始コドン近（の共通配列ＣＣ（＾／Ｇ ）　ＣＣＡＬＩＧＧを与えるコザーク則（Ｋｏｚａｋ　ｒｕｌｅ）（Ｍ、Ｋｏｚ ａｋ、Ｎａｔｕｒｅ　３０Ｂ　（１９Ｂ４）　、ｐＨ，２４１２４６）をかなり 良←満足する（ここでの対応配列はＴＣＧＣＴＡＴＧＧである）。

３′非翻訳ＳＪ！域は４７１塩基長である。ポリーＡ部分開始前１５塩基にポリ アデニル化配列ＡＡＴＡＡＡがある（Ｎ、Ｊ、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら、Ｎａｔｕ ｒｅ２６３　（１９７６）　、ｐｐ、２１１　２１４）、ｍＲＮＡのポリーＡ部 分が１５０〜２００塩基の鎖長を有するとすると、ｃＤＮＡ配列に基＜ｍＲＮＡ の総長は１６００〜１６５０塩基である。ノーザンプロット実験ではより高い値 が測定されたので、５′翻訳領域はいずれのｃＤＮＡにも完全には含まれていな い。

他のすべてのｃＤＮＡクローンと異なり、クローンｐ　Ｐ　６１５のｃＤＮＡは １００位にへの代りにＣを有する。その結果、トリプレット９８〜１０Ｇ（２２ 番目のコドン）はＧＡＡからＧＡＣに変わりＧｊｕの代りにＡｓｐをコードする 。この逸脱はいくつかの原因を有する：ａ）逆転写酵素が間違ったヌクレオチド を入れた、ｂ）この点で異なる２つの対立遺伝子（ａｌｌｅｌｉｃ　Ｈｅ！１ｅ ｓ）の転写産物がある、またはＣ）この点で異なる２つの非対立遺伝子がある。

長い読取り枠は、それからＭｅｔ−１が恐らく切断され、それに続くアラニンが アミノ基の位置でもしかするとアシル化によってブロックされる、３２０のアミ ノ酸を有するタンパク質をコードする。計真した分子量は３５．８９６Ｄであり 、Ｓ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動）による値よ り高い、確かに荷電したアミノ酸（Ａｓｐ　、　Ｇｌｕ　％　Ｌｙｓ　％　Ａｒ ｇ　、　Ｈｉｓ）の比率３０．６％（９Ｂ／３２０）は平均値２５．１％に比べ 十分高い、このことは５ＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質の異なる移動特性を 説明している０強＜荷重したアミノ酸中塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ及びＡｒｇ）（ 数４１）に比べ酸性アミノ酸（Ａｓｐ及びＧＪｕ）（数５４）が優勢である。こ れはＶＡＣ−αタンパク質の酸性の等電点（ｐｌ＝４．４〜４．８）を説明して いる。ＶＡＣ−αタンパク質はシスティン（アミノ酸位置３１６）をコードする トリプレットを１つしか含まない、典形的なＮ−グリコジル化部位（Ａｓｎ−Ｘ ＸＸ−５ｅｒ／Ｔｈｒ）はない。

アミノ酸配列の構造分析（Ｐｕｓｔｅｌｌ、Ｊら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ。

１Ｇ　（１９８２）ｐｐ４７６５〜４７８２に従って修飾した）の結果、６７ア ミノ酸長の配列の４回の（４重）の繰返しく以下、「リピート」という）がある ことが判明した（図６）、この配列の中で７つのアミノ酸（１０，４％）は４つ のリピートのすべてに保持されており、１５のアミノａ（２２，４％）は４つの リピートの３つに存在し、２８の位置（２８ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）　（４１，８ ％）で２つのリピートは各々同じアミノ酸（ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｍｉｎｏ　ａ ｃｉｄ）を含有している。

公けのデータ（１’１．Ｊ、Ｇｅｉｓｏｗ、ＦＥＢｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２０３ 　（１９８６）、ｐｐ、９９−１０３　；Ｍ、Ｊ、Ｇｅｉｓｏｗら、丁ＩＢＳ　 １１（１９８６）　、ｐｐ、４２０−４２３）との比較の結果、驚（べきことに ＶＡＣ−αがかなり広い意味での（ａｆａｉｎｌｙ　ｌａｒｇｅ　ｇｒｏｕｐ　 ｏｆ）　Ｃａ”依存性リン脂質結合タンパク質に属することが判明した。共通配 列はＬｙｓ−Ｇ　ｌ　ｙ−ｆｏｂ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇ／ｕ−ｖａ ｒ−ｖａｒ−Ｌｅｕ−ＩＩ！ｅ−ｆｉｊ！−１４！ｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ｆｏｂ −Ａｒｇ　（ｆｏｂ＝疎水性、ｆｉＪ−親水性、ｖａｒ−変化し得る）として記 述されており、Ｃａ’″゛結合において必要とされ得るＣＭ、Ｊ、Ｇｅｉｓｏｗ ら、Ｎａｔｕｒｅ３２０　（１９８６）　、ｐｐ、６３６−６３８）、この配列 は本発明のタンパク質の４つの反復した、６７のアミノ成長よりなる配列の各々 において存在する（図６）。

殆ど疎水性アミノ酸のみよりなる、各リピートの末端の６アミノ酸長の部分もま た人目を引く　（図６のｒｏｏｏｏｏＯＪ”）。

クローンＮ７１５、Ｎ、１９及びＮ７２２の配列分析はポリＡ部分に没入する、 ＶＡＣ−βｃＤＮＡについての１９４０ｂ、を示した（図７）、ポリＡ部分の１ ６塩基前にポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡがある。確かに、この共通配列 はヌクレオチド位１７０４−１７０９で生ずる。この配列がポリアデニル化シグ ナルとして用いられない理由は分らない、へＡＴＡＡＡ配列の３′末端に付加的 に必要とされる配列ＹＧＴＧＴＴＹＹ　（Ｇ４１１　Ａ、ら、Ｎａｔｕｒ＠３１ ２　（１９８４）、ｐｐ、４７３−４７４）は比較的長く離れるまで（ＴＧＴＧ ＴＴＡＴ、位置１７３５−１７４２）存在しない、このことをこの最初のポリア デニル化配列が受け入れられないこと（ｎｏｎ−ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ）の説明 とすることが可能である。

ｔｓｃＤＮＡはその初めから１０８７位までに亘る長い読取り枠を含んでいる。

それは３６２のアミノ酸のコード能力（ｃｏｄｉｎｇｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を含 んでいる。ＶＡＣ−ａとの類似性とＶＡＣの精製中に３４０００Ｄのタンパク質 も存在する（Ｅ、Ｐ、＾、　１８１．４６５参照）事実から、最初のメチオニン コドン（ＡＴＧ、　１０７−１０９位）を翻訳の開始点を考えた。コザーク則は ＶＡＣ−αの場合と同様ここでもあまりよく満足されない（＾ＡＧＡＧＡＴＧＧ 　、１０２−１１０位）、得られたタンパク質（ＶＡＣ−β）は３２７アミノ酸 長である。それは４つのシスティン基（アミノ部位、１６Ｌ　２０６．２５０及 び２９３）及び能力あるＮ−グリコジル化部位（Ａｓｎ−Ｌｙｓ−５ｅｒｘアミ ノ酸位２２５−２２７）を有している。計算された分子量は３６８３７　（図９ ）である、ＶＡＣ−βにおいても同様に平均より大きな数の荷電基があり（９７ ／３２７　（２９，６％））、一方酸性アミノａ　（Ａｓｐ＋Ｇｊｕ　４９）が 塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ＋Ａｒｇ４２）より多い、このことは５ＤＳ−ＰＡＧＥ によりめたより低い分子量の説明となる。

ＶＡＣ−βも６７アミノ酸長の配列よりなる内部繰返しを有する（図８）、この 配列中で７つのアミノａ（１０，４％）は４つのリピートのすべてで保持され、 １７のアミノａ（２５，４％）は４つのリピートの３つで存在し、２５の位置（ ３７，７％）で２つの繰返しは各々同じアミノ酸を含有する。ＶＡＣ−βも１７ アミノ酸長の共通配列と高い類似性を有している。ＶＡＣ−αについてなされた 注釈がＶＡＣ−βにもあてはまる。この領域での制御した突然変異Ｃｃｏｎｔｒ ｏｌｌｅｄ論ｕｔａｔｉｏｎ）によってタンパク質の生物活性を変える試みをな すことができる０本発明でいう突然変異は例えば保存領域（ｔｈｅ　ｃｏｎｓｅ ｒｖｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ）の１７アミノ酸をコードする領域の全もしくは部分置 き代えを包含する。

該ペプチドを比較したとき、もっとも注目される相違点はＮ−末端ペプチドであ ることが分る。従うて本発明での修飾としてはこれらのＮ−末端ペプチド上の交 換が考えられる。これらの修飾タンパク質はＮ−末端ペプチドをコードするＤＮ Ａ分子を例えばそれ自体公知の方法であるオリゴヌクレオチド合成によって製造 し、それらを残余のリピート及びリンカ一部分をコードする「残余のＤＮＡＪと つなぐことによって製造することができる。このＤＮＡを備えた形質発現ベクタ ーは適当な宿主生物中公知の手法で形質発現することができ、形質発現されたタ ンパク質は単離精製される。

ヒト胎盤からの染色体ＤＮＡのサザンによる分析は複雑な画像（ａ　ｃｏｍｐｌ ｅｘ　ｐｉｃｔｕｒｅ）を示す、このＤＮＡをＥｃｏＲＩ　％Ｈｉｎｄ　ｍｌ。

Ｂａｗｌ（Ｉ及びＰｓｔｌで切断した。ニトロセルロースに移されたＤＮＡをＶ ＡＣ−αＤＮＡ　（ｐＰｌ　１／３）及びＶＡＣ−β［１ＮＡ（ｐＰＨ２０３） とハイブリッドした。フィルターの洗浄と緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下に 行ったが、各消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）について比較的多くの数のバンドが得 られた（図１０）、２つのプロットの比較はこれらの条件下でのＶＡＣ−αＤＮ ＡとＶＡＣ−βＤＮＡの交差反応を考えられるより無視できる（ｃａｎ　ｂｅ　 ｒｕｌｅｄ　ｏｕｔ）ことを示している。バンドの多重度はＶＡＣ−αもしくは ＶＡＣ−β遺伝子に類似の遺伝子の存在によって説明できるか、またはそれは多 くの及び／または長いイントロンによって中断されている遺伝子である。

図１１はＶＡＣ−αとＶＡＣ−βのアミノ酸配列の比較を示す。

繰返された構造は両タンパク質とも同じである。結合ペプチドも２番目と３番目 のリピートの間の結合ペプチドを除いて同じ長さである０両配列の最適の釣合い （ｍａｔｃｈｉｎｇ）をもたらすためにはギャップをＶＡＣ−αの結合ペプチド に挿入しなければならない。

これらの２つのタンパク質のＮ末端ペプチドは異なった長さを有し、ＶＡＣ−α では１９アミノ酸、ＶＡＣ−βでは２５アミノ酸である。このペプチドはまたも っとも低い相同性を有する。この２つのタンパク質は３２０のアミノ部位中１７ ６が等しく、相同率５５．０％に相当する。

この時点でＶＡＣ−ａ　ｃＤＮＡとＶＡＣ−βｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比 較を示す、２つの遺伝子及びその産物を比較すると、ＤＮＡ　（−ＲＮＡ）面（ ｐｌａｎｅ）の方がアミノ酸面より大きな相同性を示す、このことは核酸におい ては塩基トリプレット（ｂａｓｅ　ｔｒｉｐｌｅｔ）の変化が新しいアミノ酸を コードするのに十分であるという事実によって説明される。

図にはＶＡＣ−ｃｒ　ｃＤＮＡとＶＡＣ−βｃＤＮＡのコード領域の比較を示す 、驚くべきことにＤＮＡはたった５４．２％の相同性度しか示さない（すなわち ２つのタンパク質より幾分低い相同性度である）。

ｔ１１３は２つのタンパク質の親水性プロフィール（ｈｙｄｒｏｏｈｉｌｉｃｉ ｔｙｐｒｏｆｉｌｅｓ）を示す、　Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄの演夏法を用いた（丁 、ｐ、ｎｏｐｐら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７８　（１９８１ ）ｐｐ、３８２４−３８２３）　。

４つのリピート領域は棒（ｂａｒｓ）によって示され、結合ペプチドは下に示さ れた配列中に枠組まれている（ａｒｅ　ｆｒａ＋＊ｅｄ）　＊驚くべきことに、 ２番目と３番目のリピートの間の結合ペプチドは特に親水性である。このペプチ ドはＶＡＣ−αにおいてもＶＡＣ−βにおいても同じ位置にアルギニンを含んで いる。ゆえにこのアルギニンがトリプシン様特異性を有するプロテアーゼに対す る好ましい攻撃点となる可能性がある。この分子はついで約等しいサイズの２つ のハーフ（ｈａｌｖｅｓ）に切断されるであろう、この種の「半分子Ｊ　（ｈａ ｌｆ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）が生物活性、例えば抗凝固活性を発揮する（ｄｅｖｅ ｌｏｐ）することは考えられる。このタンパク質の例えばトリプシン様特異性を 有するプロテアーゼによる制御された消化とは別に、これらの半分子またはわず かな修飾を伴った半分子は種々の方法で製造できる。それ自体公知の手法で製造 できるこれらの半分子をコードするＤＮＡ分子を適当な形質発現ベクターにこの ＤＮＡが形質発現制御配列によって調節されるように挿入し、これらのベクター で形質変換された宿主生物を培養することによって半分子を形質発現させ、単離 精製することができる。

わずかな修飾を伴った半分子は例えばあるプロテアーゼに必要とされる特異性を 全体としてのタンパク質に与える切断部位を挿入することによって得ることがで きる。かくして例えばＸａ因子様特異性の切断部位を有するタンパク質を、Ｘａ 因子プロテアーゼの認識テトラペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを２番 目と３番目の構造の間のリンカ−配列をコードする部分（ｓｅｃｔｉｏｎ）に挿 入すること゛によって製造することができる。このようにして、修飾された性質 、例えばタンパク質加水分解攻撃に対して改良された安定性を有し、他方Ｘａ因 子プロテアーゼに対する高度に特異的な切断部位を含有する完全タンパク質がは じめて得られる。

この結果２つの半分子を計画的に製造し治療目的に用いることができる。

ＶＡＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの制御された突然変異によっ て、タンパク質加水分解攻撃により抵抗性のタンパク質を製造することも可能で ある。このように例えば２番目と３番目のリピート構造の間のＶＡＣ−α及びＶ ＡＣ−βに共通のアルギニンをヒスチジンに置き代えることによってタンパク質 の安定性を改善することができる。他のアルギニン及びリジンのヒスチジンによ る、恐らくは対応コドンの置き代えによる、制御された置代えによってトリプシ ンの加水分解に抵抗性のタンパク質を得ることができる。これらの制御された突 然変異はタンパク質／ポリペプチドの生物活性、例えば抗凝固活性を本質的に変 化させずに温存するが、タンパク質の変化、例えば安定性の改良（すなわち半減 期の変化）をもたらす。

多くの場合、例えばタンパク質の形質発現のために成熟した（ｍａｔｕｒｅ）目 的のタンパク質／ポリペプチド配列にシグナル配列または宿主生物に固有のタン パク質配列を先行させて融合タンパク質を形質発現産物として生産されるように するのが有利である。

シグナルペプチドをコードするシグナル配列は微生物起源でも哺乳動物細胞起源 でもよいが、好ましくはシグナルペプチドは宿主生物と相同である（ｈｏｍｏｌ ｏｇｏｕｓ）　＊これらの産物を目的とする成熟タンパク質に変換することがで きるようにするために、シグナル／融合部分と成熟タンパク質の間に特異的切断 部位が必要である。

この目的のために例えばＸａ因子プロテアーゼの認識テトラペプチドをコードす るオリゴペプチドを上記したようにこの個所に挿入することができる。その結果 、形質発現された融合タンパク質はＸａ因子プロテアーゼにより制御された様式 で切断される。

アミノ部位ｌのメチオニン以外のメチオニンのコドンをロイシン、イソロイシン またはバリンをコードするコドンに置き代える場合には、得られる非成熟もしく は融合タンパク質はＢｒＣＮ切断によって成熟タンパク質に変換することができ る。こういう風にして修飾したタンパク質が同じか優れた生物活性を有すること が明らかになるならば、この方法は収率を増加する可能な方法となり、また天然 のＶＡＣタンパク質より優れた性質を有するタンパク質を製造する可能な方法と なる。

別の計画的な突然変異はセリンもしくはバリンによる、対応コドンの変換による ひとつまたは可能なそれ以上のシスティンの制御された置代えである。この変換 が生物活性に有害な影響を与えないなら、この方法は該タンパク質の単離及び／ または収率に改善をもたらす、タンパク質の性質の改善も除外されない、さらな る突然変異は本発明のタンパク質をコードする異なる完全もしくは部分配列の組 合せであり、それによって脈管抗凝固活性を有するハイブリッドタンパク質を得 る。これらのもしくは同様な突然変異によって得ることができるすべてのタンパ ク質、それらをコードするＤＮＡ、それらの製造及び使用も本発明の目的である 。

１１１３はＶＡＣ−αもＶＡＣ−βも膜を通してのタンパク質の分泌または膜中 へのタンパク質の析出を可能にする（ｐｅｒｍｉｔ）長い疎水性領域を有してい ないことを示している。従ってＶＡＣ−αもＶＡＣ−βも細胞内タンパク質であ ると思われる。

Ｗａｌｌｎｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ３２０　（１９８６）　＋ｐｐ、７７−８１） はヒトリボコルチン■の構造を報告し、５ａｒｉｓ　ら（Ｃｅｌｌ　４６（１９ ８６）、ｐｐ。

２０１−２１２）及びＨｕａｎｇら（Ｃｅｌｌ　４６（１９８６）、ｐｐ、１９ １−１９９）はネズミのもしくはヒトのカルバクチン（Ｃａｌｐａｃｔｉｎ）　 Ｉ　にれはリボコルチン■としても知られる）の構造を報告している。これらの タンパク質もＣａ”依存性リン脂質結合タンパク質の範ちゅうに属する。それら の構造はＶＡＣ−α及びβと部位的に書くことができる（図１４）、Ｌかしなが ら、ＶＡＣ−αとＶＡＣ−βの間の相同性はＶＡＣとリボコルチンの間の相同性 よりもっと著しい。

ＶＡＣ−α−ＶＡＣ−β　５５．０％ ＶＡＣ−ａ−リボコルチｙＩ　４１．９％ＶＡＣ−α−リボコルチンＩＩ　４３ ．８％ＶＡＣ−β−リボコルチンＩ　４１．７％ＶＡＣ−β−リボコルチンＩｔ 　４４．６％従ってリボコルチンもそれらのａｍ構造ゆえに抗凝固活性を有し、 従って抗凝固剤として用いることができ、さらにはこのことはこのクラスのＣａ ”依存性リン脂質結合タンパク質の一般的性質であると推測することができる。

さらに、類似構造により本発明のタンパク質も抗凝固活性に加え、すでに知られ たＣａ”依存リン脂質結合タンパク質の部類の性質を有すると思われる。ＶＡＣ のホスホリパーゼが阻害活性によって保証することができる仮定（下記参照）０ 例えばリボコルチン類の抗炎症活性をここに述べる。従って本発明は本発明タン パク質の抗炎症剤としての使用、及びリボコルチン類にあてはまるすべての適応 症、例えばりウマチ愁訴の処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）への使用にも関する。こ の目的のため必要に応じ、天然タンパク質に相当する本発明産物を上記したよう にして修飾し性質を改善することができる。

タンパク質ＶＡＣ−α、ＶＡＣ−β、リボコルチンＩ及びリボコルチン■の゛比 較は、タンパク質問のもっとも顕著な相違がＮ末端ペプチド、特に一方でのＶＡ Ｃタンパク質と他方でのりポコルチン類の間のＮ末端ペプチドにあることを示す 、従って本発明の修飾としてはこれらのＮ末端ペプチドの変換かも（ろまれる、 これらの修飾タンパク質はこれらのＮ末端ペプチドをコードするＤＮＡ分子を、 例えばそれ自体公知の手法であるオリゴヌクレオチド合成によって生産し、それ らを、残余のリピート及びリンカ一部分をコードする「残余ＤＮＡＪとつなぐこ とによって製造することができる。このＤＮＡを有する形質発現ベクターは適当 な宿主生物中公知の手法で形質発現することができ、形質発現されたタンパク質 は単離し精製される。

Ｃａ”依存リン脂質結合タンパク質の多くのメンバーは細胞骨格の精製した分泌 小胞もし他の構成要素に結合する（Ｒ，Ｂ、Ｋｒｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎａｔｕ ｒｅ３２０　（１９８６）　、ｐ５７３　（要約））６分泌の間、導管（ｔｈｅ 　ｖｅｓｓｅｌｓ）は細胞のゴルジ器管から離れ、細胞膜に移行し、そして融合 する。かくして小胞の内容物は細胞から離れる。

興奮と筋肉収縮のカンプリング（ｃｏａｐｌｉｎｇ）と類似して、刺激と分泌が Ｃａ”を介してカップリングされることが提案された（ＷＪ。

Ｄｏｎｇｌａｓ、Ｂｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃ、３４　（１９８６）　、４５１） 　ｓｃａ″＃依存リン脂質す合タンパク質は重要な役割を演することができる。

各リピートの保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）　１７アミノ酸長領域において 、ＶＡＣ−αはヒドロキシル基を有する５〜６のアミノａ（Ａｓｐ、Ｇｊｕ　、 　Ｔｈｒ　、　５ｅｒ）を（それらのうち３つは同じ位置に）有する。

ＶＡＣ−βにおいては、これらのアミノ酸のしち４つは各リピートに存在する。

該タンパク質のいずれもカルモジュリン、トロポニン（ｔｒｏｐｏｎｉｎ）　Ｃ 、Ｓ　１００及びバーブアルブミン（ｐａｒｖａｌｂｕｓ＋ｉｎ）に観察され、 これらの分子におけるＣａ”結合の役割を担うＥＦ−Ｈａｎｄ構造（Ｒ，Ｈ，Ｋ ｒｅｔｓｉｎｇｅｒ　ら、ＣＲＣＣｒ１ｔ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ−８（１９ ８０）、ｐ　１１９）を有さないが、各リピートにおけるこのサブセフシラン（ サブ領域）　（ｓｕｂｓｅｃｔｉｏｎ）の保存はこの領域がＣａ”結合の役割を 担うという結論に導く。

この領域における制御された突然変異によって該タンパク質の生物活性を変化さ せる試みがなされ得る０本発明による突然変異は例えば保存領域の１７のアミノ 酸をコードする領域の完全なもしくは部分的置代えを想定する： ａ）ＶＡＣタンパク質の、リボコルチンの対応アミノ酸をコードする領域による 置代え ｂ）ＶＡＣ−αの、ＶＡＣ−βの対応アミノ酸をコードする領域によ・る置代え 、及びその逆 Ｃ）リボコルチン！の、リボコルチン■の対応アミノ酸をコードする領域による 置代え、及びその逆 ｄ）リボコルチンの、ＶＡＣタンパク質の対応アミノ酸をコードする領域による １代え、または ｅ）その他のポリペプチド／タンパク質におけるこれらのアミノ酸をコードする 対応領域の、それぞれ他のポリペプチド／タンパク質の対応アミノ酸をコードす る領域による置代え上記の類似構造はまた、この類似性を示すタンパク質類が抗 炎症作用と抗凝固作用の両方を有し、従って治療的及び／または予防的に用いる ことができることを期待させる。

従って本発明は特に該ポリペプチドの抗炎症剤、抗リウマチ剤としての使用、リ ボコルチンにあてはまる適応症における使用；リピート領域ををする該ポリペプ チド／タンパク質の血液凝固抑制剤、トロンビン抑制剤、抗炎症剤、抗リウマチ 剤としての使用；リボコルチンの凝固抑制剤、トロンビン阻害剤としての使用、 ＶＡＣタンパダ質にあてはまる適応症における使用に関し、この種のリピート領 域を有するタンパク質の既知の使用（そのいくつかはこの出願で述べられている ）を特に排除するものである。

本発明はさらに医薬上不活性な担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ　１ｎ ｅｒｔｃａｒｒｉｅｒｓ）に加え、有効量のこれらのポリペプチドのひとつを含 有する治療処置用剤に関する。

本発明はまたリピート領域を有するポリペプチド／タンパク質をコードするＤＮ Ａ分子、リピート領域のひとつをコードするＤＮＡ分子、全リピートをコードす る領域が再配置されていることで特徴づけられるＤＮＡ分子、それらによってコ ードされたタンパク質、それらの製造及び使用に関する。

本発明はまたこれらのもしくは同様な突然変異によって得ることができるすべて のタンパク質、それらをコードするＤＮＡ、それらの製造及び使用を包含するが 、他方既知のタンパク質（それらのいくつかは本出願に記載されている）、それ らをコードするＤＮＡ、それらの既知の製造及び使用は特に除外されている。

本発明はまた非ヒト起源のＤＮＡ分子、それらによってコードされるタンパク質 、それらの製造及び使用に関する（これらは本発明に類似の方法で製造すること ができる）。

本発明は本発明のタンパク質を特異的にコードする遺伝子配列に関するのみなら ず、突然変異、分Ｎ（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）　、転位または付加によって容 易にかつルーチンに（ｒｏｕｔｉｎｅｌｙ）得ることができる修飾に関する０本 発明のタンパク質（ここに示す活性の生物スペクトルを有する）をコードし、そ れらと比較して縮重したＣｄｅｇｅｎｅｒａ　ｔｅ）いかなる配列も包含される 。当業者はコード領域のＤＮＡ配列を縮重させることができる。同様に本発明の タンパク質の活性スペクトルを有するポリペプチドをコードし、緊縮条件（例え ば８５％、好ましくは９０％より大きい相同性を選び出す条件）下で示された配 列（またはその部分）とハイブリッドするいかなる配列も包含される。

ハイブリダイゼーシヨンは６ＸＳＳＣ１５デンハート溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ ａ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）　／　０．１％ＳＤＳ中６５℃で行った。緊縮（ｓｔｒ ｉｎｇｅｎｃｙ）の度合いは洗浄工程において決定する。かくして約８５％より 大きい相同性を有するＤＮＡ配列の選択について適当な条件は０．２ｘＳＳＣ１ ０，０１％ＳＤＳ／６５℃であり、約９０％より大きい相同性を有するＤＮＡ配 列の選択について適当な条件は０．１ｘＳＳＣ１０，０１％ＳＤＳ／６５℃であ る。

本発明はさらにＶＡＣをコードするＤＮＡ配列を含有し、　ＶＡＣ活性を有する ポリペプチドがこの形質発現ベクターで形質転換された宿主細胞中で形質発現さ れるように形質発現制御配列によって調節される形質発現ベクターに関する。

本発明の形質発現ベクターは例えばＶＡＣコードＤＮＡ配列を、形質発現制御配 列を有するベクターＤＮＡ中に形質発現制御配列が該ＤＮＡ配列を調節するよう に導入することによって製造することができる。

適当なベクターは形質転換に用いる特定の宿主細胞によって選択する。適当な宿 主は例えば微生物例えばサツカロマイセス・セレビシェ等の酵母、特に制限酵素 や修飾酵素を有しない細菌株、特にエシェリキア・コリの株、例えばＥ、コリＸ １７７６、Ｅ。

コリＨＢ１０１、Ｅ、コリＷ３１１０、Ｅ、コリＨＢＩＯＩ／ＬＭ１０３５、Ｅ 、コリＪＡ２２１　（３０）もしくはＥ、コリに１２株２９４、バチルス・ズブ チリス、バチルス・ステアロサーモフィラスムぶｙ工止虹五坦山匡位、シュード モナス、ヘモフィラス７小遍ユリ−、ストレプトコッカス等；より高等な生物の 細胞、特に株化された（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）ヒトもしくは動物の細胞系を 包含する。好ましい宿主細胞はすべてＥ、コリの株、特にＥ、コリＨＢＩＯＩ、 Ｅ、コリＪＭＩ　Ｏ１及びＥ、コリＷ３１１０である。

理論的には、選ばれた宿主中でＶＡＣをコードする異種ＤＮＡ配列を複製し、形 質発現するベクターはすべて適当である。

Ｅ、コリ株中でのＶＡＣ遺伝子の発現に適当なベクターの例はバクテリオファー ジ（例えばバクテリオファージλの誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ））　；プ ラスミド、特にプラスミドｃｏｌＥ１及びその誘導体、例えばｐＭＢ９、ｐｓＦ ２１２４、ｐＢＲ３１７またはｐＢＲ３２２である６本発明の好ましいベクター はプラスミドｐＢＲ３２２から導かれる。適当なベクターは完全なレプリコンと 、形質発現プラスミドで形質変換した微生物を表現型特徴（ａ　ｐｈｅｎｏｔｙ ｐｉｃａｌ　ｆｅａｔｕｒｅ）に基いて選択し、同定することを可能にする標識 遺伝子とを含有する。適当な標識化（ｍａｒｋｉｎｇｓ）は微生物に例えば重金 属、抗生物等に対する抵抗性を与えることである。さらに本発明の好ましいベク ターはレプリコン及び標識遺伝子領域に加え、制限エンドヌクレアーゼの認識配 列（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を含み、その結果これらの点 でＶＡＣのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列及び任意的に形質発現制御配列 を挿入することができる。

好ましいベクター、プラスミドｐＢＲ３２２、は完全なレプリコン、テトラサイ クリン及びアンピシリンに対する抵抗性を与える標識遺伝子（ｔｅｔ”及びａｍ ｐ”　）　、及び制限エンドヌクレアーゼ、例えばＰｓｔｌ　（ａｓｐ”遺伝子 中で切断し、ｔｅｔ”遺伝子はそっくり残る）　、Ｂａ５ＨＩ、Ｈｉｎｄ　ｍ、 ５ａ１１　（いずれもＬｅｔ”遺伝子内で切断、他方ａｍｐ”遺伝子はそっくり 残る）、Ｎｒｕｌ及びＥｃｏＲＩのいくつかの個有の認識配列を含む。

いくつかの形質発現制御配列を、ＶＡＣ形質発現を調節するのに用いることがで きる。特に、形質転換される宿主細胞の強く形質発現された遺伝子の形質発現制 御配列を用いる０例えば、ｐＢＲ３２２をハイブリッドベクター、及びＥ、コリ を宿主生物とする場合、ラクトースオペロン、トリプトファンオペロン、アラビ ノースオペロン等の形質発現制御配列（これらの配列は特にプロモーター及びリ ポソーム結合部位を含有する）　；β−ラクタマーゼ遺伝子；ファージλＮ遺伝 子もしくはファージ、ｄ一層タンパク質遺伝子及びその他の遺伝子の対応配列が 適当である。β−ラクタマーゼ遺伝子（β−ｊａｃ遺伝子）のプロモーターはす でにプラスミドｐＢＲ３２２に含まれているが、他の形質発現制御配列はこのプ ラスミド中に導入しなげればならない０本発明において好ましい形質発現制御配 列はトリプトファンオペロン（江しＰＯ）の形質発現制御配列、セラチア・アル セフスンス及びＥ、コリの形質発現制御配列、アルカリホスファターゼプロモー ターまたはそれらのハイブリッドである。

これらの特にありふれたプロモーターに加え、他の微生物プロモーターも開発さ れ用いられるようになった０本発明のタンパク質の遺伝子配列は例えばバタテリ オファージλ（Ｐ、）の左方の（Ｉｅｆｔｗａｒｄ）プロモーターの制御下に用 いることができる。このプロモーターは特に有効な制御可能プロモーターである 。制御はその隣りの制限切断部位が知られているλ−リプレッサーによって可能 となる。このリプレッサー遺伝子の温度感受性対立遺伝子をタンパク質遺伝子配 列を含有するベクター中に挿入することができる。温度が４２℃まであがると、 リプレッサーは不活化され、プロモーターが活性化される。このシステムを用い て、機能タンパク質（ｆｓ＋ａｃｔｉｏｎａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子配列を リポソーム結合部位のすぐ近くに、ＡＰＬプロモーターからの距離を変えて配置 したクローンバンクを確立する（ｅｓｔａｂｌｉｓｈ）ことができる、これらの クローンはついでチェックし、もっとも高い収率でそれらを選択することができ る。

本発明のタンパク質をコードする配列の形質発現及び翻訳もその未形質転換形態 での生物と「相同」であるとみなされる他の調節系の制御下に行うことができる 。かくして例えばラクトース依存Ｅ、コリからの染色体ＤＮＡは酵素β−ガラク トシダーゼを分泌することによってラクトースの分解を可能にするラクトースオ ペロン（１匹オペロン）を含有する。

１匹制御要素はＥ、コリに対し感染力をもつバタテリオファージλ−ｐ　ｌ　ａ ｃ　５から得られる。ファージのｌａｃオペロンは同じ細菌種から形質導入によ って得ることができる０本発明方法で用いることができる調節系は生物に固有の プラスミドＤＮＡを源とすることができる。１匹−プロモーター−オペレーター 系はＩ　ＰＴＧによって誘導することができる。

他のプロモーター−オペレーター系またはその部分は等しく良好な効果（ｅｆｆ ｅｃｔ）で用いることができる０例えばコリシン（ｃｏｌｉｃｉｎ　）　Ｅ、オ ペレーター、ガラクトースオペレーター５．キシロースＡオペレーター、ｔａｃ オペレーター等。

原核生物に加え、真核微生物、例えば酵母培養１ｉ　（ｙｅａｓｔｃｕｌｔｕｒ ｅ）も用いることができる。サツカロマイセス・セレビシェが真核微生物中もっ ともふつうに用いられるが、いくつかの他の種も一般に入手可能である。

酵母中での複製及び形質発現に適当なベクターは酵母複製開始点（ａ　ｙｅａｓ ｔ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　５ｔａｒｔ　）及び酵母に選択的な遺伝マーカー を含む、酵母複製開始点、例えば染色体自律複製断片（ｔｈｅｃｈｒｏｍｏｓｏ ＠ａｌ　ａｕｔｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　ｓｅｇｍｅｎ ｔ）　（ａｒｓ　）　を含有するハイブリッドベクターは形質転換後酵母細胞内 の染色体外に保持される。サツカロマイセスの形質発現に対しては、例えばプラ スミドＹ　Ｒｐ　７　（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｓ＋ｂら、Ｎａｔｕｒｅ２８２．３９ 　（１９７９）　；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ−ヱー、１４１　（１９７９ ）　；Ｔｓｃｂｕ＋５ｐｅｒ　ら、Ｇｅｎｅ上工、１５７（１９８０））及びプ ラスミドＹＥＰ　１３　ＣＢｗａｃｈら、Ｇｅｎｅ　８．１２１−１３３　（１ ９７９）が通常用いられる。プラスミドＹＲＰ７はトリプトファン非常を（ｔｒ ｙｐｔｏｐｈａｎ−ｆｒｅｅ）培地で成育できない酵母変異株、例えばＡＴＣＣ ４４０７６に対して選択し得るマーカーであるＴＲＰＩ遺伝子を含有する。

酵母宿主ゲノムの特性としてのＴＲＰＩ欠損の存在は培養をトリプトファンなし に行う場合に形質転換を検出する有効な助けとなる。この関係はＬＥＵ２−マイ ナス変異株を相補する（ｃｏ＋ｍｐｌｅｍｅｎｔ　）のに用いることができる酵 母遺伝子ＬＥＵ２を含有するプラスミドＹＥＰ１３と非常によく位でいる。

