JPH02227079A - ヒト血清アルブミン断片 - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はヒト血清アルブミンの部分から成る蛋白質断片
に関する。この蛋白質断片は薬物等の運搬・供給系のキ
ャリヤー等としての用途が期待される。
に関する。この蛋白質断片は薬物等の運搬・供給系のキ
ャリヤー等としての用途が期待される。
ヒト血清アルブミンはヒト肝臓で合成される分子量６６
．４５８の高分子血漿蛋白質で、生体内では主に血液の
浸透圧調節、種々の物質（例えば脂肪酸、Ｃｕ”・Ｎｉ
”などの金属イオン、胆汁ビリルビン、多くの薬物、一
部の水溶性ビタミン、など）と結合してそれらの標的臓
器への運搬、組織へのアミノ酸供給源、などの重要な役
割を果している。これらの作用を基礎にして火傷や腎炎
などによるアルブミンの喪失や肝硬変などによるアルブ
ミン合成の低下で起こる低アルブミン血症や出血性ショ
ックなどの治療にヒト血清アルブミンは大量に使用され
ている。血清アルブミンはまた、多くの薬物と非特異的
に結合し、それらの血中運搬の役割を果たしている。ア
ルブミンと結合した薬物は血液循環によって体内を動き
、やがてアルブミンと遊離して毛細血管壁を通過して拡
散し、作用部位へと到達すると考えられている。アルブ
ミンは毒性が少ない、抗原性が低い、生体内で簡単に分
解する、薬物との共有結合及び複合体形成が簡単にでき
る、等のドラッグデリバリ−のための担体（ドラッグキ
ャリアー）として優れた特徴を有しており、また各種薬
剤の結合サイトも決定または推定されているものが多く
、製剤化のためのデザインが簡単にできるという利点も
有している。
．４５８の高分子血漿蛋白質で、生体内では主に血液の
浸透圧調節、種々の物質（例えば脂肪酸、Ｃｕ”・Ｎｉ
”などの金属イオン、胆汁ビリルビン、多くの薬物、一
部の水溶性ビタミン、など）と結合してそれらの標的臓
器への運搬、組織へのアミノ酸供給源、などの重要な役
割を果している。これらの作用を基礎にして火傷や腎炎
などによるアルブミンの喪失や肝硬変などによるアルブ
ミン合成の低下で起こる低アルブミン血症や出血性ショ
ックなどの治療にヒト血清アルブミンは大量に使用され
ている。血清アルブミンはまた、多くの薬物と非特異的
に結合し、それらの血中運搬の役割を果たしている。ア
ルブミンと結合した薬物は血液循環によって体内を動き
、やがてアルブミンと遊離して毛細血管壁を通過して拡
散し、作用部位へと到達すると考えられている。アルブ
ミンは毒性が少ない、抗原性が低い、生体内で簡単に分
解する、薬物との共有結合及び複合体形成が簡単にでき
る、等のドラッグデリバリ−のための担体（ドラッグキ
ャリアー）として優れた特徴を有しており、また各種薬
剤の結合サイトも決定または推定されているものが多く
、製剤化のためのデザインが簡単にできるという利点も
有している。
基本的にはヒト血清アルブミンの断片でも推定されてい
る多くの薬剤に対する結合部位はほとんど含んでおり、
ドラッグキャリヤーとしての活性を示すことができると
考えられる。薬物等の運搬・供給系におけるキャリヤー
等として使用する場合には、薬物等との結合性を限定す
る等の見地から、むしろヒト血清アルブミン分子全体を
使用するよりもその断片を使用する方が有利であると予
想される。
る多くの薬剤に対する結合部位はほとんど含んでおり、
ドラッグキャリヤーとしての活性を示すことができると
考えられる。薬物等の運搬・供給系におけるキャリヤー
等として使用する場合には、薬物等との結合性を限定す
る等の見地から、むしろヒト血清アルブミン分子全体を
使用するよりもその断片を使用する方が有利であると予
想される。
−ａに、蛋白質を切断してその断片を調製する方法とし
て、蛋白質を臭化シアンのごとき化学物質又はトリプシ
ン、ペプシン等のプロテアーゼを用いる方法が知られて
いる。しかしながら、これらの方法においては、蛋白質
のアミノ酸配列に依存して切断部位が必然的に定まるた
め、任意の部位で切断することができず、従って理想的
な蛋白質断片を得ることはできない、従って、ヒト血清
アルブミンについてもその様な断片は得られていない。
て、蛋白質を臭化シアンのごとき化学物質又はトリプシ
ン、ペプシン等のプロテアーゼを用いる方法が知られて
いる。しかしながら、これらの方法においては、蛋白質
のアミノ酸配列に依存して切断部位が必然的に定まるた
め、任意の部位で切断することができず、従って理想的
な蛋白質断片を得ることはできない、従って、ヒト血清
アルブミンについてもその様な断片は得られていない。
これに対して、組換えＤＮＡ技術を用いれば、任意の部
分からなるヒト血清アルブミン断片を適当な宿主細胞中
で合成させることができる。従って本発明は、ヒト血清
アルブミンの所望の蛋白質断片をコードするＤＮＡを作
製し、これに基（組換ＤＮＡ技術により、ヒト血清アル
ブミンの蛋白質断片及びその製造手段を提供しようとす
るものである。
分からなるヒト血清アルブミン断片を適当な宿主細胞中
で合成させることができる。従って本発明は、ヒト血清
アルブミンの所望の蛋白質断片をコードするＤＮＡを作
製し、これに基（組換ＤＮＡ技術により、ヒト血清アル
ブミンの蛋白質断片及びその製造手段を提供しようとす
るものである。
さらに詳しくは、本発明は、ヒト血清アルブミンの中央
部分からなるヒト血清アルブミン蛋白質断片、及びヒト
血清アルブミンの中央部と他のポリペプチドとから成る
融合蛋白質；ヒト血清アルブミンのＣ−末端部分が欠失
したヒト血清アルブミン断片、及び該断片と他のポリペ
プチドとから成る融合蛋白質、並びにヒト血清アルブミ
ンのＮ−末端部分が欠失したヒト血清アルブミン断片、
及び該断片と他のポリペプチドとから成る融合蛋白質；
これらの蛋白質断片又は融合蛋白質をコードするＤＮＡ
；該ＤＮＡを含有するプラスミド；該プラスミドにより
形質転換された宿主；及び前記宿主を培養してヒト血清
アルブミン蛋白質断片又は該断片を含む融合蛋白質を発
現せしめ、融合蛋白質を発現せしめた場合には所望によ
り該融合蛋白質から該ヒト血清アルブミン断片を切り出
すことを特徴とするヒト血清アルブミン蛋白質断片又は
該断片を含有する融合蛋白質の製造方法に関する。
部分からなるヒト血清アルブミン蛋白質断片、及びヒト
血清アルブミンの中央部と他のポリペプチドとから成る
融合蛋白質；ヒト血清アルブミンのＣ−末端部分が欠失
したヒト血清アルブミン断片、及び該断片と他のポリペ
プチドとから成る融合蛋白質、並びにヒト血清アルブミ
ンのＮ−末端部分が欠失したヒト血清アルブミン断片、
及び該断片と他のポリペプチドとから成る融合蛋白質；
これらの蛋白質断片又は融合蛋白質をコードするＤＮＡ
；該ＤＮＡを含有するプラスミド；該プラスミドにより
形質転換された宿主；及び前記宿主を培養してヒト血清
アルブミン蛋白質断片又は該断片を含む融合蛋白質を発
現せしめ、融合蛋白質を発現せしめた場合には所望によ
り該融合蛋白質から該ヒト血清アルブミン断片を切り出
すことを特徴とするヒト血清アルブミン蛋白質断片又は
該断片を含有する融合蛋白質の製造方法に関する。
正常ヒト血清アルブミンＡをコードするｃＤＮＡはすで
にクローン化されている（特願昭６３−０３７４５３）
。
にクローン化されている（特願昭６３−０３７４５３）
。
従って、このｃＤＮＡを用いて、遺伝子工学的手法によ
り正常ヒト血清アルブミンＡの任意の断片を製造するこ
とができる。
り正常ヒト血清アルブミンＡの任意の断片を製造するこ
とができる。
本発明は、この様な断片として、（１）ヒト血清アルブ
ミンの中央部分から成る血清アルブミン断片、（２）ヒ
ト血清アルブミンのＣ−末端を欠失した血清アルブミン
断片、及び（３）ヒト血清アルブミンのＮ−末端を欠失
した血清アルブミン断片を提供する。本発明は例えば、
ヒト血清アルブミンの中央部分から成る血清アルブミン
断片として正常ヒト血清アルブミンの１２３位のメチオ
ニンから３０３位のプロリンまでのアミノ酸配列を有す
るアルブミン断片について記載し、Ｃ−末端が欠失した
アルブミン断片の例として正常ヒト血清アルブミンの１
位のアスパラギン酸から３０３位のプロリンまでのアミ
ノ酸配列を有するアルブミン断片（これをミニＩＳＡと
称する場合がある）について記載し、そしてＮ−末端が
欠失したアルブミン断片の例として正常ヒト血清アルブ
ミンの１２３位のメチオニンから５８５位のロイシンま
でのアミノ酸配列から成るアルブミン断片（これを短縮
ＩＳＡと称する場合がある）について記載する。
ミンの中央部分から成る血清アルブミン断片、（２）ヒ
ト血清アルブミンのＣ−末端を欠失した血清アルブミン
断片、及び（３）ヒト血清アルブミンのＮ−末端を欠失
した血清アルブミン断片を提供する。本発明は例えば、
ヒト血清アルブミンの中央部分から成る血清アルブミン
断片として正常ヒト血清アルブミンの１２３位のメチオ
ニンから３０３位のプロリンまでのアミノ酸配列を有す
るアルブミン断片について記載し、Ｃ−末端が欠失した
アルブミン断片の例として正常ヒト血清アルブミンの１
位のアスパラギン酸から３０３位のプロリンまでのアミ
ノ酸配列を有するアルブミン断片（これをミニＩＳＡと
称する場合がある）について記載し、そしてＮ−末端が
欠失したアルブミン断片の例として正常ヒト血清アルブ
ミンの１２３位のメチオニンから５８５位のロイシンま
でのアミノ酸配列から成るアルブミン断片（これを短縮
ＩＳＡと称する場合がある）について記載する。
これら本発明の３つのタイプのアルブミン断片はそれぞ
れ下記のごとき特徴を有している。
れ下記のごとき特徴を有している。
本発明のアルブミン断片は、いずれもヒト血清アルブミ
ンの中央部分を含有している。この様に、中央部分を含
めたのは、ヒト血清アルブミン分子上の薬剤結合位置は
現在までに４つ（サイ）Ｉ〜■）知られており（Ｓ３６
ｈｏ１ｍ、 １．、Ｅｋｍａｎ＋Ｂ、ｔ！、Ｊｏｂｅｒ
。
ンの中央部分を含有している。この様に、中央部分を含
めたのは、ヒト血清アルブミン分子上の薬剤結合位置は
現在までに４つ（サイ）Ｉ〜■）知られており（Ｓ３６
ｈｏ１ｍ、 １．、Ｅｋｍａｎ＋Ｂ、ｔ！、Ｊｏｂｅｒ
。
Ａ、、 Ｌｊｕｇｓｔｅｄｔ−Ｐａｈｌｍａｎ、１．＋
Ｓｅｉｖｉｎｇ、Ｂ、＆ ５ｊ６ｄｉｎ。
Ｓｅｉｖｉｎｇ、Ｂ、＆ ５ｊ６ｄｉｎ。
Ｔ、Ｍｏ１．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１６．７６７−（１
９７９） ） 、これらのサイトにおいて薬物の結合に
重要な役割を果たすアミノ酸残基もいくつか知られてい
る（ Ｐｅｈｓｋｅ、に。