酵母のための他の適当なマーカー遺伝子（ｍａｒｋｉｎｇ　ｇｅｎｅｓ）は一般 に栄養要求酵母変異株の場合に宿主の欠損（ｄｅｆｅｃｔｓ）を補う（ｃｏｓｏ ｐｅｍｅｎｔ）遺伝子である。対応する遺伝子、例えばＵＲＡ３及びＨｒＳ３遺 伝子は栄養要求酵母変異株における原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）を確か にする。好ましくは酵母ハイブリッドベクターにも複製開始点及び細菌宿主、特 にＥ、コリについてのマーカー遺伝子を含ませその結果ハイブリッドベクター及 びその前駆体の構築及びクローニングを細菌宿主中で起こさせることができるよ うにする。酵母中での形質発現に適当な他の形質発現制御配列は例えばＰＨ０３ もしくはＰＨ０５遺伝子の形質発現制御配列、及び解糖分解に必要とされるプロ モーター、例えばＰＧＫ及びＧＡＰＤＨプウモーターを包含する。

酵母ベクターについての他の適当なプロモーター配列はＡＤＤ　１（Ａｍｍｅｒ ｅｒ　Ｇ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１　０　１　、１ ９２−２０１（１９Ｂ３））、３−ホスホグリセレートキナーゼ（３−ｐｈｏｓ ｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ　ｌ［１ｎａｓｅ）（Ｂｉ　Ｌｚｅｍａｎ　ら、　Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｂｅｍ、２　５　５．２０７３　（１９８０））、または他の解 糖酵素系（Ｋａｗａｓａｋｉ及びＦｒａｅｔ＋ｋｅｌＪＢＲＣ１０Ｂ、１１０７ −１１１２　（１９８２））例えばエノラーゼ（ｅｎｏｌａｓｅ　）　％グリセ ルアルデヒドー３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベー トデカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコ−ルー６−ホスフェー トイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼの５′−フ ランキング（翼）　（ｆｌａｎｋｉｎｇ）領域を包含する。

適当な形質発現プラスミドを構築する（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）ことによって〜こ れらの遺伝子と結合した終結配列も形質発現させる配列の３′末端で形質発現ベ クターに挿入することができ、もってｍＲＮＡのポリアデニル化及び終結（ｔｅ ｒｍｉｎａｔｉｏｎ　）を確保することができる。

増殖（ｇｒｏｗｔｈ）条件によって転写を制御できる利点も有する他のプロモー ターはアルコールデヒドロゲナーゼ−２、イソチトクロームＣ１酸性ホスフアタ ーゼ、窒素代謝と連関させた（ｃｏａｐｌｅｄｔｏ）分解酵素、上記グリセルア ルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトー スの処理の役を担う（ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ）酵素の遺伝子のプロモ ーター領域である。

酵母接合型遺伝子座によって調節されるプロモーター、例えば遺伝子ＢＡＲＩ、 ＭＦα１．５ＴＥ２．５ＴＥ３及び５ＴＥ５のプロモーターは温度依存■Ｌ突然 変異の使用による温度調節系（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　 ｓｙｓｔｅｍ　）におし１て用いることができる（Ｒｈｉｎｓ、Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈ ｅｓｉｓ、Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｏｒｅｇｏｎ＋Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒ ｅｇｏｎ（１９７９）　、Ｈｅｒｓｋｏｗｔｔｚ　ａｎｄ　Ｏｓｂｉｍａ、Ｔｈ ｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｌｉｏｌｏｇｙｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃ ｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ、Ｐａｒｔ　Ｉ　％　１　８　１　−　２　０　９　（１ ９８１）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 ）　、これらの突然変異は酵母の休止接合型カセットの型質発現、従って間接的 に接合型依存性プロモーターに影響を与える。しかしながら一般に、酵母適合性 プロモーター、原複製（ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）及び終結 配列を含有するプラスミドベクターはいずれも適当である。

かくして、酵母２μプラスミドＤＮＡに相同の配列を含有するハイブリッドベク ターも用いることができる。この種のハイプリラドベクターは存在する２μプラ スミドとの組換えによって細胞中に入れるか、自己復製させる。２μ配列は高い 形質転換頻度を有するプラスミドに適当であり、高いコピー数を可能にする。

微生物に加え、多細胞生物の培養細胞に（ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ）も適当な 宿主生物である。理論的には、を椎動物から得られた培養細胞でも無を椎動物か ら得られた培養細胞でも用いることができる。

しかしながら、を椎動物細胞の培養（組織培養）による増殖が近年ルーチンな方 法となつている（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓ＋Ｅｄｉｔｏｒｓ　Ｋｒｕｓｅ　ａｎｄ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、　（１９７３ ）　）のでを椎動物細胞にもっとも大きい興味が向けられている。この種の有用 な宿主細胞系の例はＶＥＲＯ及びヒーラ細胞、ＣＨＯ細胞及びＷ１３Ｂ、ＢＨＫ ％ＣＯ３−７及びＭＤＣＫ細胞系を包含する。これらの細胞に対する形質発現ベ クターは一般に必要な何らかのリポソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位 、ポリアデニル化部位及び転写終結配列と共に、（必要な場合の）複製開始点、 形質発現させる遺伝子の前に位置するプロモーターを含有する。

哺乳動物細胞中で用いられる場合、形質発現ベクター中の制御えば通常用いられ るプロモーターはポリオーマ、アデノウィルス２を起源とし、特にしばしば５１ ｗ１ａｎウイルス４０　（ＳＶ４０）を起源とする。ＳＶ４０の初期及び後期プ ロモーターは両者ともＳＶ４０のウィルス複製部位も含む断片としてウィルスか ら容品に得ることができるので特に有用である（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ２ ７３．１１３　（１９７８））、５Ｖ４０（７）より小さいもしくはより太き部 位に亘る役２５０ｂｐ長の配列を含む限り用いることができる。

さらにプロモーターを用いることも、または目的とする遺伝配列に正常に結合し た制御配列を用いることもこれらの制御配列が宿主細胞系に和合する限り可能で ありしばしば望ましい。

複製開始点を、例えばＳＶ４０もしくは他のウィルス源（例えばポリオーマ、ア デノ、ＶＳＶ、ＰＢＶ等）からの外来部位（ａ＋＞　ｅｘｏｇｅｎｉｃ　５ｉｔ ｅ）を入れるために、対応するベクター構築によって提供するか、宿主細胞の染 色体複製機構によって提供する。

ベクターを宿主細胞染色体中に組込む場合には後者の手段（■ｅａｓｕｒｅ）は 通常十分にみたされる。

本発明は特に複製することができ、表現型の選択ができる形質発現ベクターであ って；形質発現制御配列をＶＡＣが配置された該形質発現プラスミドで形質転換 された宿主細胞中で形質発現される形で含有し、ＶＡＣのアミノ酸配列をコード するＤＮＡ配列を該形質発現プラスミド中で転写開始シグナル及び終結シグナル 、及び翻訳開始シグナル及び停止シグナルと共に含有する形質発現ベクターに関 する。

有効な形質発現を達成するために、ＶＡＣ遺伝子は形質発現制御配列を共に正し く　（同位相に（ｉｎ　ｐｈａｓｅ））配置しなければならない、主ｍＲＮＡ開 始点と、天然では形質発現制御配列（例えば、β−ｆａｃプロモーターを用いる 場合はβ−１ａｃコード配列）に結合している（ｉｓ　１ｉｎｋｅｄ）遺伝子コ ード配列のＡＴＧとの間の領域において、形質発現制御配列を、ＶＡＣ遺伝子、 好ましくはそれと共にそれ自身の翻訳開始シグナル（ＡＴＧ）及び翻訳停止シグ ナル（例えばＴＡＧ）をもってくるＶＡＣ遺伝子に結合させる（ｌ　１ｎｋ）の が有利である。これによって有効な転写及び翻訳が確保される。

例えば、ベクター、特にｐＢＲ３２２を制限エンドヌクレアーゼで切断し、生成 直鎖状ベクターの任意的な修飾後、対応する開眼末端を有する形質発現制御配列 を導入する。形質発現ｍ鍵配列は３′末端（翻訳の方向）に制限エンドヌクレア ーゼの認識配列を含有し、その結果形質発現制御配列をすでに含有するベクター は該制限酵素で消化され、対応する末端を備えたＶＡＣ遺伝子を用いることがで きる。このようにして正しいもしくは誤った方向性（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ） において遺伝子を含有する、２つのハイブリッドプラスミドの混合物が形成され る。形質発現制御配列をすでに含んでいるベクターをそのベクターＤＮＡ内で第 ２の制限エンドヌクレアーゼで切断すること、及び得られるベクター断片におけ る正しい末端（ｔｈｅ　ｒｉｇｈｔ　ｅｎｄｓ）を備えたＶＡＣを用いることが 有利である。ベクターに対するすべての操作はレプリコンの機能及び少なくとも ひとつのマーカー遺伝子の機能が損われないように行うのが好ましい。

本発明の好ましいＢ祿においては、ｐＢＲ３２２から導かれ、形質発現制御配列 、好ましくはトリプトファンオペロン旦■ＰＧ）の形質発現制御配列を含をする ベクターであつて、好ましくは粘着末端を形成させる制限エンドヌクレアーゼ例 えばＥｅｏＲｌの認識配列をその３′末端（主ｍＲＮＡ開始点と最初のＡＴＧＯ 間）に有するベクターを上述の制限エンドヌクレアーゼ、及びベクターＤＮＡ部 分では平滑末端もしくは好ましくは粘着末端を形成する第２の制限エンドヌクレ アーゼ、例えばＢａｍＨｌで消化し、ついでかくして直鎖化されたベクターを対 応する末端（例えばＡＴＧ開始前のＥｃｏＲＩ末端及び翻訳停止コドン後のＢａ ｓ＋ＨＩ＊端）を有するＶＡＣ−ＤＮＡと結合する。結合は公知の手法で相補（ 粘着）末端を対合させ、ついで例えばＴ、−ＤＮＡリガーゼでつなぐことによっ て行われる。

好ましくは本発明によるＤＮＡ配列はまた形質発現プラスミドｐ　Ｅ　Ｒ１０３ （Ｅ、Ｒａｓｔｌｅ−Ｄｗｏｒｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　２１．２３７ −２４８（１９８３）及びＥｐ−Ａ−・０１１５６１３．１９８３年１２月２０ 日にＤＳＭ２７７３の番号でＤＳＭに寄託）、プラスミドｐａｒｐ　ＥＲ３３（ ＥＰ−Ａ−０１１５６１３）またはプラスミドｐＲＨ１００で形質発現すること ができる。これらのベクターはすべてクローン化遺伝子の高い形質発現率をもた らす調節要素（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含有している０本 発明によればセラチア・マルセフスンスからの調節可能なトリプトファンプロモ ーターと人工リポゾーム結合部位を含有するプラスミドｐＲＨ１００を合成タン パク質遺伝子の形質発現ベクターとして用いる。形質発現プラスミドｐＲＨ１０ ０を製造するために、プラスミドｐ　Ｅ　Ｒ１０３（Ｅｖａ　Ｄｗｏｒｋｉｎ− Ｒａｓｔｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　２１（１９８３）２３７−２４８　、　 ＥＰ−Ａ−０１１５６１３）を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ　ｍで直鎖化し 、オリゴヌクレオチド配列 ５’　ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＣＡＴＣＴＴＴＡ　３’３’　ＡＴＴ ＴＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡ　５’を挿入した。

対応する（特にＥｃｏＲＩ及びＢａ＋＊Ｈｔ　）末端を備え、ゲノムＤＮＡから ｍＲＮＡ法でもしくは合成で得られるＶＡＣ−ＤＮＡは、例えば配列分析用によ り多い量のＶＡＣ−ＤＮＡを得るために、形質発現プラスミドに導入する前に、 ｐＢＲ３２２等のベクター中ヘクローン化することができる。ハイブリッドプラ スミドを含をするクローンの単離は例えばＶＡＣ−ＤＮＡ特異的で放射探射した オリゴヌクレオチドプローブ（上記参照）を用いて行う、　ＶＡＣ−ＤＮＡは例 えばマクサム・ギルバー）（１１）法を用いて性質を調べる。

本発明の別の態様においてはＶＡＣ−ＤＮＡの断片を合成する。

本発明はまた宿主細胞を形質発現制御配列で調節され、ＶＡＣのアミノ酸配列を コードするＤＮＡ配列を含有する形質発現ベクターで形質転換することを特徴と する形質転換された宿主細胞を製造する方法に関する。

適当な宿主細胞は例えば上述の微生物、例えばサンヵロマイセス・セレビシェ、 バチルス・ズブチリス、及び特にエシェリキア・コリの株である０本発明の形質 発現プラスミドを用いる形質転換は例えば文献に記載されているようにしてＳ、 セレビシェ（１２）、Ｂ、ズブチリス（１３）及びＥ、コリ　（１４）に対して 行う、形質転換した宿主細胞は有利には形質発現プラスミドに含まれるマーカー 遺伝子がそれに対する抵抗性を与える生物致死剤を加えた選択栄養培地から単離 する。好ましい場合として、形質発現プラスミドａ霞ｐ１遺伝子を含む場合には アンピシリンを栄養培地に加える。形質発現プラスミドを含有しない細胞はかか る培地では死滅する。

本発明はまた記述した方法によって得ることができる形質転換宿主細胞に関する 。形質転換された宿主細胞はＶＡＣ活性を有する化合物を製造するのに用いるこ とができる。この化合物を製造する方法は形質転換宿主細胞を培養し、生産物を 宿主細胞から放出させ、単離することを特徴とする。

従つて本発明は特にＶＡＣのアミノ酸配列をコードし、形質発現制御配列で調節 されたＤＮＡ配列を含有する形質発現プラスミドで形質転換された宿主細胞を、 同化し得る炭素及び窒素源を含有する液体栄養培地に培養し；生産物を宿主細胞 から遊離させ単離し；必要ならば得られる生産物をジスルフィド結合を切断する のに適当な還元剤を混合し、必要ならば得られる還元ポリペプチドをジスルフィ ド結合の新たな形成に適する酸化則で処理し：必要ならば得られるＶＡＣ化合物 を別のＶＡＣ化合物に変換し、得られるＶＡＣ活性化合物の混合物を各化合物に 分離し；及び／または必要ならば得られる塩をポリペプチドに変換し、及び得ら れるポリペプチドを対応する塩に変換することを特徴とするＶＡＣ活性を有する 化合物及それらの塩を製造する方法に関する。

本発明は特にＶＡＣ化合物を製造する方法に関する。

本発明の形質転換宿主細胞はそれ自体公知の方法で培養する。

ここで種々の炭素源を本発明の形質転換宿主微生物の培養に用いることができる 。好ましい炭素源の例は同化し得る炭水化物、例エバグルコース、マルトース、 マンニトールもしくはラクトースまたは酢酸塩を包含し、これらは単独でも適当 な混合物としても用いることができる。適当な窒素源は例えばカザミノ酸等のア ミノ酸、ペプチド及びタンパク質及びそれらの分解産物（例えばトリプトン、ペ プトンもしくはミートエキス）、酵母エキス、マルトエキス（ｓａｌｔ　ｅｘｔ ｒａｃｔ）　％アンモニウム塩（例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムも しくは硝酸アンモニウム）を包含し、これらは単独ででも適当な混合物としてで も用いることができる。

用いることができる無機塩は例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカ ルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩及び炭酸塩を包含する。

培地はまた例えば成長促進物質例えば鉄、亜鉛、マンガン等の微量元素等、及び 好ましくは選択圧を及ぼして形質発現プラスミドを失った細胞の増殖を防止する 物質を含有する。かくして例えば形質発現プラスミドがｃＩ−Ｐ”遺伝子を含有 する場合はアンピシリンを培地に加える。このように抗生物質活性を有する物質 の添加により、汚染する、抗生物質感受性微生物も死滅する。

温度、培地ｐＨ，発酵時間等の培養条件は最大のＶＡＣ力価が得られるように選 択する。か（して、Ｅ、コリまたは酵母株を好ましくは好気的条件下液内振盪も しくは攪拌培養で約２０〜４０℃、好ましくは約３０℃の温度、４〜９、好まし くは７のｐｎで約４〜２０時間好ましくは８〜１２時間培養する。形質発現産物 は細胞内に蓄積する。

細胞密度が十分なレベルに達したら、培養を停止し、必要に応じ生産物を微生物 細胞から遊離させる。この目的のためには細胞を例えばＳＤＳもしくはトリトン 等の洗剤で処理して破壊するか、またはリンチームまたは同類の活性を存する酵 素で溶菌する。別法としてまたは付加的に、剪断力等の機械的力（例えばＸプレ ス、フレンチプレ°スまたはダイノミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ）を用いてもよい し；またはガラスピーズもしくは酸化アルミニウムと振盪することによって、例 えば液体窒素中で凍結しついで例えば３０〜４０℃にして融解することによって 、または超音波によって細胞を破壊してもよい、得られるタンパク質、核酸及び 他の細胞構成成分を含有する混合物を遠心分離後公知の手法でタンパク質を濃縮 する。

ついで例えば非タンパク質成分の大部分をポリエチレンイミン処理で分離除去し 、ＶＡＣ化合物を含有するタンパク質を例えば硫酸アンモニウムもしくは他の塩 の飽和溶液で沈澱させる。他の精製工程は例えばイオン交換クロマトグラフィー 、ＨＰＬＣ，逆相ＨＰＬＣ等のクロマトグラフィー法を包含する。ついで混合物 の成分を°、ゲル電気泳動もしくは無担体（ｃａｒｒｉｅｒ−ｆｒｅｅ）電気泳 動（適当なセファデフクスカラムを用い、分子サイズに従う）を用いて荷電後の 透析によって；例えば抗体特にモノクローナル抗体またはアフィニティークロマ トグラフィー用の適当な担体に結合させた（ｃｏｕｐｌｅｄ　ｔｏ）　）ロンビ ンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって；または他の方法、特に 文献公知の他の方法によって分離する。

例えば、形質発現ＶＡＣ化合物の！離は以下の工程を包含する。

遠心分離による培養液から細胞の分離；例えば溶菌酵素での処理及び／または凍 結及び再融解による細胞の破壊にょる粗抽出物の調製；遠心分離による不溶物質 の除去；ポリエチレンイミンの添加によるＤＮＡの沈ｓ；ｇａアンモニウムによ るタンパク質の沈澱；溶解した沈澱物のモノクローナル抗ＶＡＣ抗体カラムでの アフィニティークロマトグラフィー；得られる溶液から透析まはたセファデック スＧ２５もしくはセファデックスＧＩＯでのクロマトグラフィーによる塩の除去 。

他の精製工程はセファデックスＧ２５（またはＧ７５）でのゲル濾過及び逆相Ｈ ＰＬＣを包含する。塩はセファデックスＧ２５で除去できる。

ＶＡＣ活性は抗ＶＡＣ抗体（例えばウサギ／マウスまたはハイプリドーマ細胞か ら得られるモノクローナル抗体）を用いるテストまたはＥＰＡＯ１８１４６５に 記述のテストを用いて検出することができる。

すでに述べたごとく、アルカリホスファターゼプロモーターは本発明のタンパク 質の形質発現のために特に適当である。

Ｅ、コリからのアルカリホスファターゼ（上国人）の遺伝子は厳密な調節下に置 くべきである。リン酸塩の存在下では該遺伝子は完全にスイッチを切られるが、 培地中リン酸塩の不存在下では遺伝子発現が起こるＳ　Ｒ，Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏ ｒｔｈ旦　ａｔ、＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１４　（１９８６） 　ｐａｇｅ８６８９及びＣ，Ｎ、　ＣｈａＢ　旦　１１．。

Ｇｅｎｅ４４　（１９８６）、ｐａｇｅ１２１−１２５はこの遺伝子のヌクレオ チド配列を記述している０適当な形質発現ベクターを構築するために、ｍ人遺伝 子のプロモーター領域をいくつかのオリゴヌクレオチドから組み立て、ＥｃｏＲ Ｉ　Ｃ１ａｌ切断ＰＡＴ１５３（Ａ■ｅｒｓｈａ＋ｓ）に挿入した。リポソーム 結合部位の前にＸｈｏ１部位を導入した。もとのＥｃｏＲ１部位は合成りＮＡ断 片をつなぎ入れるときに破壊される。翻訳開始ＡＴＧ　（Ｇは５ａｃＩ　（＝Ｓ ｓｔｌ）部位の最初のヌクレオチドである）をリポソーム結合部位の後に装備し た。形質発現ベクターはこの部位で５ａｃｌにより切断して直鎖状とすることが でき、３′突出し部分は、ｄＧＴＰの存在下ＤＮＡポリメラーゼ！−クレノー断 片で処理してストレート末端（ｓｔｒａｉｇｈｔｅｎｄ　）にすることができる 、このようにしてこの位置に（ａｔ　ｔｈｉｓ　ｐｏｉｎｔ）いずれかの望まし い遺伝子を挿入することができる。正しい形質発現のためにはそれはコード領域 の最初の塩基から始まる必要がある。

ｐＡＴ部分のＨｉｎｄｍ−３ａｉｌ断片は除去され、アルカリホスファターゼ転 写ターミネータ−に置き置き代えた。もとの５ａｉ１部位は破壊した。これをな すため、それをＢａｗａＨＳ部位と共にターミネータ−の前に再導入した（Ｂａ ｍＨＩ部位もｐＡＴ１５３から削除された）０合成的に生産したＤＮＡの配列を 図１５に示す、得られるベクターをｐＲＨ２８４７と名づけた。ＶＡＣ−αの形 質発現に適したベクターを調製するために、ＶＡＣ−αをコードするＤＮＡ分子 をｐＲＨ２８４Ｔに導入した。この目的のために、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンｐ　 Ｐ　６／ＳをＢｇｊＩＩ及びＰｓｔＩで切断し、コード１域の大部分と約２００ ｂｐの３′非翻訳領域を含む９８Ｏｂｐ長の断片を単離した。コード領域のなく なっている５′末端はオリゴヌクレオチドを用いて置き代えた。Ｋｐｎｌ切断部 位を同時の２つ突然変異（ＧＧＣ−ＧＧＴ　、　Ｇｊ！ｙ　−７及びＡＣＴ　− ＡＣＣ、丁ｈｒ−８）によってＶＡＣ−ｃＤＮＡ中に導入した。

オリゴヌクレオチドは以下の外観を有していた：ＩＥＢＩ−６７８　１　ＩＥＢ Ｉ−６７７１ＥＢＩ−６８０１１ このようにして生産したベクターはｐＲＨ２９１と命名した（図１６）。

ＶＡＣ−βを形質発現するために、プラスミドｐＥＲ１０３を形質発現ベクター として好適に用いた（Ｅ、Ｒａｓｔｌ−Ｄｗｏｒｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｇｅｎ ｅ２１　（１９８３）、２３７−２４８）、！亥ベクターを旧ｎｄ■で直鎖化し た。５′突出末端をｄＡＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼｌ／クレノー断片で部分的 にみたし、残余の一本鎖残基をＳｔヌクレアーゼで消化した。該ベクターをＢａ ｍＨＩで切断し、大きな断片を単離した（図１７）、ＶＡＣ−βをコードするＤ ＮＡ分子を得られたベクターにつないだ、この目的のためにコドン１３〜１５７ を含をする４４Ｏｂｐ長のＭａｅｍ−ＢａｍＨ１断片をクローンｐＲＨ２０３か ら単離した。消失している５′末端をオリゴヌクレオチド： を用いて補った。

最適コドンをＥ、コリに対して用いた（例えばＲ，Ｇｒａｎｔｈａｍａｔ　ａｌ 、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ＠ｓ、８　（１９８０）　、１８９３−１ ９１２）　＊このコドン交換はコドン５〜７に新しいＨｉｎｄｌ１１部位をもた らした。ＢａｍＨＩで再切断後、５′末端ＶＡＣ断片を調製されたｐＥＲ１０３ ベクターにつなぎ込んだ、形成されたベクターをｐＲＨ２１１と命名した。ＶＡ Ｃ−βをコードする領域を完成させるために、１２３Ｏｂｐ長のＢａｍＨＩ　− Ｓｐｈ　！断片をクローンｐＲＨ２０１から単離した。ＢａｍＨＩから５ｐｈＩ まで約２００ｂｐ長のｐＢＲ３２２の部分をプラスミドｐＲＨ２１１から除去し 、対応するＶＡＣ−ｃＤＮＡ部分と置き代えた。これはベクターｐＲＨ２１２に 帰結した。Ｔｒｐプロモーター（Ｓ、マルセツスンス）、リポソーム結合部位、 及び合成的に製造したＶＡＣ−β遺伝子のはじまりの部分（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ ）を含有するＥｃｏＲＩ　−Ｂａ５Ｈ１断片を配列法定記よってチェックした。

プラスミドにコード化されたＶＡＣ−βをマキセル系（ａ　ｍａｘｉｃｅｌｌ　 ｓｙｓｔｅｍ）で検出した（Ａ。

５ａｎｃａｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１３７　（１９７９ ）　、ｐｐ。

６９２−６９３）。

ｐＲＨ２８４Ｔからはじまる形質発現ベクターの構築がＶＡＣ−βの形質発現の ため特に好ましい、この目的のため、ＶＡＣ−βをコードする挿入物（ｉｎｓｅ ｒｔ）を適当な方法で形質発現ベクター中につないだ０例えばベクターｐＲ）Ｉ ２１２をこの挿入物の出発物質として用いることができる。

形質発現ベクターｐＲＨ２８４Ｔを５ａｃｌで長鎖化し、３′突出末端をＤＮＡ ポリメラーゼｌ／クレノー断片及びｄＧＴＰを用いてストレイト（ｓｔｒａｉｇ ｈｔ）末端に変換した。ベクターを５ａｌｌ断片で再切断し、長い断片を単離し た。クローンｐＲＨ２１２のＨｉｎｄｌｌ［−３ａｉｌ挿入物を単離した。一対 のオリゴヌクレオチドをＶＡＣ−β挿入物及び調製されたｐＲＨ２８４Ｔでつな いだ。

Ｅ、コリ　ＨＢＩＯＩをリガーゼ溶液で形質転換した。得られたクローンをｐＲ Ｈ２９２と命名した（図１８）。

テトラサイクリン抵抗性遺伝子はそのプロモーターから５ａｉ１部位まで形質発 現ベクターｐＲＨ２９１（ＶＡＣ−α）及びｐＲＨ２９２（ＶＡＣ−β）におい て削られているので、これらのベクターはテトラサイクリン抵抗性を与えること ができない、テトラサイクリン抵抗性形質発現ベクターは例えば図３６の計画に 従う構築によって得ることができる。ＶＡＣ−α及びＶＡＣ−βＣＤＮＡは各々 ３′非翻訳領域に５ｐｈＩ部位を有する。該ベクターのβ−ラクタマーゼ遺伝子 内にＰｖｕＩ部位がある０両認識配列とも単数（ｓｉｎｇｕｌａｒ）である、従 ってＰｖｕｌ及び５ｐｈＩで切断することによって、β−ラクタマーゼ遺伝子、 ｐｈｏＡプロモーター、及びＶＡＣ−αもしくはβといくばくかの３′非翻訳ｃ ＤＮＡの全コード部分を含有するｃＤＮＡを２つの形質発現ベクターから遊離さ せることができる。他方、ｐｖｕｌ及びＥｃｏＲＩで切断することにより、β− ラクタマーゼ遺伝子の残り、複製開始点（ｔｈｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏ＋ｌＩｏ ｒｉｇｉｎ）　、及びプロモーター含有全テトラサイクリン抵抗性遺伝子をプラ スミドｐＡＴ１５３から遊離させることができる。５ｐｈｌまたはＥＣ０ＲＩ末 端を酵素処理でまっすぐにする（ａｒｅ　ｓｔｒａｉｇｈｔｅｎｅｄ）場合には 和合性末端（ｃｏ＋５ｐａｔｉｂｌｅ　ｅｎｄｓ）が得られる。ベクター断片と ＶＡＣ−αもしくはＶＡＣ−βｃＤＮＡ合音断片をつなぐ場合には、完全なテト ラサイクリン抵抗性遺伝子を合音する形質発現ベクターｐＧＮ２５　（ＶＡＣ− α）、ｐＧＮ２６　（ＶＡＣ−β）が形成される。

受容宿主生物、特にＥ、コリより具体的にはＥ、コリＨＢＩＯＩをかくして調製 した形質発現ベクターで形質転換し、適当な培地で培養した。

ＶＡＣ−α及びＶＡＣ−βの形質発現に好適な培地をその成分で記述する。

以下の組成を臂する培地が特に適当である：培地１）予備培養 発酵のため、例えば予備培養培地に対応形質発現ベクターで形質転換されたＥ、 コリを植菌し、攪拌及び酵素導入上培養した。

この予備培養物のい（ふんかを主培養培地を含む発酵槽に移し、攪拌通気下に培 養した０発酵中、グルコース濃度及び酸素分圧を観測し、最適に調製した。約２ ０時間の発酵後、混合物を冷却し、栄養培地をバイオマスから分離し、凍結した 。

形質発現タンパク質を例えばウェスタンプロットによって検出した。結果を図１ ９に示す。

「＋リン酸塩」は形質発現のないコントロールであり、「−リン酸塩」はアルカ リホスファターゼプロモーターの制御下でのＶＡＣ−４（り０−７ＨＢ１０１／ ｐＲＨ２９１）またはＶＡＣ−一β（クローンＨＢＩＯＩ／ｐＲＨ２９２）タン パク質の形質発現を示す、ＶＡＣ−α及びＶＡＣ−βタンパク質とも染色したゲ ル（ｓｔａｉｎｅｄ　ｇｅｌ）で検出することができる。生成したＶＡＣタンパ ク質の量は、驚くべきことに少なくとも２０ｍｇ／　ｊ　／　ＯＤ　ｈ。。１゜ 細菌培養液である。

ウェスタンプロットは染色されたＶＡＣ−αバンドを明瞭に示す、加えて９、よ り低い分子量のいくつかのタンパク質が３０ＫＤまでの範囲で見られるが、ＶＡ Ｃ−αタンパク質のＮ及び／またはＣ末端でのタンパク質加水分解切断によって 生じたものかもしれない、別の注目される特徴は２０ＫＤより下の範囲における 抗血清によって認識されるタンパク質であり、このタンパク質はタンパク質加水 分解で生じたＶＡＣ−αタンパク質の半分子である可能性がある。驚くべきこと に、ＶＡＣ−βも抗ＶＡＣ血清によって認識された。このバンドはＶＡＣ−αバ ンドよりずっと弱く着色されるがクマシーブルーで染色したゲル中でのＶＡＣ− βバンドはその強度においてＶＡＣ−αに相当するので、抗ＶＡＣ抗血清による ＶＡＣ−βタンパク質の認識はＶＡＣ−αタンパク質の認識より実質上弱いと結 論できる。

形質転換タンパク質を単離し、精製するために、凍結バイオマスを適当な溶菌緩 衝液に懸濁した。ついで細胞を例えばマントン−ガラリンプレスを用いて機械的 に破壊した。ポリエチレンイミン等の非タンパク質構成成分の沈澱剤の添加後、 固体成分を例えば遠心分離によって除去する。タンパク質を好ましくは硫酸アン モニウム分画によって沈澱し、沈澱を溶解し、沈澱剤を除去し、溶液を清澄化し て（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、得られる抽出物を種々のクロマトグラフィ ー精製工程に及せしめた。なお、タンパク質沈澱の代りに、粗ＶＡＣ抽出物をク ロマトグラフィー予備精製によって精製し、ついで精製サイクルに付すこともで きる０例えばＳｉＯ２が予備精製のカラム物質として適当であることが明らかと なったが、同様な性質を有する他の物質も適当である０本発明ではＭｅｓｓｒｓ 　Ｇｒａｃｅ社製造の５ｉｌｉｃａ　Ｃａｔａｌｙｓｔ　Ｃａｒｒｉｅｒ　ｓ　 ｇｒａｄｅ　９５３Ｗを用いた０本発明のタンパク質の精製に適当なりロマトグ ラフィー精製サイクルは例えばＤＥＡＥ高速（ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ）セファロー スクロマトグラフィー、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ−２００高解 像（Ｈｉｇｈ　Ｒｅ５ｏｌｕｔｉｏｎ）クロマトグラフィー及びＱ　−５ｅｐｂ ａｒｏｓｅＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ　Ｃｈｎｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙよりなってし） た、このようにして得られた本発明のタンパク質の純度は５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ウ ェスタンブロンド、ゲル透過ＨＰＬＣ，逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ，アミノ酸測定、Ｎ− 末端配列決定及び等電点電気泳動によってめた。

培養、単離及び精製のすべての工程で留意しなければならないパラメータ、例え ば温度、量比、各工程の配列、ｐＩＩ値、特別の試薬等は当業者に知られている 。後で述べる実施例は必要に応じ当業者に公知の手法で適宜修飾することができ る。

遺伝子工学によって生産されたＶＡＣタンパク質（以後、ｒ−ＶＡＣと略称する ）が天然の物質から得られるＶＡＣタンパク質（ＥＰＡＯ１８１４６５）（以後 ＶＡｃという）　とａ造及び生り活性の両面で同じかどうかを決定することが特 に重要である。

これらの質問に答えるために以下の方法を用いた。

１　ゲル透過ＨＰＬＣ ２逆相ＨＰＬＣ ３Ｎ末端配列決定 ４　トリプシンペプチドマツプ ５　ウェスタンプロット ６　等電点電気泳動 ゲル透過ＨＰＬＣによると分子量はＶＡＣについては３４０００、ｒ−ＶＡＣに ついて３３０００であったが、これは方法の正確性の範囲内で等価とみなすこと ができる。＠密にいうと用いたカラムが分子量でなく分子サイズで異なっている （ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｃ）ことが留意されるべきである。

逆相ＨＰＬＣでは両タンパク質とも約２９分の保持時間の後溶出する。

アミノ酸３９までのｒ−ＶＡＣのＮ−末端配列決定は予想された配列と１００％ 一致した。遺伝子工学で生産されるタンパク質においてしばしば付加的に見い出 されるＮ末端メチオニンは驚くべきことに検出されなかった。予想されたように ｒ−ＶＡＣのＮ末端はブロックされない状態で存在している。

２つのタンパク質の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる比較も実質上同一の挙動を示した０ 両者とも明らかにジスルフィド橋によって結合するダイマー形態を含んでおり、 ジチオスレイトールによって還元することができる。

ウェスタンプロットによる免疫的比較によっても２つのタンパク質の同一性が確 認された。

等電点測定て見い出されたｒ−ＶＡＣにおける＋〇、　１　ｐＨ単位の差は遊離 Ｎ末端（ｆｒｅｅ　Ｎ−ｔｅｒｓ＋１ｎｕｓ）によって説明することができる。

ｒ−ＶＡＣの生物活性をチェックするために、種々の凝固テストを行い、結果を 天然物質からのＶＡＣを用いて得られる結果と比較した０行われたすべての凝固 テスト、修飾したプロトロンビン時間テスト及びトロンビンテスト、さらには組 織因子で活性化した血＠　（ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ 　ｐｌａｓｍａ）中でのＸａ因子の生成は、ｒ−ＶＡＣが生物活性を有すること 及びその生物活性が天然物質からのＶＡＣのそれと区別できないたとを明らかに 証明している。

ＶＡＣ−βのｃＤＮＡから導いたアミノ酸配列はＶＡＣ−αと５４％の相同性を 示している。これらの知見に基き、我々はＶＡＣ−βのいくつかの生物活性を調 べ、ＶＡＣ−αと比較した。

１）　プロトロンビナーゼ活性に対するＶＡＣ−αとＶＡＣ−βの影響　・ ４７図は２つのタンパク質ＶＡＣ−αとＶＡＣ−βがプロトロンビナーゼ活性に 対し、同じ阻害作用を及ぼすことを示す。