９７９） ） 、これらのサイトにおいて薬物の結合に
重要な役割を果たすアミノ酸残基もいくつか知られてい
る（ Ｐｅｈｓｋｅ、に。
らＢｉｏｃｈｅｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏ１４Ω、、６８８
−（１９８１） ）が、そのほとんどがこの中央部分に
集中しているためである。
−（１９８１） ）が、そのほとんどがこの中央部分に
集中しているためである。
Ｓｊ６ｈｏ１ｍらは薬物をヒト血清アルブミンに均一に
分散させた小球体を使い、多種の薬物の結合位置を調べ
、ジアゼパムサイト（サイトＩＬジギトキシンサイト（
サイト■）、及びワルファリンサイト（サイト■）に分
類しているが、この他にタモキシフェン（サイト■）ま
たはビリルビン結合サイトが存在するらしい。Ｆｅｈｓ
ｋｅらはジアゼパムサイト、ワルファリンサイト、ビリ
ルビン結合サイトにおいて重要な役割をしているアミノ
酸として各々Ｌｙｓ１９５と旧５１４６及びＡｒｇ１４
５ 、 Ｔｒｐ２１４及びＬｙｓ１９９ 、 Ｌｙｓ２
４０を推定している。一方パルミチン酸塩のような長鎖
脂肪酸の結合サイトはＣ端側領域にあるらしく （Ｒｅ
ｅｄ、 Ｒ，Ｇ、 ＋ Ｆｅ１ｄｈｏｆ ｆ 、 Ｒ，
Ｃ，、Ｃ１ｕｔｅ。
分散させた小球体を使い、多種の薬物の結合位置を調べ
、ジアゼパムサイト（サイトＩＬジギトキシンサイト（
サイト■）、及びワルファリンサイト（サイト■）に分
類しているが、この他にタモキシフェン（サイト■）ま
たはビリルビン結合サイトが存在するらしい。Ｆｅｈｓ
ｋｅらはジアゼパムサイト、ワルファリンサイト、ビリ
ルビン結合サイトにおいて重要な役割をしているアミノ
酸として各々Ｌｙｓ１９５と旧５１４６及びＡｒｇ１４
５ 、 Ｔｒｐ２１４及びＬｙｓ１９９ 、 Ｌｙｓ２
４０を推定している。一方パルミチン酸塩のような長鎖
脂肪酸の結合サイトはＣ端側領域にあるらしく （Ｒｅ
ｅｄ、 Ｒ，Ｇ、 ＋ Ｆｅ１ｄｈｏｆ ｆ 、 Ｒ，
Ｃ，、Ｃ１ｕｔｅ。
０、Ｌ、＆ Ｐｅｔｅｒｓ、Ｔ、Ｔｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、 １４，４５７８−（１９７５） ；Ｂｅ
ｒｄｅ、 Ｃ，Ｂ、 、 Ｈｕｄｓｏｎ、 Ｂ、Ｓ、
、 Ｓｉ＋ｗｏｎｉ、 ＋ Ｒ，Ｄ、＆５ｋｌａｒ、Ｌ
、Ａ、Ｊ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、２５４．３９１−（１
９７９））、本発明のヒト血清アルブミンの中央部分か
ら成るヒト血清アルブミン断片、又はＣ−末端部分を欠
失したヒト血清アルブミン断片を利用すれば長鎖脂肪酸
が結合できず、ジアゼパム、ワルファリン等が結合でき
るドラッグキャリアーの作製が可能となる。
ｉｓｔｒｙ、 １４，４５７８−（１９７５） ；Ｂｅ
ｒｄｅ、 Ｃ，Ｂ、 、 Ｈｕｄｓｏｎ、 Ｂ、Ｓ、
、 Ｓｉ＋ｗｏｎｉ、 ＋ Ｒ，Ｄ、＆５ｋｌａｒ、Ｌ
、Ａ、Ｊ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、２５４．３９１−（１
９７９））、本発明のヒト血清アルブミンの中央部分か
ら成るヒト血清アルブミン断片、又はＣ−末端部分を欠
失したヒト血清アルブミン断片を利用すれば長鎖脂肪酸
が結合できず、ジアゼパム、ワルファリン等が結合でき
るドラッグキャリアーの作製が可能となる。
ヒト血清アルブミンは５８５個のアミノ酸から成る高分
子蛋白質で、しかも分子内に３５個のシスティン残基を
有し、そのうち最もＮ端側に位置するシスティン残基（
Ｃｙｓ−３４）のみが遊離のＳＨ基を有する状態で存在
し、その他のものは互いにジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合
を形成し、計１７個のＳ−３橋が分子内に形成されてい
る。蛋白質分子の高次（立体）構造形成の過程で少なく
とも２種の酵素〔ペプチジルプロリルｃｉｓ−ｔｒａｎ
ｓイソメラーゼ及びプロティンジスルフィドイソメラー
ゼ（ＰＤＩ））が関与していることが最近明らかになっ
てきたが、Ｓ−３橋形成に重要な役割を果たすのは後者
のＰＤＩである。血清アルブミンを産生ずる哺乳類の細
胞内では生合成及び血清アルブミン蛋白質の細胞内輸送
の過程でＰＤＩが働き蛋白質分子内にＳ−８橋が形成さ
れ、ＰＤＩの主な存在場所は小胞体を含むミクロソーム
画分であることが知られている。大腸菌をはじめとする
原核生物細胞内でヒト血清アルブミンを生合成させた場
合上述のような反応が起き、分子内に正しいＳ−３橋が
形成される保証はな（、Ｃｙｓ−３４が分子内のシスチ
ン残基とチオール／ジスルフィド交換反応を起こし、Ｓ
−３橋のかけ違えが生じ、異性体を生じる可能性がある
。このように遊離のＳＨ基を有するシスティン残基が存
在すると本来あるべき正常な立体構造をとった蛋白質が
できる効率が低くなり、異常な立体構造をとった蛋白質
は機能的にも正常でなくなる危険性が大となる。これに
対して、本発明のＮ−末端部分が欠失した、１２３位の
メチオニンから５８５位のロイシンまでのアミノ酸配列
から成るアルブミン断片では、Ｃｙｓ３４が他の６個の
アミノ末端側に位置するシスティンと共に除かれており
、このような危険性を少なくしである。
子蛋白質で、しかも分子内に３５個のシスティン残基を
有し、そのうち最もＮ端側に位置するシスティン残基（
Ｃｙｓ−３４）のみが遊離のＳＨ基を有する状態で存在
し、その他のものは互いにジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合
を形成し、計１７個のＳ−３橋が分子内に形成されてい
る。蛋白質分子の高次（立体）構造形成の過程で少なく
とも２種の酵素〔ペプチジルプロリルｃｉｓ−ｔｒａｎ
ｓイソメラーゼ及びプロティンジスルフィドイソメラー
ゼ（ＰＤＩ））が関与していることが最近明らかになっ
てきたが、Ｓ−３橋形成に重要な役割を果たすのは後者
のＰＤＩである。血清アルブミンを産生ずる哺乳類の細
胞内では生合成及び血清アルブミン蛋白質の細胞内輸送
の過程でＰＤＩが働き蛋白質分子内にＳ−８橋が形成さ
れ、ＰＤＩの主な存在場所は小胞体を含むミクロソーム
画分であることが知られている。大腸菌をはじめとする
原核生物細胞内でヒト血清アルブミンを生合成させた場
合上述のような反応が起き、分子内に正しいＳ−３橋が
形成される保証はな（、Ｃｙｓ−３４が分子内のシスチ
ン残基とチオール／ジスルフィド交換反応を起こし、Ｓ
−３橋のかけ違えが生じ、異性体を生じる可能性がある
。このように遊離のＳＨ基を有するシスティン残基が存
在すると本来あるべき正常な立体構造をとった蛋白質が
できる効率が低くなり、異常な立体構造をとった蛋白質
は機能的にも正常でなくなる危険性が大となる。これに
対して、本発明のＮ−末端部分が欠失した、１２３位の
メチオニンから５８５位のロイシンまでのアミノ酸配列
から成るアルブミン断片では、Ｃｙｓ３４が他の６個の
アミノ末端側に位置するシスティンと共に除かれており
、このような危険性を少なくしである。
本発明においては、前記３つのタイプのアルブミン断片
の代表例として特定のアミノ配列範囲を有する３種類の
アルブミン断片を具体的に記載するが、３つのタイプの
アルブミン断片はそれぞれ前記のごとき特徴を有してお
り、それらの特徴を発揮することができるアルブミン断
片はすべて本発明の範囲に属する。例えば、薬剤結合部
位が集中している中央部分として第１２３位のメチオニ
ンから３０３位のプロリンまでの範囲を例示したが、中
央部分は必ずしもこの範囲に限定されず、薬剤結合部位
の大部分を含む範囲であれば、第１２３位〜３０３位よ
りも長くても、短かくてもよい。また、長鎖脂肪酸の結
合部位が存在し、従って除去されるべきＣ−末端側領域
として３０４位からＣ−末端までの範囲を例示したが、
これに限らず、長鎖脂肪酸の結合部位を含む範囲であれ
ば、さらに長い範囲でもよく、又短い範囲でもよい。さ
らに、システィンを多数含有し、従って除去されるべき
Ｎ−末端の範囲としてＮ−末端から１２２位までの範囲
を例示したが、第３４位のシスティンを含存するＮ−末
端側領域であればＮ−末端から１２２位までの範囲に限
定されるものではなく、さらに長いか又は短い範囲であ
ってもよい。
の代表例として特定のアミノ配列範囲を有する３種類の
アルブミン断片を具体的に記載するが、３つのタイプの
アルブミン断片はそれぞれ前記のごとき特徴を有してお
り、それらの特徴を発揮することができるアルブミン断
片はすべて本発明の範囲に属する。例えば、薬剤結合部
位が集中している中央部分として第１２３位のメチオニ
ンから３０３位のプロリンまでの範囲を例示したが、中
央部分は必ずしもこの範囲に限定されず、薬剤結合部位
の大部分を含む範囲であれば、第１２３位〜３０３位よ
りも長くても、短かくてもよい。また、長鎖脂肪酸の結
合部位が存在し、従って除去されるべきＣ−末端側領域
として３０４位からＣ−末端までの範囲を例示したが、
これに限らず、長鎖脂肪酸の結合部位を含む範囲であれ
ば、さらに長い範囲でもよく、又短い範囲でもよい。さ
らに、システィンを多数含有し、従って除去されるべき
Ｎ−末端の範囲としてＮ−末端から１２２位までの範囲
を例示したが、第３４位のシスティンを含存するＮ−末
端側領域であればＮ−末端から１２２位までの範囲に限
定されるものではなく、さらに長いか又は短い範囲であ
ってもよい。
従って、次の条件を考慮しながら種々のアルブミン断片
をデザインすることができ、それらは本発明の範囲に属
する。ヒト血清アルブミンの断片をデザインするために
重要な条件として、特定の薬物結合に必要な立体構造を
保持することが期待できるような断片を選定することが
重要である。
をデザインすることができ、それらは本発明の範囲に属
する。ヒト血清アルブミンの断片をデザインするために
重要な条件として、特定の薬物結合に必要な立体構造を
保持することが期待できるような断片を選定することが
重要である。
この際注意すべきことは（ｉ）天然のヒト血清アルブミ
ンの構造中に存在するＳ−３橋をそのままの形で保持さ
せること、（ｉｉ ）そのため断片を構成するポリペプ
チド鎖中には偶数個のシスティン残基を有すること、（
ｉｉｉ）Ｓ−３橋で結ばれてル−プを形成しているポリ
ペプチド鎖の途中に切断を入れないこと、即ち天然ヒト
血清アルブミン分子中にいくつか存在する主要なドメイ
ン構造あるいは少なくともサブドメイン構造は破壊しな
いこと、などがあげられる。
ンの構造中に存在するＳ−３橋をそのままの形で保持さ
せること、（ｉｉ ）そのため断片を構成するポリペプ
チド鎖中には偶数個のシスティン残基を有すること、（
ｉｉｉ）Ｓ−３橋で結ばれてル−プを形成しているポリ
ペプチド鎖の途中に切断を入れないこと、即ち天然ヒト
血清アルブミン分子中にいくつか存在する主要なドメイ
ン構造あるいは少なくともサブドメイン構造は破壊しな
いこと、などがあげられる。
以上の点はたとえば不溶化した形で細胞からとり出した
ヒト血清アルブミン断片をｉｎ ｖｉｔｒｏ （試験管
内）で可溶化し、本来の正常な立体構造（Ｓ−３結合も
含めて）をとらせようとする場合に特に重要なことであ
る。このようなｉｎ ｖｉｔｒｏでの立体構造形成（リ
フォールディング）反応にはペプチジルプロリルｃｉｓ
−ｔｒａｎｓイソメラーゼやＰＤＩが使われる可能性が
ある。
ヒト血清アルブミン断片をｉｎ ｖｉｔｒｏ （試験管
内）で可溶化し、本来の正常な立体構造（Ｓ−３結合も
含めて）をとらせようとする場合に特に重要なことであ
る。このようなｉｎ ｖｉｔｒｏでの立体構造形成（リ
フォールディング）反応にはペプチジルプロリルｃｉｓ
−ｔｒａｎｓイソメラーゼやＰＤＩが使われる可能性が
ある。
正常ヒト血清アルブミンＡの全体又は大部分をコードす
るｃＤＮＡの作製方法は参考例１において具体的に記載
する。目的とする蛋白質断片をコードするＤＮＡは、そ
の全体を常法に従って化学合成することもでき、又前記
のｃＤＮＡから調製することもできる。ｃＤＮＡから調
製する場合、正常ヒト血清アルブミンへの全体又は大部
分をコードするｃＤＮＡを、目的とする蛋白質断片をコ
ードするｃＤＮＡｆｉＩ域の５′末端又は３′末端の内
側で、適切な制限エンドヌクレアーゼにより切断し、不
足の末端コード配列を化学合成したＤＮＡにより補完す
ることにより調製される。あるいは、ｃＤＮＡを、目的
とする蛋白質断片をコードするｃＤＮＡ領域の５′末端
又は３′末端外側で、適切な制限エンドヌクレアーゼに
より切断した後、余分のＤＮＡ部分をエキソヌクレアー
ゼにより除去することもできる。上記２つの方法の内５
′末端と３′末端の加工において異る方法を組み合わせ
て用いることもできる。
るｃＤＮＡの作製方法は参考例１において具体的に記載
する。目的とする蛋白質断片をコードするＤＮＡは、そ
の全体を常法に従って化学合成することもでき、又前記
のｃＤＮＡから調製することもできる。ｃＤＮＡから調
製する場合、正常ヒト血清アルブミンへの全体又は大部
分をコードするｃＤＮＡを、目的とする蛋白質断片をコ
ードするｃＤＮＡｆｉＩ域の５′末端又は３′末端の内
側で、適切な制限エンドヌクレアーゼにより切断し、不
足の末端コード配列を化学合成したＤＮＡにより補完す
ることにより調製される。あるいは、ｃＤＮＡを、目的
とする蛋白質断片をコードするｃＤＮＡ領域の５′末端
又は３′末端外側で、適切な制限エンドヌクレアーゼに
より切断した後、余分のＤＮＡ部分をエキソヌクレアー
ゼにより除去することもできる。上記２つの方法の内５
′末端と３′末端の加工において異る方法を組み合わせ
て用いることもできる。
本発明の例においては、正常ヒト血清アルブミンのアミ
ノ酸配列中のＮｅ ｔ （１２３） −Ｐｒｏ （３０
３）から成る蛋白質断片をコードするＤＮＡとして、Ｎ
ｅｔ（１２３）−Ａｌａ（１５１）をコードする合成り
ＮＡ （第１図）とＰｒｏ （１５２） −Ｐｒｏ （
３０３）をコードするｃＤＮＡ （第８−１図〜第８−
２図中〔〕で示した部分）とを連結したものを使用する
。アルカリホスファターゼのシグナルペプチドとミニＩ
ＳＡの融合蛋白質をコードするＤＮＡとしては既に特願
昭６３−０３７４５３に記載のアルカリホスファターゼ
のシグナルペプチドと全長のヒト血清アルブミン分子と
の融合蛋白質をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＵ
ｃ−ｐｈｏＡＨＳＡ−八からアルカリホスファターゼの
シグナルペプチド及びヒト血清アルブミンＡの八５ｐｌ
＝Ｐｒｏ１５２までをコードするＤＮＡを特願昭６３−
２６８３０２に記載のプラスミドｐＵＣ−ＩＳＡ−Ｉ
’から切り出したＧ１ｕ１５３〜Ｐｒｏ３０３をコード
するＤＮＡ断片とを融合したものを使用する。短縮Ｈ３
ＡをコードするＤＮＡとしては上記で作製したＭｅｔ１
２３−Ｐｒｏ３０３をコードするＤＮＡのうち合成りＮ
Ａ部分（Ｍｅｔ１２３−Ａｌａ１５１）を切り出したも
のと特願昭６３−０３７４５３に記載のｐＵｃ−ｐｈｏ
Ａ−Ｈ３Ａ−Ａから切り出したＰｒｏ１５２−Ｌｅｕ５
８５のコード領域および３′側非翻訳領域を含むＤＮＡ
配列とを連結したものを使用する。
ノ酸配列中のＮｅ ｔ （１２３） −Ｐｒｏ （３０
３）から成る蛋白質断片をコードするＤＮＡとして、Ｎ
ｅｔ（１２３）−Ａｌａ（１５１）をコードする合成り
ＮＡ （第１図）とＰｒｏ （１５２） −Ｐｒｏ （
３０３）をコードするｃＤＮＡ （第８−１図〜第８−
２図中〔〕で示した部分）とを連結したものを使用する
。アルカリホスファターゼのシグナルペプチドとミニＩ
ＳＡの融合蛋白質をコードするＤＮＡとしては既に特願
昭６３−０３７４５３に記載のアルカリホスファターゼ
のシグナルペプチドと全長のヒト血清アルブミン分子と
の融合蛋白質をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＵ
ｃ−ｐｈｏＡＨＳＡ−八からアルカリホスファターゼの
シグナルペプチド及びヒト血清アルブミンＡの八５ｐｌ
＝Ｐｒｏ１５２までをコードするＤＮＡを特願昭６３−
２６８３０２に記載のプラスミドｐＵＣ−ＩＳＡ−Ｉ
’から切り出したＧ１ｕ１５３〜Ｐｒｏ３０３をコード
するＤＮＡ断片とを融合したものを使用する。短縮Ｈ３
ＡをコードするＤＮＡとしては上記で作製したＭｅｔ１
２３−Ｐｒｏ３０３をコードするＤＮＡのうち合成りＮ
Ａ部分（Ｍｅｔ１２３−Ａｌａ１５１）を切り出したも
のと特願昭６３−０３７４５３に記載のｐＵｃ−ｐｈｏ
Ａ−Ｈ３Ａ−Ａから切り出したＰｒｏ１５２−Ｌｅｕ５
８５のコード領域および３′側非翻訳領域を含むＤＮＡ
配列とを連結したものを使用する。
本発明の正常ヒト血清アルブミン断片をコードするＤＮ
Ａは、それ自体として発現させることもできるが、他の
ペプチドをコードするＤＮＡと連結した状態で発現せし
め、融合蛋白質を得ることができる。この様な融合蛋白
質を得る場合の融合パートナ−として種々のペプチドを
用いることができ、その１つとして例えば大腸菌アルカ
リ性ホスファターゼのシグナルペプチドが挙げられる。
Ａは、それ自体として発現させることもできるが、他の
ペプチドをコードするＤＮＡと連結した状態で発現せし
め、融合蛋白質を得ることができる。この様な融合蛋白
質を得る場合の融合パートナ−として種々のペプチドを
用いることができ、その１つとして例えば大腸菌アルカ
リ性ホスファターゼのシグナルペプチドが挙げられる。
目的とするヒト血清アルブミン断片をこの様な融合蛋白
質として得る場合には、その後、シグナルペプチドを除
去してヒト血清アルブミン断片を得ることができる。
質として得る場合には、その後、シグナルペプチドを除
去してヒト血清アルブミン断片を得ることができる。
ヒト血清アルブミン断片の発現のためには、例えば前記
のごとき融合蛋白質をコードするＤＮＡを適当な発現ベ
クター、例えばプラスミドに挿入した後、該ベクターを
宿主に導入する０発現用宿主としては動物細胞や酵母の
ごとき真核細胞、及び細菌のごとき原核細胞を用いるこ
とができ、ベクターは宿主に依存して選択される。細菌
での発現用プラスミド中では、ヒト血清アルブミン断片
又は該断片を含む融合蛋白質をコードするＤＮＡをプロ
モーター及びＳＤ配列を含む発現制御領域のもとに置く
。プロモーターとしては、例えばｔｒｐプロモーター
１ａｃプロモーター、λフアージプロモーター（Ｐａ
、 ＰＬ ） 、ｔｕｆＢプロモーター、もしくはｒ
ｒｎＢプロモーター、又はこれらのバイブリドプロモー
ターを使用することができる。
のごとき融合蛋白質をコードするＤＮＡを適当な発現ベ
クター、例えばプラスミドに挿入した後、該ベクターを
宿主に導入する０発現用宿主としては動物細胞や酵母の
ごとき真核細胞、及び細菌のごとき原核細胞を用いるこ
とができ、ベクターは宿主に依存して選択される。細菌
での発現用プラスミド中では、ヒト血清アルブミン断片
又は該断片を含む融合蛋白質をコードするＤＮＡをプロ
モーター及びＳＤ配列を含む発現制御領域のもとに置く
。プロモーターとしては、例えばｔｒｐプロモーター
１ａｃプロモーター、λフアージプロモーター（Ｐａ
、 ＰＬ ） 、ｔｕｆＢプロモーター、もしくはｒ
ｒｎＢプロモーター、又はこれらのバイブリドプロモー
ターを使用することができる。
発現ベクター、例えばプラスミドによる宿主、例えば大
腸菌の形質転換は常法に従って行うことができる。大腸
菌の培養は常法により行う。目的のタンパク質の生産の
ためには、大腸菌が一定のレベルに増殖した後、誘発処
理を行うことにより目的とする遺伝子の発現を誘導する
。誘導の方法は使用されるプロモーターにより異り、例
えばｔｒｐプロモーターを用いる場合には、３−β−イ
ンドールアクリル酸を培地に添加することにより誘導を
行うことができる。
腸菌の形質転換は常法に従って行うことができる。大腸
菌の培養は常法により行う。目的のタンパク質の生産の
ためには、大腸菌が一定のレベルに増殖した後、誘発処
理を行うことにより目的とする遺伝子の発現を誘導する
。誘導の方法は使用されるプロモーターにより異り、例
えばｔｒｐプロモーターを用いる場合には、３−β−イ
ンドールアクリル酸を培地に添加することにより誘導を
行うことができる。
大腸菌を宿主とする場合、目的蛋白質は主として細胞内
に蓄積する。このため、蛋白質の回収のためにはまず培
養菌体を集め、これを必要に応じて洗浄した後、水、又
は緩衝液に再懸濁し、細胞を破壊する。目的とする蛋白
質は主として不溶性画分に含まれるため、例えば遠心分
離により不溶性画分を集め、必要により洗浄する０次に
、不溶性画分を蛋白質可溶化用緩衝液、例えばドデシル
硫酸ナトリウム及び２−メルカプトエタノールを含有す
る緩衝液に移すことにより蛋白質を可溶化する。
に蓄積する。このため、蛋白質の回収のためにはまず培
養菌体を集め、これを必要に応じて洗浄した後、水、又
は緩衝液に再懸濁し、細胞を破壊する。目的とする蛋白
質は主として不溶性画分に含まれるため、例えば遠心分
離により不溶性画分を集め、必要により洗浄する０次に
、不溶性画分を蛋白質可溶化用緩衝液、例えばドデシル
硫酸ナトリウム及び２−メルカプトエタノールを含有す
る緩衝液に移すことにより蛋白質を可溶化する。