このことはＶＡＣ−αとＶＡＣ−βが同じ機構により凝固を抑制することを示唆 している。

２）　ＶＡＣのホスホリパーゼ阻害活性それらの一次構造から、ＶＡＣ−α及び ＶＡＣ−βはアネクシン（ａｎｎｅｗｉｎｓ）の群（ｆａ＋ａｉ　ｌｙ）に分類 することができる（Ｇｅｉｓｏｗ、　Ｍ、　Ｊ、（１９８６）　Ｆｅｂｓ　Ｌｅ ｔｔｅｒｓ２０３．９９−１０３）、この群の他のメンバー、例えばカルバクチ ン（ｃａｌ−ｐａｃｔｉｎ　］及び■）がホスホリパーゼ阻害剤であることが示 されている。これはリン脂質へのカルシウム依存性結合及びそれによるホスホリ パーゼのその基質への接近を阻止することによってこの活性を表わす（Ｄａｕｉ ｄｓｏｎ、　Ｆ、Ｆ、、Ｄｅｎｎｉｓ　、　Ｅ、Ａ、、Ｐｏｗｅｌｌ＋Ｍ、＋＆ 　Ｇｌｅｎｎｅｙ　ｔ　Ｊ、Ｒ−＋Ｊｒ　（１９８７）　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｗ。

２６２．１６９Ｂ−１７０５）。

ＶＡＣ−α及びＶＡＣ−βはカルシウム依存的にリン脂質に結合するので、２つ のタンパク質も抗ホスホリパーゼ活性を有するかどうか検討した。この目的のた め、３Ｈ−オレイン酸で標識したＥ、コリを用いる操作を選んだ。

４８及び４９図はＶＡＣ−α、ＶＡＣ−β共ホスホリパーゼＡ、活性を阻害する ことを示している。さらに両タンパク質は選ばれた条件下で同じ程度に活性であ る。すなわち５０％阻害は約６５ｎＭのＶＡＣ−αもしくはＶＡＣ−βで達成さ れている。基質濃度を半分にするとＶＡＣのＩＤ５ｏも％に減少する。このこと はＶＡＣが基質のレベル（１ｅｖｅｌ）で働くことを示している。従って、ＶＡ Ｃがリン脂質膜に結合し、もってホスホリパーゼ活性を阻害するどとはありそう なことである。

カルバクチン（ｃａｌｐａｃｔｉｎ）　Ｉがマイクロモル濃度のＣ″００レベル ン脂質膜に結合することが示された（Ｄｒｕｓｔ、Ｄ、Ｓ、＆　ＣｒｅｕｔｚＣ ，Ｅ、（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ３３１．８８−９１）、我々はＶＡＣが低カ ルシウム濃度でホスホリパーゼ活性を阻害することができるかどうか調べた。膵 臓ホスホリパーゼＡ！は５０μＭより下のＣａ”°濃度では不活性であったので 、これがもっとも低いテスト濃度である０図５０及び５１はホスホリパーゼ活性 のＶＡＣ誘導阻害のカルシウム依存性を示している。テストしたすべてのＣａ　 ”濃度でＶＡＣ−α、ＶＡＣ−βとも阻害活性を示した。しかしながら、ＶＡＣ −αとＶＡＣ−βの間には機能的差異があるように思われる。もっとも低いＣａ ”濃度で、ＶＡＣ−βはＶＡＣ−αより有意により有効であった。このことはＶ ＡＣ−βが膜結合のためにより少ないＣａ″０しか必要としないことを意味して いると考えることができる。

本発明によって得られるＶＡＣタンパク質はそれ自体公知の方法で他のＶＡＣタ ンパク！（ペプチド）に変換することができる。

テストの結果、ジスルフィド橋は天然ＶＡＣの凝固抑制活性と関係を有さないこ とが分った。宿主細胞の選択によってもシスティン基同士が一次翻訳産物中で天 然に起こるプロセスと異なるように結合してジスルフィド橋を形成することを除 外することはできない、確立した（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　）産物の「誤った 」三次構造が価値ある薬理活性、特に凝固抑制活性の減少さらには損失もしくは あるいは改良をもたらすことが考えられ、このことを上述のＶＡＣアンセイを用 いて調べることができる。かかる場合、ジスルフィド結合を適当な還元剤で切断 し、還元ポリペプチドを適当な酸化剤で処理してジスルフィド結合を再形成させ るのが適当である。生成した・生産物のＶＡＣ活性を用いて、選ばれた条件（還 元及び／または酸化剤）が生物活性における目的とする増加をもたらすか、また はその条件を公知の方法で修正しなければならないかを決めることが可能である 。

ジスルフィド橋を切断するために適当な還元剤の例はチオール化合物、例えばチ オフェノール、４−ニトロチオフェノール、１゜４−ブタンジチオール及び特に １．４−ジチオスレイトールを含む、還元は水性アルカリ性媒体中、例えば水酸 化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸 塩、または有機塩基、特に例えばトリエチルアミン等のトリ低級アルキルアミン の希水溶液中室温で行うのが有利である。

還元されたポリペプチド中にジスルフィド結合を再形成させるのに適当な酸化剤 は例えば空気からの酸素の包含し、空気は必要に応じ触媒量の例えば硫酸鉄（■ ）、塩化鉄（Ｉｌｌ）もしくは硫酸銅（ｎ）等の遷移金属塩を加えた該ポリペプ チドの水溶液を通過させる。上記適当な酸化剤はまた好ましくはメタノール等の アルコール溶液もしくは水性的ノール等の水性アルコール溶液中で用いられる、 ヨウ素もしくはヨウ化カリウム付加ヨウ素、ＫＩＳの形態にあるヨウ素；水溶液 中のへキサシアノ鉄酸（ｍ）カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｈｅｘａｃｙａｎ ｏ−ｆｅｒｒａｔｅ　（ｍ）　）　；水中または水と水とまじりあうアルコール （例えばメタノール）よりなる混合物中で反応させる１、２−ショートエタンま たはアゾジカルボン酸ジメチルもしくはジエチルを包含する。酸化は特に周囲温 度で行う。

試薬、特に塩及び酸化もしくは還元剤、及び目的ＶＡＣ化合物からの二次生産物 の分離はそれ自体公知の方法、例えばセファデックスもしくはバイオゲル等を用 いる分子量濾過（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に よって行われる。

本方法によ、って得られるＶＡＣ活性を有する化合物の混合物は公知の方法で個 々の成分に分離することができる０分離の適当な方法は例えば吸着クロマトグラ フィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣもしくは逆相ＨＰＬＣ等のク ロマトグラフィー法；及びまた多重分配；酢酸セルロース電気泳動、ゲル電気泳 動、特にポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）等の電気泳動法を包含す る。

本発明によって製造することができる化合物は遊離形態のみならず塩、特に医薬 上許容される塩の形態で存在する０本発明の化合物は遊離アミノ基を有する複数 のアミノ酸基を含有するので、例えば酸付加塩の形態で存在することができる。

用いられる酸付加塩は特に常用の療法的に有用な酸との生理上許容される塩であ ることができる。無機酸の例は塩酸等のハロゲン化水素酸（ｈｙｄｒｏｈａｌｉ ｃ　ａｃｉｄｓ）　、硫酸、リン酸、ビロリン酸等を包含し、有Ｉ！酸の例はま ず第１にベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、低級アルカンスルホン 酸（例えばメタンスルホンｉ２）等のスルホン酸、酢酸、乳酸、パルミチン酸、 ステアリン酸、リンゴ酸、酒石酸、アスコルビン酸、クエン酸等のカルボン酸を 包含する。ＶＡＣ化合物は遊離のカルボキシル基ををするアミノ酸基も含むので 、金属塩、特にナトリウム、カルシウム、マグネシウム塩等のアルカリ金属もし くはアルカリ土類金属塩として、またはアンモニアもしくは生理的に許容される 有ＩＩ窒素含有塩基から導かれるアンモニウム塩として存在することもできる。

しかしながら、ＶＡＣ化合物は遊離カルボンキシル基も遊離アミノ基も含有する ので、内部塩としても存在し得る。

用いられる操作によって、本発明の化合物は遊離形態、酸付加塩または塩基との 塩の形態で得られる。遊離化合物は酸付加塩及び塩基との塩から公知の方法によ りて、例えばｐＨを等電点に調整することによって得ることができる。同様に逆 に療法的に許容される酸付加塩もしくは塩基との塩は遊離化合物から、酸もしく は塩基、例えば上述の塩を形成する酸もしくは塩基との反応、及び蒸発もしくは 凍結乾燥によって得ることができる特異的抗原に結合する抗体の性質は身体外で の定性及び定量測定（免疫アッセイ）において及び抗原の精製（免疫アフィニテ ィークロマトグラフィー）において実用性をもたらす、免疫化した動物の血清は 通常同じ抗原と異なる結合部位、異なる親和性で反応する種々の異なる抗体、及 び個体の以前の体験を反映する他の抗原に対する抗体を含有する。しかしながら 、抗原を検出、精製する抗体の成功的使用には高い特異性と再現性が必要である 。

これらの必要性を満足する均質な（ｈｏｍｏｇｃｎｅｏｕｓ　）抗体がＫｏｈｌ ｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ　（１７）によって記述されたハイブリドーマ技術に よって入手可能となった。基本的には、この技術は例えば免疫化した動物の肺臓 からの、抗体分泌Ｂ−リンパ球と腫瘍細胞を融合させることよりなる。形成され たはハイブリドーマ細胞は分割によって無制限に複製する能力と均一な抗体を生 成し分泌する能力を併有する。非融合腫瘍細胞は死滅するがハイブリドーマ細胞 は複製する選択培地での培養及び適当な操作によって、クローン、すなわち単一 のハイブリドーマ細胞から導かれ遺伝的に同一の細胞集団を得て培養することが 可能であり、細胞によって生産されたモノクローナル抗体はついで単離される。

本発明はＶＡＣに対するモノクローナル抗体、かかる抗体を生産するハイブリド ーマ細胞及びそれらを製造する方法に関する。

ハイブリドーマ細胞系及び、ＶＡＣと特異的に反応し、それらによって分泌され るモノクローナル抗体が好ましい、モノクローナ゛　ル抗ＶＡＣ−ａ及び抗ＶＡ Ｃ−β抗体の製造方法はマウスをＶＡＣで免疫化し、免疫化動物からのＢ−リン パ球をミエローマ細胞と融合させ、形成されたハイブリドーマ細胞をクローン化 し、ついで生体外でまたはマウスに注射することによっ培養し、抗体を培養物か ら単離することを特徴とする。

本発明はさらに免疫アフィニティークロマトグラフィーカラム、及びこれらの抗 体を含有する免疫アッセイ用テストキットに関する。

本発明方法によれば、Ｂａ１ｂ／Ｃマウス等のマウスを公知の手法で免疫化する 。好ましいＳ様においては、ＶＡＣを大ざっばにいって毎週もしくはより長い間 隔で十分な数の抗体生産Ｂ　−ＩＪンバ球が生成するまで数週間以上、例えば５ 〜１２週間注射する。

用いたＶＡＣの免疫原性を高めるために、ＶＡＣを強度に免疫原性の担体、例え ば異種アルブミン（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ａｌｂｕｍｉｎ）またはキーホ ールリンブレンドヘモシアニン（ＫＬ）（）に結合させた（ｗａｓ　ｃｏｕｐｌ ｅｄＬ好ましくは、異なるＶ　Ａ　Ｃ／Ｋ　Ｌ　Ｈ１ｉｉ製物を用い、成る免疫 化計画に従って十分な抗体産性細胞が生成するまで、例えば約４０週まだ免疫化 を続けた。

Ｂ−リンパ球を含有する器官、例えば肺臓細胞を免疫化したマウスから取り出し 、突然変異の結果、選択培養培地で増殖できないミエローマ細胞と融合させる。

かかるミエローマ細胞は知られており、例えばＸ６３−Ａｇ３、Ｘ６３−Ａｇ３ ．６．５．３、ＭＰＣ−１１、ＮＳＪ−Ａｇ４／１、ＭＯＰＣ−２１ＮＳ／１ま たは５Ｐ２１０を包含する。好ましい態様においては、免疫化したマウスからの 肺臓細胞を細胞系Ｘ６３−Ａｇ３．６．５．３のミエローマ細胞と融合させる。

融合は公知の方法によってポリエチレングリコールセンダイウィルス、塩化カル シウム、リゾレシチン等の細胞融合剤の添加と共に、Ｂ−リンパ球とミエローマ 細胞を混合することに゛よって行う、融合は好ましくは例えば１０００〜４００ ０の分子量のポリエチレングリコールの存在下に行う。

融合後、得られるハイブリッドをヒボキサンチン、アミノプテリン及びチミジン （ＨＡＴ培地）を加えた選択培養培地に公知の方法で培養する。非融合ミエロー マ細胞はこの培地で増殖できず、正常リンパ球と同様死滅する。

ハイブリドーマ培養物の上清の特異的抗体含量は公知の方法によって、例えば放 射免疫アッセイ、ＥＬ　Ｉ　ＳＡまたは凝集によってテストすることができる。

驚くべきことに、ＶＡＣに特異的な抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を上述の 方法で得ることができることが見い出された。目的とする特異性の抗体を産性す るハイブリドーマ細胞は融合によって生産された種々のハイブリドーマ細胞の混 合物からクローニングによって選択される。これをなすために、培養液を、限界 希釈法として知られる方法によって単一の増殖細胞からなるように調整する。

大量生産のために、目的とする特異性の抗体を産性するハイブリドーマ細胞クロ ーンを生体外で公知の培地に培養するか、複製のためマウスに注入する。好まし い態様においては、ハイブリドーマ細胞をブリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）で前 処理したマウスに注入し、腹水を取り出し、そこから抗体を硫酸アンモニウム溶 液で沈澱させて単離する。

これらのハイブリドーマ細胞によって得られるＶＡＣ特異的抗体は公知の手法で 免疫アフィニティーカラムをつくるのに用いることができる０本発明の好ましい ８！１においては、適当な担体物質（１ｓ、衝溶液に懸濁）を抗体溶液と混合し 、結合しなかった成分を洗浄除去し、担体物質の未占有部位をブロックする。ハ イブリドーマ細胞より得られるＶＡＣ特異的抗体は公知の手法でテストキットを 製造するのに用いることができる。これらのテトスキソトは種々の方法、例えば 放射線免疫アンセイ、ラテッスク凝集、スポットテスト、競合もしくはサンドイ ンチ免疫アンセイ、酵素免疫アンセイ、免疫螢光法、免疫化学酵素テストに基礎 を置くことができる。これらのキットは種々の起源の常用の抗体に加え、酵素も しくは螢光担体との抗体複合体、さらに放射性同位元素例えば１１２Ｂで標識す るか、酵素例えばホースラディシュパーオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ 　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）もしくはアルカリホスファターゼを複合化したＶＡＣ ｌさらに酵素気質、適当な緩衝剤、ゲル、ラテックス、ボーリスチレンまたは他 の増量剤及び担体を含有することができる。

本発明によって得られる既知タンパク質（ペプチド）は価値ある薬理的性質を有 し、予防薬として、さらには特に療法目的のために用いることができる。

本発明の新規ＶＡＣ化合物は従って天然ＶＡＣと同様に術後血栓症の予防も含め 血栓症及び血栓塞栓症の治療及び予防；急性シッンクの処置（例えば敗血症によ って起こるもしくは多外傷性の（ｐｏｌｙｔｒａｕ蒙ａｔｉｃ　）シ費ンク）； 消費性凝固障害の治療；血液透析；血液分離；保存血液；対外循環（ｅｘｔｒａ ｃｏｒｐｏｒｅａｌｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）に用いることができる。

本発明は本発明の化合物の少なくとも１つもしくは医薬的に許容されるその塩、 及び任意的な、医薬的に許容される担体及び／または賦形剤を含有する医薬組成 物に関する。これらの組成物は、例えば非経口ルート、（例えば静脈内、皮肉、 皮下もしくは筋肉内ルートまたは局所に投与する場合、特に上述の適応症に用い ることができる。゛ 本発明はまた本発明の新規化合物及びそれらを含有する組成物の、ヒト及び動物 の体の予防できる処置及び治療的処置のための、特に上記症候群のための、なか んずくヒト及び動物の内部及び外部での血液凝固を抑制するための使用に関する 。

投与量は主として投与の具体的形態及び治療もしくは予防の目的による０個々の 投与量の大きさ及び投与プランは特定の症例の個々の評価のもとに最適に決定す ることができる。関連の血液因子（ｂｌｏｏｄ　ｆａｃｔｏｒｓ　）を決定する のに必要とされる方法は当業者に周知である０通常、注入について、本発明化合 物の療法的に有効な量は約０．０　Ｏ５〜０．１ｍｇ／ｋｇ体重である。好まし い範囲は約０．０１〜約０．０５ｍｇ／ｂ体重である。該物質は静脈内、筋肉内 もしくは皮下注射によって投与される。非常経口投与用医薬製剤は単一投与形態 で、投与方法によって、用量あたり本発明化合物約０．４〜約７．５　Ｂ含有す る。活性物質に加え、これらの医薬組成物は通常ｐＨを約３．５〜７に保つため の緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝剤、及び等張溶液をつくるための塩化ナトリウム 、マンニトールもしくはソルビトールも含有する１本組成物は凍結乾燥形態でも 溶解された形態でもよく、溶液の場合は抗菌作用を有する保存剤、例えば０．２ 〜０．３％の４−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはエチルを含有することがで きる０局所使用用製剤は水溶液、ローシランもしくはゼリー、油性溶液もしくは 懸濁液、または油性の（ｇｒｅａｓｙ）もしくはより具体的には乳化した軟膏の 形態をとることができる。水溶液形態の製剤は例えば本発明の活性物質もしくは その療法的に許容される塩をｐＨ４〜６．５で緩衝剤水溶液に溶解し、必要に応 じ、抗炎症剤等の別の活性物質、及／またはポリビニルピロリドン等の高分子結 合剤及び／または保存剤を添加することによって得ることができる。活性物質の 濃度は溶液１０−２もしくはゲル１０ｇ中約０．１〜約１．５　ｍｇ、好ましく は０．２５〜１．０請８である。

局所適用用油性製剤は例えば本発明の活性物質もしくはその療法上許容される塩 を油に、ステアリン酸アルミニウム等の膨潤剤、及び／またはＨＬＢ値（！！水 性親油性バランス）が１０より下の界面活性剤例えばグリセリンモノステアレー ト、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステアレートもしくはソルビタ ンモノラレ−ト等の多価アルコールの脂肪酸モノエステルの任意的添加と共に、 懸濁することによって得られる。油性軟膏は例えば本発明の活性物質もしくはそ の塩を伸展し得る（ｓｐｒｅａｄａｂｌｅ）油性基Ｍ　（ｂａｓｅ）　、１０よ り小さなＦＩＬＢ値を有する界面活性剤の任意的添加と共に懸濁することによっ て得られる。乳化軟膏は本発明の物質もしくはその塩の水溶液を軟らかい、伸展 し得る油性基剤中で、１０より下のＨＬＢ値の界面活性剤を添加してトリチュレ ートすることによって得られる。これらの局所製剤はすべて保存剤を含有してい てもよい、活性物質の濃度は基剤組成物約１０ｇ中０．１〜１．５　ｍｇ、好ま しくは０．２５〜１．０　ｍｇである。

ヒトもしくは動物の体に直接医療的に使用することを目的とする上述の医Ｎ組成 物及びその類憤物に加え、本発明はまたヒトもしくは動哺乳動物の生体外での医 療的使用のための医薬組成物及び製剤に関する。この種の組成物及び製剤は主と して、循環もしくは処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　）　（例えば人工腎臓における 対外循環もしくは透析）、身体外での保存もしくは修飾（例えば血液分離）に供 せられる血液への抗凝固添加剤として用いられる。これらの製剤は、例えば投与 量単位の形態にある貯蔵溶液もしくは製剤の組成は上述の注入できる製剤と同様 である。しかしながら、活性物質の量もしく゛は濃度は処理される血液の量に関 連させるのがよい。

具体的目的によって、適当な用量範囲は、上限は危険な−く越えることができる けれども、血液１１あたり活性物質約０．０１〜１．０−ｇである。

特に、本発明は実施列に記述するようにＶＡＣタンパク質をコードするＤＮＡ分 子、かかるＤＮＡ分子を含有する形質発現プラスミド、かかる形質発現プラスミ ドで形質転換した微生物、ＶＡＣに対するモノクローナル抗体、かかる抗体を産 性するハイブリドーマ細胞、及びかかる抗体を含有する免疫アッセイ用テトスキ フト、実施例に記述するそれらを製造する方法及び実施例に記述する形質転換微 生物によってＶＡＣ活性を有するタンパク質／ポリペプチドを製造する方法、及 び実施例に記述する新規ＶＡＣ化合物に関する。

本願が簡単に脈管系抗凝固タンパク質もしくはＶＡＣタンパク質という場合は、 それは最初にＥＰＡ１８１４６５に記述したタンパク質に固有の性質を本質的に 有するポリペプチド／タンパク質に関している。これらの性質はそこに記述した テスト及び特徴づけによって検出し、チェックできる（ＶＡＣ活性）。

この定義はまた、それ自身集合形態において生物活性を有さないかもしくは制限 された生物活性しか有さなくても、生体内もしくは生体外で少なくとも１つの活 性成分に変換される限り、例えばダイマー、トリマーもしくはテトラマー等の集 合体を構成するポリペプチド／タンパク質を包含する。

本発明の範囲内で、それ自身生物活性を有さないか制限された生物活性しか有さ ないポリペプチド／タンパク質、例えば融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ　ｐｎｏ ｔｅｉｎｓ　）もしくはいわゆるプロドラッグ；当業者に公知の方法で、例えば 生体外もしくは生体内での処理によりて活性成分に変換することができるポリペ プチド／タンパク質；または生体内でのみ活性を発揮するポリペプチド／タンパ ク質が得られる場合、これらも脈管系抗凝固剤タンパク質、短くはＶＡＣタンパ ク質の定義に包含され、本発明の目的の一部となる。

ｒＶＡＣ活性を有する化合物」なる句は上記形質転換宿主細胞によって形質発現 され、ＶＡＣ活性及び抗ＶＡＣ抗体との陽性反応を示し、ＶＡＣの一次構造もし くはそれに由来する構造を有するポリペプチドを指称する。ＶＡＣの一次構造に 由来する構造を有するＶＡＣ化合物は修飾がＶＡＣの一次構造の短縮化、リピー ト構造の再配置または安定性もしくは活性の変化をもたらす修飾よりなる修飾さ れたＶＡＣ化合物である。

本発明において、−ｒＶＡＣ−ＤＮＡ／遺伝子」なる語は前に定義したＶＡＣタ ンパク質をコードするＤＮＡ分子を指称する。

以下の実施例及び図面は本発明を例示するためのものであり、いかなる意味にお いても限定するものではない。

以下の実施例を単純化するため、しばしば操り返される方法を短縮した形で記述 する。

プラスミドは大文字及び数字を後に付した小文字のｒｐＪで記載される。出発プ ラスミドは制限なく商業上もしくは公共上入手できる。それらはまた公知の手法 によりかかるプラスミドから構築できる。

ＤＮＡの「切断Ｊ　（ｃｕｔｔｉｎｇ　）もしくは「消化」は制限部位として知 られるこの目的のための特異的部位での制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）に よるＤＮＡの触媒的切断を指称する。制限エンドヌクレアーゼは商業上入手でき 、製造者によって推奨される条件下で用いる（ＩＩ衝剤、担体タンパク質として のウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）抗酸化剤としてのジチオスレイトール（Ｄ ＴＴ））。

制限エンドヌクレアーゼは大文字で記載され、通常小文字及び通常ローマ数字が 後に続く０文字は当面の制限エンドヌクレアーゼが単離された微生物による（例 えば、３ｅａｌ；セラチア・マルセンスンス）０通常、約１μｇのＤＮＡが約２ ０μｌの緩衝溶液中の１単位以上の酵素で切断される０通常、３７℃で１時間の インキュベーシッン期間が用いられるが、製造者によりて提供される使用のため の指示により変化させることができる。切断後、ときとして５′リン酸基を子牛 の腸からのアルカリホスファターゼ（ＣＩ　Ｐ）を用いるインキュベーシヨンに より除去する。これは引き続いてのりガーゼ反応（例えば第２のＤＮＡ断片の挿 入なしの、直鎖化プラスミドの環状化）における特異的部位の好ましくない反応 を防止するのに役立つ、別に注記しない場合、ＤＮＡ断片は通常１１１１Ｉｌ！ エンドヌクレアーゼで切断後脱リン酸化されない。

アルカリホスファターゼを用いるインキユベーシヨンの反応条件は例えばｔｈｅ 　Ｍ　１３　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　５ｅｑｕ’ｅｎｃｉｎｇ　Ｈａｎｄｂｏ ｏｋ（Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄ　Ｓｅｑｕｅａｉｎｇ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｐｕｂ ｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐ　Ｉ　／　１　２　９／８３／１２ ）に見出される。インキエベーシッン後、タンパク質をフェノール及びクロロホ ルムによる抽出で除去し、ＤＮＡを水相からエタノールの添加によって沈澱させ る。

特異的ＤＮＡ断片の「単離」は切断したＤＮＡを例えば１％アガロールゲルで分 離することをいう、を気泳動、及びエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を用いる 染色によりＵＶ先光下ＤＮＡを見えるようにした後、目的とする断片を、さらな る電気泳動によってＤ　Ｅ　８１　ｐａｐｅｒ　（Ｓｃｈｌｅｉｃｂｅｒ　ａｎ ｄ　５ｃｈｉｉｌｌ）に通用し、結合さセた分子量マーカーによって局在化させ る。ＤＮＡを低塩緩衝液（２００ｍＭ　ＮａＣ１，２０ｍＭ）リスｐｎ−７，ｓ 、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）ですすぐことに゛よって洗浄し、高塩緩衝液（１ｍＭ　Ｎ ａＣ１，２０ｍＭ）リスｐＨ鱒７．５．１■Ｍ　ＥＤＴＡ）で溶出する。ＤＮＡ をエタノール添加により沈澱させる。「サザン分析」はＤＮＡ混合物中の特異的 ＤＮＡ断片の存在を、既知の標識したオリゴヌクレオチドプローブもしくは標識 したＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションによって実証する方法である。別に 注記しない場合、これより以後のサザン分析、Ｅ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、　 Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８（１９７８）、ｐａｇｅｓ　５０３−５１７の方法 及びＲ，Ｂａｕｐｔｍａｎｅｔ　ａｌ、ＪａｃｌｅｉｅＡｃｉｄｓＲｅｓ、１３ 　（１９８５）　、ｐａｇｅｓ　４７３９−４７４９に記載されたハイブリダイ ゼーションを用いる、ＤＮＡ混合物の１％アガロースゲルでの分離、変性及びニ トロセルロースフィルターへの移行（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｂｉ ｉｌｌ）　、Ｂ　Ａ　８５　）を意味する。

「形質転換」はＤＮＡがそこで染色体外にもしくは染色対組込み対（ａ　ｃｈｒ ｏ＠ｏｓｏｍａｌ　ｉｎｔｅｇｒａｎｔ　）として複製されるように生物中にＤ ＮＡを導入することを指称する。Ｅ、コリの形質転換はｔｈｅ　Ｍ　１　３　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　（Ｃｌｏｎ ｉｎｇ　ａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ 　ｂｙ　Ａｍｅｒｓｈａｗ、　Ｐ　Ｉ　／　１２９　／８３／１２）で具体化さ れている方法に従う。

ＤＮＡの「配列決定」はＤＮＡ中のヌクレオチド配列の分析を意味する。これを なすために、ＤＮＡを種々の制限酵素で切断し、断片を、対応して切断したＭｌ 　３ｍｐ　８、ｍｐ９、ｍｐｌＢもしくはｍｐ１９二木鎖ＤＮＡに導入するか、 ＤＮＡを、雑音波処理、ひき続いての末端修復及びサイズ選択によって、５ｅａ ｌで切断し、脱リン酸化したＭ１３ｍｐ８ＤＮＡ　（シヲントガン法による）に 導入する。Ｅ、コリＪＭＩ　Ｏ１の形質転換後、−末鎖ＤＮＡをｔｈｅ　Ｍ　１ ３　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｍａｎｕａｌ　（Ｃｌｏ ｎｉｎｇ　ａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｈａｒ＋ｄｂｏｏｋ　ｐｕｂｌｉｓｈ ｅｄ　ｂｙ　Ａｓｅｒｓｈａｓ、　Ｐ　１　／　１２９　／８３／１２）に従っ て組変えＭ１３ファージから単離し、サンガーのジデオキシ法（Ｆ、Ｓａｎｇｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。

７４　（１９７７）　、ｐｐ、５４６３−５４６７）によって配列決定する。配 列の評価（ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）はＲ，５ｔａｄｅｎ　（Ｒ，５ｔａｄｅｎ。

ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、１０　（１９８２）　、ｐｐ４７３１−４７ ５１）によって最初に開発され、Ｃｈ、　Ｐｉｅ！ｅｒ　（Ｃ，Ｐｉｅｌｅｒｌ 　９８７、Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ　（学位論文）　％　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉ ｔｙ　ｏｆ　Ｖｉｅｎｎａ）によって修飾されたコンビエータ−プログラムを用 いて行う。

「連結Ｊ　（ｌｉｇａｔｉｏｎ）は二本鎖ＤＮＡ断片の２つの末端の間にホスホ ジエステル結合を形成させる処理を指称する０通常、１０μｌ中０．０２〜０． ２μｇのＤＮＡ断片を適当な緩衝剤溶液中約５車位の７４−ＤＮＡリガーゼ（リ ガーゼ）でつなぐ（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ、　１９８２、ｐａｇｅ４７４）　。

形質転換体からＤＮＡの「製造」はリゾチームを省く、Ｂｉｒｎｂｏｉ−及びＤ ｏｌｙ　（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ａｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ。

１９８２、ｐｐ、３６８−３６９）によって修飾されたアルカリＳＤＳ法を用い て細菌からプラスミドＤＮＡを単離することを意味する。１．５〜５０ｓＪの培 養液からの細菌が用いられる。

「オリゴヌクレオチド」は化学的に合成された短いポリデオキシヌクレオチドで ある。τｈｅ　Ａｐｙｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｓｙｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ　３８１　Ａがこのために用いられた。オリゴヌクレオチドはｔｈｅ 　ｍｏｄｅｌ　３８１　Ａ　Ｕｓｅｒ　Ｍａｎｎａｌ　（Ａｐｙｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ）従って製造され、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧ Ｅ）によって精製される。

「リン酸化」はＴ−リン酸基のＡＴＰから核酸、通常オリゴヌクレオチドの遊離 ５　’　ＯＨ基への酵素による転移を意味する。

１０μｌの溶液中で、１００１００ｐ！のオリゴヌクレオチドが１００１００ｐ のＡＴＰの存在下、１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで、適当な緩衝剤 溶液（７０ｍＭ）リス、ｐＨ−７，６，１０ａＭ　Ｍｇｃｌｚ　５＊Ｍ　ＤＴＴ ）中、３７℃で３０分でリン酸化される０反応は通常１００℃に１０分加熱する ことによって停止させる。

用いた略語はいくつかをここに定義する；ｂｐ　＝塩基対 ＢＳＡ　：ウシ血清アルブミン ＤＴＴ　ニジチオスレイトール ＥＤＴＡ　：エチレンジニトロテトラ酢酸二ナトリウム・塩ＳＤＳ　ニドデシル 硫酸ナトリウム トリス　ニドリス（ヒドロキシメチル）−アミノエタンデンハルト７０．０２％ 　フィコール、０．０２％　ポリビニルピロリドン、旬、＠２％　ＢＳＡ ＬＢ　：ｌＯｇ／ｊ）リプトン、５ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｉ　ＮａＣＪ ＩＸＳＳＣ：　１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１５−ｈクエン酸三ナトリウム、ｐＨ− １ ＴＥ　：１０ｍＭ）リス　ｐＨ鴎８．０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ数字のリスト： ０．１：胎ｆｉＶＡｃからのトリプシン断片０．２：胎盤ＶＡＣからのトリプシ ンペプチドのＨＰＬＣＯ，３：調帯ＶＡＣからのトリプシンペプチドのＨＰＬＣ Ｏ０４：胎盤及び調帯ＶＡＣのゲル透過ＨＰＬＣ０，５＝胎盤ＶＡＣの逆相ＨＰ ＬＣ ０，６：胎盤ＶＡＣ（７）ＳＤＳゲル電気泳動１　ニスクリーニングオリゴヌク レオチドＥＢＩ−３８６、：３８７及び３８８ ２　ニスクリーニングオリゴヌクレオチドＥＢＩ−１１８及び３　：ＶＡＣ−ｅ ｘ及びＶＡＣ−βＣＤＮＡを用イルノーザンプロット分析 ４　：ＶＡＣ−ｃｒｃＤＮＡ配列 ５　：ＶＡＣ−αｃＤＮＡ由来アミノ酸配列中のペプチド配列の配置 ６　：ＶＡＣ−αタンパク質中での４回の繰返し配列７　：ＶＡＣ−βｃＤＮＡ 配列 ８　７ＶＡＣ−βタンパク質中での４回の繰返し配列９　：ＶＡＣ−α及びＶＡ Ｃ−βのアミノ酸組成１０　：ＶＡＣ−α及びＶＡＣ−βｃＤＮＡを用いるゲノ ムサザンプロット分析 １１　：ＶＡＣ−αとＶＡＣ−βのアミノ酸比較１２：ＶＡＣ−ａ及びＶＡＣ− βｃＤＮＡ（７１間ノヌクレオチド比較 １３　：ＶＡＣ−ｔｘ及びＶＡＣ−βの親水性プロット１４　：ＶＡＣ−α、Ｖ ＡＣ−β、リポコルチン■及びリボコルチン■の比較 １５　：ｐＲＨ２８４中のプロモーター及びターミネータ−切片の配列 １６　：ｐＲＨ２９１の構築 １７　：ｐＲＨ２１２の構築 １８　：ｐＲＨ２９２の構築 １９：形質発現されたタンパク質のＳＤＳゲル電気泳動ａ）クマシーブルで染色 したタンパク質ゲルｂ）ウェスタンプロット 凡例：Ｍ　−分子量マーカー ＋ホスフェ−）−ＶＡＣ形賞形質の阻害−ホスフェ−）−ＶＡＣ形賞形質（ルプ ロモーター誘導） ２０：ＶＡＣ−αの精製；クマシーブルー染色ＳＤＳゲル電気泳動ゲル ノインド： １：粗抽出物 ２：硫酸アンモニウムベレット（溶解され透析された）１２：５μｇのＤＥＡＥ −ＦＦセファロース画分１−１１３　：　ＤＥＡＥ−ＦＦセファロースクロマト グラフィー後のＶＡＣプール ４：セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　−Ｓ　２００　ＨＲクロマトグラフ ィー後のＶＡＣプール ５：Ｑ−セファロース−ＦＦクロマトグラフィー後の精製ＡＣ ６：ヒト胎盤からの精製天然ＶＡＣ ７：分子量マーカー（ファーマシアｉ　９４ｋＤ、６７ｋＤ。