次に、ヒト血清アルブミン断片の融合蛋白質を含有する
この溶液から、常法に従って該蛋白質を回収・精製する
。融合蛋白質を開裂せしめることにより目的とするヒト
血清アルブミン断片の融合蛋白質を得るには、大腸菌の
リーダーペプチダーゼ（シグナルペプチダーゼ■）によ
りインビトロで分解する方法（Ｚｗｉｚｉｎｓｋｉ、Ｃ
，及び一１ｃｋｎｅｒ、 Ｈ，。
この溶液から、常法に従って該蛋白質を回収・精製する
。融合蛋白質を開裂せしめることにより目的とするヒト
血清アルブミン断片の融合蛋白質を得るには、大腸菌の
リーダーペプチダーゼ（シグナルペプチダーゼ■）によ
りインビトロで分解する方法（Ｚｗｉｚｉｎｓｋｉ、Ｃ
，及び一１ｃｋｎｅｒ、 Ｈ，。
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、■Ｌ、７９７３（１９８０）
）を用いることができる。また融合蛋白質に臭化シア
ンを作用させればＣｙｓ１２４−Ｍｅｔ２９８の断片が
得られる。
）を用いることができる。また融合蛋白質に臭化シア
ンを作用させればＣｙｓ１２４−Ｍｅｔ２９８の断片が
得られる。
本発明のＣ−末端領域を欠失したアルブミン断片は、Ｃ
−末端に存在する長鎖脂肪酸の結合部位を欠いているた
め、長鎖脂肪酸を結合せず、しかも中央領域により種々
の薬物と結合することができるという特徴を有する。他
方、Ｎ−末端領域を欠失したアルブミン断片はＣｙｓ３
４及び他の多数のシスティン残基を欠いており、蛋白質
の安定なフォールディングのために有利である。さらに
、ヒト血清アルブミンの中央部分のみから成るアルブミ
ン断片は、前記両方の特徴を有する。
−末端に存在する長鎖脂肪酸の結合部位を欠いているた
め、長鎖脂肪酸を結合せず、しかも中央領域により種々
の薬物と結合することができるという特徴を有する。他
方、Ｎ−末端領域を欠失したアルブミン断片はＣｙｓ３
４及び他の多数のシスティン残基を欠いており、蛋白質
の安定なフォールディングのために有利である。さらに
、ヒト血清アルブミンの中央部分のみから成るアルブミ
ン断片は、前記両方の特徴を有する。
次に、本発明のヒト血清アルブミン断片の製造について
、実施例により具体的に説明する。
、実施例により具体的に説明する。
なお、実施例中に特に記載しない場合、ＤＮＡの処理の
ための酵素反応は次の条件によった。
ための酵素反応は次の条件によった。
皿１■案反応
ＭＳＩ）！（ニアポンジーン、１０単位／Ｊ１１）、Ｂ
ａｍＨＩ （−−ッポンジーン、３５単位／ｊ１１）
、Ｃ１ａ １にューイングランドバイオラブス、５単位
／ｌ１ｌ）、Ｈｉｎｄｌ［［にッポンジーン、１２単位
／１１１）、及びＥｃｏＲＩ （ニラポンジーン、１２
単位／ｄ）の場合：ＤＮＡ１１！ｇ、酵素１ ｔｄ、
ＩＯＸ ＥｃｏＲＩ緩衝液（ＩＭＴｒｉｓ −ＨＣｊ
！ （ｐＨ７，５）、 １００ｏ＋Ｍ ＭｇＣ
ｊ！ｚ、 ５００ｍＭＮａＣ１） ３ ｒｄに滅菌蒸
留水を加えて３０Ｉ１１とする。
ａｍＨＩ （−−ッポンジーン、３５単位／ｊ１１）
、Ｃ１ａ １にューイングランドバイオラブス、５単位
／ｌ１ｌ）、Ｈｉｎｄｌ［［にッポンジーン、１２単位
／１１１）、及びＥｃｏＲＩ （ニラポンジーン、１２
単位／ｄ）の場合：ＤＮＡ１１！ｇ、酵素１ ｔｄ、
ＩＯＸ ＥｃｏＲＩ緩衝液（ＩＭＴｒｉｓ −ＨＣｊ
！ （ｐＨ７，５）、 １００ｏ＋Ｍ ＭｇＣ
ｊ！ｚ、 ５００ｍＭＮａＣ１） ３ ｒｄに滅菌蒸
留水を加えて３０Ｉ１１とする。
３７°Ｃ，１時間保温して切断を完了させる。５ａｆＩ
及びＸｂａｌにッポンジーン、１５単位／ｍ）の場合は
ＩＯＸ ＥｃｏＲＩ緩衝液の代わりに１００＋＋＋Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５） 、７０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ！ ｔ、 １．７５Ｍ ＮａＣ１、７０ｓ＋Ｍ２−
メルカプトエタノール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．１
％ウシ血清アルブミンを使用する。
及びＸｂａｌにッポンジーン、１５単位／ｍ）の場合は
ＩＯＸ ＥｃｏＲＩ緩衝液の代わりに１００＋＋＋Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５） 、７０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ！ ｔ、 １．７５Ｍ ＮａＣ１、７０ｓ＋Ｍ２−
メルカプトエタノール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．１
％ウシ血清アルブミンを使用する。
ＰｓｔＩにッポンジーン、１２単位／Ｊ！１）及び５ｐ
ｈｌ（宝酒造、１０単位／ｍ）の場合はＭｇＣｌ！の濃
度を２倍にする。
ｈｌ（宝酒造、１０単位／ｍ）の場合はＭｇＣｌ！の濃
度を２倍にする。
バク−アアルカ１ ホス −ゼによるＤＮＡｌａｇ
、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ［各々ｌＩ、ＩＯ
Ｘ ｔ！ｃｏＲＩ ！１衝液２Ｉ、滅菌蒸留水を加えて
２０ｄとし、３７°Ｃで１時間保温した後、９０℃、５
分間加熱し酵素を失活させる０次に、滅菌蒸留水３８Ｉ
、バクテリアアルカリ性ホスファターゼ２Ｉ（全酒造０
．５単位／ｍ）を加えて３７℃、１時間保温した後、フ
ェノール抽出を行い、得られた水層をエタノール沈澱に
用いる。
、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ［各々ｌＩ、ＩＯ
Ｘ ｔ！ｃｏＲＩ ！１衝液２Ｉ、滅菌蒸留水を加えて
２０ｄとし、３７°Ｃで１時間保温した後、９０℃、５
分間加熱し酵素を失活させる０次に、滅菌蒸留水３８Ｉ
、バクテリアアルカリ性ホスファターゼ２Ｉ（全酒造０
．５単位／ｍ）を加えて３７℃、１時間保温した後、フ
ェノール抽出を行い、得られた水層をエタノール沈澱に
用いる。
Ｔ４ＤＮＡＩガーゼ几
たとえばベクターＤＮＡＩｇ、ベクターＤＮＡと等モル
量のＤＮＡフラグメント、ＩＯＸリガーゼ緩衝液〔６６
抛Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５）、６６ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ！ ｚ。
量のＤＮＡフラグメント、ＩＯＸリガーゼ緩衝液〔６６
抛Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５）、６６ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ！ ｚ。
１００ｏ＋Ｍジチオスライトール、１ａｚＭ＾ＴＰ）３
Ｊ１！、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｊ１１（宝酒造、約４０
０単位／Ｊ１１）、滅菌蒸留水を加えて３０Ｊ１１とし
１６°Ｃで一晩保温する。
Ｊ１！、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｊ１１（宝酒造、約４０
０単位／Ｊ１１）、滅菌蒸留水を加えて３０Ｊ１１とし
１６°Ｃで一晩保温する。
５０＋ａＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，６
）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ！、ｇ 、 ５ｍＭジチオ
スライトール、０．２ ｓＭ ＡＴＰを含有する溶液（
２５ｍ ”）中でＤＮＡフラグメントの各々の分量（約
３０ｐｍｏｌｅｓ）を６単位のＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（宝酒造）で３７°Ｃ１６０分間処理することに
より５′端をリン酸化する。リン酸化されたフラグメン
トを含む溶液を混ぜ（計１００ｍ）１００℃の水浴に５
分間放置した後室温で放冷しアニーリングを行う、２ｕ
のＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え１６°Ｃで一晩保温し、
フラグメント間を連結し、二本鎖フラグメントとする。
）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ！、ｇ 、 ５ｍＭジチオ
スライトール、０．２ ｓＭ ＡＴＰを含有する溶液（
２５ｍ ”）中でＤＮＡフラグメントの各々の分量（約
３０ｐｍｏｌｅｓ）を６単位のＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（宝酒造）で３７°Ｃ１６０分間処理することに
より５′端をリン酸化する。リン酸化されたフラグメン
トを含む溶液を混ぜ（計１００ｍ）１００℃の水浴に５
分間放置した後室温で放冷しアニーリングを行う、２ｕ
のＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え１６°Ｃで一晩保温し、
フラグメント間を連結し、二本鎖フラグメントとする。
ＤＮＡポ１−−ゼ
ＤＮＡ１ｑ、ＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｋｌｅｎｏ−
フラグメント、宝Ｗｉ造３５ｔｌｌＬ位／ ｐｌ ）
１１、ｌ ｗｌｎ ｄ）ＣＴＰ（ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ
、 ｄＣＴＰ、 ＴＴＰ）混合物） １ｍ、 ＩＯＸ
＠樹液（７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，
５）、 １ ｍ？Ｉ ＥＤＴ＾、 ２００＋ａＭＨａ（
：、１ 、７０ｍＭ ＭｇＣｌ１ｚ ） ３ ｔｒｌに
滅菌蒸留水を加えて全量を３０ｄとし、３７°Ｃで３０
分間保温する。
フラグメント、宝Ｗｉ造３５ｔｌｌＬ位／ ｐｌ ）
１１、ｌ ｗｌｎ ｄ）ＣＴＰ（ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ
、 ｄＣＴＰ、 ＴＴＰ）混合物） １ｍ、 ＩＯＸ
＠樹液（７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，
５）、 １ ｍ？Ｉ ＥＤＴ＾、 ２００＋ａＭＨａ（
：、１ 、７０ｍＭ ＭｇＣｌ１ｚ ） ３ ｔｒｌに
滅菌蒸留水を加えて全量を３０ｄとし、３７°Ｃで３０
分間保温する。
５′端にＢａ５ａｌ ｌ付着端をもち、３′端付近にＨ
ｐａ Ｉｆ （Ｍｓｐ Ｉ ）認識配列をもち、その二
本鎖部分力ヒト血清アルブミンのＭｅｔ（１２３）−Ａ
ｌａ（１５１）を完全にコードする遺伝子断片の構築を
以下のように行った。大腸菌での発現を効率よくするた
めに大腸菌で高い効率で発現される遺伝子によってよく
使用されるコドン（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｄ
ｏｎｓ）をできるだけ多（含むよう配列をデザインした
。これらのコドンに対するｔＲＮＡ種は一般に大腸菌内
に多量に存在しており〔たとえば、Ｉｋｅ＋５ｕｒａ＋
Ｔ、 Ｊ、 Ｍｏｌ 。
ｐａ Ｉｆ （Ｍｓｐ Ｉ ）認識配列をもち、その二
本鎖部分力ヒト血清アルブミンのＭｅｔ（１２３）−Ａ
ｌａ（１５１）を完全にコードする遺伝子断片の構築を
以下のように行った。大腸菌での発現を効率よくするた
めに大腸菌で高い効率で発現される遺伝子によってよく
使用されるコドン（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｄ
ｏｎｓ）をできるだけ多（含むよう配列をデザインした
。これらのコドンに対するｔＲＮＡ種は一般に大腸菌内
に多量に存在しており〔たとえば、Ｉｋｅ＋５ｕｒａ＋
Ｔ、 Ｊ、 Ｍｏｌ 。
Ｂｉｏｌ、 １５１．３８９−４０９（１９８１）；Ｇ
ｏｕｙ、Ｍ、＆ Ｇａｕｔｉｅｒ、Ｃ。
ｏｕｙ、Ｍ、＆ Ｇａｕｔｉｅｒ、Ｃ。
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、１０．７０５５
−７０７４（１９８２）） 、翻訳効率に影響すること
が期待される。第１図にデザインされた配列を示す。
−７０７４（１９８２）） 、翻訳効率に影響すること
が期待される。第１図にデザインされた配列を示す。
実際の合成に当っては、次の４種類のオリゴヌクレオチ
ド： ５ ’ −ＡＧＧＴＡＴＴＴＴＴＴＣＡＧＧＡＡＧＧＴ
ＴＴＣＴＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡ＾ＧＣＧＧＴＧ
ＣＡＣＡＴＧ−３’ ５’ −ＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＣＣＴＧＴＡＣＧＡＡＡ
ＴＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＡＣＣＣＧＴＡＣＴＴＣＴＡ
ＣＧＣＴＣＣＧＧ−３’５’ −ＣＧＡＡＧＡＡＣＡＧ
ＣＡＧＴＴＣＣＧＧＡＧＣＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＧＧＧ
ＴＧ＾ＣＧＡＣＧＡＧＣＧＡＴＴＴＣＧＴＡＣ−３’を
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ら（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ、Ｄ
、及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ＋Ｍ、Ｈ６Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１．７１９（１９８０））
により開発されたホスホアミダイト法を応用した自動合
成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３
８０Ｂ）を用いて合成した０合成されたＤＮＡ鎖（約３
０ｐｍｏｌｅｓ） ５０ａ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ
（ｐＨ７，６）、１０ｍ？Ｉ ＦＩｇＣｌ □５ ｍＭ
ジチオスライトール及び０．２ ｓＭ ＡＴＰを含有す
る溶液（５０Ｉ）中で６単位のＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（宝酒造）存在下で３７℃、６０分間処理するこ
とにより５′一端をリン酸化した。
ド： ５ ’ −ＡＧＧＴＡＴＴＴＴＴＴＣＡＧＧＡＡＧＧＴ
ＴＴＣＴＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡ＾ＧＣＧＧＴＧ
ＣＡＣＡＴＧ−３’ ５’ −ＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＣＣＴＧＴＡＣＧＡＡＡ
ＴＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＡＣＣＣＧＴＡＣＴＴＣＴＡ
ＣＧＣＴＣＣＧＧ−３’５’ −ＣＧＡＡＧＡＡＣＡＧ
ＣＡＧＴＴＣＣＧＧＡＧＣＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＧＧＧ
ＴＧ＾ＣＧＡＣＧＡＧＣＧＡＴＴＴＣＧＴＡＣ−３’を
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ら（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ、Ｄ
、及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ＋Ｍ、Ｈ６Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１．７１９（１９８０））
により開発されたホスホアミダイト法を応用した自動合
成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３
８０Ｂ）を用いて合成した０合成されたＤＮＡ鎖（約３
０ｐｍｏｌｅｓ） ５０ａ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ
（ｐＨ７，６）、１０ｍ？Ｉ ＦＩｇＣｌ □５ ｍＭ
ジチオスライトール及び０．２ ｓＭ ＡＴＰを含有す
る溶液（５０Ｉ）中で６単位のＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（宝酒造）存在下で３７℃、６０分間処理するこ
とにより５′一端をリン酸化した。
リン酸化されたフラグメント４本を混ぜ１００℃の水浴
中に５分間保温しついで室温で放冷してアニーリングを
行った。２１１１のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（８００単位
、宝酒造）を加えて１６℃で一晩保温しフラグメント間
を連結して二本鎖フラグメントとした。
中に５分間保温しついで室温で放冷してアニーリングを
行った。２１１１のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（８００単位
、宝酒造）を加えて１６℃で一晩保温しフラグメント間
を連結して二本鎖フラグメントとした。
次にこの二本鎖フラグメントをＨｐａ Ｉ［（Ｍｓｐ
Ｉ ）で切断して９６ｂｐのフラグメントを得た。
Ｉ ）で切断して９６ｂｐのフラグメントを得た。
考例１：第６図）をＥｃｏＲｌにより切断してヒト血清
アルブミンｃＤＮＡ部分を切り出し、これをプラスミド
ｐｕｃ １９のＥｃｏＲ１部位に挿入してプラスミドｐ
ｕｃ−ｕｓＡ−Ｉを作製した。
アルブミンｃＤＮＡ部分を切り出し、これをプラスミド
ｐｕｃ １９のＥｃｏＲ１部位に挿入してプラスミドｐ
ｕｃ−ｕｓＡ−Ｉを作製した。
ｐｔｌＣ−ＩＳＡ−１をＰｓｔｌで切断し、生じた５′
端のリン酸基をバクテリアアルカリ性ホスファターゼで
処理して除去した後、ｌ１ｐａ ＩＩ （Ｍｓｐ Ｉ
）で切断して７５０ｂｐのフラグメントを切り出した。
端のリン酸基をバクテリアアルカリ性ホスファターゼで
処理して除去した後、ｌ１ｐａ ＩＩ （Ｍｓｐ Ｉ
）で切断して７５０ｂｐのフラグメントを切り出した。
この７５０ｂｐのフラグメントを実施例１において合成
した９６ｂｐのフラグメントとＴ４ ＤＮＡリガーゼで
Ｈｐａ Ｉｆ （ＭｓｐＩ）の付着末端同士の対合を利
用して結合した後、ｐｕｃ １９のＢａｍＨＩとＰｓｔ
ｌの二重消化物の大きい方のフラグメントとＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼにより連結しｐＳＡＬ ＩＩプラスミドを得
た。
した９６ｂｐのフラグメントとＴ４ ＤＮＡリガーゼで
Ｈｐａ Ｉｆ （ＭｓｐＩ）の付着末端同士の対合を利
用して結合した後、ｐｕｃ １９のＢａｍＨＩとＰｓｔ
ｌの二重消化物の大きい方のフラグメントとＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼにより連結しｐＳＡＬ ＩＩプラスミドを得
た。
正常ヒト血清アルブミンのアミノ末端側をコードする部
分を欠き、さらに３０４番目のセリンをコードするコド
ンが翻訳終止コドンに変化している配列を含むλｇｔｌ
ｌヒトｃＤヒトクローン（ＩＳＡ−ＩＡ） （参ｐＳＡ
Ｌ ＩｆをＢａ５Ｈ１で処理して開環し末端を大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼｌで処理し、平滑末端とした後、旧ｎ
ｄｌ［［で切断しＨＳＡ ｃＤＮＡを含む７５０ｂｐの
フラグメントを得た。一方ｐｕｃ １９プラスミドにて
大腸菌アルカリ性ホスファターゼ（ｐｈｏＡ）のシグナ
ルペプチドをコードする人工リーダー配列を組み込んだ
プラスミドｐＵｃ−ｐｈｏＡ （参考例２）をＨｐａ
ＩＩ （ＭｓｐＩ）で切断し、大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩで平滑末端とした後ＥｃｏＲＩで切断し、リーダー
配列を含む６９ｂｐのフラグメントを得た。このフラグ
メントとｐＳＡＬ ＩＩ由来の正常ヒト血清アルブミン
ｃＤＮＡの一部を含む７ｓｏｂｐのフラグメントをＴ４
ＤＮＡリガーゼで連結し、さらにｐｕｃ １９のＥｃ
ｏＲＩと旧ｎｄｌ［Ｉの二重消化物のうち大きい方のフ
ラグメントと連結しリーダー配列とＨＳＡ ｃＤＮＡ部
分がつながったｐＵＣ−ｐｈｏＡ−５ＡＬ ＩＩプラス
ミドを得た。このようにして連結されたｐｈｏＡシグナ
ルペプチドをコードするリーダー配列とＨＳＡ ｃＤＮ
Ａの一部との間にはヌクレオチド配列ＧＧＡＴＣＣがア
ダプター配列として生じ、２個のアミノ酸Ｇｌｙ−５ｅ
ｔをコードするために実際にこの融合遺伝子により合成
される融合蛋白質はｐｈｏＡシグナルペプチド−Ｇｌｙ
−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ１２３〜ｐｒｏ３０３という構造をと