４３ｋＤ、３０ｋＤ、２０ｋＤなど１４ｋＤ）２１：予備精製ｒ−ＶＡＣ−αの Ｑ−セファロース−ＦＦクロマトグラフィー ２２：予備精製ｒ−ＶＡＣ−αのＱ−セファロース−ＦＦクロマトグラフィー ２３：天然ＶＡＣのゲル透過１（ＰＬＯ２４：組換えＶＡＣ−ａＯ）ゲル透過） （ＰＬＯ２５：天然ＶＡＣの逆相ＨＰＬＣ ２６；組換えＶＡＣ−ｅｘ（Ｄ逆相ＨＰＬＣ２７：天然ＶＡＣからのトリプシン 断片のＨＰＬＣ２８：組換えＶＡＣ−αからのトリプシン断片のＨＰＬＣ２９： ＤＴＴの存在下もしくは不存在下における天然及び組換えＶＡＣ−αの間の比較 からのＳＤＳゲル３０　：ｐ”ｒ’ｒの存在下もしくは不存在下における組換え ＶＡＣ−αからのＳＤＳゲル ３１：天然ＶＡＣ及び組換えＶＡＣ−αのウェスタンプロット分析 ３２：天然ＶＡＣ及び組換えＶＡＣ−αの等電点電気泳動３３：天然及び組換え ＶＡＣを用いる修飾プロトロンビン時間テスト ３４：天然及び組換えＶＡＣを用いるトロンビン時間テスト３５：天然及び組換 えＶＡＣによる血漿中へのＸａ因子の生成３６　：ＶＡＣのリン脂質二重層への 結合３７　：ｐＧＮ２５及びｐＧＮ２６の構築３８：組換えＶＡＣ−βの精製； クマシーブルー染色ＳＤＳゲル電気泳動ゲル ３９：組換えＶＡＣ−βの精製；処理サンプル中４０：組換えＶＡＣ−βｃ）　 ｙ　７Ｌ／透過ＨＰＬｃ４１：組換えＶＡＣ−βの逆相ＨＰＬＣ４２：インキュ ベーション後の組換えＶＡＣ−βの逆相ＨＰＬ４３：組換えＶＡＣ−βのアミノ 酸分析４４：＆ｉ換えＶＡＣ−βのＮ末端配列決定４５　：ＤＴＴの存在下もし くは不存在下における組換えびＶＡＣ−９βのＳＤＳゲル ４６：組換えＶＡＣ−βの等電点電気泳動４７：プロトロンビナーゼ活性に対す るＶＡＣ−α及びＶＡＣ−βの影響 プロトロンビン活性化はテキストに記載されているごとく変化する量のＶＡＣ− α（０）もしくはＶＡＣ−β（・）の存在下に測定した。

４８　：ＶＡＣ−αのホスホリパーゼＡ□活性に対する影響ホスホリパーゼＡ２ 活性はテキストに記載されているようにしてめた。ＶＡＣ−α誘導阻害は１３． ２ＭＭリン脂質（開いた円）または６．６μＭリン脂質（閉じた円）で測定した 。゛ ４９　：ＶＡＣ−βのホスホリパーゼＡｔ活性に対する影響阻害％の測定はテキ ストに記載されている。阻害は１３．２μＭ（開いた円）または６．６μＭリン 脂質（閉じた円）で測定した。

５０：ホスホリパーゼ活性のＶＡＣ−α誘導阻害に対するＣａ”の影響 阻害は６．６．１７　Ｍリン脂質、及びｌｓ＋Ｍ（開いた円）、０．５１（閉じ た円）、０．１ｍＭ（開いた正方形）もしくは０．０５５Ｍ　Ｃａ”（閉じた正 方形＞　で測定した。

５１：ホスホリパーゼ活性のＶＡＣ−β誘導阻害に対するＣａ”の影響 阻害は６．６μＭリン脂質、及び１１（開いた円）、０．５ｍＭ　（閉じた円） 、０．１ｍＭ（開いた正方形）もしくは０．０５ｍＭ　Ｃａ−”（閉じた正方形 ）で測定シタ。

ｘｌｕ１克 請書導管（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｃｏｒｄ　ｕｅｓｓｅｌｓ）及び／または胎盤 から阜離し、精製した勧賞を並相ＨＰＬＣで再精製した。

静止相　：　Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　Ｗ　Ｐ　−ＲＰ　ｌ　Ｂ、４．６Ｘ２５Ｑｍ 、（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ　ｐｈａｓｅ）５　ｓｅａ粒子、３００Ａ孔 移動相Ａ：水中０．１％トリフルオロ酢酸、ＰＨ２，２移動相Ｂニアセトニトリ ル中０．１％トリフルオロ酢酸勾配：２４分で２０−６８％Ｂ 流速（ｆｌｕｘ）　＝　１　ｍｊ／ｗｉｎ検出：　ＵＶ、　２１４Ｍｍ この精製工程後、共に３２０００の分子量を有する両物質をトリプシンで消化し た。

反廠条註 胎盤から＋７１ＶＡＣ３０，Ｉｊｇを０．１５　Ｍ　Ｎ１（４ＨＣＯｓ、ｐＨ８ ，０１３５μｌ中で反応させた。

＋２％ｗ／ｗ−）リブシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、３７℃、６時間＋２％ −／ｗ　）リブシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、３７℃−夜蹟帯からのＶＡＣ ３０／Ｊｇを１％ＮＨ４［ＩＣＯｓ、ｐＨ８，０１００，ｃ＋ｊ’中で反応させ た。

＋２％−／ｗ　）リブシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、３７℃、６時間＋２％ ｗ／ｗ　）リブシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、３７℃−夜得られた断片をＨ ＰＬＣで分離し、Ａｐｙｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔａｍｓ社製作のガス相シーク エネーターＴｙｐｅ４７０　Ａ、　Ｐｒｏｇｒａｗｈ　０２　ＲＰ　Ｔ　Ｈで配 列決定静止相：　ｐＢｏｎｄａｐａｋｃ　１　Ｂ、３．８Ｘ３０Ｏｎ、１０μ粒 子移動相Ａ：水中０．１％トリフルオロ酢酸、ｐＨ２，２移動相Ｂ：゛アセトニ トリル中０．１％トリフルオロ酢酸勾配：５５分で０−５５％Ｂ 流速＝１ｍＡ／鴎ｉｎ 検出：　ＵＶ−２１４Ｍｍ　（上部痕跡）　（ｕｐｐｅｒ　ｔｒａｃｅ）２８０ ｎ＠（下部痕跡）（］０賀ｅｒ　ｔｒａｃｅ）トリプシン消化に加え、逆相ＨＰ ＬＣ精製物質はまたＢｒＣＮ切断にも服せしめた。これらの切断ペプチドも配列 決定し、トリプシン消化からのペプチドに関するデータと比較した。

敗■皿皿 ＲＰ−ＨＰＬＣで精製したＶＡＣ１１μｇを７０％ギ酸１１１μｌに溶解した。

このものはすでに２５０倍モル過剰のＢｒＣＮ　（９０μｇ）を含有していた。

インキュベーションは暗がり中周囲温度で１７時間行った。１００μｌをＨＰＬ Ｃ分離に用いた。

ＨＰＬＣカラム：　ｐＢｏｎｄａｐａｋｃ　１８移動相Ａ：水中０．１％トリフ ルオロ酢酸移動相Ｂニアセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸勾配ニア０分 で６−７０％Ｂ 流速：　ｌ　ｓ＋Ｊ／ｗｉｎ 検出：ＵＶ、２１４及び２８０Ｍｍ か（して得られた結果とゲル透過ＨＰＬＣによる分析とＳＤＳゲル電気泳動の比 較は胎盤からのＶＡＣと一帯からのＶＡＣが同一であることを証明している。

移動相：　０．５Ｍ　ＮａｚＳＯａ　、０．０２Ｍ　ＮａｚＰＯａ　、ｐＨ７， ０，２５％ポリエチレングリコール、０．０４％ツイーン２０流速：　０．５　 ｍｊ　／ｗｉｎ 検出：ＵＶ−１２１４ｎｓ １工」泣シリＬ１木軌 ＳＤＳゲル：１５％ ゲル厚さ２０．７日 電気泳動：２０ｍＡ／プレート、運転時間（ｒｕｎｎｉｇ　ｔｉｍｅ）条件　２ 〜３時間 染色：クマシブルー プローブ：！！ｌ帯からのＶＡＣ８μｇまたは胎盤からのＶＡＣ７μ　ｇ 失意皿上 ヒト。、ｃＤＮＡ−イプーリーのｆ、制ａ）。からの　ＲＮＡ　離 ＧＴ：５Ｍグアニジニウムチオシアネート、５０ｍＭ）リスｐＨｍ７．４．２５ ｍＭ　ＥＤＴＡ、使用前８％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトメタノールを加える。

２０＋ｓ１のＧＴを使用前５〜１０分氷上で冷却する。ＧＴはこの時間中沈殿し てはならない、。

ＧＨ：６Ｍグアニジウムハイドロクロライド、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ。

１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、ｐＨ−７，Ｏｓ氷冷強く冷凍し、機械的に 粉末化した胎盤１ｇをＧＴ　（０℃）２０ｗａｌｌ中でＰｏｌｙｔｒｏｎ（Ｂｒ ｉｎｋｍａｎｎ）を用い最大速度で２０秒間混合する。均質化した混合物の容量 を測定し、０．３容量のエタノール（−２０℃）に注ぎ、混合し、直ちに１２０ ０Ｏｒｐｍ、−１０℃で５分遠心分離する（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ　Ａ　２１遠心 分ａｍ、Ｊ　Ｓ　１３．１０−ター）、タンパク質及び上清を除去する。１０ｓ Ｊの水冷ＧＨをベレットに加え、Ｐｏ１ｙｔｒｏｎで１０秒間均質化する。懸濁 液を一１０℃、１２０００ｒｐ−で５分間遠心分離する。上清を無菌Ｃｏｒｅｘ 管に移し、ペレットを捨てる。０．０２５容量の１Ｍ酢酸及び０．７５容量の冷 エタノール（−２０℃）を上滑に加え、十分に混合する。−２０℃で約２時間イ ンキュベートした後、混合物を６００Ｏｒｐｍ、−２０℃で１０分遠心分離する （ＪＡ２０ローター）、タンパク質フィルム及び上滑を注意深く除去する＊　２ 　ｍＡのＧＨ（０℃）をペレットに加え、ペレットを再懸濁し、懸濁液を１５− １のＣｏｒｅｘ管に移す、前のＣｏｎｅｘ管を８　ｍｊのＧＨですすぎ、溶液を 前記２−１と一緒にする。ペレット全体は懸濁されていることが重要であり、必 要ならば穏やかな音波処理による処理に服せしめるべきである。０．０２５容量 の１Ｍ酢酸及び０．５容量の冷エタノール（−７０℃）を加え、−２０℃で約２ 時間インキュベートする。遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分、ＪＡ２０ロータ ー）、溶解及び沈殿を２回繰り返し、全量のＧＨを２等分し７５ｓＪにする。最 後の遠心分離後、タンパク質のフィルムが溶液上に見えてはならず、さもなくば この精製工程を繰り返す必要がある。ベレットをピロ炭酸ジエチル処理水（０℃ ）　５　ｗＩｌで２分間渦動する。清澄な溶液をデカントし、もういくらかの水 を残存するペレット残渣に加え、溶液が清澄になるまで渦動を続ける。

０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（１）Ｈ−５，８）及び２．５容量のエタノー ルを加え、−７０℃で１時間インキュベートし、ＲＮＡを６００Ｏｒｐｍ、４℃ で１０分遠心分離する。溶解及び沈殿を１回繰り返す、最後にＲＮＡをエタノー ル中−２０℃で貯蔵する。

ｂ）ボｌ　−Ａ”　−ＲＮＡ車 オリゴｄＴセルロース（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｔ ｙｐｅ３、結合容量５■ポリ−Ａ′″ＲＮＡ／ｇ）０．５ｓｙｒを結合緩衝液（ ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）　（２００ｍＭ　ＮａＣｊ、　０．２％ＳＤＳ、 １０ｍＭ）リス、ｐ）Ｉ　−７，４，１ｍＭ　ＴＤＭＡ）に５濁する。この懸濁 液ｌ　ｍｌをカラムに充填し、水１０　ｍＩｌ、　０．ＩＮ　ＮａＯＨ１０ｍｌ 、水１０ｍ１及び結合緩衝液１０ｍＡの順で洗浄する。全ＲＮＡをアルカリ溶液 から遠心分ＩＩ（１０分、６０００ｒｐｍ、ＪＡ２０ｏ−ター）でペレットとし て取り出す、約１０■のＲＮＡを水４．５　輸ｌに溶解する。２％５ＤＳ５０μ ｌを添加後、溶液を７０℃に３分加熱し、直ちに氷上で冷却する。ＩＭＦリス（ ｐＨ＝７．４）　５０μ！、０．５Ｍ　ＥＤＴＡＩＯμｆｆ及び５ＭＮａＣｌ２ ００ＪＪｊの添加後、′溶液を直ちにカラムに加える。カラムからしたたり落ち る溶液をカラムに注ぎ戻す。この操作を全部で３回繰り返す、ついでカラムを結 合緩衝液３０■ｌで洗浄する。結合ＲＮＡを０．２％５ＤＳ５ＩＩＩＴ：溶出す る。カラムを水１０　ｍｌ、　０．ＩＮ　Ｎａ０Ｂ　１０　＋ｊ！及び水１０１ １１で洗浄し、結合緩衝液１０−Ｅで平衡にする。

ＲＮＡ溶液を７０℃で３分加熱し、氷上で急冷し、１Ｍ）リスｐＨ−７，４５０ μｚ、０．５Ｍ　ＥＤＴＡＩＯμｊ！及び５ＭＮａＣｌ２００μｌを加え、得ら れる溶液をカラムに注ぐ、遺り抜けた溶液をオリゴｄＴカラムに全部で３回注ぎ 返す、洗浄後、ＲＮＡを０．２％５ＤＳ３０■ｌで溶出する。

０．１容量の３Ｍ＠ＨナトリウムｐＨ−５，６及び２．５容量のエタノールを添 加し、−２０℃で１６時間インキュベートすると、ＲＮＡが沈殿する。これを遠 心分離しくｌｏ、００Ｏｒｐｍ　、１５分、ＪＡ−２０ローター）、ｌμｇ／μ ｌの濃度で水に溶解する。

Ｃ）　λ−ｔｌｏｃＤＮＡ−イプーリーの章−（ｃｏｎｓｔｎｕｃｔｉｏｎ）ｃ ＤＮＡの合成、内部ＥｃｏＲ１部位のメチル化、ＥｃｏＲＩリンカ−の適用、Ｅ ｃｏＲＩでの再切断、短いＤＮＡ断片の除去、λ−ｇｔｌｏアーム（ａｒｍｓ） での連結及び生体外での連結ＤＮＡの充填を、＾−ｅｒｓｈａｍ　（ＲＰＮ　１ ２５６）及びｃＤＮＡクローニング系λ−ｇｔｌ　Ｏ（Ａｓｅｒｓｈａｓ、ＲＰ Ｎ１２５７）によってなされたｃＤＮＡ合成系を用いて行った。この系を与える 作業操作は正確にフォローされた。約３μｇからはじめて、最終的に約０．５× １０６の組換えλ−ｇｔｌＯファージをｍＲＮＡから得た。

該ｃＤＮＡライブラリーからＶＡＣタンパク質コードｃ　ＤＮＡを捜索するため に、トリプシンペプチドＰ］６／ＩＩの配列に対応する２つのオリゴヌクレオチ ドを合成し、さらに５ｔａｐｈ　ＡペプチドＰ２０／１／６に対応する１つのオ リゴヌクレオチドを合成した（ｔｉｌｌ）、これらのオリゴヌクレオチドは対応 するｍＲＮＡをコードするあらゆる可能性を考慮に入れたすべての変種（ｖａｒ ｉａｗＩｔｓ）の全混合物である。ＥＢＩ−３８６は２０ヌクレオチドの鎖長を 有する５１２の変化（ｕａｒｉａｔｉｏｎｓ）を有し、５ｔａｐｈ　−Ａタンパ ク質Ｐ２０／Ｉ／６にぴったり合う（ｆｉｔｓ）　、トリプシンペプチドｐ　’ ｒ　６／ＩＩに対するオリゴヌクレオチドの変化を最小にするために、２つのオ リゴヌクレオチド（２０−ｍａｒｓ）を合成した：ＥＢＩ−３８７：１２８変化 、ＥＢＩ−３８８：６４変化。

さらに、トリプシンＶＡＣペプチドＰ３０／Ｉに適合する（ｆｉｔ）２つのオリ ゴヌクレオチドを「ゆらぎ」の位置の塩基としてデスオキシイノシンを用いて合 成した（図２）：ＥＢｌ−１１８及びＥＢＩ−１１９，この置換はＥ、０ｂｔｓ ｕｋａ　ｅｔ　ａｌ　＋ｌ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２６０１５　（１９８５）　、ｐｐ、２６０５−２６０８、及びＹ。

Ｔａｋａｂａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ　、、　Ｐｎｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、　（１９８５）　ＰＰ、　１９３１−１９３５によりて記述されている。イノ シンはシトシンとよく塩基対を形成するが、他のヌクレオチドをパートナ−とし て与えられても二重らせんの形成を殆ど乱さない。

各オリゴヌクレオチド６０ｐｓｏｌをＴ−″”　Ｐ　−Ａ　Ｔ　Ｐ　（Ａｍｅｒ ｓｂａｓ＋。

ＰＢ２１８．５００Ｃｉ／ｍｓ＋ｏｌ）　６０ｐｍｏｌで３０ｕｌの溶液中２０ 単位のＴ、ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。溶液は７０ｍＭ） リスｐＨ７，５、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣｌ、及び５ｍＭ　ＤＴＴを含有しており、 インキエベーシッン期間は３０分であった０反応を３０ｍＭ　ＥＤＴＡの添加で 停止し、７０℃で５分加熱した。

標識オリゴヌクレオチドをバイオゲルＰ　６０　Ｇ　（Ｂｉｏｒａｄ）を用いる カラムクロマトグラフィーによって非加入放射能物（ａｎｙ　ｎｏｎ−ｉｎｃｏ ｒｐｏｒａｔｅｄｒａｄｉｏａｃｔｉｕｉｔｙ）から分離した。７０Ｘ１０”− １１０Ｘ１０”ｃｐ−のリン−３２が各オリゴヌクレオチドに移入された（ｗｅ ｒｅ　１ｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄＬ各１５ｐ＠０１０ＥＢＩ−１１８及びＥＢＩ −１１９を９０ｐＪ中４５ｐｍｏｌ　のｒ　−”　Ｐ　−Ａ　Ｔ　Ｐ　（Ａｍｅ ｒｓｈａｍ、　Ｐ　Ｂ　２　１　８　５０００ｃｉ／−簡ｏ１）の添加で、ｌＯ 単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いリン酸化し、バイオゲルＰ６ＤＧで 精製した。全部で７０Ｘ１０’ｃｐｍのリン−３２が移入された。

ファージλ−ｇｔｌＯ中ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーの組換えファージ約１． ２ＸＩＯ’ｐｆｏ　（プラーク形成単位）を用いてＥ。

コリＣ６００に感染させた。約ｓｏ、ｏｏｏファージを各１３．５３ペトリ皿（ ＬＢ、ｌｏｍＭ　Ｍｇ５０ｍ、１５ｇ／ｊバクトアガー（Ｂａｃｔ。

−Ａｇｒ）　）に入れた。プラークが実際上−緒になりでから、各プレートから の２つの抽出物をニトロセルロースフィルター上に用意した（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ ｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｉｉｌｌ、　Ｂ　Ａ　８５　）　（丁、Ｍａｎｉａｔｉｓ 　ｅｔａｌ’、　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　、　ｌ　９８２　 、ｐｐ３２０−３２１　）　＊フィルターをＴＥで１００℃で３×２０分処理し 、６５℃で一夜洗浄した。

洗浄溶液＝５０ｍＭ）リスｐｐＨ− ８Ｉ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳフィルターをついで４０℃ で４時間予備的にハイブリッドした（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｓｅｄ）　：予備ハ イブリダイゼーシヲン溶液： ６ＸＳＳＣ，５ｘデンハート、Ｏ，１％ＳＤＳ、１ｍＭビロリン酸ナトリウム、 ５０　ｍＭ　！ｉａＨ，ＰＯａ　ｐＥ−６，５，１００ｍＭ　ＡＴＰ、８０μｇ １ｗｒｌ変性ニシン精子ＤＮＡハイブリダイゼーシッンは同じ溶液中で標識オリ ゴヌクレオチドの全量を用いて行った。プレート１〜６からの２倍にした抽出物 をＥＢＩ−３８６と、プレート７〜１２からのそれらをＥＢＩ−３８７及びＥＢ Ｉ−３８８とそれぞれ４９℃で１６時間ハイブリッドさせた。プレート１３〜２ ４からの抽出物は３７℃で１６時間ＥＢＩ−１１８及びＥＢＩ−１１９とハイプ リントさせた。

ハイブリダイゼーシ寥ン後、フィルターを６ＸＳＳＣ１０，０１％ＳＤＳで２回 すすぎ、周囲温度で２×３０分、６　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１０，０１％ＳＤＳで、４ ９℃及び３７℃で３×２０分、同じ溶液で、それぞれ洗浄した。空気乾燥後、フ ィルターをＫｏｄａｋ　Ｘ−Ｏｍａｔ　Ｓ　フィルム上にインテンシファイアフ ィルム（ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ　ｆｉｌｍ）を用い、−７０℃で露光した（ｗ ｅｒｅ　ｅｘｐｏｓａｄ）　＊両フィルターでオリゴヌクレオチドとのハイブリ ダイゼーシヨンを示したλファージを均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）のため 同じハイブリダイゼーシヨンを用いて精製した。

ＥＢＩ−３８６，３８７及び３８８とのハイブリダイゼーシヨンはファージλｐ Ｈ／３、λＰ６１５及びλＰ６／６に帰結した。ＥＢＩ−１１８及び１１９との ハイブリダイゼーシヨンはファージλ−Ｎｒ１５、λ−Ｎｒ１９及びλ−Ｎｒ２ ２に帰結した。

ｂ）ｃＤＮＡの Ｅ、コリＣ６００を２．５Ｘ１０’ｐｆｕ　（プラーク形成単位）のファージに 感染させ、１３．５ｃｍ寒天皿（ＬＢ、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，，１，５％アガロ ース、０．２％グルコース）上の６　ｗｒｌｌのトンプアガロース（ｔｏｐ　ａ ｇａｒｏｓｅ）　（０，７％アガロース、１０　ｍ　Ｍ　Ｍｇ５Ｏ，、ＬＢ）を 用いて平板培養した（ｐｌａｔａｄ）　、　３７℃で５Ａ時間の培養（ｉｎｃｕ ｂａｔｉｏｎ）後、プラーク同士が一緒になった。プレートを４℃で３０分冷却 し、アガロースをラムダ希釈液（１０ｍＭトリス、ｐＨ−８，１０ｍ　Ｍ　１１ ｇ５Ｏａ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で覆つた。

ファージを隠やかな振盪下４℃で一夜溶出した。上清ファージ怒濁液（約８−２ ）をＣｏｒｅｘ管に移し、１５０００ｒｐ−で１０分遠心分離した。（４℃、Ｊ Ａ２１遠心分離機）、上滑をポリカーボネート管にデメントし、５０．００Ｏｒ ｐｍでｏｍｅｇａ”ｔ　＝　３　Ｘ　Ｉ　Ｏ”　（約２３分）まで遠心分離した （２０℃、Ｌ　７０　Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機、２０℃、５０Ｔｉローター） 、ペレフト化したファージを上滑の除去後ラムダ希釈液０．５ｓ＋ｊに再懸濁し 、エフベンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　）試験管に移した。剋濁液を非懸濁粒 子から短い遠１０／Ｊｇ／ｓｊのＲＮａｓｅ　Ａ及び１μｇ／ｗｈｌのＤＮａｓ ｅ　Ｉの添加後、混合物を３７℃で３０分インキュベートした。２５ｍＭ　ＥＤ ＴＡ、２５ｍＭ）リス（ｐＨ−８）　、０．２％ＳＤＳの添加後、混合物を７０ ℃で３０分インキュベートした。ついで、１容量のフェノール／クロロホルム（ １：　１）を加え、タンパク質を試験管を傾けることによって抽出した。エフベ ンドル）遠心分離機中での２分間の遠心分離後、水相を１容量のクロロホルムで （滑動させることな（単に傾けることによって）抽出した。遠心分離による相分 ｍｕｋ、１１２０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム及びエタノールｌ　ａｌｌを上滑に 加えた。かくしてファージＤ　Ｎ　Ａ　（Ｄ　Ｎ　Ａ　ｐｂａｇｅｓ）をフィラ メント形態で沈殿させた。０℃、５分間のインキエベーシ曹ン後、ＤＮＡを遠心 分離（１０分）で得た。該ペレットを７０％エタノールで１回洗浄し、乾燥し、 ５０μｌのＴＥ　（４℃）に−夜溶解した。

ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、得られる断片を１％アガロースゲルで分離した。

クローンλ−ｐＨ／３、λ−Ｐ６１５及びλ−Ｐ６／６のｃＤＮＡ挿入物は約１ ３００〜１４００ｂｐのサイズに亘っていた。配列分析は３つのクローンがすべ て１つの同じｍＲＮＡに由来することを示した。しかしながら、ｍＲＮＡの５′ 末端はｃＤＮＡからなくなっていた。ファージλ−Ｎｒ１５、λ−Ｎｒ１９及び λ−Ｎｒ２２の挿入物は約１６００．１１００及び１０００ｂｐの長さを有して いた。配列分析はほぼ完全なｃＤＮＡを示した。

２つのファージグループλ−ｐＨ／３、λ−Ｐ６１５及びλ−Ｐ６／６とλ−Ｎ ｒ１５、λ−Ｎｒ１９及びλ−Ｎｒ２２のｃＤＮＡは以下の配列分析に示される ように、２つの異なるｍＲＮＡに由来する。

３つのクローンλ−ｐＨ／３、λ−Ｐ６１５及びλ−Ｐ６／６のＥｃｏＲＩ挿入 物を阜離し、ＥｃｏＲＩ切断ＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅＭ　１３°ベクター（Ｖｅｃ ｔｏｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　％　３７７０Ｔａｎｓｙ　５ｔｒｅ ｅｔ；　ＳａｗＤｉｅｇｏ　、　Ｃｌ９２１２１、ＵＳＡ）に連結した（Ｉｉｇ ａｔｅｄ）、得られたクローンをｐ　Ｐ　６１５、ｐＰ６／６及びｐＰ１１／３ と命名した。

３つのクローンλ−Ｎｒ１５、λ−Ｎｒ１９及びλ−Ｎｒ２２のＥｃｏＲＩ挿入 物を単離し、ＥｃｏＲＩ切断Ｂ１ｕｅｓｃｒｉｂｅＭ　１３°ベクター中につな いだ、得られたクローンをｐＲＨ２０１％ｐＲＨ２０２及びｐＲＨ２０３と命名 した。

他のｃＤＮＡクローンを得るために、ヒト胎盤λ−ｇｔ１０ライブラリーを、こ んどはｐＰ１１／３のＥｃｏＲＩ挿入物をプローブとして用いてもう一度捜索し た。

このＤＮＡ断片を二フクトランスシーシッン（丁、Ｍａｎｉａｔｉｓ。

Ｍｏ１ａｃｕｌａｒ　％　ＣＩｏｎｉｎｇ　−、１９８２、ｐａｇｅｓ１０９− １１２、ＤＮａｓｅ　Ｉ不使用）によって放射標識した。全部で８プレート上の ４Ｘ１０’フアージを調査した。ニトロセルロースフィル身−の処理はＴ、Ｍａ ｎｉａｔｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｔａｒ　ｓ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　−、１９８２、ｐ ａｇｅｓ３２０−３２１に記載されたように行った。ハイブリダイゼーシッン溶 液は６ＸＳＳＣ，５ＸＤａｎｈａｎｄｔ’ｓ　、　０．１％ＳＤＳおよび２０Ｘ ｌＯ’ｃｐｍ　ｐｐＨ／３挿入物を含んでいた。ハイブリダイセーシッンを６５ ℃で１６時時間−た（ｌｉｓｔｅｄ）　＊つぃでフィルターを周囲温度で３×１ ０分、６ｘＳＳＣ１０，０１％５ＤＳｔ’、及び６５℃で３×４５分、０．２　 Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃで洗浄した。全部で６９の陽性反応するクローンを得た（λ−Ｖ ＡＣ１〜λ−ＶＡＣ６９）。

これらのクローンの１２を上記したように小型スケールで調製し、ＥｃｏＲＩに よるｃＤＮＡ挿入物を遊離させ、１％アガロ−スゲバク賞をコードする全読取り 枠を含んでいることが明らがとなった。

スＩＬ影 ＶＡＣ−α　びＶＡＣ−βをコードするＣＤＮＡの　オづしくｃｈａｒａｃｔｅ ｒｉｌｉｓａｔｉｏｎ）ａ）ノーザンプロット 水５μ！、ホルムアミド１６μｌ、ホルムアルデヒド６ｔｔｌ及び０．１　Ｍ　 ＮａＯＨ３１１１２をポリ−Ａ’ＲＮＡ２μｇに加え、溶液を６８℃で１０分イ ンキュベートし、ついで氷上で冷却した。染料溶液（５０％グリセロール中各０ ．４％のブロモフェノールブルー及びキシ゛レンジアノ′−ル（ｃｙａｎｏｌ） 　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）　５μｍの添加後、ＲＮＡをホルムアミドアガロースゲ ル（１，５％アガロース、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ−７，６，１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ。

５ｒｎＭ酢酸ナトリウム、６％ホルムアルデヒド、電気泳動１００Ｖ、３時間、 ゲル緩衝液としての溶出緩衝液、ホルムアルデヒドなし）で分離した。全ＲＮＡ を基準物質（ａ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　５ｕｂｓｔａｕｃｅ）として適用した。

この痕跡（ｔｒａｃｅ）を電気泳動の後、取り出し、２８及び１８Ｓ　ｒＲＮＡ の位置を決定するためにＥｔＢｒで染色した。ゲルの残りをｌ　０ＸＳＳＣ中１ ０分で２回洗浄し、ＲＮ　Ａ’を２０ＸＳＳＣでニトロセルロースフィルターに 移した。フィルターを２ＸＳＳＣで洗浄し、乾燥し、真空下８０℃で２時間加熱 乾燥した。ｐＰ１１／３及びｐＲＨ２０３各１μｇをマルチプライム（ｓｕｌｔ ｉｐｒｉｍｅ）　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｔａｌｌｉ系（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＲＰ　Ｎ　 １６０１　）で放射標識した。ニトロセルロースフィルターを６ＸＳＳＣ／５ｘ Ｄａｎｈａｒｄｔ　’　ｓ　／　０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２時間予備ハイブ リッドした。１つの痕跡を１８０Ｘ１’０’ｃｐｓ　ｐＰ１１／３もしくはｐＲ Ｈ２０３でハイブリッドした（６５℃、１６時間）、フィルターを周囲温度でて ３０分、６ｘＳＳＣ１０，０１％ＳＤＳで２回、６５℃で３０分、０．２ＸＳＳ Ｃ１０，０１％ＳＤＳで２回洗浄し、乾燥し、インテンシファイア−フィルムを 用い％　Ｋｏｄａｋ　Ｘ−０＊ａｔ　Ｓフィルムで露光した（ｅｘｐｏｓｅｄ） 　＠結集を図３に示す−り’−ンｐＰ１１／３（７）ｃＤＮＡは約１７００塩基 長のｍ　ＲＮ　ＡはハイブリッドしくＶＡＣ−α）、クローンｐＲＨ２０３のｃ ＤＮＡは約２２００塩基長のｍＲＮＡにハイブリッドする（ＶＡＣ−β）。

第１に用いた放射能の量及びトレース（ｔｒａｃｅ）あたり適用したｍＲＮＡ０ 量がほぼ同じであり、第２に同じ溶液中でのゲノムプロットのハイブリダイゼー シぢンが両ｃＤＮＡと等しい強度のバンドを生じさせた（下記参照）ので、短い 方のｍＲＮＡ（ｒＶＡＣ−α」）が長い方のｍＲＮＡ　（ｒＶＡＣ−β」）より 胎盤中により多くあることが結論づけられる。

ｂ）ＶＡＣ−ｅｔ　ｃＤＮＡの配 クローンｐ　Ｐ　６１５、ｐ　Ｐ　６／６及びｐＰ１１／３のｃ　ＤＮＡを全面 的に配列決定し、クローンλ−ＶＡＣＩ〜１２のｃ　ＤＮＡを部分的に配列決定 した。結果を図４に示す、全部で１４６５塩基を配列決定した。ｃＤＮＡは３２ ０のアミノ酸をコードできる長い読取り枠を有する。このＤＮＡ配列をアミノ酸 配列に翻訳する場合、配列決定されたペプチドをすべてこの配列に収容できる（ 図５）、従って、このｃＤＮＡはその対応ｍＲＮＡがＶＡＣタンパク質をコード するｃ　ＤＮＡである。

第２の単離ｃＤＮＡ（下記参照）の配列はＶＡＣと類似しているが異なるタンパ ク質をコードしているので、ＶＡＣ−αなる命名をここに導入する。

最初のＡＴＧコドン（塩基３５−３７）は同じ読取り枠の停止コドンによって先 行されている。塩基３０〜３８は翻訳開始コドン近くの共通配列ＣＣ（Ａ／Ｇ） ＣＣＡＬ）ＧＧを与えるコザーク則（Ｋｏｚａｋ　ｒｕｌｅ）　（Ｍ、Ｋｏｚａ ｋ　、　Ｎａｔｕｒｅ３０　Ｂ　（１９８４）　ｐａｇｅｓ２４１−２４６）を かなりよく満足する。ここでの対応する配列はＴＣＧＣＴＡＴＧＧである。３′ 非翻訳領域は４７１塩基長である。ポリーＡ部分の開始１５塩基前にポリアデニ ル化配列ＡＡＴＡＡＡ　（Ｎ、Ｊ、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ　ｅｔ　ａｔ、　、　Ｎ ａｔｕｒｅ２６３　（１９７６）、ｐＩ）２１１−２１４）がある、ｍＲＮＡの ポリーＡ部分が１５０〜２００塩基の鎖長を有するとすると、ｃＤＮＡ配列に基 いたｍＲＮＡの総長！：１６００〜１６５０であろう、ノーザンプロット実験で はより高い値が測定されたので、５′非翻訳領域はｃＤＮＡの完全な形となって いない。

他のすべてのｃＤＮＡクローンと異なり、クローンｐｐ　６　／　５のｃＤＮＡ は１００位でＡの代りにＣを有する。従って、トリプレット９８〜１００　（２ ２番目ノコトン）はＧＡＡがらＧＡＣに変化し、ＧｌｕＯ代りにＡｓｐをコード する。この変化は以下の現象の理由となることができる：ａ）逆転写酵素が間違 ったヌクレオチドを移入した、ｂ）それらはこの点で異なる２つの対立遺伝子の 転写産物である、Ｃ）この点で異なる２つの非対立遺伝子がある。

その長い読取り枠はそのＭｅｔ−１が恐らく切断され、その次のアラニンが、あ るいはアシル化によって、アミノ基においてブロックされるであろう、３２０の アミノ酸を有するタンパク質をコードする。計算した分子量は３５．８９６　Ｄ で５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量より大きい、確かに、荷電されたアミノａ　（ Ａｓｐ　、　Ｇｌｕ、Ｌｙｓ　、、　Ａｒｇ　ｓ　Ｈｉｓ）の割合（３０，６％ ）（９８／３２０）は平均値２５．１％と比べて十分高い、このことは５ＤＳ− ＰＡＧＥにおけるタンパク質の異なる移動挙動を説明する０強度に荷電したアミ ノ酸中、酸性アミノｅ１　（Ａｓｐ及びＧｌｕ）は５４個で塩基性アミノ酸（Ｌ ｙｓ及びＡｒｇ）（４１個）に比べ優勢である。このことはＶＡＣ−αタンパク 質の酸性の等電点（ｐｌ−４，４〜４．８）を説明している。ＶＡＣ−αはシス ティンをコードする唯一のトリブレット（アミノ部位３１６）を含み、典形的な Ｎ−グリコジル化部位（Ａｓｎ−ＸＸＸ−５ｅｒ／Ｔｈｒ）を有さない、アミノ 酸配列の構造分析（Ｐｕｓｔｅｌｌ　、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、　＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｃｓ、　１０　（１９８２）ｐｐ４７６５−４７８２）は６７ アミノ酸長の配列の４回の繰返しくａ　ｆｏｕｒｆｏｌｄ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｏ ｎ　ｏｆ　ａ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　６　７　ａｍｉｎｅ　ａｃｉｉｄｓｌｏｎｇ ）　（図６）　（以下「リピート」と称する）を示す、この配列内で、７つのア ミノａ２（１０，４％）は４つのリピートのすべてに保存され、１５のアミノ酸 （２２，４％）は４つのリピートの３つに存在し、２８個の位置（４１，８％） で２つのリピートは同じアミノ酸を含有している。