る。
分を欠き、さらに３０４番目のセリンをコードするコド
ンが翻訳終止コドンに変化している配列を含むλｇｔｌ
ｌヒトｃＤヒトクローン（ＩＳＡ−ＩＡ） （参ｐＳＡ
Ｌ ＩｆをＢａ５Ｈ１で処理して開環し末端を大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼｌで処理し、平滑末端とした後、旧ｎ
ｄｌ［［で切断しＨＳＡ ｃＤＮＡを含む７５０ｂｐの
フラグメントを得た。一方ｐｕｃ １９プラスミドにて
大腸菌アルカリ性ホスファターゼ（ｐｈｏＡ）のシグナ
ルペプチドをコードする人工リーダー配列を組み込んだ
プラスミドｐＵｃ−ｐｈｏＡ （参考例２）をＨｐａ
ＩＩ （ＭｓｐＩ）で切断し、大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩで平滑末端とした後ＥｃｏＲＩで切断し、リーダー
配列を含む６９ｂｐのフラグメントを得た。このフラグ
メントとｐＳＡＬ ＩＩ由来の正常ヒト血清アルブミン
ｃＤＮＡの一部を含む７ｓｏｂｐのフラグメントをＴ４
ＤＮＡリガーゼで連結し、さらにｐｕｃ １９のＥｃ
ｏＲＩと旧ｎｄｌ［Ｉの二重消化物のうち大きい方のフ
ラグメントと連結しリーダー配列とＨＳＡ ｃＤＮＡ部
分がつながったｐＵＣ−ｐｈｏＡ−５ＡＬ ＩＩプラス
ミドを得た。このようにして連結されたｐｈｏＡシグナ
ルペプチドをコードするリーダー配列とＨＳＡ ｃＤＮ
Ａの一部との間にはヌクレオチド配列ＧＧＡＴＣＣがア
ダプター配列として生じ、２個のアミノ酸Ｇｌｙ−５ｅ
ｔをコードするために実際にこの融合遺伝子により合成
される融合蛋白質はｐｈｏＡシグナルペプチド−Ｇｌｙ
−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ１２３〜ｐｒｏ３０３という構造をと
る。
融合蛋白質を大腸菌で発現させるためにｐｈｏＡシグナ
ルペプチド−正常ヒト血清アルブミンの融合タンパク質
の発現に用いたｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａ
’（参考例３及び４；特願昭６３−０３７４５３）を利
用した。 ｐＡｒ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ４ｓａ−ａをＥｃ
ｏＲＩと旧ｎｄｌ［［で二重消化し、ｐｈｏＡリーダー
配列−Ｈ５ＡｃＤＮＡ部分を含まない大きい方のフラグ
メントを、ｐＵｃ−ｐｈｏＡ−５ＡＬ Ｉｆプラスミド
をＥｃｏＲＩと旧ｎｄｌ［Ｉにより二重消化して得られ
る８００ｂｐのフラグメントとＴ４ ＤＮＡリガーゼに
より連結しｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＳＡＬ Ｕプラ
スミドを得た。
ルペプチド−正常ヒト血清アルブミンの融合タンパク質
の発現に用いたｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａ
’（参考例３及び４；特願昭６３−０３７４５３）を利
用した。 ｐＡｒ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ４ｓａ−ａをＥｃ
ｏＲＩと旧ｎｄｌ［［で二重消化し、ｐｈｏＡリーダー
配列−Ｈ５ＡｃＤＮＡ部分を含まない大きい方のフラグ
メントを、ｐＵｃ−ｐｈｏＡ−５ＡＬ Ｉｆプラスミド
をＥｃｏＲＩと旧ｎｄｌ［Ｉにより二重消化して得られ
る８００ｂｐのフラグメントとＴ４ ＤＮＡリガーゼに
より連結しｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＳＡＬ Ｕプラ
スミドを得た。
ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−５ＡＬ ＩＩプラスミドを
大腸菌ＨＢＩＯＩに形質転換法により導入し大腸菌ＨＢ
ＩＯＩ （ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＳＡＬ Ｉｆ
）を得た。
大腸菌ＨＢＩＯＩに形質転換法により導入し大腸菌ＨＢ
ＩＯＩ （ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＳＡＬ Ｉｆ
）を得た。
この大腸菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第１０３０８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１０３０８）と
して寄託されている。
研菌寄第１０３０８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１０３０８）と
して寄託されている。
皇族■土 鳳企蛋ｎ１皇発里
ｐＡＴ−Ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＳＡＬ Ｕを保有する大腸
菌による大腸菌アルカリ性ホスファターゼのシグナルペ
プチドとヒト血清アルブミン断片の融合蛋白質を次のよ
うにして発現させた。
菌による大腸菌アルカリ性ホスファターゼのシグナルペ
プチドとヒト血清アルブミン断片の融合蛋白質を次のよ
うにして発現させた。
隻−１
ｐＡＴ−Ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＳＡＬ ＩＩを持つ大腸菌
０８１０１株を５ｄの、アンピシリンを２５ｘ／ｄ含む
ルリア（ＬＢ）培地（バタトトリプトン１％、酵母エキ
ス０．５％、ＮａＣ１０，５％）に接種し、３７°Ｃ１
８時間振とう培養した。この培養液０．２ ｄをアンピ
シリンを２５ｎ／−含む５ｄのＭ９− ＣＡ培地（Ｎａ
ｚＨＰＯ４０，６％、Ｋ）１．ＰＯ。
０８１０１株を５ｄの、アンピシリンを２５ｘ／ｄ含む
ルリア（ＬＢ）培地（バタトトリプトン１％、酵母エキ
ス０．５％、ＮａＣ１０，５％）に接種し、３７°Ｃ１
８時間振とう培養した。この培養液０．２ ｄをアンピ
シリンを２５ｎ／−含む５ｄのＭ９− ＣＡ培地（Ｎａ
ｚＨＰＯ４０，６％、Ｋ）１．ＰＯ。
０．３％、ＮａＣｊ！ ０．５％、 ＮＨ４（Ｊ ０．
１％＋ ＣａＣｌ ｚ ００１ｍＭ、 Ｍｇ５Ｏｎ ２
ｍＭ、カザミノ酸０．８％）に接種し、３０分３７℃で
培養した後、誘導物質である３−β−インドールアクリ
ル酸（ＩＡＡ）を２０ｘ／ｄとなるよう加えた。さらに
３７℃で５〜７時間振とう培養を行った。
１％＋ ＣａＣｌ ｚ ００１ｍＭ、 Ｍｇ５Ｏｎ ２
ｍＭ、カザミノ酸０．８％）に接種し、３０分３７℃で
培養した後、誘導物質である３−β−インドールアクリ
ル酸（ＩＡＡ）を２０ｘ／ｄとなるよう加えた。さらに
３７℃で５〜７時間振とう培養を行った。
ｌ１１」ｂト１應巳
上記のように培養した培養液を７００Ｏｒｐｍ 、５分
遠心し、集菌した。沈殿した菌体を２０％ショ糖、２５
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ （ｐＨ７，５） 、１（
１ｗＭ ＥＤＴＡ 、 １ ｄＰ？ｌＳＦ （ぶつ化フ
ェニルメチルスルホニル）に再浮遊させ、卵白リゾチー
ムを０．２■／ｄ加えた。３７’ＣＩ５分静置すること
により、外膜が消化され、プロトプラスト （スフェロ
プラスト）が得られた。
遠心し、集菌した。沈殿した菌体を２０％ショ糖、２５
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ （ｐＨ７，５） 、１（
１ｗＭ ＥＤＴＡ 、 １ ｄＰ？ｌＳＦ （ぶつ化フ
ェニルメチルスルホニル）に再浮遊させ、卵白リゾチー
ムを０．２■／ｄ加えた。３７’ＣＩ５分静置すること
により、外膜が消化され、プロトプラスト （スフェロ
プラスト）が得られた。
この浮遊液を水中に移し、冷却した後、１ｏｏｏｏｒｐ
ｎ＋、１０分遠心し、スフェロプラストを沈殿させた。
ｎ＋、１０分遠心し、スフェロプラストを沈殿させた。
このスフェロプラストを２０％シ＝ｓ ｔａｃｔ （２
５ａＭ ＴｒｉｓＨＣＩ （ｐＨ７，５） 、１０ａＭ
ＥＤＴＡ ）に再浮遊させ、水浴中でポリトロンホモ
ゲナイザ−（ダイアル値：８）により破砕した。４°Ｃ
において破砕液を１５．０００ｒｐｍ、２０分遠心し、
菌体残香を得た。この菌体残香を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｊｌ （ｐＨ７，５）に再浮遊させ、４°Ｃにお
いて浮遊液を１５．ＯＯＯｒｐｍ 、 ２０分遠心した
。
５ａＭ ＴｒｉｓＨＣＩ （ｐＨ７，５） 、１０ａＭ
ＥＤＴＡ ）に再浮遊させ、水浴中でポリトロンホモ
ゲナイザ−（ダイアル値：８）により破砕した。４°Ｃ
において破砕液を１５．０００ｒｐｍ、２０分遠心し、
菌体残香を得た。この菌体残香を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｊｌ （ｐＨ７，５）に再浮遊させ、４°Ｃにお
いて浮遊液を１５．ＯＯＯｒｐｍ 、 ２０分遠心した
。
この操作をさらにもう一回行い、得られた沈澱を不溶性
画分として得た。
画分として得た。
５ＤＳ−ボ アク１ルアミド゛ル
１）菌体総蛋白質の分析
培養液０．５ ａｊｔを７００Ｏｒｐｍ 、５分遠心し
、集菌した。菌体を１０Ｉの５ＤＳ−サンプル液（６２
，５醜ｈＴｒｉｓ−ＨＣｊｌ （ｐＨ６，８） 、２
％５Ｄ８１１０％シー＊￥Ｉ！、５％２−メルカプトエ
タノール〕に浮遊させ、１００℃５分処理した。これを
分離ゲル濃度１０％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
（Ｌａｅｍｍｌｉの方法： Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏ
ｎ）２７７．６８０（１９７０） ）にアプライし、電
気泳動を行った。
、集菌した。菌体を１０Ｉの５ＤＳ−サンプル液（６２
，５醜ｈＴｒｉｓ−ＨＣｊｌ （ｐＨ６，８） 、２
％５Ｄ８１１０％シー＊￥Ｉ！、５％２−メルカプトエ
タノール〕に浮遊させ、１００℃５分処理した。これを
分離ゲル濃度１０％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
（Ｌａｅｍｍｌｉの方法： Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏ
ｎ）２７７．６８０（１９７０） ）にアプライし、電
気泳動を行った。
２）不溶性画分の分析
残香を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＲＣ４（ｐＨ７，５）に再