公げにされたデータ（ｌＩｌ、Ｊ、Ｇｅｉｓｏｗ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　 ２０３　（１９８６）、ｐｐ、９９〜ｌ　Ｑ３．Ｍ、Ｊ−Ｇｅｉｓｏｗ　ｅｔ　 ａｌ、　、　ＴｌＢ５　１１（１９８６）、ｐｐ、４２０〜４２３）との比較は 驚くべきことに、ＶＡＣ−αがかなり広い意味での（ａ　ｆａｉｒｌｙ　ｌａｒ ｇｅ　ｇｒｏｕｐ、ｏｆ）Ｃａ・°依存性リン脂質結合タンパク賃に属すること を示した。　Ｃａ”結合に巻き込まれる共通配列はＬｙｓ−Ｇｌｙ−ｆｏｂ−Ｇ ｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−ｖａｒ−ｕａｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−ｆｉｌ−１ １ｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ｆｏｂ−Ａｒｇ　ｆｏｂ−疎水性、　ｆｉｌ−親水性、 ｕａｒ　”可変性と記述されている（Ｍ、Ｊ、Ｇｅｉｓｏｗ　旦　虹、・Ｎａｔ ｕｒｅ３２０　（１９８６）　、ｐ９．６３６−６３８）、この配列は本発明の タンパク質の４回繰り返された６７アミノ酸長の配列の各々に存在する（図６） 、殆ど疎水性アミノ酸のみよりなる、各リピートの末端の６アミノ酸長の部分も 注意を引く　（図６の「○ｏＯｏｏｏ」）。

ｃ）ＶＡＣ−β　ｃＤＮＡの配■ クローンＮｒｌ　５、Ｎｒｌ　９及びＮｒ２２のＶＡＣ−β　ｃＤＮＡ配列は１ ９４０ｂＰを有し、ポリーＡ部分に没入する（図７）、ポリーＡ部分の１６塩基 前にポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡがある。確かに、この配列はヌクレオ チド位１７０４−１７０９に存する。この配列がポリアデニル化シグナルとし用 いられない理由は知られていない、ＡＡＴＡＡＡ配列の３′末端でさらに必要と される配列、すなわちＹＧＴＧＴＴＹＹ　（Ｇｉｌｌ　Ａ、旦　虹、。

Ｎａｔｔ＋ｒｅ３１２　（１９８４）　、ＰＰ、４７３−４７４）は比較的にず っと離れて存在する（ＴＧＴＧＴＴＡＴ、１７３５−１７４２位）。

これが、最初のポリ”アデニル化配列が受容されない説明となるかもしれない。

ｔｉｅＤＮＡ配列はＣＤＮＡの始めがら１０００位まで亘る読取り枠を含有する 。それは３６２のアミノ酸のコード能力を含んでいる。ＶＡＣ−αとの類似性及 びＶＡＣの精製に際し３４．０００Ｄのタンパク質を生ずるという事実から、最 初のメチオニンコドン（ＡＴＧ、１０７−１０９位）が翻訳の開始点とされた。

コザーク則はここではＶＡＣ−αの場合はどよくは満足されない（ＡＡＧＡＧＡ ＴＧＧ、１０２−１１０位）。

それは４つのシスティン基（アミノ部位１６１．２０６．２５０及び２９３）及 び能力あるＮ−グリコジル化部位（Ａｓｎ−Ｌｙｓ−５ｅｒ、アミノ部位２２５ −２２７）を有する。計夏された分子量は３６．８３７である（図９）、ＶＡＣ −βにも、平均数より多い荷電基があり　（９７／３２７　（２９，６％））、 酸性アミノ酸（Ａｓｐ　＋ＧＩｕ４９）が塩基性アミノａ　（Ｌｙｓ　↑＾ｒｇ ４２）より優勢である。

このことは５ＤＳ−ＰＡＧＥで積出されるより低い分子量を説明する。

ＶＡＣ−βも６７アミノ酸長の配列の内部繰返しを示す（図８）。

この配列内で、７つのアミノａ（ｌｏ、４％）は４つのリピートのすべてで保存 され、１７のアミノ酸（２５，４％）は４つのリピートの３つで存在し、２５個 の位置（３７，７％）で２つのリピートが同じアミノ酸を含んでいた。ＶＡＣ− βも１７アミノ酸長の共通配列と高い１７１４以性を示す、ＶＡＣ−αについて された注目もＶＡＣ−βにあてはまる。

ｄ）ゲノムサザンプロット　析 ヒト胎盤からの染色体ＤＮＡのサザンによる分析は複雑な写真（ａ　ｃｏｍｐｌ ｅｘ　ｐｉｃｔｕｒｅ）を与える。このＤＮＡをＥｃｏＲＩ　ｓ旧ｎｄＩ［Ｉ。

Ｂａｍ１’ｌＩ　及びＰｓｔ　Ｉで切断した。ニトロセルロースに移したＤＮＡ をＶＡＣ−ａ　ＤＮＡ（ｐＰ１１／３）及びＶＡＣ−β　ＤＮＡ（ｐＲＨ２０３ ）の両方とハイブリッドさせた。フィルターをストリンジェントな（ｓｔｒｉｎ ｚｅｎｔ）条件下（前記ａ）参照）に、すなわち０．２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ及び６ ５℃で、洗浄した。それにも拘らず、比較的多い数のバンドが各消化について生 じた（図１０）、２つのプロットの比較は、ＶＡＣ−ｅｘ　ＤＮＡとＶＡＣ−β 　ＤＮＡ（７）交差反応をこれらの条件下で恐らく排除することができることを 示した。バンドが多数であることはＶＡＣ−αもしくはＶＡＣ−β遺伝子に類憤 の遺伝子の存在、または多数の及び／または長いイントロンによって中断された 遺伝子の存在によりて説明することができる。

スＪＬ［Ｌ支 タンパク質合成 図１１はＶＡＣ−αとＶＡＣ−βのアミノ酸配列の比較を示す。

繰返し構造は両タンパク質において同じに配置され得る。結合ペプチドも２番目 及び３番目のリピートの間のそれらを除き同じ長さである。ＶＡＣ−αにおいて は、２つの配列の最適な調和（曽ａｔａｈｔｎｇ）を可能にするのに、ギャップ をこの結合ペプチドに挿入しなければらない、２つのタンパク質のＮ−末端ペプ チドは、ＶＡＣταでは１９のアミノ酸で、ＶＡＣ−βでは２５のアミノ酸で長 さが異なっている。このペプチドももっとも低い相同性を有する。２つのタンパ ク質は３２０のアミノ酸位置の１７６で同じであり、相同度は５５．０％である 。

ココテ、ＶＡＣ−ａ　ｃＤＮＡとＶＡＣ−β　ｃＤＮＡ（７）ヌクレオチド配列 の比較について述べる。２つの遺伝子とそれらの産物を互いに比較すると、より 大きな相同性はアミノ酸面よりＤＮＡ（−ＲＮＡ）面でみられる。このことは核 酸においては塩基トリブレットの変化が新しいアミノ酸をコードするのに十分で あるという事実によって説明される。

図１２はＶＡＣ−ｅｔ　ｃＤＮＡとＶＡＣ−β　ＣＤＮＡのコード領域の比較を 示す、′Ｒくべきことに、ＤＮＡはたった５４．２％の相同性度しか示さない（ すなわち２つのタンパク質より幾分低い相同性度である）。

図１３はＶＡＣ−αもＶＡＣ−βも、膜を通しての分泌または膜中への該タンパ ク質の貯蔵を可能にする比較的長い疎水性領域を有さないことを明瞭に示してい る。従ってＶＡＣ−α、ＶＡＣ−βとも細胞内タンパク質であると推測すること ができる。

Ｗａｌｌｎｅｒｅｔ　ａｌ、（Ｎａｔｕｒｅ３２０　（１９８６）　、ｐｐ、７ ７〜８１）はヒトリボコルチン■の構造を報告し、５ａｒｉｓ　ラ（Ｃｅ１１４ ６（１９８６）　、ｐｐ、２０１〜２１２）及びＨｕａｎｇら（Ｃｅ１１４６（ １９８６）、ｐｐ、１９１〜１９９）はネズミのもしくはヒトのカルバクチン（ ｃａｌｐａｃｔｉｎ）　Ｉ　（これはりボコルチン■としても知られる）の構造 を報告している。これらのタンパク質もＣａ”依存性リン脂質結合タンパク質の 範ちゅうに属する。それらの構造はＶＡＣ−α及びβと類似的に書くことができ る（図１４）、Ｌ、かしながら、ＶＡＣ−αとＶＡＣ−βの間の相同性はＶＡＣ とリボコルチンの間の相同性よりもっと著しい。

ＶＡＣ−ａ−ＶＡＣ−β　５５．θ％ ＶＡＣ−ｅｘ−リボコルチア　１　４１．９％ＶＡＣ−ａ−リポコルチア　ＩＩ 　４３．８％ＶＡＣ−β−リボコルチン１　４１．７％ＶＡＣ−β−リボコルチ ンＩＩ　４４．６％従ってリボコルチンもそれらの類似構造ゆえに抗凝固活性を 青し、従って抗凝固剤として用いることができ、さらにはこのことはこのクラス の（ａｏｓ依存依存性リン脂質結合タンパク一般的性質であると推測することが できる。

Ｃａ”依存性リン脂質結合タンパク質の多くは細胞骨格の精製した分泌小胞もし 他の成分に結合するＣＲ，Ｒ，Ｋｒｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３２０　 （１９８６）　、ｐ５７３　（要約））０分泌の間、小胞は細胞のゴルジ器官か ら離れ、細胞膜に移行し、それと融合する。かくして小胞の内容物は細胞から離 れる。刺激と筋肉収縮のカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）と類イ以して、刺激 と分泌がＣａ”を介してカップリングされることが提案された（ＷＪ、Ｄｏｕｇ ｌａｓ　％　Ｂｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃ。

３４　（１９６８）　、４５１）、Ｃａ”依存性リン脂質結合タンパク質は重要 な役割を演することができる。各リピートの保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ） 　１７アミノ酸長領域において、ＶＡＣ−ａはヒドロキシル基を有する５〜６の アミノ酸（Ａｓｐ　、　Ｇｌｕ　、　Ｔｈｒ　、　５ｅｒ）を（それらのうち３ つは同で位置に）有する。ＶＡＣ−βにおいては、これらのアミノ酸のうち４つ は各リピートに存在する。該タンハク賞のいずれもカルモジニリン、トロボニン （ｔｒｏｐｏｎｉｎ）　Ｃ％Ｓ−１００及びバーブアルブミン（ｐａｒｖａｌｂ ｕｓｉｎ）に観察され、これらの分子におけるＣａ”°結合の役割を担うＥ　Ｆ −Ｈａｎｄ構造（１？、）ｌ。

Ｋｒｅｔｓｒｎｇｅｒら、ＣＲＣＣｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、８　 （１９８０）、Ｐ１１９）を有さないが１．各リピートにおけるこのサブセクシ ョン（サブ領域）　（ｓｕｂｓｅｃｔｉｏｎ）の保存はこの領域がＣａ”結合の 役割を担うという結論に導く。

この領域における制御された突然変異によってＶＡＣタンパク質の生物活性を変 化させる試みがなされ得る。

１１１ｉ Ｅ、コ１１におけるＶＡＣ−αの形質発現Ｅ、コリからのアルカリホスファター ゼ（ＰｈｏＡ）の遺伝子を緊縮調節（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏ ｎ）に服せしめる。リン酸塩の存在下ではこの遺伝子は完全にスイッチを切られ ており、培地中リン酸塩の不存在下で遺伝子発現が起こる。　Ｈ，Ｓｈｕｔｔｌ ｅｗｏｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４　 （１９８６）　ｐａｇｅ８６８９及びＣ，Ｎ。

Ｃｈａｎｇ、ｅｔ　ａｌ、　、　Ｇｅｎｅ４４　（１９８６）　、ｐｐ、１２１ −１２°５はこの遺伝子のヌクレオチド配列を記述している。

ＰｈｏＡ遺伝子のプロモーター領域をいくつかのオリゴヌクレオチドから組み立 て（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）、ＥｃｏＲｌ　−Ｃ１ａ　Ｉで切断したｐＡＴ１５３ に挿入した。リポソーム結合部位の前にＸｈｏ１部位を挿入した。もとのＥｃｏ Ｒ１部位は該合成りＮＡ断片をつなぎ込むときに破壊される。リポソーム結合部 位の後に、翻訳開始ＡＴＧ　（そのＧは５ａｃｌ　（”’　５ｓｔｌ）部位の最 初のヌクレオチドである）を設けた（ｐｒｏｖｉｄｅｄ）　ｅ該形質発現ベクタ ーはこの点でＳａｃ　Ｉにより切断されて直鎖化することができ、３′突出部分 （０νｅｒｈａｎｇ）はｄＧＴＰの存在下にＤＮＡポリメラーゼＩ−クレノー断 片で処理してストレート末端（ｓｔｒａｉｇｈｔ　ｅｎｄ）に変換することがで きる。

このようにして、この点に目的とする遺伝子を挿入することができるが、正しい 形質発現のため、この遺伝子はコード領域の最初の塩基から始まらなければなら ない。

ｐＡＴ部分の）ｌｉｎｄｌ［ｌ　−５ａｌ　ｌ断片を除去し、アルカリホスファ ターゼ転写ターミネータ−に置き代えた。ちとの５ａｌ１部位は破壊された。こ れをなすために、それを、ｐＡＴ１５３から削除されたＢａｍＨ１部位と共に該 ターミネータ−の前に再導入した０合成的に生産したＤＮＡを図１５に示す。

ｂ）形質発現りローンｐＲＨ２９１ ｃＤＮＡクローンｐＰ６１５をＢｇｌｌ及びＰｓｔｌで切断し、コード領域の大 部分と約２００ｂｐの３′非翻訳領域を含有する９８０ｂｐ長の断片を単離した 。コード領域のなくなってでいる５′末端はオリゴヌクレオチドによって置き代 えた。　Ｋｐｎｌ切断部位を同時の２つの突然変異（ＧＧＣ−ＧＧＴ、Ｇｌｙ− ７及びＡＣＴ−ＡＣＣ。

Ｔｈｒ−８）によってＶＡＣ−ｃＤＮＡ中に導入した。

オリゴヌクレオチドは以下の外観を有していた：ｌ　ＥＢＩ−６７８ ５’　ＧＣＡＣＡＧＧＴＴＣ丁ＣＡＧＡＧＧＴＡＣＣＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＴＣ ＣＣＴＧＧ＾丁ＴＴＧＡＴＧＡＧＣＧＧＧＣＴ３　’ＣＧＴＧＴＣＣＡＡＧＡＧ ＴＣＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡＧＧＧＡＣＣＴＡＡＡＣＴＡＣ丁Ｃ ＧＣＣＣＧＡＩ　ＥＢＩ−６８０１１ ＧＡＴＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＴＴＣＧＧＡＡＧＧＣＴＡＴＧＡＡＡＧＧＣＴＴＧ ＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＡＧＣＣＴＡＣＧＴＣＴＴＴＧＡＧＡＡＧＣＣ ＴＴＣＣＧＡＴＡＣＴＴＴＣＣＧＡＡＣＣＣＧＴＧＴＣＴＡＣＴＣＣＴＣ丁ＣＧ Ｂ１− １１ＥＢＩ−６８２１ ＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＣＧＡＡＧＴＡＡＴＧＣＴＣＡＧ ＣＧＣＣＡＧＧＡＡＡＴＣＴＣＴＧＣＡ３　’丁ＡＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＡＣ ＴＧＴＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＴＡＣＧＡＧＴＣＧＧＣＧＴＣＣＴＴＴＡＧＣＧ　 ５’６７９１１　ＥＢＩ−６８１１ オリゴヌクレオチドＥＢＩ−６８０，６７７，６７８及び６８２の５′末端をリ ン酸化した。ＥＢ）−６７８及び６８０、ＥＢＩ−６７７及び６７９及びＥＢＩ −６８２及び６８１を対にして１００℃に加熱し、ゆっくり冷却した（２　Ｑ　 ｐ　ｌ申に１００　ｐｏｏｌ）　＄二本鎖オリゴヌクレオチド同士を結合しくｃ ｏｍｂｉｎｅｄ）　％つないだ（ｌｉｇｅｔｅｄ）、　ｐ　ＲＨ２８４ＴをＳａ ｃ　Ｉで直鎖化し、その３′突出部分をｄＧＴＰの存在下ＤＮＡポリメラーゼ■ ／クレノー断片で処理してストレート末端にしくｒｅｄｕｃｅｄ）、ついでＢａ ５ａｌで再切断する。約３０ｎｇのベクター、２００ｎｇのｃＤＮＡ及び２５０ ｎ＋ｍｏｌのオリゴヌクレオチドを１５μｌの溶液中で連結する（ｌｉｇａｔｅ ｄ）、受容Ｅ、コリＨＢＩＯＩを該リガーゼ溶液で形質転換した。得られたクロ ーンをｐＲ）１２９１と命名した（図１６）。

寒丘孤立 プラスミドｐＥＲ１０３を形質発現ベクターとして用いた（Ｅ。

Ｒａｓｔｌ−Ｄｗｏｒｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｇｅｎｅ２１　（１９８３） 　、２３７−２４８Ｌ咳ベクターをＨ４ｎ６ｍで直鎖化した。５′突出末端をｄ ＡＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼＩ／クレノー断片で部分的に埋め、残りの一本鎖 残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）を８１ヌクレアーゼで消化した。ａベクターをＢａｇ旧 で再切断し、大きな断片を単離した（図１７）、クローンｐＲＨ２０３から、コ ドン１３〜１５７を含有する４４０ｂｐ長のＭａ＠ｌ［［−ＢａｍＨ１断片をｊ ｉＬＩＩした。失われている５′末端は以下のオリゴヌクレオチドで補った： ＥＢＩ−３０７ ５’　ＣＣＡＴＧＧＣＴＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣ丁ＴＧＧＡＴＣＧＡＡＣＡＧＧ ＡＡＧＧ丁　３　′３　’　ＧＧＴＡＣＣＧＡＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＧＡＡＣＣ ＴＡＧＣＴＴＧＴＣＣ丁丁ＣＣＡＣＡＧＴＧ　５　’ＥＢＩ−３０６ Ｅ、コリに対して最適のコドンを用いたく例えばＲ，Ｇｒａｎｔｈａｍｅｔ　ａ ｌ、　、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、８　（１９８０）　、１８９３− １９１２）　ａこのコドン交換はコドン５〜７に新しいＢｉｎｄｌｌ［部位をも たらす。

オリゴヌクレオチドＥＢＩ−３０６をリン酸化し、ＥＢＩ−３０７とハイブリッ ドさせ、ＶＡＣ−β断片でつないだ、　ＢａｍＨＩで再切断後、５′末端ＶＡＣ 断片を上記で調製されたｐＥＲ１Ｇ３ベクターにつなぎ込んだ、得られたクロー ンをｐＲＨ２１１と命名した。ＶＡＣ−βをコードする領域を完成させるために 、１２３０ｂｐ長のＢａ５ａｌ−Ｓｐｈｌ断片をクローンｐＲＨ２０１から単離 した。

Ｂａ５ＢＩから５ｐｈｌまで約２００ｂｐ長のｐＢＲ３２２の部分をプラスミド ｐＲＨ２１１から除去し、対応するＶＡＣ−ｃＤＮＡ部分に置き代えた。これは クローンｐＲＨ２１２に帰結した。　Ｔｒｐプロモー１−　（Ｓ、マルセソセン ス）、リポソーム結合部位、及び合成的に製造したＶＡＣ−β遺伝子のはじまり の部分（ｓｔａｒｔ）を含有するＥｃｏＲＩ−ＢａｓＨＩ断片を配列決定によっ てチェックした。

ｂ）ＶＡＣ−β（ｐＲＨ２１２）の形質発現プラスミドにコードされたＶＡＣ− β（ｔｈｅ　ｐｌａｓｓ＋１ｄ−ｃｏｄｅｄＶＡＣ−β）をＭａｘｉｃａｌｌ系 で検出した（＾、５ａｎｃａｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１３７　（１９７９）　、ｐＬ　６９２−６９３）　、　 Ｅ、コリＣ３Ｒ６０３（Ｆ−、旦ｒ−１ｓ　１ｅｕＢ６　、肛並り、　庄−り。

ｒｅｃＡｌ　−、ｄ、ｔｈｉ−１ｓ　ｕｖｒＡ６　％　ａｒａ−１４，１ａｃＹ １、■…Ｌ。

ｎ旦り、　ｍｔｌ−１、■旦匹（ｎａｌＡ９Ｂ）、■匹旦、ｔｓｘ−３３、λ− 憇匹Ｕ） をｐＲＨ２１２で形質転換し、３７℃でＯＤ、。、まで増殖させた。

培養液２０−Ｅを用いたベトリ皿中５０値の距離から５秒ＬＩＶ殺菌灯（１５Ｗ ）で照射し、もう１時間インキュベートした。Ｄ−サイクロセリン１００μｇを 培養液に加えた。１６時間後細菌を遠心分離によって回収し、バージエイ（Ｈｅ ｒｓｈｅｙ）塩溶液（５，４ｇ／ｌ　ＮａＣ１１３，Ｏｍｌｌ　ＭＣｊ、　１． １　ｇ／　Ｉ　ＮＨ，Ｃｌ、１５ｗ／Ｉ　ＣａＣｊ、　Ｘ２１１．Ｏ１８７■／ 　ｊ　ＫＨｇＰＯａ　、１２．１　ｇ／　１　）リスｐｉｔ−７，４）で２度洗 浄し、バージエイ培地（バージエイ塩１００ｍ１あたり、２０％グルコース２． Ｏｗａｌｌ、　２％トレオニン０．５ｗｘｌ、１％ロイシン１．０　ｍＡ、２％ プロリンｌ、ＱｍＪ、・２％アルギニン１．０　纏１０．１％チアミン−〇Ｃｊ Ｏ，ｌ　ｍＡ）５　ｍＡに再懸濁し、２０μｇ／■！のインドールアクリル酸で ２時間インキュベートした。。Ｓ−メチオニン５ｓ＋ｃＣｉ／　ｗａｎの添加及 び３７℃（１時間）のさらなるインキュベーシヨンによって、プラスミドにコー ドされたタンパク質を放射標識した。細菌を遠心分離で回収し、ＳＤＳプローブ 緩衝液（Ｌａｍｍｌｉ　Ｇｅｌ　Ｓｙｓｔｅｍ　、例えばり、Ｇ。

Ｄａｖｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８６）　ｐｐ−３０６−３１０）２００μＥに取った 。標識した生産物を１５％アクリルアミドゲルで分離した。ゲルを乾燥し、ＫＯ ｄａｋ　Ｘ−０＋ｓａｔ　Ｓフィルムに露光した（ｅｘｐｏｓｅｄ　ｏｎ）　＊ 基準物質（ａ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）として精製ＶＡＣ−αタンパク質をそれと 一緒に移動させ（ｗａｓｒｕｎ）、染色によって目にみえるようにした。ＶＡＣ −αは分子量から予想されるようにｐＲＨ２１２にコードされたＶＡＣ−βより も早く誘導した。ＶＡＣ−βの形質発現ばまた誘導因子インドールアクリル酸の 添加によって刺激することができる（図１８）。

Ｃ）クローン　ＲＨ２９２のヅ 形質発現ベクターｐＲＨ２８４ＴをＳａｃ　Ｔで直鎖化し、３′突出末端をＤＮ ＡポリメラーゼＩ／クレノー断片及びｄＧＴＰでストレート末端に変換した。ベ クターをＳａｌ　Ｉで再切断し、大きな断片を単離した。クローンｐＲＨ２１２ の旧ｎｄｌ［ｌ−５ａｌｌ挿入物を単離した＊　０．２ｐｍｏｌのオリゴヌクレ オチド対５　’　ＧＣＴＴＧＧＴＧＧＡ＾３　’　ＥＢＩ−６８４３’　ＣＧＡ ＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＧＡ　５　’　ＥＢＩ−６８５を０．２　ｐｍｏｌのＶＡ Ｃ−β挿入物及び０．０１５　ｐｗｏｌの調製ｐＲＨ２８４Ｔでつないだ、Ｅ、 コリＨＢＩＯＩをリガーゼ溶液で形質転換した。得られたクローンをｐＲＨ２９ ２と命名した（図１８）。

！ＪＪＬＬ Ｅ、コリ　でのＶＡＣ−α　びＶＡＣ−βのノ　のａ）クローンＨＢＩＯＩ／　 Ｒ）１２９１　びＨＢＩＯＩ／　ＲＨ１主１立隻ｌ 培地１）予備培養 １０　ｇ／ｊ　）リプトン ５ｇ／Ｊ！酵母エキス ４ｍｌｌグルコース ９　ｇ　／　Ｊ　ＮａＪＰＯａ　”　２ＨｔＯ１ｇ／ｊＮＩ１．ｃｊ １　ｓｊ　／　ｌ！　ＩＭ　ＭｇＳＯ４・ＩＨｚＯ１００■／１アンピシリン 開始ｐＨ−１，２ ２）主培養 ０−６８　ｇ　／　ｊ　（ＮＨａ）ｔｌｌＰＯａＯ−６２ｇ　／　ｊ　ＬＩＩＰ Ｏａ・３１１１０２．３３　ｍｌｌ　ｉ［ｃｊ！ ０．５　ｍｌｌ　ＮａＣ１ ０，５３ｇ／ｊ　ＮＢａＣｚ １−２３　ｇ／　ｊ　Ｍｇ５Ｏａ・７１１ｔＯ０，０１１ｇ　／　ｌ　ＣａＣｌ 　ｚ ｌｏ　ｗａｒ／ｌチアミン−ｔｌｃ１ ３．９２　Ｉｆ／　Ｊ　（ＮＢａ）Ｊｅ（ＳＯａ）ｔ　”　６Ｈ！００．７２　 ｍｌｌ　ＡｆｆｉＣｊ、・６Ｂ１００．７２　ｍｌｌ　／　Ｉ　ＣｏＣｊ　ｇ・ ６Ｈ２０１，５ｍｔｌ　ｊ　ＫＣｒ（ＳＯＪｚ　・１２ＢｇＯ０，７５■／　Ｉ 　Ｃｔ＋ＳＯａ　＋　５Ｏｆｆｉ。

０．１９　■７１４　Ｈ３ＢＯｓ ０．５１　・ｗｇ／　Ｉ　Ｍｎ５Ｏａ　・ＨＪｏ、７９　■／　ｉｔ　Ｎ１５Ｏ ａ・６１２００．７３　ｍｔｌ　ｊ！　ＮａｚＭｏＯａ　・２Ｈ！００．８６　 ｗ／　１２　ＺｎＳＯ４・７Ｈｔ０２１　ｍｌｌカゼイン加水分解物（Ｍｅｒｃ ｋ　Ａｒｔ、Ｎｏ、２２３８）２５　ｍｌｌカゼイン加水分解物（Ｓｉｇｍｅ　 Ｃ９３８６）１００　■／ｌシスティン ２　ｇ／ｊ！酵母エキス １　ｍｌｌクエン酸 １１　ｇ／Ｉｔグルコース・ｎ、ｏ　（開始時点もしくは供給）予備培養培地７ ００ｍ１に形質発現クローンを！！［Ｗｌシ、攪拌（１０００μ！ｗｒ　、磁気 棒）及び酸素導入（５ｖｖｗ（＋ｗｖｏｌ／ｖｏｌ／５ｉｎ）、通風格子（ｖｅ ｎｔｉｌａｔｉｏｎ　ｇｒｉｄ））下３７℃で１５時間培養した。この予備培養 物６００ｍｊ！を主培養培地１２１を含有する発酵槽に移した。主培養は以下の 条件で行った。

撹拌機系：翼撹拌機　１０００ｒｐ蒙 通風＝１．０ｖｖｓ 温度：２８℃ ｐＢ：６．５（調整のため　２５％　ＮＨｓ　）発酵中グルコース濃度を測定し た。グルコース濃度が５８／！にＮ　ちたら、１０ｔ／ｌのグルコースを加えた 。各場合１０ｇ＃の他の添加はすべて発酵槽中のグルコース濃度が１０μｌに低 下したときに行った。酸素分圧が約０．０５気圧に下がったら、発酵槽中の酸素 分圧を０．３バール（０，２９６気圧）に上げた。２０時間後、混合物を１５℃ に冷却し、バイオマスをＣＥＰＡ遠心分離機によって栄養培地から分離し、−７ ０℃で凍結した。

ｂ）　えＶＡＣ−αもしくはＶＡＣ−βタンパク　の溶液 プローブ緩衝液 １２５ｍＭ）リス　ｐＨ−６，８，４％　ＳＤＳ、１０％　メルカプトエタノー ル、１０％　グリセロール、０．０２％　ブロモフェノールブルー アクリルアミドゲル 積層ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ　ｇｅｌ）３％　アクリルアミド、０．１％　ビス アクリルアミド、１２５＋＊Ｍ）リス　ｐｎ譚６．８．０．１％　ＳＤＳ分離用 ゲル １３．５％　アクリルアミド、０．４５％ビスアクリルアミド、３７５ｍＭ）す 六　ｐｌｌ−８，８，０，１％　ＳＤＳ溶出緩衝液 １４．４ｇ／ｊ　グリシン、３．０２５ｇ＃　）リス、５ｍＪ２０％　ＳＤＳ タンパク質ゲル染色溶液 ０．１％　クマシーブルー、５０％　メタノール、１０％　酢酸脱染色溶液 ５％　メタノール、１０％　酢酸 グリセロール溶液 ７％　酢酸、２％　グリセロール 移動（ｔｒａｎｓｆｅｒ）　ＩＮＮ液 液１０×移動緩衝 液４．４ｇ＃！　）リス、１１２．６ｇ／＃　グリセロール１×移動緩衝液 １００ｍｊ！／ｊ　１０ｘ移動緩衝液、２００ｓ１／Ｊ　メタノール、１ｍ１／ Ｊ　エンピゲン（Ｅｍｐｉｇｅｎ）ブロッキング溶液 １％　ツイーン２０．１％　ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）、１０％　ウシ胎 児血清（ＣＩＢＳＯ）（ＰＢＳ中）ＢＳ ８　ｔ／　Ｉ　ＮａＣ！、０．２ｇ／１ＫＣ１−０，１５ｇ／ｌ　ＮａｔＰＯａ 、０、２　ｇ／　ｊ　ＫＢｇＰＯａ、０．１ｇ／ｊ　Ｍｇ（ｊｚ　、０．７ｇ／ Ｊ　Ｃａα２アルカリホスフアターゼ緩衝液 １００ｍＭ）す、２．　ｐＥ−９，５，１００ｍＭＮａＣ４’、５ｍＭ　ｈｇｃ ／。

発酵終了時に、液の光学密度を測定し、既知少量（ｏｎｅ　ａｌｉｑｗｏｔ）を 採取した。細菌をエンベンドルフ遠心分離機でペレット化し、２０００、。。ア 、（６００ａｍでの光学密度）の濃度でプローブ緩衝液に再懸濁し、１００℃で ５分変性した。不溶部分をすべてエンベンドルフ遠心分離機中で遠心分離するこ とによってベレット化した。５μ！をアクリルアミドゲル上に荷した。用いた参 考物質（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）はより高いリン酸塩濃度（０，０８ｍＭリン酸塩 ）で定常的に増殖させた形質発現クローンよりなっていた。これらの条件下でア ルカリホスファターゼプロモーターは活性化されなかった。

タンパク質を分子量によって６．５ジノ３（積層ゲル）もしくは１３ν／口（分 離用ゲル）でブロモフェノールブルー染料がゲルの末端に達するまで分離した。

ゲルの半分をクマシープルーで染色した。この目的のため、ゲルを染色溶液中で ３０分攪拌し、ついで脱染色溶液中で１時間処理した。過剰の染料（ｓｔａｉｎ ）を十分に除去するため、活性炭を充填した透析管を脱染色溶液に浸漬した。

ついでゲルとグリセロール溶液で３０分処理し、ゲル乾＠機で乾燥した。

残り半分のゲルタンパク質をニトロセルロースフィルターに移した。これをなす ために、バイオランド移動（ｔｒａｎｓｆｅｒ）装置中のＳａｎｄｗｉｃｈ　Ｗ ｈａｔｍａ＋＋　３　ＭＭベーパーゲルニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｂｅ ｒ−Ｓｃｈｕｅｌｌ　、　ＢＡ　８５）　ｔ＋ｌｂａｔｍａｎ３ＭＭペーパーを １×移動緩衝液中１５０Ｖ（１を流強度１０００ｍＭ）の電圧に２時間、冷却し ながら、さらした、ニトロセルロースフィルターをブロッキング溶液５０−ｌ中 周囲温度で一夜処理した。フィルターを、プロ７キング溶液／１：１０００希釈 ウサギ抗ＶＡＣ抗血清５■ｌ中で３時間インキュベートし、ついで流水で３０分 、ＰＢＳ／１％ツイーン２０　（Ｍｅｒｃｋ−３ｅｈｕｅｂａｒｄｔ　Ｎｏ、８ ２２１８４＞中で１５分（３回）洗浄した。フィルターを、抗ウサギ’　ｇ、Ｇ 　（Ｆｃ）　−アルカリホスファターゼ複合体（Ｐｒｏｍｅｇａ−ＰｒｏｔｏＢ ｌｏｔ　ＩｍｍｕｎｏｓｃｒｅｅｎｉｎｇＳｙｓ　ｔｅｍ）の１：２０００希釈 ブロッキング溶液２０■ｌ中周囲温度で３時間インキュベートした。フィルター を流水及びＰＢＳ／１％ツイーン２０中で上記したようにして洗浄した。結合し た抗体−アルカリホスファターゼ複合体を発色反応（Ｐｒｏｍｅｇａ−Ｐｒｏｔ ｏＢｌｏｔＩｓｍｕｎｏｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　５ｙｓｔｅ−）で検出した。ＮＥ Ｔ　（７０％ジメチルホルムアミド中の５０■７ｍｌニトロ−ブルーテトラゾリ ウム）６６μ！及びＢＣＩＰ（ジメチルホルムアミド中の５０■ｌ園１５−フロ モー４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート）３３μｌをアルカリホスファ ターゼ緩衝液ＩＱｓ＆に溶解した。ニトロセルロースフィルターをこの溶液中で 発色が進行する（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）までインキュベートし、ついで流水で３ ０分洗浄した。フィルターを乾燥し、プラスチックフィルム中に加熱密封した。

図１９は結果を示す、「＋リン酸塩」は形質発現のないコントロールであり、「 −リン酸塩」はアルカリホスファターゼプロモーターノ制御下で（７）ＶＡＣ− α（りｏ−７ＨＢ１０１／ｐＲＨ２９１）もしくはＶＡＣ−β（りｏ−７ＨＢ　 １０１／ｐＲＨ２９２）タンパク質の形質発現を示す、ＶＡＣ−α及びＶＡＣ− βタンパク質とも染色ゲル上で容５に検出できる。形成されたＶＡＣタンパク質 の量は驚くべきことに少なくとも２０　Ｎ／　１１０Ｄｉｓｅｍｓ細菌培養液で あった。

ウェスタンプロ、トは染色されたＶＡＣ−αバンドを明瞭に示している。加えて 、より低分子量のいくつかのタンパク質が３０ｋＤまでの範囲に検出されるが、 ＶＡＣ−αタンパク質のＮ及び／またはＣ末端でのタンパク質加水分解切断によ って形成されたものかも知れない、タンパク質加水分解によって生成したＶＡＣ −αタンパク質の半分子であるかもしれない、抗血清によって認識される、２０ ｋＤより下の範囲のタンパク質も注意を引く、驚くべきことに、ＶＡＣ−βも抗 ＶＡＣ抗血清によって認識された。このバンドは実質上ＶＡＣ−αバンドはど強 く染色されていないが、クマシーブルー染色ゲルでのＶＡＣ−βバンドはその強 さにおいてＶＡＣ−αに相当するので、抗ＶＡＣ抗血清によるＶＡＣ−βの認識 は実質上ＶＡＣ−αタンパク質のそれに劣ると結論できる。

叉ｌ五−主 えＶＡＣ−αの　４ 出発材料　：　Ｅ、コリ　ＨＢＩＯＩ／ｐＲＨ２９１菌体を遠心分離し、−７０ ℃で凍結した。

ａ）　ホモジ　イゼーシッン　び 凍結菌体ケーキ１０３．５ｇを氷冷溶菌緩衝液（１００■ｈ　トリス／Ｈｃｌ、 ５０ｓ＋Ｍ　ＥＤＴＡ及び２０（１＋ＭＮａｃｊ、ｐＨ７，５）　５００ｓｊに 懸濁し、細菌塊（ｃｌｕｍｐｓ）を破壊するためにＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ（ ５回の短い振動）　（５ｂｒｉｅｆ　ｐｕｌｓｅｓ）で処理した。懸濁液をマン トン−ガラリン圧搾機（ｐｒｅｓｓ）に６０００　ｐｓｉ　（４２１，９ｋｇ／ ｃｄ）で３回通した。最後に、圧搾機を溶菌緩衝液３００ｍｆですすいだ、５Ｎ ＨＩＪでｐＨ８に調整したＰＥ４（ポリエチレンイミン、分子量３０，０００〜 ４０．０００）５％溶液を均質化懸濁液にＯ，Ｓ％ＰＥＩの最終濃度が達せられ るまで徐々に加えた。水浴中で３０分攪拌後、溶液をベンクマンＪ２−２１遠心 分離機を用い９０００　ｇ、４℃で６０分処理して清澄化した（粗抽出液）。

ｂ）　アンモニウム 固体硫酸アンモニウムを攪拌した粗抽出液に徐々に加えて、３０％飽和（１７６ ｇ／Ｊりとした。冷蔵庫中に一夜放置後沈殿を除去した。清澄な上滑を固体硫酸 アンモニウムと、６５％飽和（２３５ｇ／ｌ上清）となるまで徐々に混合し、つ いで２時間攪拌した。沈殿を１０，０００ｇ、４℃で３０分遠心分離して回収し た。これを５００ｗｚの２０ｍＭ）リス／ＩＩｃ／＋　５０ｍＭ　ＮａＣｆｆ、 ｐＨ７，４に溶解し、同じ緩衝液で硫酸アンモニウムがすべて除去されるまで（ 透析物にＢａＣｆｆｚを添加してＢａ５Ｏａを生成しないことによって決定する ）透析した。

Ｃ）匹且ｊ旦」懇闇ロ１江ユ凶杉３ＬυとＬＬＬ１Ｚエニ透析物を遠心分離して 清澄化し、２０ｍＭ）リス／ＨＣｆ’＋５０５Ｍ　ＮａＣＺ、ｐＨ７，４で平衡 化した、１６０ｍｊ！のＤＥＡＥ−ＦＦ−セファロースカラム（ファーマシア） に適用した。溶出液の０Ｄｚｔ。１．が緩衝液レベルに達したらすぐに、２０ｍ Ｍ）リス／ＨＣｆｆ、ｐ）１７．４中の５０−５００ｇＭ　Ｎａ（ｊの勾配を通 用した（すべての場合、直線濃度勾配の１０カラム容量）、溶出液をＯＤ□。。

、で監視し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　；及びＥＰＡＯ１８１４６５にウシＶＡＣに対 して記載された方法で調製した、胎盤ＶＡＣに対するウサギ抗血清、及びアルカ リホスファターゼにカップルさせたブタ抗ウサギＩｇＧを用いるウェスタンプロ ットによって分析した。　ＶＡＣを含有する画分をすべて集め、主ピークの端に あたるいくつかの画分を捨てた。ＶＡＣプールをＡＭＩＣＯＮｔＩＩ外濾過セル （ｃｅｌｌ）及びＰ　Ｍ　１０−　ｔｙｐｅ　Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒを用いて 濃縮した。

ファーマシアに２６／１００カラム（５００ｓｊ）にセファクリルＳ−２００Ｈ Ｒ（ファーマシア）を充填し、２０　ｍＭビス−トリス／　Ｈ１ｊ＋　１００ｍ Ｍ　ＮａＣｆｆ、　ｐＨ６，３で１５１５−２Ｏ／ｈの通過速度で平衡化した。

６−１５　＠Ｊ既知量の濃ＤＥＡＥ−ＦＦ−セファロ−スプール（全量８７．４ ｓ＋ｊり及び引き続いてのビス−トリス緩衝液（上記参照）をカラムに適用した 。溶出液をＯＤ□。７゜で監視した。ＶＡＣを表すピークは５ＤＳ−ＰＡＧＥ及 び既知量のウェスタンプロットで示されたように、ＵＶプロフィール（ｐｒｏｆ ｉｌｅ）の最後の目立つピークである。それを回収し、すべてのテストからのプ ールを合して（全部で７）、２０ｍＭビス−トリス／ＢＣＺ　ｐＨ６，３に対し て透析した。

ｅ）　Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ−ＦＡＳＴ−ＦＬＯ−での　Ｏ？トゲ−フィーＱ −３ｅｐｂａｒｏｓｅ−ｆａｓｔ−ｆｌｏｗ（ファーマシア）の４０　請１１カ ラム（Ｋ　１６／２０）をＦＰＬＣ系（ファーマシア）に結合し、２０１ビス− トリス／１（ＣＺ、ｐＨ６，３で平衡化した。透析したＶＡＣプールをカラムに 適用し、溶出液のＯＤ！、。１．が緩衝液レベルに戻るまで２０−ｎビス−トリ スで洗浄した。２０醜Ｈビス−トリス／ＨＣＪ、ｐＨ６，３中でのＮａ（ｊ勾配 を溶出のために用いた：１カラム容量中　０〜１０５ｍＭ　ＮａＣｆｆ　（４０ ｍｌ’）２０カラム容量中　１０５〜２４５ｗＭ　ＮａＣｆｆ　（８００ｍｊり ２カラム容量中　２４５〜３５０ｍＭ　Ｎａ（ｊ　（８０ｓｊりＶＡＣは約０． １４Ｍ　ドａｃｊで溶出する、ＵＶプロフィールの最後の目立ったピークにおい て同定することができた。純度を５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンプロット、逆相 ＨＰＬ、Ｃ及び等電点電気泳動で測定した。ＵＡＣプールを一２０℃で保存した 。

叉遡■−エ えび炊ＶＡＣ−αの２ 用いた方法： ａ）ゲル透過ＨＰＬＣ％　ｂ）　逆相ＨＰＬＣｃ）　Ｎ末端配列決定　、ｄ）ト リプシンペプチドマフブｅ）ＳＤＳゲル電気泳動、　ｆ）　ウェスタンプロット ｇ）等電点電気泳動 比較のため、天然ＶＡＣを一方で用い、組換えＶＡＣ−αを他方で用いた０個々 の分析方法のテスト条件を以下に記述する。

ａ）　ゲ７ｂ”１（ＰＬ旦 カラム・：　Ｗａｔｅｒｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐａｋ　Ｉ　１２５．２Ｘ（７， ８Ｘ３００鶴）、１０Ｍ粒子直径 溶出溶媒：　０．５　ＭＮａｔｓｏａ、０．０２　Ｍ　ＮａＨｔＰＯａ　、ｐＨ ７，０，０，０４％　ツイーン２０．２５％　プロピレングリコール 流速　：　０．５　ｍｊ！／ｓ＋ｉｎ 検出　：　Ｕｖ吸収、２１４ｇｍ 天然及び組換えＶＡＣ−αのクロマトグラムはそれぞれ３４　、０００及び３３ ．０００の分子量でＶＡＣモノマーの主ピークを示す０．さらに、少量のより早 く溶出するＶＡＣダイマーがある０分子量尺度（ｓｃａｌｅ）は４つの標準タン パク質によって決めた（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄＬ厳密にいうと、カラムは分子量 ではなく分子サイズによって分離される。

ｂ＞　ｕ口ＩＰＬＣ カラム　：　Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　ＷＰＣ＋ｓ　４−６　Ｘ　２５０．５ｇ粒子 直径、３Ｏａｍ孔直径 溶出溶媒Ａ：氷水中、１％　トリフルオロ酢酸溶出溶媒Ｂニアセトニトリル中０ ．１％　トリフルオロ酢酸勾配　：　２０％　Ｂ　２分、２０−６８％　Ｂ　２ ４分、６８％　Ｂ　１０分、６８−２０％　Ｂ　１分流速　＝　１．０　ｍｊ／ ｓ＋ｉｎ 検出　：　Ｕｖ吸収、２１４及び２８０ｎｓ天然及び組換えＶＡＣのクロマトグ ラムはＶＡＣについて約２９分の保持時間を示す、存在する非常に小さなピーク はその一部分はＶＡＣプローブ中の不純物である。ＢＷと名づけだすべてのピー クはカラムのブラインド値（ｂｌｉｎｄ　ｖａｌｕｅ）に基く。

ｃ）　Ｎ：】］Ｉυ引九定 逆相ＨＰＬＣで脱塩した（ｄｅｓａｌｉｎａｔｅｄ）組換えＶＡＣ−ａビークを 配列決定した。配列決定はプログラム（ｐｒｏｇｒａｍ）　４０　ＡＰＴＢを用 い、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ガス相シークエネーターによっ て行った。プローブを７０％ＨＣＯＯＨ５０μｌに溶解した。２×２５μｌをシ ークエネーターに適用した。最初の量の２．３ｎｍｏｌでアミノ酸３９まで配列 決定することができた。（天然タンパク質及びｃＤＮＡからの）予想との１００ ％一致が見い出された。

付加的なＮ−末端Ｍ　ｅ　ｔは検出されなかった（５１％）、＆ｌｌ換えＶＡＣ −αにおいて、Ｎ−末端は遊離状態にあって、天然ＶＡＣと同様ブロックされて いない。

ｄ）　ト１プシンベブチトマープ 天然ＶＡＣと組換えＶＡＣ−αとを比較した０両サンプルから、ＶＡＣを逆相Ｈ ＰＬＣで脱塩し、乾燥し、０．１％ＮＨＪＣ（ｈに溶解した。切断のため、４ｗ ｔ％のトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｔ　Ｐ　ＣＫ処理、水に１■／ ■ｌの量で溶解）を加え、３７℃で６時間のインキュベーシッン後、さらに４ｗ ｔ％のトリプシンを加えた。さらに−夜インキュベーション後、生成したペブキ ドを逆相ＨＰＬＣで分離した。示されたクロマトグラム（２１４ｎ−及び２８０ ｎｍ）は事実上同一のペプチドパターンを示す。

カラム　：　Ｗａｔｅｒｓ　μＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ＋ｓ、３．８Ｘ３００ｍ、 １０ｇ粒子直径、Ｉｏｎ一孔直径 溶出溶媒Ａ：氷水中、１％　トリフルオロ酢酸溶出溶媒Ｂニアセトニトリル中０ ．１％　トリフルオロ酢酸勾配　：　０−５５％　Ｂ　５５分、５５％　Ｂ　１ ５分、５５−０％　Ｂ　１分 流速　：１．０　■Ｊ／ｓｉｎ 検出　：　Ｕｖ吸収、２１４ｎ−及び２８０ｎ＊ｅ）　ＳＤＳ°ル　゛ ５ＤＳｔ気泳動は主として、Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｍ＋ｍｌｉ　（Ｎａｔｕｒｅ　 ２２７　。

６８０−６８５　（１９７９））によって最初に記述された方法によって行った 。銀染色（ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）を０ａｋｌｅｙ（Ａｎａｌ、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ−１０５，３６１−３６３（１９８０））の方法を用いて行った。

第１のゲルは天然及び組換えＶＡＣ−αの比較を示す、ダイマーＶＡＣの含量を レーザー目配濃度記録計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）による走査（ｓｃａｎｎ ｉｎｇ）によって定量したところ、天然ＶＡＣでは２％、組換えＶＡＣでは４％ であった。第２のゲルはＤＴＴ　（ジチオスレイトール、還元剤）を通用したか もしくはしなかった組換えＶＡＣ−αを示す、これはＳＤＳに安定なダイマーは 明らかにジスルフィド橋を介して結合しており、この結合はＤＴＴで還元できる ことを示している。

試薬の原（ｏｒｉｇｉｎａｌ）ｉＩ液：１５％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ） 過ｆＬ酸アンモニウム１５０■を蒸留水１謡ｌにする。

３０％アクリルアミド＋０．８％ビスアクリルアミドアクリルアミド　ビスアク リルアミド　水（加えて）１５ｇ　０．４ｇ　５０ｍｆ ３０ｇ　０．８ｇ　１００ｍｊ ４５ｇ　１．２ｇ　１５０ｍ１ アクリルアミドを対応する量の水に溶解し、使用前に濾過する。

分離用ゲル緩衝液 １．５Ｍ）リスＨＪ、０．４　％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　（Ｆ　テシル硫酸ナトリウム） ｐｕａ、ｓ １８、１６　ｇ　）リス＋〇、４ｇ５ＤＳを濃ＨαでＰＨ８，８に調整し、蒸留 水で、１００■ｌにする。

積層ゲル緩衝液　゛ ０、５　Ｍ　）す７．−　ＢＣｆ、　０．４％ＳＤＳ％ｐｌ’１６．８６．０４ ｇ）リス＋０．４ｇ５ＤＳを濃”ｆｌｃｌ　ｒｐＨ６，８４：調整し、蒸留水で １００ｍＡにする。

溶出緩衝液 ２５ｍＭ）リス、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、０．００５％ナトリウ ムアジド、ｐＨ，５ １２ｇトリス＋５７．６　ｇグリシン＋４ｇ５ＤＳ＋０．２ｇナト。

リウムアジドを蒸留本釣３．５１に溶解し、ｐｕｓ、ｓに調整し、４、（ｌにす る。新しい溶出緩衝液の電気伝導度を先行するバッチと比較するのが望ましい。

０．０５％クマシープルー染色溶液 ０．５５ｇのクマシープリリャントプルーＲ８５０をメタノール５００ｍｊ！に 溶解し、３０分攪拌し、濾過する。氷酢酸１００ｍ＃及び蒸留水５００■ｌを加 える。

脱染色溶液 ａ）手仕事の（ｍａｎｕａｌ）脱染色 脱染色溶液は染料なしの染色溶液に相当する：メタノール５００ｍｊ＋蒸留水５ ００ｍｊ＋氷酢酸１００ｍ！ｂ）７．５％酢酸中での電気泳動脱染色４ＸＳＤＳ 適用緩衝液（約１ケ月保存できる）染料濃縮物：ブロモフェノールブルー　５０ ｍｊ、グリセロール　０．５　鋤１１蒸留水を加えて１０ｍ１゜この溶液は約３ ケ月保存できる。

適用緩衝液：染料濃縮物　０．４■Ｊ、ＳＤＳ　０．８ｇ、グリセロール　４ｇ 、蒸留水を加えて１０論ｌ。

ｌＸ５ＤＳ適用緩衝液 ４ＸＳＤＳ適用緩衝液の蒸留水による１：４希釈液０ａｋｌｅｙによる銀染色： 試薬 脱染色剤 エタノール　２００ｍ７！、濃酢酸　６２．５　ｍｌ、蒸留水を加えて　１００ ０ｓｊ！ １０％ゲルタンジアルデヒド溶液 ２５％ゲルタンジアルデヒド 蒸　留　水　５０　ｍｌまたは１００　ｍｌ溶液は冷蔵庫に保存しなければなら ない。

０、ＩＮアンモニア性銀溶液 使用直前にのみ製造すべきである。

０、ＩＮ硝酸銀（１６．９ｇ／ｆ）　２３　ｍｌ　４６　ｓ６２５％アンモニア を８液　０．９　ｍｌ　１．９　ｓ＋ｊＯ．３６％ＮａＯｌ］（１．８ｇ１０． ５ｊり　１　０．　５　ｓｊ！　２　１　ａｌｌ蒸留水を加えて　５０　ｍｌ　 １００　ｍｌ現像剤（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）溶液 使用直前に調製する。

０、５％クエン酸（１．２５ｇ／２５０　＋＊Ｊ）　５　ｍｌ蒸留水　１ｚ ３７％ホルムアｌレデヒド　１霞ｌ 脱染色剤溶液（ｐｈｏｔｏｆｉｘｅｒ）Ｋｏｄａｋ定着液（ｆｉｘｅｒ）　（ｐ ｈｏｔｏｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を蒸留水でｌ：４に希釈する．希釈液は数回用 い得るが、脱染色に要する時間は頻繁な使用後は増加する。

２％グリセロール溶液 蒸留水１．１中　２３ｇグリセロール８７％０ａｋｌｅｙによる銀染色の方法 電気泳動後、ゲルの一角をｍｓし、ついで、シェーカー中で次の染色工程を行っ た。

−脱染色剤浴に３０分 −２０％ゲルタンジアルデヒド溶液（５０ｓｊ）に３０分−流水に３０分または 約２ｅの水に一夜−アンモニア性１１溶液（５０ｗｉＪ）に１０分−流水に３分 −現像剤溶液に約５分 現像プロセスは正確な期間内には終了しなかったが、遅くともバンクグラウンド が染色されはじめるまでには、バンドは十分染色された。現像は −ゲルに３０分水を供給する（タンク中でもしくは流水として） ことによって停止させた。

現像はゲルが水中にあるときもまだ続いていた（拡散時間）。

ゲルの脱染色はバンクグラウンドが強く染色されすぎた場合のみ必要であった。

−Ｋｏｄａｋ定着液にバンドとバックグラウンドの間の最適のコントラストが達 せられるまで約５−１０分、脱染色も流水中で直接停止させられた後も続いてい た（拡散時間）。

−２％グリセロール溶液に３０分 この後ゲルを濾紙上８０℃で１時間乾燥させることができる。

ｆ）　ウェス　ンプロート 免疫学的証明がウサギ抗ＶＡＣ血清（１：１０００に希釈）、及びアルカリホス ファターゼと複合させたブタ抗ウサギＩｇＧ（１：５００に希釈）と共のＶＡＣ について得られた。アルカリホスファターゼの酵素活性を検出するために、基質 ＢＣＩＰ（５−プロモー４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート）及びＮＢ Ｔ　にトロブルーテトラゾリウム）を用いた。ニトロセルロース上での比較用タ ンパク質の染色をアミドブランク（ａｍｉｄｏ　ｂｌａｃｋ）を用いて行った。

セミ−ドライ法によるウェスタンブロッティング１　材料 半乾燥電気ブロンター（ｅｌｅｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒ）　（Ｍｅｓｓｅｒｓ、Ｓ ａｔｒｏｒｉｕｓ）ＳＭ１７５５６；プロットされるゲルと同じサイズの濾紙； ゲルと同じサイズのニトロセルロース膜（孔サイズ　０．４５μ■）２　試薬 陽極緩衝液Ｉ　ＰＨ１０，４ ０、３Ｍ　）リス　３．６３　ｇ／８０　ｍｌｌ、２０％メタノール２０婁ｌ 陽極緩衝液２　ｐＨ１０，４ ２５ｍＭ）リス　０．３ｇ／８０ｍＡ、２０％メタノール　２０　■ｌ陰極緩衝 液　ｐＨ９，４ ２５Ｍトリス　０．３ｇ／８０　鵬！ ４０−Ｍε−アミノカプロン酸０．５２ｇ／８０　ｗｈｌ　（Ｍｗ　１３１．３ 　）２０％メタノール　２０−１ アミドブランクタンパク質染色培地 ０．５％（ｗ／ｖ）アミドブラック　４０ｍｊ！に０．５ｇ５０％メタノール　 ５０−１ １０％酢酸　１０−ｌ 脱染免液 メタノール−水−酢酸（５：　５　：　１）ＰＢＳ　（リン酸緩衝化塩水）　（ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）１０×ｓ縮液　ＰＨ１ ，２ １３６ｍ１’！　塩化ナトリウム　８０　ｇ２６ｍＭ　塩化カルシウム　２ｇ ８０ｍＭ　リン酸水素二ナトリウム　１１．３ｇ（８０ｍＭ　リン酸水素二ナト リウム・１２１１１０　２８．７ｇ）１４１　リン酸二水素ナトリウム　２ｇ蒸 留水を加えて　ＩＩ！。

使用前に１／１０に希釈する。

ブロンキング緩衝液 ｌ　ｘｐＢＳ中　１％　ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０洗浄緩衝液 　ｘＰＢＳ １　ｘ　Ｐ　Ｂ　ｓ　＋　０．１％ツイーン２０　ｘＰＢＳ アルカリホスファターゼ染色用染色緩衝液　ｐｎｓ、ｓｌｏｏｓＭ）リス　１． ２２ｇ １０（ｌａＭ　塩化ナトリウム　０．５８ｇ５ｍＭ　塩化マグネシウム・６Ｂ＊ ０　０．１０ｇ蒸留水で１００　■ｌにした。

ＮＥＴ　にトロブルーテトラゾリウム）溶液５０ｘ　ＮＢＴ　（Ｍｅｓｓｅｒｓ 、　５１ｇ５ａ　Ｎ−６８７６）　／　ｍ１７０％　ジメチルホルムアミド ＢＣＩＰ（５−プロモー４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート）溶液 ５０ｗ　ＢＣＩＰ　（Ｍｅｓｓｅｒｓ、Ｓｉｇｍａ　Ｂ−８５０３）　／　ｍ１ １００％　ジメチルホルムアミド アルカリホスファターゼ用染色媒体 染色緩衝液　ｌＯ■ｌ、ＢＣＩＰ　Ｏ，０３３ｍｌｌ及びＮＢＴＯ，Ｏ６５■ｌ 抗体試薬 アルカリホスファターゼと複合させたウサギ抗ＶＡＣ血清３　プロット操作 ブロッティングは０．８ａＡ／−ゲル面積で６０分行った。

４　ニトロセルロース膜上のタンパク質の検出４．１　アミドブランクによるタ ンパク質の染色タンパク質染色に供するニトロセルロース膜の部分を切り取り、 アミドブランク染色溶液に５分間入れた。ついで数回用いることができる該染色 溶液を流し出し、過剰の染色溶液をニトロセルロース膜から水ですすぎ去った。

４．２　免疫的検出 ４．２．１　ニトロセルロース膜のブロッキング免疫的検出の前に、ニトロセル ロース膜を０．１％ツイーン２０含有ＩＸＰＢＳ中の１％ＢＳＡで少なくとも６ ０分（もしくは−夜）ブロックした。

４．２．２　酵素！ｌ識した抗体による検出ブロンキング後、ニトロセルロース 膜をウサギ抗ＶＡＣ血清（ブロンキング媒体で希釈するのが適当である）で６０ 分インキュベートした。

ついで３回洗浄した（１ｘＰＢＳ、０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳ、１ｘＰＢ Ｓ）、膜をアルカリホスファターゼと複合化させたブタ抗ウサギＩｇＧ（ブロッ クキング媒体での適当な希釈で）でインキュベートした（６０分）、ついで膜を 上記と同様３ＸＰＢＳで再び洗浄した。

４．２．３　プロットの酵素的染色 ニトロセルロース膜を染色媒体（ミニゲルについてはｌＱｍＩｌで十分であった ）中に入れ、バンドが十分に染色されるまでシェーカー中でゆっくり移動させた 。染色媒体を水で洗い流すことにより染色を停止させ、ニトロセルロース膜を空 気乾燥させた。

５　ウェスタンプロットの評価 免疫的／酵素的に検出したプロットのバンドをプロットのタンパク質染色のバン ド及び５ＤＳｔ気泳動の対応するバンドパターンと比較し、互いに帰属させた（ ａｓｓｉｇｎｅｄ）　＊７　等電点電気泳動 組換えＶＡＣ−ａの等電点（ｐｉ）４．９は天然ＶＡＣ（４，８）より０．１　 ｐＨ高い。

ポリアクリルアミドゲル−等電点電気泳動（ＰＡＣＩＦまたはＩＥＦ） 装置及び試薬 フィルム上で重合させた等電点電気泳動用ポリアクリルアミドゲルプレート（Ｌ ＫＢ−’″ＰＡＧ　ｐｌａｔｅ　ｓ、　５ＥＲＶＡ　−５ｅｒｖａｌｙｔ　ｐｒ ｅｃｏｔｅｓ　”）当面のｐＨ範囲のための電極溶液 ｐＨ３，５−９，５（Ｌ　Ｋ　Ｂ　−ＦＡＧ　ｐｌａｔｅ　）陽極溶液　１Ｍリ ン酸 陰極溶液　１Ｍ水酸化ナトリウム溶液 ｐＨ５，５−８，５（Ｌ　Ｋ　Ｂ　−ＰＡＧ　ｐｌａｔｅ　）陽極溶液　０．４ Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（Ｎａアドジに共に）陰極溶液　０．１　Ｍ　Ｎａ１ｌ ｐＨ４，０−６，５（Ｌ　Ｋ　Ｂ　−ＰＡＧ　ｐｌａｔｅ　）陽極溶液　０．５ Ｍリン酸＋０．１　Ｍグルタミン酸陰極溶液　０．ＩＭβ−アラニン（Ｎａアジ ドと共に）ｐＨ３，５９，５（ＳＥＲＶＡＬＹＴ　−ｐｒｅｃｏｔｅｓ　）陽極 溶液　２５１アスパラギン酸＋２５５１Ｍグルタミン酸陰極溶液　２Ｍエチレン ジアミン＋２５ｍＭアルギニン塩基＋３７．５ａＭリジン塩基 冷却剤　ケロセン（ｋｅｒｏｓｅｎｅ）　（Ｓ　Ｅ　ＲＶ　Ａ製）定着（ｆｉｘ ｉｎｇ）　溶液　５％スルホサリチル酸と共の１０％トリクロロ酢ａ（ＴＣＡ） ０．０５％クマシーブルー染色溶液 脱染色液　５００　蒙ｌメタノール＋５００　輸ｌ水＋１００■ｌ氷酢酸 プローブ プローブは塩分が少ないか、好ましくは塩分がないことが必要である。高すぎる 塩分濃度はＩＥＦ前に約５−１０ｍＭ緩衝液もしくは水に対して透析しなければ ならない、しかしながらＮａＣ１は１００ｓ＋Ｍまで存在していてもよく、その 範囲では溶出前＠（ｅｌｕｔｉｏｎ　ｆｒｏｎｔｓ）を混乱させない。

タンパク質染色前のＩＥＦゲルの定着（ｆｉｘｉｎｇ）ゲルを定着溶液に入れ、 振盪することなく　（ゲルはフィルムから容易にはがれる）２０分保持した。つ いでゲルに５分間水をかけた。

クマシーブルーによるＩＥＦゲルのタンパク質染色定着したゲルを染色溶液に約 ２時間入れ、非常に緩やかに動かした。

ＩＥＦゲルの脱染色 染色後、過剰の染色溶液を水ですすいで除き、ゲルを脱染色液を頻繁に取り換え ることによって脱染色した。十分な脱染色欲、ゲルに脱染色液がすべて洗い去ら れるまで水をかけた。

ＩＥＦゲルの乾燥 ゲルを湿った水透過性の透明なフィルムまたは透析膜上に水不透過側を上にして 置き、８０℃で１時間乾燥した。

裏Ｕ土立 えＶＡＣの Ａ　Ｉｆｌ飾プロトロンビン時間テスト（ＥＰＡＯ１ａ　１４６５ｅａ）クエン 酸化した（ｃｉｔｒａｔｅｄ）血小技除去血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｆｒｅｅｐ ｌａｓｍａ）を組換えＶＡＣ（ｒ−ＶＡＣ）または天然ＶＡＣの存在下もしくは 不存在下３７℃で２分間攪拌した。インキュベーション後、脳組織因子（ｂｒａ ｉｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ）及びＣａ”の溶液を加えた。フィブリン形 成が観察され、凝固時間を視覚的に記録した。結果を図３３に示すが、ｒ−ＶＡ Ｃ及びＶＡＣが投与量の関数としてフィブリン形成を抑制することを証明してい る。

ｒ−ＶＡＣ及びＶＡＣの特異的活性は明らかに同じ程度の大きさである。

Ｂ　トロンビン時間テスト（ＥＰＡＯ１８１４６５参照）クエン酸化したＰＰＰ をｒ−ＶＡＣもしくはＶＡＣの存在下もしくは不存在下３７℃で２分間攪拌した 。インキュベーション後、トロンビン及びＣａ”を加えた。フィブリン形成を視 覚的に観察した０図３４から分るごとく、ｒ−ＶＡＣもＶＡＣもトロンビン誘導 フィブリン形成を抑制しない、従って、ｒ−ＶＡＣ及びＶＡＣはトロンビン生成 を抑制するがトロンビンの活性は抑制しない。

Ｃ＆ｌＩ織因子活性化血漿中でのχａ因子の生成（Ｅ　Ｐ　Ａ　０１８１４６５ 参照） クエン酸化したＰＥＰをｒ−ＶＡＣもしくはＶＡＣの存在下もしくは不存在下３ ７℃で２分間攪拌した。

ついで脳組織因子及びＣａ”の溶液を、凝固を開始させるために、ＰＰＰに加え た。一定時間後、サンプルを採取し、緩衝液で１０００倍に希釈した。この溶液 １０μｌを、以下のプロトロンビナーゼ複合体成分を含有する混合物４０／ＪＪ に加えた＝０．６ｎＭ　Ｖａ因子、５０μ詐リン脂質（８０％ジオレオイル−ホ スファチジルコリン／２０％　ジオレオイル−ホスファチジルセリン）、１．０ μｈプロトロンビン２分の反応後、活性化されたプロトロンビンの量を色素形成 基質（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ）　Ｓ　２２３８を用いる アミド分解活性から判断した。この方法で測定されるアミド分解活性の量はＰＦ Ｐ中の活性Ｘａ因子の量に直接比例する。

１００倍希釈後、ＶＡＣがＰＰＰに存在する場合、プロトロンビン活性化作用は 観察されなかった。

典型的なＸａ因子生成曲線及びｒ−ＶＡＣ及びＶＡＣ（７）効果を図３５に示す 。

これらの結果から、ｒ−ＶＡＣがＶＡＣと同様に組織因子によって誘導される血 漿中のＸ因子の活性化を用量の関数として阻害すると結論することができる。

これらの結果はまたｒ　−Ｖ　Ａ　Ｃ！ＪＶ　Ａ　ＣもＸａ因子を直接に時間依 存的に不活化するのではないことを間接的に示している。

この言は曲線の形に基いてなすことができる。極大値に達するとＰＥＰ中の活性 Ｘａ因子の量は擬像−次動力学（ｐｓｃｕｄｏ　ｆｉｒｓｔｏｒｄｅｒ　ｋｉｎ ｅｔｉｃｓ）に従って減少しはじめる。恐らくこの減少が抗トロンビンｍによる Ｘａ因子の不活化に帰結するのであろう。

これらのデータから計算された擬似−次速度定数は約０．２５＠ｉｎ−’であり 、ｒ−ＶＡＣ及びＶＡＣが存在するときも変らない。

これらのデータはｒ−ＶＡＣがＶＡＣ活性を有することを明瞭に実証している。

この凝固テストにおけるｒ−ＶＡＣの特異的活性はＶＡＣのそれと同じであり、 またｒ−ＶＡＣはχａ因子及びトロンビンを直接的には不活化しないけれども、 ＶＡＣ活性がｒ−ＶＡＣに属するという事実を何らの疑いなく実証するために、 ｒ−ＶＡＣのリン脂質への結合の研究を付加的に行った。

ジオレオイル−ホスファチジルコリンとジオレオイル−ホスファチジルセリン（ ８０％／２０％）よりなるリン脂質二重層へのｒ−ＶＡＣ及びＶＡＣの結合は自 動円二色計（ｅｌ　１　ｉｐｓｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。この方法はＣ ｕｙｐｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ。

２５８　（１９８３）、２４２６−２４３１に記載されている。

この研究の良形的な結果を３６図に示すａ　ｒ−Ｖ　Ａ　ＣもＶＡＣも、この二 重層Ｉｌあたり１ｋｇの濃度で加えたとき、二重層に対し同じ結合動力学を示す 、結合はＣａ”の存在下に行われ、ＥＤＴＡの添加によって実証されるように可 逆的である。

要約するに、ｒ−ＶＡＣは生物的に活性であり、天然ＶＡＣと区別できないこと が見い出された。

災立史上上 テトラサイクリン抵抗性ＶＡＣ−α及びＶＡＣ−β形質発現ベクター（ｐＧＮ２ ５、ｐｃＮ２６）の構築１μｇのｐＡＴ１５３を５０ｐｌの溶液中ＥｅｏＲ１で 切断した。

ｉＩ素活性を７０℃に加熱することによって破壊し、突出末端をＤＮＡポリメラ ーゼＩ／クレノー断片（ｐｏｌ　１ｋ）（５単位）及び４つのデオキシリボヌク レオシドトリホスフェート（各最終濃度２０　ｐＨ）の添加に°よって充填反応 （ａ　ｆｉｌｌ−ｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏａ）に服せしめることによりまつすぐに した（ｓｔｒａｉｇｈｔｅｎｅｄ）　＊　７０℃に加熱してｐｏｌ　１　ｋ活性 を破壊した後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。直鎖化したＤＮＡを５０μＥ 中のＰｖｕｌで再切断した。

ｐＲＨ２９１及びｐＲＨ２９２をまず５Ｐｈｌで直鎖化し、３′突出末端をｄＧ ＴＰの存在下ｐｏｌ　ｌ　ｋの３′エキソヌクレオリテ４７り（３’　ｅｘｏｎ ｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性によって分解した。ＤＮＡの沈殿後、これらのＤＮ ＡをＰｖｕ２で再切断した。３つの消化による断片をアガロースゲルで分離し、 対応する断片を溶出した（ｐＡＴ１５３　３０３２ｂｐ、ｐＲＨ２９１１９８７ ｂｐ。

ｐＲＨ２９２２６０７ｂｐ）、ｐＡＴ１５３断片５０ｎｇを５０ｎｇのｐＲＨ２ ９１またはｐＲＨ２９２断片と混合し、１０ＩＪｊ中でつないだ、１００μ＆’ の受容（ｃｏｍｐｔｅｎｔ）　Ｅ、コリＨＢＩＯＩを５μｌのリガーゼ溶液と一 緒にして形質転換させた０選択は１００μｇ／ｍｊ！のアンピシリンを含有する ＬＢ寒天上で行なった。形成されたクローンのいくつかを１２．５ｋｇｌ−ｌの テトラサイクリンを含有するＬＢ寒天上に撒いた。その上で増殖するクローンを 用いてプラスミドＤＮＡｆｃ調製した。微量調製されたプラスミドを種々の制限 酵素で切断し、このようにして構築の正しさをチェックした。各場合において１ つのクローンを選びｐＧＮ２５（ＶＡＣ−α）またはｐＧＮ２６　（ＶＡＣ−β ）と命名した。

Ｅ、コリＨＢ１０１／ｐＧＮ２５またはＨＢＩ　Ｏ１／ｐＧＮ２６を、アンピシ リンの代りにテトラサイクリン５■／ｌを予備培養において用いた以外実施例７ と同様な発酵に服せめた。主発酵の間、既知の少量を採取し、Ｌ’ｍ＊ｍｌｉに 従って１５％アクリルアミド１０．１％ＳＤＳゲル上で調査した。Ｅ、コリＨＢ 　１０１／ｐＲＨ２９１もしくはＨＢＩＯＩ／ｐＲＨ２９２の発酵から何の差異 も見い出されなかった。ＶＡＣ−α及びＶＡＣ−βを発酵のバイオマスから精製 した。タンパク質分析も、クローンＨＢ　１０１／ｐＲ１（２９１及びＨＢＩＯ Ｉ／ｐＲＨ２９２の発酵からの対応組換えタンパク質から何の差異も示さなかっ た。