浮遊させ、一部をとり、５ＤＳ−サンプル液で希釈した
。
浮遊させ、一部をとり、５ＤＳ−サンプル液で希釈した
。
１００℃５分処理することにより、不溶性蛋白質を可溶
化させ、ゲル電気泳動を行った。
化させ、ゲル電気泳動を行った。
３）染色及び脱色
泳動終了後、ゲルは染色液（クマシーブリリアント・ブ
ルー０．２５％、エタノール４５％、酢酸１０％）に３
０分間〜１時間浸し、染色した。染色されたゲルは脱色
液（メタノール５％、酢酸ｌＯ％）を満たした脱色装置
（バイオランド社製、モデル５５６型）に移し、脱色し
た。
ルー０．２５％、エタノール４５％、酢酸１０％）に３
０分間〜１時間浸し、染色した。染色されたゲルは脱色
液（メタノール５％、酢酸ｌＯ％）を満たした脱色装置
（バイオランド社製、モデル５５６型）に移し、脱色し
た。
ウェス −ンブロ トと
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動終了後、ゲル
をガラス板よりはずした。ゲルサイズに切断したニトロ
セルロースフィルター（Ｂｉｏ−ｒａｄ＋Ｔｒａｎｓ−
ｂｌｏｔ＠ ） 、及びワットマン社製３ＭＭ濾紙（２
枚）をプロッティング液（０，３％Ｔｒｉｓ ｓｌ、４
４％グリシン、２０％メタノール）に浸した。プロッテ
ィング液であらかじめ浸したスコッチ・パッド上に濾紙
、ゲル、フィルター、濾紙の順に重ね合わせ、スコッチ
パッドではさみ、プロッティング装置ｌｌ （ＴＥＦＣ
Ｏ社製、Ｍｏｄｅｌ ：ＴＣ−８０８）にセットした。
をガラス板よりはずした。ゲルサイズに切断したニトロ
セルロースフィルター（Ｂｉｏ−ｒａｄ＋Ｔｒａｎｓ−
ｂｌｏｔ＠ ） 、及びワットマン社製３ＭＭ濾紙（２
枚）をプロッティング液（０，３％Ｔｒｉｓ ｓｌ、４
４％グリシン、２０％メタノール）に浸した。プロッテ
ィング液であらかじめ浸したスコッチ・パッド上に濾紙
、ゲル、フィルター、濾紙の順に重ね合わせ、スコッチ
パッドではさみ、プロッティング装置ｌｌ （ＴＥＦＣ
Ｏ社製、Ｍｏｄｅｌ ：ＴＣ−８０８）にセットした。
プロッティング液をみたし、２００ｍＡ、 １時間電
気泳動を行った。
気泳動を行った。
泳動終了後、フィルターをゲルからはがし、ＴＢＳ液（
２５ｓ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５） 、０．
５ ＭＮａＣｌ ）で１０分処理した。３％ゼラチン入
りのＴＢＳ液で３０分処理した後、フィルターを０．０
２５％Ｔｗｅｅｎ−２０の入ったＴＢＳ液（ＴＴＢＳ液
と以下略す）に移し、５分処理し、さらに同操作をくり
返した。
２５ｓ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５） 、０．
５ ＭＮａＣｌ ）で１０分処理した。３％ゼラチン入
りのＴＢＳ液で３０分処理した後、フィルターを０．０
２５％Ｔｗｅｅｎ−２０の入ったＴＢＳ液（ＴＴＢＳ液
と以下略す）に移し、５分処理し、さらに同操作をくり
返した。
抗ヒトアルブミン−ウサギ血清のＩｇＧ画分（カッペル
社製）を１％ゼラチン入りのＴＴＢＳ液で２０００倍に
希釈し、この液中にフィルターを浸し、２〜１８時間処
理した。次に、フィルターをＴＴＢＳ液中に移し５分処
理した。この操作をさらに２回行った。
社製）を１％ゼラチン入りのＴＴＢＳ液で２０００倍に
希釈し、この液中にフィルターを浸し、２〜１８時間処
理した。次に、フィルターをＴＴＢＳ液中に移し５分処
理した。この操作をさらに２回行った。
抗つサギＩｇＧ−ヤギー西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ
標識抗体（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を１％ゼラチン含有の
ＴＴＢＳ液で３０００倍に希釈した液中にフィルターを
移し、２時間処理した。同処理後、フィルターをＴＴＢ
Ｓ液で２回、ＴＢＳ液で１回、それぞれ５分間洗った。
標識抗体（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を１％ゼラチン含有の
ＴＴＢＳ液で３０００倍に希釈した液中にフィルターを
移し、２時間処理した。同処理後、フィルターをＴＴＢ
Ｓ液で２回、ＴＢＳ液で１回、それぞれ５分間洗った。
０．０１５％ｏ、ｏｔ、 ０．０５％ＨＲＰカラーデベ
ロップメント・リージェント（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）、１
６．７％メタノール含有のＴＢＳ液にライルターを浸し
、１５分反応させた０次に、フィルターを水につけ３０
分放置した。抗ヒト・アルブミン抗体と交差する物があ
る所は、濃い紫色に発色した（第４図）０分子量２１０
００の位置に本発明の発現生成物が認められた。
ロップメント・リージェント（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）、１
６．７％メタノール含有のＴＢＳ液にライルターを浸し
、１５分反応させた０次に、フィルターを水につけ３０
分放置した。抗ヒト・アルブミン抗体と交差する物があ
る所は、濃い紫色に発色した（第４図）０分子量２１０
００の位置に本発明の発現生成物が認められた。
大腸菌アルカリ性ホスファターゼシグナルペプチドと成
熟ヒト血清アルブミンＡの融合タンパク質をコードする
ＤＮＡ配列を含む参考例３に記載のｐＵｃ−ｐｈｏ＾−
ＨＳ＾−ＡをＥｃｏＲＩとＭｓｐ Ｉで二重消化し、ア
ルカリ性ホスファターゼのシグナルペプチドのアミノ末
端のメチオニンコドンの直前から成熟ヒト血清アルブミ
ンＡの１５２位のプロリンのコドンまでの領域（約５０
０ｂｐ）を切り出した。一方前駆体プレプロヒト血清ア
ルブミンＡのうち成熟ヒト血清アルブミンＡの３０３位
のプロリンまでをコードするが、３０４位のセリンのコ
ドン（ＴＣＡ）がオパールコドン（ＴＧＡ）に置換され
たＤＮＡ配列を含む組換えプラスミドｐＵＣ−ＩＳＡ−
１’をＭｓｐ ｌとＸｂａ ［で二重消化し、１５３位
のグルタミン酸から３５６位のトレオニンまでの領域を
コードする （しかし３０４位のオパールコドンで翻訳
は終止するので実際には３０３位のプロリンまでの領域
をコードする）約６１０ｂＰのＤＮＡ断片を得た。これ
ら２つのＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐｌＪｃ１
８をＥｃｏＲＩとＸｂａ Ｉとで二重消化して得た大き
な方の断片（約２６６０ｂｐ）と連結させることにより
、大腸菌アルカリ性ホスファターゼのシグナルペプチド
と成熟ヒト血清アルブミンＡのＡｓｐｌ−Ｐｒｏ３０３
の領域からなる融合タンパク質（ｐｈｏＡ−−ｌ５Ａ）
をコードするＤＮＡ配列を含む組換えプラスミドｐＵｃ
−ｐｈｏＡ−ｍＨｓＡを構築した。
熟ヒト血清アルブミンＡの融合タンパク質をコードする
ＤＮＡ配列を含む参考例３に記載のｐＵｃ−ｐｈｏ＾−
ＨＳ＾−ＡをＥｃｏＲＩとＭｓｐ Ｉで二重消化し、ア
ルカリ性ホスファターゼのシグナルペプチドのアミノ末
端のメチオニンコドンの直前から成熟ヒト血清アルブミ
ンＡの１５２位のプロリンのコドンまでの領域（約５０
０ｂｐ）を切り出した。一方前駆体プレプロヒト血清ア
ルブミンＡのうち成熟ヒト血清アルブミンＡの３０３位
のプロリンまでをコードするが、３０４位のセリンのコ
ドン（ＴＣＡ）がオパールコドン（ＴＧＡ）に置換され
たＤＮＡ配列を含む組換えプラスミドｐＵＣ−ＩＳＡ−
１’をＭｓｐ ｌとＸｂａ ［で二重消化し、１５３位
のグルタミン酸から３５６位のトレオニンまでの領域を
コードする （しかし３０４位のオパールコドンで翻訳
は終止するので実際には３０３位のプロリンまでの領域
をコードする）約６１０ｂＰのＤＮＡ断片を得た。これ
ら２つのＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐｌＪｃ１
８をＥｃｏＲＩとＸｂａ Ｉとで二重消化して得た大き
な方の断片（約２６６０ｂｐ）と連結させることにより
、大腸菌アルカリ性ホスファターゼのシグナルペプチド
と成熟ヒト血清アルブミンＡのＡｓｐｌ−Ｐｒｏ３０３
の領域からなる融合タンパク質（ｐｈｏＡ−−ｌ５Ａ）
をコードするＤＮＡ配列を含む組換えプラスミドｐＵｃ
−ｐｈｏＡ−ｍＨｓＡを構築した。
上記プラスミドｐＵｃ−ｐｈｏＡ−ｍ）ＩＳＡをＥｃｏ
ＲＩと旧ｎｄ■で二重消化し、大腸菌アルカリ性ホスフ
ァターゼシグナルペプチドとミニＨ３Ａとの融合タンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列を切り出し、これを、大腸
菌アルカリ性ホスファターゼシグナルペプチドと成熟ヒ
ト血清アルブミンへの融合タンパク質の製造に用いた組
換えプラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａ
からＥｃｏＲＩと旧ｎｄｌ［［との二重消化により切り
出した大きい方のＤＮＡ断片と連結した０組換えプラス
ミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａは大腸菌ト
リプトファンプロモーターの下流に存在するＥｃｏＲＩ
認識部位の下流に大腸菌アルカリ性ホスファターゼシグ
ナルペプチドと成熟ヒツト血清アルブミンＡの融合タン
パク賞をコードするＤＮＡ配列及びその３′側非翻訳配
列が位置しその最後に旧ｎｄｌｌＩ認識部位が配置され
ている構造をとっている。従って、ＥｃｏＲＩと旧ｎｄ
ｌ［Ｉを用いた二重消化により得られた大きな方のＤＮ
Ａ断片は大腸菌アルカリ性ホスファターゼシグナルペプ
チドと成熟ヒト血清アルブミンＡの融合タンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列を欠いた形となり、大腸菌アルカリ
性ホスファターゼシグナルペプチドとミニＨ５Ａとの融
合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＥｃｏＲｌ
−ＨｌｎｄＩ［ｌ断片と連結することにより、大腸菌ト
リプトファンプロモーター制御下に該融合タンパク質を
発現できる構造を持った組換えプラスミドｐＡＴ−ｔｒ
ｐ−ｐｈｏＡ−ｎ＋ＨＳＡを構築できた。
ＲＩと旧ｎｄ■で二重消化し、大腸菌アルカリ性ホスフ
ァターゼシグナルペプチドとミニＨ３Ａとの融合タンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列を切り出し、これを、大腸