２里■上上 組換えＶＡＣ−βの精製 盗見林料 Ｅ、コリ　クローンＨＢＩＯＩ／ｐＲ）１２９２菌体を遠心分離によって回収し 、−７０℃に凍結した。

１体良ｌ止及登迫斑 凍結菌体１００ｇ−を氷冷溶菌緩衝液（１００ｗ＋Ｍ　）リス／ＨｃＩ！、５０ ５Ｍ　ＥＤＴＡ及び２００ｍＭＮａα、ｐＨ７，５）　５００　ｍｌに懸濁し、 固まりを破壊するためにＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ中での５つの短い衝撃によっ て処理した。ついで懸濁液をマントン−ガラリン圧搾機に６０００ｐｓｉ　（４ ２１，９ｋｇ／ｃｊ）で３回通し、圧搾機を３００ｍ１溶菌緩衝液ですすいだ、 均質化した懸濁液に、５Ｎ塩酸でｐ）ｌ−８に調整した、ＰＥＩ（ポリエチレン イミン、分子量３０，０００−４０．０００）の５％溶液を加え、最終濃度０． ５％ＰＥＩとした。

水浴中で３０分攪拌後、溶液をＢｅｃｋｓａｎ　Ｊ　２−２１遠心分離機を用い て９０００ｇ、４℃、６０分で清澄化し、粗ＶＡＣ−β抽出液を得た。

シ１カクロマトグーフイー ５ｉｌｉｃａ　Ｃａｔａｌｙｓｔ　Ｃａｒｒｉａｒ＋　Ｇｒａｄｅ　９５３ｖ　 （Ｇｒａｃｅ　Ｇｓ＋ｂＨ，、Ｉ＋ｌｏｒｍｓ。

ＢＲＤ）を蒸留水に沈陣させて細粉を除き、直径５０１１．床高２０１のクロマ トグラフィーカラムに充填した。溶菌緩衝液で平衡後、粗抽出液をカラムに通塔 し、溶菌緩衝液３Ｅで洗浄した。ＶＡＣ−βを溶菌緩衝液中のテトラメチルアン モニウムクロライドの直線勾配（２０００＋＋＋Ｊ緩衝液中０−　Ｉ　Ｍ）で溶 出した。溶出液の画分を参照物質（ａ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｍａｔｅｒｉａｌ ）を用い、ＶＡＣ−βのための５ＤＳ−ＰＡＧＥで監視し、ＶＡＣ−β含有画分 をプールした。

ＤＥＡＥ−５ｅ　ｈａｎｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗクロマトグラフィープール したシリカ百分を２０ｍＭ）リス／ＥＣ！　ｐＨ８，４で透析し、２０ｓＭ）リ ス／ＨＣ！　ｐＨ８，４で平衡化したＤＥＡＥ−ＦＦ−セファロース（ファーマ シア）のカラム（２６Ｘ３３０諺諺１７５ｍｊ）に適用した。カラムを５００ｍ Ａ’の緩衝液で洗浄し、ＶＡＣ−βを８７５ｍ１！ｌｉ衝液（５カラム容量）中 ０−５００＊Ｍ　Ｎａ（ｊの勾配で溶出した。溶出液のタンパク質含量を２８Ｏ ｎｍで監視し、タンパク質合音画分を参照物質を用い、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより て分析した。ＶＡＣ−β含有画分をプールし、Ａ？１ＩＣＯＮスタート（ｓｔｉ ｒｒｅｄ）限外濾過セル及びＰＭＩＯフィルターを用いてｆｓ縮した。

ファーマシアカラムに２６／１００　（５００ｓｊ）にセファクリル５−２００ ＨＲ（ファーマシア）を充填し、２０ｍＭ）リス／ＢＣ！＋　１００ｍＭ　Ｎａ （ｊ　ｐＨ８，４で１２０　診ｊ／ｈの流速上平衡化した。濃縮ＶＡＣ−βプー ル（４１１１りをカラムに適用し、流速を６０−８０　■ｊ／ｂに減じた。溶出 液のタンパク質を２８Ｏｎ−で監視した。ＶＡＣ−βをＵＶプロフィールの唯一 のピークとして同定できた。それを、ＵＶプロフィールでも検出された、ショル ダーの高分子量不純物を除いてプールした。精製ＶＡＣ−βを５Ｄｓ−ＰＡＧＥ で分析し、−２０℃で保存した。

ｌ　：　組換えＶＡＣ−β出発材料、すなわち１００ｇの凍結国体ペーストの精 製 粗抽出液　８１０　１６．１　１３．０４０ＤＥＡＥ−ＦＦ−プール濃縮物　４ 　５８　３２３ｘ）　Ｂ　ｌｏ−ＲＡＤタンパク質アッセイ（標準：ウシ血清ア ルブミン）によるタンパク質 寒施五上主 ＶＡＣ−βの　と　卆づ番 ＳＤＳゲル電気泳動を各精製工程間の処理中チェックとして用いた。この分析は 最終チェックにおけると同様正確に行ったが、その分析についてはそこに記述す る。１つの精製中に得られたＳＯＳゲルシリーズは実施例１２（ＶＡＣ−βの精 製）に含有されている。

以下の方法を最終チェックとして及び精製タンパク質を性格づけるために用いた 。

ａ）　ゲル透過ＨＰＬＣ，ｂ）　逆相ＨＰＬＣＣ）　アミノ酸分析、　ｄ）　Ｎ 末端配列決定ｅ）　ＳＤＳゲル電気泳動、ｆ）等電点電気泳動ａ）ヱ止盗盪且り １旦 カラム＝に４ａｔｅｒｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐａｋ　Ｉ　１２５．　２　Ｘ　（ ７，８Ｘ３００Ｍ）、粒子直径１０ｃｒａ＋、周囲温度溶出溶媒＝　０．５　Ｍ 　ＮａｔＳＯａ、０．０２　Ｍ　ＮａＨｚＰＯａ　、ｐＨ７，０１０，０４％ツ イーン２０．２５％プロピレンゲルコール流速：０．５ｍｊ／■ｉ１１ 検出：ＵＶｖ＆収、２１４ｎｓ、０．５０ｔＪＴ精製ＶＡＣ−βのクロマトグラ ム（図４０）は分子量２９．ＯＯＱにＶＡＣ−βモノマーの主ピークを示し、さ らに少量のＶＡＣ−β二量体も検出できる（Ｍ　ａｐｐｎａｘ、　５　（Ｌ　Ｏ ＯＯ）　、これらの分子量値は予想された値（Ｍ　３７．０００）より比較的に ずっと低いが、これは用いたゲル透過カラムが分子量でな（分子サイズもしくは 分子配置（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）に基いて分離す るものだからであると推測される。

ｂ）１凰且ヱ旦旦 カラム：　Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　Ｗ　Ｐ　Ｃ＋　ｓ、４．６Ｘ２５０ｍ、粒子直 径５μｍ、孔直径３０ｎ謡、周囲温度 溶出剤Ａ：氷水中０．１％　トリフルオロ酢酸溶出剤Ｂニア七ト二トリル中　０ ．１％　トリフルオロ酢酸勾配：２０％　Ｂ　２分、２０−６８％　Ｂ　２４分 、６８％　Ｂ　１０分、６８−２０％　Ｂ　１分流速：　ｌ　ｍＡ／ｓｉｎ 検出：ＵＶ＠収、２１４ｎｗ、　０．５ＯＵＴクロマトグラム（図４１）は最後 の精製段階の溶出液に直接由来するものであるが、酸化されたＶＡＣ−βの主ピ ーク（２つのジスルフィド橋、ｔ＋＋−２６，６分）を示している。さらに約９ ％の還元ＶＡＣ−β（ｔ、−２７，４分）及び残りの不純物のいくつかの小さな ピークも検出できる。

クロマトグラム（図４２）は３Ｍ尿素、０．０５Ｍジチオスレイトールで２時間 インキニベーシッン後の同じＶＡＣ−βサンプルを示す、タンパク質は主として 還元形態で存在している（１＋＋電２７．４分）。

Ｃ）ヱｍ辷丸近 精製ＶＡＣ−βを逆相ＨＰＬＣ（方法についてはバラグラフｂ参照）によって脱 塩した。ＶＡＣ−βの主ピークを加水分解管に回収し、乾燥した。

ガス相中６Ｎ塩酸（１％フェノール添加）で加水分解を行った（１１０℃、２２ 時間）、アミノ酸をアミノ酸アナライザー（タイプ６３００、ベックマン製）を 用い、ニンヒドリンによる後カラム誘導体化（ａ　ｐｏｓｔ−ｃｏｌｕｍｎ　ｄ ｅｒｉｖａｔｉｓａｔｉｏｎ）によって測定した。

ＶＡＣ−β試料のアミノ酸分析（４３図）は理論組成物から６．５６％の合計偏 差（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を示している。

ｄ）Σ困ユ里舅夾よ 精製ＶＡＣ−βを逆相ＨＰＬＣ（方法についてはパラグラフｂ参＠）によって脱 塩した。シＡＣ−βの主ピークを回収し乾燥した。

残留物を０．１％トリフルオロ酢酸７５μｌに溶解し、配列決定のために直接用 いた。

配列決定はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂ玉ｏｓｙｓｔｅ−製のガス相シークエネーター（ Ｍｏｄｅｌ　４７０　Ａ　９　）を用い、プログラム３９ａｐｔｈで行った。

約１ｎＭの開始量で３９番目のアミノ酸まで配列決定することができた。予想さ れた配列と１００％の一致が見られた。明らかに、Ｎ末端メチオニンは１００％ はがされていた（図４４）。

ｅ）ＳＤＳゲル　気泳 ＳＤＳゲル電気泳動を主としてＵ、　Ｋ、　ＬＭ＊ｍｌｉによって規定された療 法にそって行った。処理中チェックのため、ＶＡＣ−β試料を通用前にジチオス レイトールと一緒にし、煮沸した（ｄｅｃｏｃｔｅｄ）　＊最終チェックは還元 条件下及び非還元条件下の両方で行った。

ゲルをクマシープルーで染色した。

図４５はＶＡＣ−β試料のＳＤＳゲルを示す。

トレース（ｔｒａｃｅ）　ｌ及び１０：分子量マーカーなしの処理中ＶＡＣ−β 試料 トレース４及び６　：　ＶＡＣ−β　１０μｇ、還元せずトレース５及び７　： 　ＤＴＴで還元したＶＡＣ−β　１０μｇトレース８及び９：ＶＡｃ−β　１μ ｇ、還元せず還元剤なしのＶＡＣ−βは二重バンドとして検出できる０Ｍ約３６ ，０００のより強力な低い方のバンドは酸化形態であり、他方Ｍ約３８．０００ の高い方のバンドはＶＡＣ−βの還元形態である。２つの形態の量分布（ｑｕａ ｎｔｉｔｙ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）はトレース８及び９に容易に見ること ができる。

還元剤としてのＤＴＴの添加後−従って上の方のバンドのみ依然として見ること ができる（トレース３．５及び７参照）。

トレース４〜７は大きな過負荷になっている（ｏｖｅｒｌｏａｄｅｄ）、ＶＡＣ −βバンドに加え残余不純物のい（つかのバンドも見られる。

ｆ）隻Ｉ」がしく虹軌 クマシーブルーを用い染色を行う、大いに精製したＶＡＣ−βの等電点電気泳動 、図４６（３，３，１９８８１５１）はＶＡＣ−βがその最後の精製段階（トレ ース２及び３）でｐＨ５，３５及び５．４５での２本の主バンドを生ずることを 示している。従うＴＶＡＣ−βの等電点（ｐｉ）はＶＡＣ−α（ｐｌ−４，９） のそれより有意により塩基性であるが、このことはＶＡＣ−βが酸性アミノ酸を より少ししか含有しないことから予想されることである。

ジチオスレイトールで還元後、ｐｎｓ、ａｓの主バンドが大巾に濃縮される（ト レース４及び５）、これは明らかにＶＡＣ−βの還元形態である。

！丘■土土 ＶＡＣ−ｃｒ　びＶＡＣ−βの　活 プロトロンビナーゼ複合体を精製ウシ凝固因子とリン脂質から再構成した（ｒｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）　＊それは０．３　ｎＭ　Ｘａ因子、０．６　ｎＭＶ ａ因子、１μｈプロトロンビン、２μｈリン脂質小胞（２５９Ａジオレオイル− ホスファチジルセリン、７５％ジオレオイル−ホスファチジルコリン）及び３ｍ Ｍ　ＣａＣＩｚよりなっていた。

プロトロンビン活性を以下のようにして測定した。

Ｘａ因子、Ｖａミリン質、Ｃａ”・及び変化量のＶＡＣを３７℃で２分インキュ ベートした。プロトロンビンの活性化をそれの添加によって開始させた。いくつ かの時点で混合物から既知少量を採取し、５０１トリス／Ｈｃ！、１７５ｓＭ　 Ｎａ（ｊ、　０．５ｗ／ｓｊ　ＢＳＡ、２０−Ｍ　ＥＤＴＡ及び０．２３ｍＭ　 ３２２３８よりなる緩衝液に入れた。

アミド分解活性を４０５ｎ−で追跡した。既知量のトロンビンで作成した参照曲 線（ａ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｃｕｒｖｅ）から、活性化されたプロトロンビン の量を決定した。４７図はこの結果を示す。

Ｅ、コリを３Ｈ−オレイン酸で代謝的に標識し、別に記載されたようにして（Ｄ ａｖｉｄｓｏａ＋　Ｆ、　Ｆ、、　Ｄｅｒ＋ｎｉｓ＋　Ｅ、　ＣＩ　Ｐｏｗｅｌ ｌ、　Ｍ、、　＆Ｇｌｅｎｎｅｙ、Ｊ、　Ｒ，、Ｊｒ　（１９８７）、Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　２６２　、１９９８−１７０５）さらに処理した。Ｅ、コ リ膜調製物は比活性１．２×１０　’　ｃｐｓ／ｎ　ｍａｔ　リン脂質のリン脂 質を１９８μＨ含有していた。

この膜調製物は我々のアッセイにおける、ホスホリパーゼの基質として機能した 。

このアッセイは以下のようにして行った。変化量のＶＡＣ及びＣａ”を含をする ０、　１　Ｍ　）リス／ＥＣＩ　（ｐＨＢ、ｏ）　１３０　、！＋　１２．及び Ｅ。

コリ膜１０μｌを室温でインキュベートした０時点０でウシ膵臓ホスホリパーゼ Ａｘ−２ｎｇを含有する０、　１　Ｍ　）リス／ｌｌＣ！（ｐＨ８，０）１０ａ ｌｌを加えた。２分の時点で２ＮＨｃ１５０．ｃｒｆと、Ｂ５Ａ１００ｗ／ｍＡ 含有０．１　Ｍ　）す：ｘ、／ＨＣ！　（ｐＨ８，０）　５０　ｐ　ｌを添加し て反応を停止させた。混合物を１４．０ＯＯｒｐ−で５分遠心分離した。上滑中 の放出３Ｈ−オレイン酸量をシンチレーション計数によってめた。ホスホリパー ゼＡｔ活性の阻害率を次のようにして計真した； １００％−［（ＣＰＩＩｐｔａ＊ｖｍｃ−ＣｐＨｂｔａｍｍ）／（ＣＰＩｌｐｔ ｍ　−ＣＰｍｂｔｍａｃ）］　”　１００％式中ｃｐ纏ｐ１ｍ＋ｖａｃ　＊　Ｃ Ｉ）Ｉｌｐｔｉ及びｃｐＨｋｌ、□はそれぞれホスホリパーゼＡ、及びＶＡＣ， ホスホリパーゼＡ！、及びＶＡＣを含有する混合物の上滑中で測定されるｃｐｓ を表す。

結果を図４８．４９．５０及び５１に示す。

１、　キーホールリンペント（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ）（ｌｉｍｐｅｔ ：カサ貝）ヘモシアニンに結合させた（ｃｏｕｐｌｅｄ）　Ｖ　Ａ　Ｃ−αの調 製ＶＡＣ−αを以下のようにしてキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　 Ｈ；　Ｓ　Ｉ　ＧＭＡ　ｃｈｅｍｉｃａ１社＋　ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ＋　ＵＳＡ　 ；カタログ番号　Ｈ−２１３３）に共有結合させた。

１、ＩＶＡＣ−α／ＫＬＨ調製物１ リン酸緩衝化塩溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ） 　（ｐＨ７，２）１．５ｍｌ１に？容解したＶＡＣ−α０．５１■をキーホール リンペフトヘモシアニン溶液（リン酸緩衝化塩溶液（ｐＨ７，２）中８■／園ｊ り０．１２ｍｊ！と混合した。２５％グルタルジアルデヒドートシ、ついでリン ａ緩衝化塩溶液Ｂで一夜透析した．この溶液の既知少量ずつを一２０℃で貯蔵し た。

１、２　、ＶＡＣ−α／ＫＬＨｉｌｉｉ製物２０、１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ ｐＨ７．０）　Ｚ　ｗａｎに溶解した２、５４■ＶＡＣ−αをキーホールリンペ ットヘモシアニン溶液（１．１参照）０．３＊＋ｖと混合した．２５％グルタル ジアルデヒド溶液０．０２３＊ｊ！を加え、溶液を室温で４５分インキュベート し、リン酸緩衝化塩溶液（ｐＨ７．２）　ｌ　ｌで透析した。

既知少量を一２０℃で貯蔵した。

２　免疫化 １０週令の雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウスを次のようにして免疫化した。

免疫化　日　ＶＡＣ−α／）ｆＬ）！調製物　アジュバント１　１　１　（０． １５　ｓｆ）　完全２　２４　１　（０．１５　ｍｊ）　不完全３　４９　１　 （０．１５　ｍＪ）　不完全４　１８８　２（０．１　ｍｊ）　不完全５　２２ ５　２（０．１　ｍＡ）　不完全６２５８　２（０．１　ｍｊｔ）　不完全７　 ２６５　２（０．１　１１Ｊ）　不完全８　２７１　２（０．１　ｗａｎ）　不 完全９　２７２　２（０．１　鋤ｌ）　不完全１０　２７３　２（０．１　ｗａ ｎ）　な　しすべての免疫化（最後のものを除（）は等量のフロインドアジュバ ントで乳化した免疫原の溶液を用い、腹腔内注射によって与えた。

３　細胞融合及びハイプリドーマの選択圧糖溶液（１　０　０　ｇ／Ｉｌ脱イオ ン水）での洗浄によってＢａｌｂ／ｃマウスから腹腔内細胞を得た．細胞を遠心 分離によって回収し、ペニシリンＧナトリウム（１　０　Ｑｕｏｉｔｓ／ｍ１及 びストレプトマイシン（　５　０　ｕｎｉｔｓ／ｓ　ｌ　）を含有するＲｏｓｗ ｅｌｌ　Ｐａｒｋ　ＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｒ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　） 　１　６　４　０培地（以下「培養培地」という）に１０％ウシ胎児血清と共に 、約３．　５　Ｘ　１　０　４ｃｅｌｌｓ／　ｍｌの濃度に９．濁した．０．１ 　■１（既知少量）ずつを微量力価組織培養プレート（プレートのあたり９６穴 ）の各穴に分配した．プレートを一夜インキュベートした。

最後の免疫化の１日後、マウスをエーテルで麻酔し、頚部転移（ｃｅｒｖｉｃａ ｌ　ｄｉｓｌｏｃａｔｉｏｎ）によって殺した．肺臓を無菌的に取り出し、ステ ンレススチール鋼で穏やかにこすり取る（ｓｃｒａｐｅ）ことによって肺臓細胞 を得た．細胞を１０ｍｆの培養培地に懸濁し、遠心分離によって回収した，Ｐ３ ｘ６３Ａｇ８．６５３ネズミミエローマ細胞（Ｘｅｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．、　 Ｊ．　Ｉｖｓｕｎｏｌ．　１２３　：　１５４８　；１９７９）を１０％ウシ胎 児血清を補った培養培地で定常悲濁培１ｋ（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ　ｓｕｓｐｅ ｎｓｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ）に付して増殖させた。

約１０８細胞を遠心分離によって回収し、培養培地中で一度洗浄し、１０■ｌの 培養培地に再懸濁した．ミエローマ細胞を肺臓細胞に加えた．混合した細胞集団 を再び遠心分離によ−うて回収し、培地上滑を捨てた．細胞を培養培地中４０％ ポリエチレンゲルコール４　０　０　０　（Ｍｅｒｃｋ，　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ ＋　ＦＲＧ，カタログ番号９　７　２　７）の無菌溶液３　＠ｌｌに懸濁し、緩 やかな渦動上室温で１、５分インキュベートし、ついで渦動なしに１時間さらに インキュベートした．培養培地３■ｌを緩やかな渦動下１．５分かけて滴下した ．渦動なしで１分インキュベートした後、さらに６ｍｊの培養培地を緩やかな渦 動下１．５分かけて滴下した．再び細胞を渦動なしに１分インキュベートした． 細胞懸濁液を、ｌＯ％ウシ胎児血清を含をする培養培地１２−ｌで３分かけて希 釈し、室温で１５分静置した。ついで細胞を遠心分離によって回収し、２０％ウ シ胎児血清、チミジン（１，６Ｘ　１０−’Ｍ）　、ヒボキサンチン（１０−’ Ｍ）及びアミノプテリン（４Ｘ　１０−’Ｍ）を含有する培地（以後ｒＨＡＴ培 地」という）１５０ｍｊ！に再懸濁した。この懸濁液０．１　ｍｌを、前日ネズ ミ腹腔内細胞を入れた各穴に加えた。プレートを３日間インキュベートした。つ いで０．０７５ｍｊ！の新鮮なＨＡＴ培地を加え、８日間インキニベーシ四ンを 続けた。

細胞培養液はすべて空気中５％ＣＯｔを含む水飽和雰囲気中３７℃に保った。

３　ＶＡＣ−αに対する抗体を含有する培養液のスクリーニングＶＡＣ−αに対 する抗体のスクリーニングのために酵素免疫アッセイ技術を用いた。９６大ポリ スチレン微量力価プレートの穴をＶＡＣ−α（０，１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ ｐＨ９，６）中ｏ、ｏｏｓ■／−１）を用いて、２〜８℃で一夜もしくは３７℃ で１時間被覆した（ｃｏａ　ｔｅｄ）　ｅ溶液を除去し、穴を脱イオン水で１回 洗浄した。残余のタンパク質結合部位をウシ血清アルブミン溶液（リン酸緩衝化 塩溶液　ｐｌ＋７．２中５■／ｍＡ）を用い室温で１時間インキュベートするこ とによってブロックした。穴を水で１回洗浄した。ハイブリドーマ上清０．１ｍ ｊを加え、室温で２〜３時間インキュベートした。溶液を除去し、穴を水で３回 洗浄した。マウス免疫グロブリンに対する、パーオキシダーゼ複合化ウサギ免疫 グロブリンの溶液（Ｄｏｋｏｐａｔｔｓ、コペンハーゲン、デンマーク；カタロ グ番号Ｐ１６１；ウシ血清アルブミン５ｗ／ｓｚ含有り７酸緩衝化塩溶液（ｐＨ ７，２）　テｌ　：　２００　Ｑニ希釈）０．０５　ｍｌを加え、室温で２〜３ 時間インキュベートした。穴を水で３回洗浄し、等容量のローフェニレンジアミ ン（０，１Ｍクエン酸カリウムｐＨ５中８．６５■／ｍＪ）、過ホウ酸ナトリウ ム（０，１Ｍクエン酸カリウムｐ）１５中３．７５■／−り及び水の新たに調製 した混合物０．１ｍＡを加えた。室温で３０分インキエベーシヲン後、４Ｎ　Ｈ ｔＳＯａ　０．１　ｍｌを加えた。溶液の光学密度を多重チャネル光度計（ｍｕ ｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ　ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用い４９２ｎｍで測定した。

２０％ウシ胎児血清を含存する細胞培養培地を陰性コントロールとして用い、ウ シ血清アルブミン５■７ｍｌを補ったリン酸緩衝化塩溶液（ｐＢ　７．２　）で 希釈した免疫化マウス血清を陽性コントロールとして用いた。

すべてのハイブリドーマ培養液の上滑をそれぞれ２つの場合について、すなわち 細胞融合１１及び１３日後にテストした。

この２つの一次スクリーニング実験で陽性シグナルを与える培養液を、ＶＡＣ− α被覆プレートに加え、非被覆アンセイプレートも用いる二次スクリーニング実 験でテストした。培養液の２つが一貫して、被覆プレートには陽性反応を与える 一方非被覆プレートには与えなかった。結果を以下の表に示す。

試　料　４９２ｎｓ＋での光学音度 実験　１　実験　２ 被　覆　非被覆　被　覆　非被覆 マウス血清１　：　１００　０．２９１　０．１５２　１．７３５　０．４７５ バイブリド−ｖＶＡＡ−８１，０６１０，１０２１，１６９０，１０８ハイプリ ドーマシＡＡ−９０，５５２０，１８７０，３８７０，１０９陰性コントロール 　０．０３２　０．０３１　０．０７１　０．０５５陽性培養菌を標準的操作に 従ってクローン化、液体窒素で凍結した。

去ＩＬＬＬ ベク　−　ＲＨ２８１／ｎ　び　ＲＨ２８１／ｎＴ（ｎ諺５．６．７．８．９） の Ｅ、Ｐ、Ａ、　Ｎｏ、　１８６０９８に記述の形質発現ベクターｐＲＨ１００は いくつかの欠点を有している： ａ）　リポソーム結合部位（ｒｂｓ）は翻訳開始ＡＴＧの間の距離が一定である 。

ｂ）　ｒｂｓとＡＴＧの間の領域がい（つかのＣ’ｓとＧ’ｓを含有している。

Ｃ）　セラチア・マルセッスンスのｔｒｐプロモーターの一３５領域がＥ、コリ 配列と比較して最適でない（ＴＴＧＡＣＴ対ＴＴＧＡＣＡ）　。

ｄ）　プロモーターの前に不必要なＥｃｏＲＩ部位がある。

以下の配列ををするひと組のオリゴヌクレオチドを合成した：二丁ｒｐ−１−＞ 　：：Ｔｒｐ−３−＞ＡＡＴＴＧＡＣＧＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＣＡＴＴＧ ＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＣＣＣＴＧＣＧＡＣＴＡＣＣＧ ＡＴＴＴＴＧＴＡＡＣＡＣＧτ丁丁ＴＴＣＴＣＣＣＡＡＣＴＧＴＡＡＣＧＧＴＴ ＣＧＣＧＡＡＣＣＡＧＴ？ＡＡＣ？ＡＧＴＡＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＧＣＴＣ ＧＡＧＡＣＧＧＴＡＡＧＧＡＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＣＡＡＴＴＧＡＴＣＡＴＧ？ ＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＣＧＡＧＣＴＣ’ＴＧＣＣＡＴＴＣＣ＜−Ｔη−４：：　 −−−− Ｂ５ ５ａｔＩＣ１ａＩ ＡＧＧ’ｒ’ｒ’ｆ’ＡＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＧＡＡ’ｒＴＣＡＴＴＣＣＡＡＡ Ｔ’ｒＡＴＡＣＴＣＧＡＧＣ丁丁ＡＡＧＴＡＧＣ：　ｎ＝５　： １００１００ｐのオリゴヌクレオチドＴｒｐ−２、Ｔｒｐ−３、Ｔｒｐ−４及び Ｔｒｐ−５を１０ｐｌ中でリン酸化した０反応終了後、等モル量（１００ｐｍｏ １）のＴｒｐ−１とＴｒｐ−２、Ｔｒｐ−３とＴｒｐ−４さらにＴｒｐ−５とＴ ｒｐ−６を一緒にして１００℃に加熱し、ゆつくり冷却してアニール化させた（ ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、オリゴヌクレオチド対を一緒にし、合計容量５５ｐｌ中 で連結した（ｌｉｇａｔｃｄ）。

ｐＡＴ１５３をＥｃｏＲＩ及びＣ１ａ　Ｉで二重に消化し、大きナヘクター断片 を単離した。５０μｇのｐＡＴ１５３断片と２０μ−〇Ｅの合成プロモーターＤ ＮＡを２０μｌの溶液中で連結した。

受容Ｅ、コリＨＢＩＯＩを得られたプラスミドで形質転換した。

得られたクローンのいくつかからのプラスミドＤＮＡを単離し、挿入したＤＮＡ の領域を配列決定によってチェックした。１つの′プラスミドを選択しｐＲＨ２ ８１１５と命名した。この５はｒｂｓと翻訳開始ＡＴＧの間のヌクレオチドの数 を表す。

この形質転換ベクターからはじめて、Ｘｈｏｌ　−３ｓｔｌ挿入吻を以下のオリ ゴヌクレオチド対で置き代えた：ＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＴＴＡＴ ＡＣＴｒｐ−１０ＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡｆｆＴＡＴＴＡＣＴｒｐ− １２ＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＴＣＣＡＭτ丁ττＡＴＴＡＣＴｒｐ−１４得られた 形質発現ベクターをｐＲＨ２８１／６、ｐＲＨ２８１／７、ｐＲＨ２８１／８及 びｐＲＨ２８１／９と命名した。

これらの新規形質発現ベクターは以下の特徴を示す：ａ）　ｐＡ午１３５の原Ｅ ｃｏＲ１部位が破壊されているｂ）　セラチア・マルセッスンスプロモーターの 一３５領域がＥ。

コリ　ｔｒｐ−プロモーターのものと同じである。

ｃ）　ｒｂｓの前に、このｒｂｓを別のものに代えることを可能にする唯一のＸ ｈｏ１部位がある。

ｄ）翻訳開始ＡＴＧのＧは５ｅｔｌ　（＝　５ａｃｌ）部位の最初の塩基である 。　５ｓｔｌで切断し、ついで３′突出部分を除去することによって、いかなる ｃＤＮＡもしくは遺伝子にもつなぐことができる平滑末端が創造される。このＤ ＮＡが翻訳領域の最初の塩基赤ら始まる場合、正しい転写及び翻訳がＥ、コリ内 で起こる。

ｅ）　５ｓｔｌ部位の後に単一のＥｃｏＲＩ、Ｃｊ！ａｌ及びＨ３ｎｄ　ｍ部位 があり、これらの部位は形質発現させるべきいずれかのＤＮＡの意図されたクロ ーニングのために用いることができる。さらにテトラライタリン抵抗性遺伝子に 含有される単一の制限酵素部位も用いることができる。

ｆ）変化１５〜１９　（ｔｈｅ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　／　５　ｔｏ　／　９） は形質発現されるいずれかの遺伝子についてのｒｂｓとＡＴＧの間の最適間隔を 見い出すことを可能にする。

時として、形質発現遺伝子の３′部位に転写終結シグナルを育することが有利で ある（ＲｏＧｅｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｎｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７８（１９８１）　、　４９３６−４９４０）、　ｐＲＨ２８ １／　５　の　Ｆｌｉｎｄ　ｍ−５ａｌｌ断片を除去し、ｐｈｏ　Ａ転写ターミ ネータ−（Ｂ。

Ｓｃｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｂ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、　１４（１９８６）　、８６８９　；　Ｃ。

）１．　Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　４４（１９８６）、１２１− １２５）を含有するオリゴヌクレオチド対で置き代えた： ：ＥＢＩ−４５６−＞ ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴ　ｃｇＡＣＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＡＧ’ｌ’ＧＡＡ ＴＴＴＴＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧ’ｒＧＧＡＣＣＴＡＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＣＧ ＧＧＣＣＧＴＣＡＣ’ｌ”ｒＡＡＡＡＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＡＣＣ−−−−−シ ｌ田Ｉ　−−−−−− １１ｉ１ｎｄＩＩＩ　５ａｉｌ ＴＴＴＴＴτ丁ＧＣＴＧＣ 入んリリ請ムＣＧＡＣＧＡＧＣＴ ＜−ＫＢＩ−４５９： １０ｐｍｏ１の該アニール化オリゴヌクレオチドと１１００ｎの、ｐＲＨ２８１ １５の該Ｈｉｎｄ　ｍ−５ａｉｌ切断ベクタ一断片を２０μｌの容量中でつない だ、Ｅ、コリＨＢＩＯＩの形質転換、いくつかのコロニーからのプラスミドＤＮ Ａの単離及び配列決定によるチェック後、ひとつのプラスミドを選択し、ｐＲＨ ２８１１５Ｔと命名した。

このプラスミドからはじめて、形質発現ベクターｐＲＨ２８１／６Ｔ％　ｐＲＨ ２８１／７Ｔ％　ｐＲＨ２８１／ＢＴ及びｐＲＨ２８１／９Ｔの全セ−／　）を 上記操作を用いて生産した。

以下の突然変異をＶＡＣ−αＤＮＡに導入した（アミノ酸及びヌクレオチドの番 号付けは図４におけると同じである）。

ａ）　ＶＡＣ分子のサイズの減少 ＶＡＣ−ｔｘは単一のＮ−末端伸張部分（Ｒ５ｎｇｕｌａｒ　Ｎ−ｔｅｒｍ＋ｎ ａｌｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を有する６　７／６８アミノ成長配列の４回の繰返し を有している（図６）、３つの突然変異体が生産された。

ｉ）アミノ酸２〜１８の削除：阜−のＮ末端伸長部分の削除、ｎｅｔ−１をＡｌ ｍ−１９に結合させる。

■）３番目と４番目のリピートの削除：Ａｒｇ−１６１コドンを停止コドンに突 然変異させる。

ｉ）Ｎ末端単−伸張部分及び１番目と２番目のリピートの削除。

Ｎｅｔ　−１をＡｊ！ａ−１６５に結合する。

ｂ）　Ａｒｇ−１６１はタンパク質分解攻撃の可能な部位である。従りて、この アミノ酸を突然変異させる：ｉ）　Ａｒｇ　１６１をＧ１１ｕ−１６１へｉｉ） 　Ａｒｇ−１６１をＧｌｕ−１６１へｃ）　２番目と３番目のリピートの間への Ｘａ因子切断部位の導入は凝固カスケードのＶＡＣによる阻害を免れるＸａ因子 を結合する分子をもたらす可能性がある。さらに、この突然変異体はＸａ因子に よりて切断されて２つの機能性半分子となり、それによってＶＡＣの阻害作用を 高める可能性がある。以下の突然変異が行われた：　Ａｓｐ　１６８−Ｇｆｆｉ ｕ−１６８、Ｇｌｕ−１６９→Ｇ１ｙ−１６９及びＡｌｍ　−１７０−＝　Ａｒ ｇ　−１７０，これによってＸａ因子認諏配列１１ａ−Ｇｊｕ−Ｇｊｙ−Ａｒｇ が導入される。

ｄ）　システィン−３１６の生物学的意義及びダイマー形成におけるその可能な 役割についての情報を得るため、以下の突然変異を施した： ｉ）　Ｃｙｓ−３１６→５ｅｒ−３１６ｉｉ）　Ｃｙｓ−３１６−Ｖａｔ−３１ ６Ｎ末端伸張部分の影響を調べるために、この９！（Ａｊａ−２〜Ａｊａ−１９ ）をす°ボコルチン■、カルバクチン（ｃａｌｐａｃｔｉｎ）　１及びＶＡＣ− βのＮ末端伸張部分と置き代えた。

最初の工程はｐＲＨ２９１からはじめる、形質発現ベクターｐＧＮＩＯの構築で あった。この形質発現ベクターはＰＲＨ２９１で用いられた５ＴＩＩの代りにフ ァージλｃＩＩｒｂｓを用いる。

ｐＲｌ（２９１をＸｂｏｌ及びＫｐｎｌで二重に切断し、大きな断片を単離した 。配列 ＥＢＩ−７２５ＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＡＣＴＴＡＣＡＴＡＴ ＧＧＣＡＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＧＡＧＧＴＡＣＥＢＩ−７２７ＣＡＡＴＡＧＡＴ ＴＣＣＴＴＴＡＴＧＡＡＴＧ丁＾丁ＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＡＧＡＧＴＣＴＣＸｈ ｏＩ　ＲＢＳ　ＡＴＧ　Ｋｐｎｌ を有するオリゴヌクレオチド対ＥＢＩ−７２５／ＥＢＩ−７２７４０ｐｍｏ＆を ６μｌの溶液中でアニール化し、合計２０μｌ中約２００ｎｇのＰＲＨ２９１／ 大断片でつないだ、受容Ｅ、コリＨＢ１０１を形質転換した。得られるコロニー のいくつかのプラスミドを単離し、新たに挿入したＤＮＡの配列を配列決定によ ってチェックした。１つのクローンを選択し、ｐＧＮｌｏと名づけた。

ｉｌｌ儂として、ｐＧＮｌｏのＰｖｕ　ＩＩ　−Ｓｐｈ　Ｉ断片を単離した。

Ｐｖｕ　ｎはＰｈｏ　Ａプロモーター領域で切断し、ｓｐｈ　ＩとＶＡＣ−αｃ ＤＮＡの３′非翻訳領域で切断する。ｃＤＮＡ含有断片を単離し、５ｍａ　１及 びｓｐｈ　Ｉで二重に切断したＭ１３ｍｐｌＢ二本鎖ＤＮＡにつなき込んだ、受 容Ｅ、コリＪＭＩＯＩの形質変換後、１つのプラークを選択し、−末鎖ＤＮＡを 大規模に生産した。−オリゴヌクレオチドへ向けた突然変異誘発は°ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄｉｎｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅ ｓｔｓ　５ｙｓｔｅ−″　（オリゴヌクレオチド指向生体外突然変異誘発）　（ Ａｓｅｒｓｈａｓ＋、　ｃｏｄｅ　ＲＰＮ、　２３２２）により、供給者の指示 に従って行った。

得られた突然変異体の配列決定後、対応する二本鎖形態の組換えＭｌ　３ｗｐｌ 　Ｂ／ＶＡＣ−αファージＤＮＡを微量調製（ｍｉｎｐｒｅｐ）操作を用いて単 離した。オリゴヌクレオチドＥＢＩ−９７７の突然変異（ｎｔ、１０５−１１０ でのＣｊａ　１部位）を除き、ＤＮＡはＸｈｏ　Ｉ及びｓｐｂ　Ｉで切断し、切 断を含有するＶＡＣ−ｃＤＮＡを単離し°た。約５０ｎｇの各切断を１０ｔｔｌ 溶液中５０ｎｇのＸｈｏ　ｌ−５ｐｈｌ二重切断ｐＲ８２８１１５ベクターでつ なぎ、得られたプラスミドを用いて受容Ｅ、コリＨＢＩＯＩを形質転換した。得 られたコロニーのいくつかのプラスミドを単離し、その構成を制限酵素分析によ ってチェックした。最終的に選択したコロニーを実験室規模で発酵させ、該細菌 のタンパラ賞をウェスタンプロット分析によって調べた。

以下の表は突然変異体を要約する。

突然変異の結果生じた　新規クローンの性質オリゴ形質発現ベクター ＥＢＩ−１０５１ｐＧＮ４２　Ａｊａ−２〜Ａｒｇ−１８の削除ＥＢＩ−９６４ ｐＧＮ２９　１６１で翻訳停止（Ａｒｇ−１６１＝Ａｓｐ−３２０の削除）ＥＢ Ｉ−１１０５ｐＧＮ４３　Ａｌ１ａ−２〜Ａｒｇ−１６４の削除ＥＢＩ−１１０ ３ｐＧＮ４４　Ａｒｇ−１６１→Ｇｊｎ−１６１εＢ！−１２０４ｐＧＮ４５　 Ａｒｇ−１６１−”　Ｇｊｕ−１６１ＥＢＩ−９６０ｐＧＮ３０　１６７〜１７ ０のＸａ因子Ｕ！、諏配列 ＥＢＩ−９６１ｐＧＮ４１　Ｇｙｓ−３１６−＝Ｓｅｔ−３１６ＥＢＩ−９５９ ｐＧＮ４６　Ｇｙｓ−３１６−Ｖａ　Ｒ−３１６ＥＢＩ−９７７ｐＧＮ３１　ｎ ｔ、１０５−１１０のＣｍ！ａ１部位突然変異オリゴヌクレオチドの配列は次の 通りである（５′−−＞３’）： Ｄｒ−１０５１：　ＣＣＧＡＡＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧ ＴＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣｆｆ丁ＡＧ示されたこれらの配列は前記したようにＭ１ ３ｓｐ１８におけるＶＡＣ−αのクローニングによる、図４のＤＮＡ配列に相補 的である。

ｎｔ、１０５−１１０にＣ１ａ　１部位を有する突然変異体をＥｃｏＲ■及びＨ ｉｎｄ　！１１で切断単離し、ＥｃｏＲＩ　−Ｂｉｎｄｌ［［二重消化Ｂｌｕｅ ｓｃｒｉｂｅ　Ｍ　１３　＋ＤＮＡ　（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌ ｌａ。

Ｃｏ１１ｆｏｒｎｉａ、　ｔｌｓＡ）中にクローン化した。得られたプラスミド をｐＧＮ３１と命名した。ｐＧＮ３１をＣｊａｌ及びＸｈｏｌテ二重に消化し、 大きな断片を単離した。以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、リボコルチンＩ 　（Ｋ、　−３，Ｈｕａ＋ｌＩｇ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｃｅ１ｌ　４６（１９８６ ）、１９１−１９９）、カルバクチン（Ｃａｌｐａｃｔｉｎ）　Ｉ（リボコルチ ン■と同一、（Ｋ、　−５，Ｈｕａｎｇ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１ｌ　４６（１ ９８６）　、１９１−１９９）及びＶＡＣ−βに特異的な（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　 ｆｏｒ）Ｎ末端をコードするＤＮＡを導入した：ａ）　リボコルチンＩ特異的Ｎ 末端（Ｌｉｐｏｃａｒｔｉｎ　１５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ） ：ロ！−９７２−＞　：開始リポコルチンＧＧＣＣ’Ｉ’ＧＧＴＴＴＡ丁丁ＧＡ ＡＡＡＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＴＡＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧＴＣ ＣＧＧＡＣＣＡＡＡＴＡＡＣＴＴＴＴＡＣＴＴＣＴＣＧ？ＣＣＴＴ＾丁ＡＣＡＡ Ｇ’ｒＴＴＧＡＣＡＣＴＴＣＡ：：１３１−９？フー〉 ＣＡＴＣＣＡＡＡＧＧＴＧＧ’ｌ’ＣＣＣＧＧＡＴＣＡＧＣＧＧＴＧＡＧＣＣＣ ＣＴＡＴＣＣＴＡＣＣＴＴＣＡＡ’ｒＧＴＡＧＧＴＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣ ＴＡＧ’ｌ’ＣＧＣＣＡＣ’ｒＣＧＧＧＧＡＴＡＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴＴＡ＜− ’ＥＢＸ−９８８：： ：　ＶＡＣ−αコード領域 ＣＣＡＴＣＣＴＣＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＡＣ’ｒＣＴｒＣＧＧＡＡＧＧＣＴＡＴ ＧＡＡＡＧＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＡＧＧＡＧＣＣＴＡＣＧＴＣＴＴＴＧＡ ＧＡＡＧＣＣττＣＣＧＡＴＡＣＴＴ？ＣＣＧＡＡＣＣＣＧＴＧＡＧＡＴＧＡＧ ＧＡＡ’ｒ 丁Ｃ’ｒＡＣＴＣＣＴＴＡＧＣ ＜−ＥＢＩ−９８２： ｌｐｍｏｊのＥＢＩ−９７８及び１ｐｓｏＪのＥＢＩ−９８８を一緒にしくｃｏ ｍｂｉｎｅｄ）　、６　μｍ溶液中でリン酸化した０反応を１００℃への加熱に よって終了させた。各１ｐｍｏｊのＥＢＩ−９７２及びＥＢＩ−９８２を加え、 溶液を再加熱し、徐冷した。２つのオリゴヌクレオチド対をリガーゼを用いてつ ないだ、約１μｇの大きなｐＧＮ’３１／ＣＪａＩ−Ｘｈｏｌ断片を加え、容量 サイズを４０μｌに増し、つないだ、受容Ｅ、コリＨＢ　１０１の形質転換後、 い（つかのコロニーを選択し、それらのプラスミドをＢｌｕｓｃｒｉｂｅプロト コルに従って一本鎖として単離した。配列チェック後、ひとつのプラスミドを選 択し、ｐＧＮ３２と名づけた。ｐＧＮ３２をＸｂｏ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ｍで二重 に切断しく　Ｂｉｎｄ　ｎ［は　Ｓｃｈ　Ｉの３′側で切断し、Ｂｌｕｅｓｃｒ ｉｂｅ　Ｍ　１３＋ベクターの多重クローニング（ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ） 部位に存在する）、挿入物を精製した。

ｐＲＨ／２８１１５もＸｂｏ　Ｉ及びＨｉｎｄ　Ｉで二重に消化し、ベクタ一部 分を阜離した。２００ｎｇのｐＧＮ３２挿入物と約５０ｎｇのｐＲＨ２８１１５ ベクターＤＮＡを２０μ！溶液中でつないだ。

Ｂ、コリＨ’Ｂ　１０１をこのＤＮＡで形質転換した。得られたいくつかのアン ピシリン抵抗性クローンからのプラスミドＤＮＡを阜離し、制限酵素分析によっ てチェックした０選択したコロニーを実験室規模で発酵させ、５ａｉｉタンパク 質をウサギ抗ＶＡＣ抗血清を用いるウェスタンプロット分析に服せしめた。得ら れたりボコルチンＩ／ＶＡＣ−αハイブリッドの形質発現プラスミドをｐｃＮ３ ５と名づけた。

ｂ）　カルバクチンＩ特異的Ｎ末端 ：　：ＫＢＩ−１００１−＞　：ＶＡＣ−ｃｒ　：２−ド領域Ｅ１３１−９８５ ：： ＜−ＥＢＩ−９９４： ＆ｌｌ換えＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ　Ｍ　１３＋プラスミドＰＧＮ３３の構築、そ の配列決定によにチェック及び形質発現ベクターｐＲＨ２８１１５を用いる再ク ローニングをリボコルチン！ハイブリッドについて概要を示した操作に従って行 った。得られた形質発現プラスミド（カルバクチンＩ／ＶＡＣ−αバイブリフト ）をｐＧＮ３６と名づけた。

ｃ）　ｖＡ−ｃ−β特異的Ｎ末端 ：Ｅ３３１−９８７−＞　：ｖｈｃ−β開始丁ＣＧＡＧＡＧＧＴＴＧＡＧＧＴＧ ＡＴＴＴＴＡ？ＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＧ丁ＧＧＡＴ’ｒＧＡＡＣＡＣ ＴＣＣ人ＡＣＴＣＣＡＣＴＡＡＡＡＴＡＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＴＴＴＡＧＧＡＣ ＣＴｋｋＣＴＴＧ丁：ＶＡＣ− ＧＧＡＧＧＧＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＣ’！ＴＣＡ ＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧＴＧＴＣＡＣＴＴＣ’ｒ ＣＧＴＣＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣαコード、領 域 ＣＡＧＡＡＡＣＴＣＴＴＣＧＧＡＡＧＧＣＴＡＴＧＡＡＡＧＧＣＴＴＧＧＧＣＡ ＣＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡ丁ＧＴＣＴ！ＴＧＡＧＡＡＧＣＣＴ’ｒＣＣＧＡＴＡＣ ＴＴτＣＣＧＡＡＣＣＣＧＴＧＴ（ＹＡＣ丁ＣＣＴＴＡＧＣ＜−ＥＢＩ−９８９ ： ｌｐ■ｏｉｌの各オリゴヌクレオチドを６μｆｔｓ液中で加熱し、ついで徐冷す ることによってアニール化した。このＤＮＡを上記と同様にしてＸｈｏｌ−Ｃ１ ａに型切断ｐＧＮ３１ベクターにつないだ、形質発現ベクターｐＧＮ３７　（ｐ ＲＨ２８１１５中ＶＡＣ−β／ＶＡＣ−αハイブリッド）の構築を上記と同様に して行つた。

浄書（内容に変更なし） トリプシンペプチド Ｐ５　ＨＡ　Ｌに ＰＩ３　Ｖ　Ｌ　Ｔ　Ｅ　Ｉ　Ｉ　Ａ　Ｓ　ＲＰ２０／ＩＩ　Ｌ　ｒ　Ｖ　Ａ　 Ｔ、　Ｍ　ＫＰ２１／ｒ　Ｓ　Ｅ　Ｉ　Ｄ　Ｌ　Ｆ　Ｎ　Ｉ　ＲＫＰ２３／Ｉ　 Ｆ　ＩτＩＦＧＴＲ Ｐ２ａ　Ｋ　Ｎ　Ｆ　ＡτＳＬＹＳＭＩＫＢｒＣＮ−ペプチド ＢｒＣＮ　ｌ　にＧＡＧＴＤＤＨＴＬＩＲＶＢｒＣＮ　４　Ｉ　Ｋ　Ｇ　Ｄ　Ｔ 　Ｓ　Ｇ　Ｄ　Ｙ　Ｋ　Ｋ　Ａ浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 一一一時間（ｍｉｎ　） Ｆｌ（ｙ、　０．４７７ 浄書（内容に変更なし） Ｆｌ（３，０，４／２ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ＶＡＣ＝−カー　ＶＡＣ十ＳＨＥ Ｌ 浄書（内容に変更なし） トリプシンペプチド　Ｐ１６／ＩＩ τ ５ｔａｐｈ−Ａ　ヘグテドＰ２０／Ｉ／６（トリプシンペプチドのサブ断片　Ｐ 　２０Ａ＞τ　τ　丁 Ｘ　Ｉ　ＰＡＹＬＡＥＴＬＹＹＡＭＫ ５’　、、、ＧＡＡＡＣＮＣＵＮＵＡＣＵＡＣＧＣＮＡＵＧＡＡＡ、、、３’　 ｍＲＮＡＣυ　υ　Ｇ ＬＪＡ 浄書（内容に変更なし） ＶＡＣ−α　ｃＤＮＡ ＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＡＧＴＡＧＴＣＧＣτＣＡ ＣＣＡＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡｌ：ＣＡＣＣＴＴＴＡ（：ＣＴＣ ＣＡｎτ口ＡτａｃｃＡｃτＣζτＡＡＣＡ　１０５７τａｃＴＴＴＡＡＴｃＡ ＧＡＡ（：（ａ”：Ａｆｌ：Ｃ１−＝７（：ＡＡＡ−−：Ｔｆａ’−ＡＣ’：− −−：：ＡＡＡ：：−−Ａ、−；、＝F：ＡＡ；　：ｊ二： ＡＴＡＡＡＣＡＴＴＴＣＴ（ＴＣＣＣＣＣＴ（ニーＰｏ１ｙＡ　：ａ３７浄書（ 内容に変更なし） 配列決定したＶＡＯ−プテド：　配列比較ＢｒＣＮ　２２ ＢｒＣＮ　１５ にＰＳＲＬＹＤＡＹＥＬＫ）ｌ Ｐ１６／ＩＩ Ｗ？Ｌ　Ｙ　Ｄ　Ａ　Ｙ　Ｅ　Ｌに Ｐ２０／ＸＩ　Ｐ１６／Ｉ　Ｐ５ ｐＨ／Ｉ Ｖ　Ｇ　Ｔ　Ｄ　Ｅ　Ｅ　Ｋ　Ｐ２３／１１τＩＦＧＴＲ ｒＣＮ　４ ＩＫＧＤＴＳにＤＹＫＫム ＦＩＧ、５／２ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ＶＡＣ−ｌ　ｃＤＮＡ ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧにＡＧＣＣＡＧＡＣＧＴ ＧＴＧにＡＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡＡＣ（ＴｃｒｃｒｃｒｃｒｒＣＡ ＴＣＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＴＧｃｃｃｃｃｃＡＡｃｒｃＡＡＡｃＡＧＡＡ ＧＡＡＣＡＡＣＡ（：ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴ（ＡＡＣＣＣＡＣＡＣＴＣＴＣＣＡ ＧにＡＣＴＣ：ＣＡＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣ：ＣＯＬＯ５O ＡＡＣＡＡ（：ＣＣ″：Ｃτ：°人こＡＡＡ　Ａ：ＡＣτ７：：Ａ　：Ｃ人ｍ＋ ニー’、：：：：：Ａに、：＋Ｔ：：＋＋：：：、’：＋：F＋　：４５： Ａ（：ＡＴＴＴｔ７ＡＴｒＣＡＡＣ’ｒＣ−ｐｏｌｙＡ　１８３４浄書（内容に 変更なし） 浄書（内容に変更なし） アミノ酸組成 附＝　３５８９６　況飄３６８３７ 荷　重　：　９８　（３０，６％）　９７　（２９，６％）浄書（内容に変更な し） ＶＡＣ−α　ＶＡＣ−β Ｅ　ＨＢ　Ｐ　ｋｂ　Ｅ　ＨＢ　Ｐ 浄！（内容に変更なし） ５ＣＩ３．Ｂｃｔｓ−’ｅ３”　ｏ（５’−浄書（内容に変更なし） ｖＡＣ−ａ及びＶＡＯ−βＣＤＮＡ　Ｏ比較浄書（内容に変更なし） 疎水性１親水性 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） プラユミド　Ｉ）ＲＨ２８４Ｔ　におけるアルカリホス７７ターゼ遺伝子成分の 配列ＡＡＣＧＡＣＧＡＧＣ？ 浄書（内容に変更なし） ｐｈｏＡ Ｐｌｏ　Ｈｉｎｄｌｌｌ　Ｆ／（）、　７６゜浄書（内容：：変更なし） 浄を＜汽容二二変更なし） Ｍ　Ｍ　ｋＤａ ｐＲＨ２９１ｐＲＨ２９２ 十−十　−リン険塩 Ｍ　Ｍ　ｋｏａ 浄１ｉ（内容に変更なし） 浄！（内容に変更なし） □時間（ｍｉ口） ＦＩＧ、２１．。

浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄＠（内容に変更なし） 浄書（内容に変更ない 浄書（内容に変更なし） りマシーブルー 浄書（内容に変更なし） 積層ゲル ゲル部　■　グ部■ 銀　染　色　クーシー染色 １５°／、　５Ｏ５−ＰＡＧＥ　クエスタンプ・ット免疫学的　ＮＷ　タンパク 質染色 アｉドブフック 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　３２ａ。

浄書（内容に変更なしり Ｌ　ＯＧ　（Ｔｃ（ｓ）） 浄書（内容に変更なし） 凝固時間　（ｓ） 浄な（内容−二変更なし） １２・５°／、　５０５−　ＰＡＧＥ　クーシー染色浄５（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） タンパク質　：　ＶＡＣ−／ 、、、、、、　：　２１．ＯＬ、８ａ　３：１７：３６注入容量　−：５ＯＪ１ １ 標　準　値　：実験２２回の平均 ”　［ｒ　ｎＭｏ１ｌ　（Ｎ−〒ｎ誌　−〒〒　−ｋｌ、　’Ｊｊ’ｌＡ、　Ｒ ｅ１．名目上・名称　名目上　輸ｔ％際　およそ媚　偏差　７．偏差浄８（内容 ｉ：変更なし） 浄書（内容に変更なし） 試料：３．ＶＡＣ憂Ｓ　２ＢＶ餐ＦＲ５１，−５Ｐ１２・５°／、　ＳＯＳ　Ｐ ＡＧＥ　クーシー染色浄書Ｃ内容に変更なし） ＦＩＧ、　４６ａ。

電極溶液：陽極　ＩＭリン蒙 −電ａ泳動　３０００Ｖｈ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 最大生成Ｕ、のチ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、４９．ＶＡＣｐ（ｎＭ） 浄！（内容に変更なし） ＦｆＧ、５１．　ＶＡＣβ（ｎＭ） 平成　年　月　日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示　ＰＣＴ／ＥＰ　８８１００２６６３、補正をする者 事件との関係　出願人 ５、補正命令の日付　平成１年８月２２日国際調査報告 ＰＣＴ／ｌ：Ｐ８８１００２６６ 国際調査報告 ＥＰεε００２６６

Claims (79)

【特許請求の範囲】
1. １．脈管抗凝固性タンパク質の生物特性を実質上有するポリペプチド／タンパク 質をコードするＤＮＡ。
2. ２．それが式 【配列があります】 （式中、ＸＸＸはＧＡＡもしくはＣＡＣを表す）に相当することを特徴とする請 求項１記載のＤＮＡ及びその縮重変種。
3. ３．式 【配列があります】 に相当することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
4. ４．式 【配列があります】 （式中、ＸＸＸはＧＡＡもしくはＧＡＣを表し、及び／または停止コドンは最後 のＡＧＡの後にくる）に相当することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ及びそ の縮重変種。
5. ５．式 【配列があります】 に相当し、開始コドンが任意的に最初のＧＡＣの前にくることを特徴とする請求 項１記載のＤＮＡ及びその縮重変種。
6. ６．式 【配列があります】 に相当し、停止コドンが任意的に最後のＡＧＧの後にくることを特徴とする請求 項１記載のＤＮＡ及びその縮重変種。
7. ７．式 【配列があります】 に相当し、開始コドンが任意的に最初のＧＡＴの前にくることを特徴とする請求 項１記載のＤＮＡ及びその縮重変種。
8. ８．特異的プロテアーゼの認識配列をコードするオリゴヌクレオチドが、２番目 と３番目のリピート構造の間のリンカー配列をコードする部分に挿入されている ことを特徴とする請求項１〜３のひとつに記載のＤＮＡ。
9. ９．アルギニン＋１６１（ＶＡＣ−α）もしくは＋１６７（ＶＡＣ−β）をコー ドするトリプレットが、トリプシンによって好ましい切断部位として認識されな いアミノ酸、例えばヒスチジンをコードするコドンに置き代えられていることを 特徴とする請求項２もしくは３のひとつに記載のＤＮＡ。
10. １０．リジン及び／またはアルギニンをコードするトリプレットがコントロール した方法によってヒスチジンをコードするトリプレットに置き代えられているこ とを特徴とする請求項１〜８のひとつに記載のＤＮＡ。
11. １１．システィンをコードする１つのもしくは複数のトリプレットがセリンもし くはバリンをコードするトリプレットによって任意的に置き代えられていること を特徴とする請求項１〜５及び５〜１０のひとつに記載のＤＮＡ。
12. １２．リピート領域を有するポリペプチド／タンパク質をコードすることを特徴 とする請求項１記載のＤＮＡ。
13. １３．リピート領域のひとつをコードすることを特徴とする請求項１２記載のＤ ＮＡ。
14. １４．全リピートをコードする領域が再配置されていることを特徴とする請求項 １〜１３のひとつに記載のＤＮＡ。
15. １５．保存領域の１７のアミノ酸をコードする領域が修飾されていることを特徴 とする請求項１〜１４のひとつに記載のＤＮＡ。
16. １６．保存領域の１７のアミノ酸をコードする領域がａ）ＶＡＣタンパク質にお いて、リポコルチン中の対応アミノ酸をコードする領域にあって、 ｂ）ＶＡＣ−αにおいて、ＶＡＣ−βの対応するアミノ酸をコードする領域及び その逆によって、 ｃ）リポコルチンＩにおいて、リポコルチンＩＩの対応アミノ酸をコードする領 域及びその逆によって、ｄ）リポコルチンにおいて、ＶＡＣ−タンパク質中の対 応アミノ酸をコードする領域によって、またはｅ）その他のポリペプチド／タン パク質において、その他のポリペプチド／タンパク質の対応アミノ酸をコードす る領域によって 完全にもしくは部分的に置き代えられていることを特徴とする請求項１〜１５の ひとつに記載のＤＮＡ。
17. １７．Ｎ末端ペプチドをコードする領域がリピート構造を有するその他のタンパ ク質のひとつのＮ末端ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドによって置き代 えられている請求項１〜１７のひとつに記載のＤＮＡ。
18. １８．Ｎ末端５′末端が当面の宿主に相同のシグナル配列によって先行されてい ることを特徴とする先行請求項のひとつに記載のＤＮＡ。
19. １９．３′末端のシグナル配列がプロテアーゼに対する特異的認識部位をコード することを特徴とする先行請求項に記載のＤＮＡ。
20. ２０．Ｎ末端５′末端が融合タンパク質成分をコードする配列によって先行され ていることを特徴とする請求項１〜１１のひとつに記載のＤＮＡ。
21. ２１．３′末端の融合タンパク質成分をコードするＤＮＡがプロテアーゼについ ての特異的認識切断部位をコードしていることを特徴とする先行請求項に記載の ＤＮＡ。
22. ２２．それが先行請求項に記載のＤＮＡのひとつの対立遺伝子であることを特徴 とするＤＮＡ。
23. ２３．それが先行する請求項に記述されたＤＮＡのひとつの縮重し得る形態であ ることを特徴とするか、またはそれが実質上脈管抗凝固性を有するハイブリッド タンパク質をコードする、先行請求項のひとつの異なる総もしくは部分配列の組 合せよりなることを特徴とするＤＮＡ。
24. ２４．請求項１〜２３のひとつに記載のＤＮＡ分子のひとつと８５％、好ましく は９０％より高い相同を示す条件でハイブリットし；天然、合成もしくは半合成 の起源よりなることができ；突然変異、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、 ヌクレオチド挿入及びヌクレオチド逆位によって請求項１〜２３のひとつに記載 のＤＮＡ分子と関連することができ；及び脈管抗凝固性タンパク質と実質上同じ 生物特性を有するポリペプチド／タンパク質をコードすることを特徴とするＤＮ Ａ。
25. ２５．ベクター中に挿入されていることを特徴とする先行請求項のひとつに記載 のＤＮＡ。
26. ２６．先行請求項のひとつに記載のＤＮＡが、形質発現調節配列と機能的に関連 したベクターであって徴生物及び哺乳動物細胞中で複製し得るベクターに連結さ れていることを特徴とする請求項２５記載のＤＮＡ。
27. ２７．ベクタ一が原核生物中で複製し得るプラスミドであることを特徴とする請 求項２５または２６のひとつに記載のＤＮＡ。
28. ２８．ベクターが真核生物中で複製し得るプラスミドであることを特徴とする請 求項２５または２６のひとつに記載のＤＮＡ。
29. ２９．ベクターが哺乳動物細胞中で複製し得るプラスミドであることを特徴とす る請求項２５または２６のひとつに記載のＤＮＡ。
30. ３０．請求項２５〜２９のひとつに記載のＤＮＡで形質転換されていることを特 徴とする宿主生物。
31. ３１．原核生物、好ましくはＥ．コリであることを特徴とする請求項３０記載の 宿主生物。
32. ３２．真核生物であることを特徴とする請求項３０記載の宿主生物。
33. ３３．哺乳動物細胞系であることを特徴とする請求項３０記載の宿主生物。
34. ３４．脈管抗凝固性タンパク質の性質を本質的に有するポリペプチド／タンパク 質をコードするＤＮＡ分子を製造する方法であって、このポリペプチドをコード する遺伝子をゲノムＤＮＡライプラリーから単離するか；このポリペプチドをコ ードする相補ＤＮＡをこの遺伝子に属するｍＲＮＡから逆転写酵素によって製造 するか；このポリペプチドをコードするＤＮＡを化学的及び／または酵素方法を 用いて製造することを特徴とする方法。
35. ３５．ＤＮＡが請求項１〜２３に記載のＤＮＡのひとつに相当することを特徴と する先行請求項に記載の方法。
36. ３６．適当な末端を有し、脈管抗凝固性タンパク質の性質を木質的に有するポリ ペプチドをコードするＤＮＡを、制限エンドヌクレオチドで切断されたベクター ＤＮＡに挿入することを特徴とする請求項２５〜２９のひとつに記載のＤＮＡを 製造する方法。
37. ３７．適当な末端を有し、脈管抗凝固性タンパク質の性質を本質的に有するポリ ペプチドをコードするＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼで切断され、形質発現 調節配列を含有するベクターＤＮＡに、この形質発現調節配列が挿入ＤＮＡを調 節するように挿入することを特徴とする請求項２６〜２９のひとつに記載のＤＮ Ａを製造する方法。
38. ３８．宿主生物を請求項２５〜２９のひとつに記載のベクターのしとつで形質転 換することを特徴とする請求項３０〜３３のひとつに記載の形質転換宿主生物を 製造する方法。
39. ３９．脈管抗凝固性タンパク質の性質を本質的に有するポリペプチド。
40. ４０．請求項１〜１３のひとつに記載のＤＮＡにコードされていることを特徴と する請求項３９記載のポリペプチド。
41. ４１．式 【配列があります】 （式中、ＸＸはＧｅｕまたはＡｓｐを表し、１位のメチオニンは切断されていて もよくかつ２位のアラニンはブロックされていてもよく、及び／または例えばシ スティン間の分子間ジスルフィド橋によって３１６位で集合が起こっていてもよ い）に相当することを特徴とする請求項３９記載のポリペプチド。
42. ４２．式 【配列があります】 に相当するが、１位のメチオニンは切断されていてもよくかつ２位のアラニンは ブロックされていてもよく、及び／または１６１位及び／または２０６位及び／ または２５０位及び／または２９３位のシスティンの間に分子内ジスルフィド橋 が存在していてもよく、及び／または上記位置の間の分子間ジスルフィド橋の結 果として集合が存在していてもよい請求項３９記載のポリペプチド。
43. ４３．式 に相当するが、ＸＸＸがＧｌｕまたはＡｓｐを表し、１位のメチオニンは切断さ れていてもよくかって２位のアラニンはブロックされていてもよく、及び／また は集合が存在していてもよいことを特徴とする請求項３９記載のポリペプチド。
44. ４４．式 【配列があります】 に相当するが、Ｘがメチオニンもしくは水素を表し、及び／または例えば分子間 ジスルフィド橋によって引き起こされる集合が１５６位のシスティン間に存在し ていてもよいことを特徴とする請求項３９記載のポリペプチド。
45. ４５．式 【配列があります】 に相当するが、１位のメチオニンは切断されていてもよくかつ２位のアラニンは ブロックされていてもよく、及び／または例えば１６１位のシスティンの間の分 子間ジスルフィド橋によって引き起こされる集合が存在していてもよいことを特 徴とする請求項３９記載のポリペプチド。
46. ４６．式 【配列があります】 （式中、Ｘはメチオニンもしくは水素を表し、及び／または４０位及び／または ８４位及び／または１２７位のシスティン間に分子内ジスルフィド橋が存在して いてもよく、及び／または上記位置の間に分子間ジスルフィド橋の結果として集 合が存在していてもよい）に相当することを特徴とする請求項３９記載のポリペ プチド。
47. ４７．相同ポリペプチドが全くない先行請求項のひとつに記載のポリペプチド。
48. ４８．リーダーペプチドを含むことを特徴とする先行請求項のひとつに記載のポ リペプチド。
49. ４９．ａ融合タンパク質成分を含み及び／またはｂ先行する請求項のひとつに記 載のポリペプチドの部分領域を含み（ハイブリッドタンパク質）及び／またはｃ ダイマー、トリマー、テトラマーもしくはマルチマーとして存在することを特徴 とする先行請求項のひとつに記載のポリペプチド。
50. ５０．脈管抗凝固性タンパク質の性質を本質的に有するポリペプチドを製造する 方法であって、 ａ適当な宿主生物をＶＡＣタンパク質をコードする遺伝情報で形質転換し、 ｂ該情報を宿主生物中で形質発現させてＶＡＣタンパク質を生成させ、及び ｃＶＡＣタンパク質を単離する ことを特徴とする方法。
51. ５１．宿主生物が請求項３０〜３３に定義された宿主生物であることを特徴とす る請求項５０記載の方法。
52. ５２．遺伝情報が請求項１〜２９のひとつに記載のＤＮＡ分子に含まれているこ とを特徴とする請求項５０もしくは５１記載の方法。
53. ５３．ＶＡＣタンパク質が請求項３９〜４９のひとつに定義されたＶＡＣタンパ ク質であることを特徴とする請求項５０〜５２のひとつに記載の方法。
54. ５４．請求項５０〜５３のひとつによって製造されたポリペプチド。
55. ５５．請求項３９〜４９または５４のひとつに記載のポリペプチドの製薬上許容 される塩。
56. ５６．ヒトもしくは動物の体の治療もしくは予防処置のための請求項３９〜４９ または５４のひとつに記載のポリペプチドの使用。
57. ５７．医薬製剤製造のための請求項３９〜４９または５４のひとつに記載のポリ ペプチドの使用。
58. ５８．請求項３９〜４９または５４のひとつに記載のポリペプチドの抗凝固剤と しての使用。
59. ５９．請求項３９〜４９または５４のひとつに記載のポリペプチドの抗炎症剤と しての使用。
60. ６０．請求項３９〜４９または５４のひとつに記載のポリペプチドの抗リウマチ 剤としての使用。
61. ６１．請求項３９〜４９または５４のひとつに記載のポリペプチドの、リポコル チンに適用する標識のための使用。
62. ６２．リピート領域を有するポリペプチド／タンパク質の血液凝固抑制剤として の使用。
63. ６３．リピート領域を有するポリペプチド／タンパク質のトロンビン阻害剤とし ての使用。
64. ６４．リピート領域を有するポリペプチド／タンパク質の抗炎症剤としての使用 。
65. ６５．リピート領域を有するポリペプチド／タンパク質の抗リウマチ剤としての 使用。
66. ６６．リポコルチンの血液凝固抑制剤としての使用。
67. ６７．リポコルチンのトロンビン阻害剤としての使用。
68. ６８．請求項３９〜４９または５４のひとつに記載のタンパク質に適用する標識 のためのリポコルチンの使用。
69. ６９．請求項３９〜４９または５４のひとつに記載のポリペプチドのトロンビン 阻害剤としての使用。
70. ７０．医薬上不活性な担体に加え、有効量の請求項３９〜４９または５４のひと つに記載のポリペプチドを含有することを特徴とする治療処理用剤。
71. ７１．請求項３９〜４９または５４のひとつに記載のポリペプチドのひとつに対 するモノクローナル抗体を分泌することを特徴とするハイブリッド細胞系。
72. ７２．請求項３９〜４９または５４のひとつに記載のポリペプチドの作用を完全 にもしくは部分的に特異的に中和するか、または上記ポリペプチドのひとつに特 異的に結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
73. ７３．請求項３９〜４９または５４のひとつに記載のポリペプチドのひとつを定 性的及び／または定量的測定のための請求項７３記載のモノクローナル抗体の使 用。
74. ７４．請求項３９〜４９または５４のひとつに記載のポリペプチドのひとつを精 製するための請求項７３に記載のモノクローナル抗体の使用。
75. ７５．請求項７３に記載のモノクローナル抗体を含有することを特徴とする請求 項３９〜４９または５４のひとつに記載のポリペプチドを検出するための試験キ ット。
76. ７６．宿主動物を請求項３９〜４９または５４のひとつに記載のポリペプチドの ひとつで免疫化し、これらの宿主動物のＢリンパ球をミエローマ細胞と融合させ 、モノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞系をサブクローン化し生体外 もレくは生体内で培養することを特徴とする請求項７３記載のモノクローナル抗 体を製造する方法。
77. ７７．ヒトまたは動物の身体の治療的もしくは予防的処置のための、請求項３９ 〜４９または５４のひとつに記載のポリペプチドと不活性担体の間の医薬上許容 される付加体及び共有化合物。
78. ７８．ヒトまたは動物の身体の治療もしくは予防的処置のための、請求項３９〜 ４９または５４のひとつに記載のポリペプチドと例えばポリエチレングリコール の間の医薬上許容される付加体及び共有化合物。
79. ７９．請求項３９〜４９または５４のひとつに記載のポリペプチドの血液保存剤 としての使用。