菌アルカリ性ホスファターゼシグナルペプチドと成熟ヒ
ト血清アルブミンへの融合タンパク質の製造に用いた組
換えプラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａ
からＥｃｏＲＩと旧ｎｄｌ［［との二重消化により切り
出した大きい方のＤＮＡ断片と連結した０組換えプラス
ミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａは大腸菌ト
リプトファンプロモーターの下流に存在するＥｃｏＲＩ
認識部位の下流に大腸菌アルカリ性ホスファターゼシグ
ナルペプチドと成熟ヒツト血清アルブミンＡの融合タン
パク賞をコードするＤＮＡ配列及びその３′側非翻訳配
列が位置しその最後に旧ｎｄｌｌＩ認識部位が配置され
ている構造をとっている。従って、ＥｃｏＲＩと旧ｎｄ
ｌ［Ｉを用いた二重消化により得られた大きな方のＤＮ
Ａ断片は大腸菌アルカリ性ホスファターゼシグナルペプ
チドと成熟ヒト血清アルブミンＡの融合タンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列を欠いた形となり、大腸菌アルカリ
性ホスファターゼシグナルペプチドとミニＨ５Ａとの融
合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＥｃｏＲｌ
−ＨｌｎｄＩ［ｌ断片と連結することにより、大腸菌ト
リプトファンプロモーター制御下に該融合タンパク質を
発現できる構造を持った組換えプラスミドｐＡＴ−ｔｒ
ｐ−ｐｈｏＡ−ｎ＋ＨＳＡを構築できた。
ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｍＨ５Ａプラスミドを大腸
菌ＨＢＩＯＩに形質転換法により導入し、大腸菌ＨＢＩ
ＯＩ （ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ａ＋ｌ５Ａ）を得
た。この大腸菌は微工研菌寄第１０９５２号（ＦＨＲ）
Ｉ Ｐ−１０９５２）として工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている。
菌ＨＢＩＯＩに形質転換法により導入し、大腸菌ＨＢＩ
ＯＩ （ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ａ＋ｌ５Ａ）を得
た。この大腸菌は微工研菌寄第１０９５２号（ＦＨＲ）
Ｉ Ｐ−１０９５２）として工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている。
１施１ｉ −ＨＳＡ コード るＤＮＡ Ａ・前記
組換えプラスミドｐＳＡＬ ＩＩは成熟ヒト血清アルブ
ミンＡのＭｅｔ１２３からＰｒｏ３０３までをコードで
きるＤＮＡ配列を含んでおり、Ｂａｗｌ ｌとＭｓｐ
Ｉとの二重消化によりＭｅｔ１２３−Ａｌａ１５１をコ
ードするＤＮＡ断片（約９０ｂｐ）をこれから切り出し
た。一方、上記プラスミドｐＵｃ−ｐｈｏＡ−Ｈ５Ａ−
Ａを？１ｓｐ Ｉと旧ｎｄｎｌとで二重消化して、Ｐｒ
ｏ１５２から成熟ヒト血清アルブミンＡのカルボキシル
末端であるＬｅｕ５８５をコードしさらにその３′側非
翻訳配列を含む約１３５０ｂｐの断片を得た。これら２
つの断片をｐＵｃ１８をＢａｍＨＩと旧ｎｄｌｌｌとで
二重消化して得た約２６６０ｂｐのＤＮＡ断片と連結し
、Ｍｅｔ１２３−Ｌｅｕ５８５（短縮Ｈ５Ａ）をコード
するＤＮＡ配列を含む組換えプラスミドｐｕｃ−ｔｎｓ
ａをｉｌｌ ｉ Ｌ タ。
組換えプラスミドｐＳＡＬ ＩＩは成熟ヒト血清アルブ
ミンＡのＭｅｔ１２３からＰｒｏ３０３までをコードで
きるＤＮＡ配列を含んでおり、Ｂａｗｌ ｌとＭｓｐ
Ｉとの二重消化によりＭｅｔ１２３−Ａｌａ１５１をコ
ードするＤＮＡ断片（約９０ｂｐ）をこれから切り出し
た。一方、上記プラスミドｐＵｃ−ｐｈｏＡ−Ｈ５Ａ−
Ａを？１ｓｐ Ｉと旧ｎｄｎｌとで二重消化して、Ｐｒ
ｏ１５２から成熟ヒト血清アルブミンＡのカルボキシル
末端であるＬｅｕ５８５をコードしさらにその３′側非
翻訳配列を含む約１３５０ｂｐの断片を得た。これら２
つの断片をｐＵｃ１８をＢａｍＨＩと旧ｎｄｌｌｌとで
二重消化して得た約２６６０ｂｐのＤＮＡ断片と連結し
、Ｍｅｔ１２３−Ｌｅｕ５８５（短縮Ｈ５Ａ）をコード
するＤＮＡ配列を含む組換えプラスミドｐｕｃ−ｔｎｓ
ａをｉｌｌ ｉ Ｌ タ。
１隻炎８． − ＨＳＡ せるための え
短縮ＨＳ Ａ （Ｍｅｔ１２３−Ｌｅｕ５８５）を融合
型ではなく直接発現させるのに大腸菌トリプトファンプ
ロモーターを用いた。プラスミドベクターｐＡＴ１５３
を基本にして大腸菌トリプトファンオペロン、由来のプ
ロモーター及びｔｒｐＬのＳＤ配列を組み込んだ発現用
プラスミドベクターｐＡＴ−ｔｒｐをトリプトファンオ
ペロン由来の配列の下流にあるＣ１ａ Ｉ認識部位で切
断し、開環させた後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ！で処
理しヌクレオチド重合反応により末端の一本鎖部分を埋
めた。次に、Ｓｐｈ ｌで切断し、大きい方のＤＮＡ断
片を得た。一方、成熟ヒト血清アルブミンＡの？１ｅｔ
１２３−Ｐｒｏ３０３ （ＳＡＬ ＩＩ ）をコードす
るＤＮＡ配列を含む組換えプラスミドｐＳＡＬ ＩＩを
Ｍｅｔ１２３コドンの直前にあるＢａ−８１認識部位で
切断した後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■によるヌクレ
オチド重合反応を行い、末端の一本鎖部分を埋めた０次
に、ｓｐｈ ｌで切断し、ＳＡＬ ＩＩをコードするＤ
ＮＡ配列を含む小さい方のＤＮＡ断片を得ｆやこの２つ
のＤＮＡ断片を連結し大腸菌トリプトファンオペロン由
来配列の下流にＳＡＬ ＩＩをコードするＤＮＡ配列が
配置された組換えプラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−３ＡＬ
ｕを作製した。このｐＡＴ−ｔｒｐ−５ＡＬｕをＳＡＬ
ｎ ＤＮＡ配列の下流に位置するＳａｌ Ｉ認識部位
で切断した後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌで一本鎖Ｄ
ＮＡ部分を埋め、さらにＢａｍＨＩによりＳＡＬ ｎ
ＤＮＡの５′末端の部位で切断し、ＳＡＬ ＩＩ口ＮＡ
を切断・除去した。こうして得た大きな方のＤＮＡ断片
をｐｕｃ−ｔＨ５ＡプラスミドをＢｉｎｄｌ［［で切断
し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■で一本鎖部分を埋め、
１３ａｍＨＩで切断して得た短′ｆＭＨ３Ａをコードす
るＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片と連結し短縮Ｈ３Ａ３％
用組換えプラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｔＨＳＡを構築し
た。
短縮ＨＳ Ａ （Ｍｅｔ１２３−Ｌｅｕ５８５）を融合
型ではなく直接発現させるのに大腸菌トリプトファンプ
ロモーターを用いた。プラスミドベクターｐＡＴ１５３
を基本にして大腸菌トリプトファンオペロン、由来のプ
ロモーター及びｔｒｐＬのＳＤ配列を組み込んだ発現用
プラスミドベクターｐＡＴ−ｔｒｐをトリプトファンオ
ペロン由来の配列の下流にあるＣ１ａ Ｉ認識部位で切
断し、開環させた後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ！で処
理しヌクレオチド重合反応により末端の一本鎖部分を埋
めた。次に、Ｓｐｈ ｌで切断し、大きい方のＤＮＡ断
片を得た。一方、成熟ヒト血清アルブミンＡの？１ｅｔ
１２３−Ｐｒｏ３０３ （ＳＡＬ ＩＩ ）をコードす
るＤＮＡ配列を含む組換えプラスミドｐＳＡＬ ＩＩを
Ｍｅｔ１２３コドンの直前にあるＢａ−８１認識部位で
切断した後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■によるヌクレ
オチド重合反応を行い、末端の一本鎖部分を埋めた０次
に、ｓｐｈ ｌで切断し、ＳＡＬ ＩＩをコードするＤ
ＮＡ配列を含む小さい方のＤＮＡ断片を得ｆやこの２つ
のＤＮＡ断片を連結し大腸菌トリプトファンオペロン由
来配列の下流にＳＡＬ ＩＩをコードするＤＮＡ配列が
配置された組換えプラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−３ＡＬ
ｕを作製した。このｐＡＴ−ｔｒｐ−５ＡＬｕをＳＡＬ
ｎ ＤＮＡ配列の下流に位置するＳａｌ Ｉ認識部位
で切断した後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌで一本鎖Ｄ
ＮＡ部分を埋め、さらにＢａｍＨＩによりＳＡＬ ｎ
ＤＮＡの５′末端の部位で切断し、ＳＡＬ ＩＩ口ＮＡ
を切断・除去した。こうして得た大きな方のＤＮＡ断片
をｐｕｃ−ｔＨ５ＡプラスミドをＢｉｎｄｌ［［で切断
し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■で一本鎖部分を埋め、
１３ａｍＨＩで切断して得た短′ｆＭＨ３Ａをコードす
るＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片と連結し短縮Ｈ３Ａ３％
用組換えプラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｔＨＳＡを構築し
た。
ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｔＨＳＡプラスミドを大腸菌ＨＢＩＯ
Ｉに形質転換法により導入し大腸菌ＨＢＩＯＩ （ｐＡ
Ｔ−ｔｒｐ−ｔＨＳＡ）を得た。この大腸菌は微工研菌
寄第１０９５０号（ＦＥＲＭＰ−１０９５０）として工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
Ｉに形質転換法により導入し大腸菌ＨＢＩＯＩ （ｐＡ
Ｔ−ｔｒｐ−ｔＨＳＡ）を得た。この大腸菌は微工研菌
寄第１０９５０号（ＦＥＲＭＰ−１０９５０）として工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
１旌■ｌ アルカ ホスフ −ゼシグ大腸菌
アルカリ性ホスファターゼシグナルペプチドとＳＡＬ
ｎの融合タンパク質を発現するための組換えプラスミド
ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏ＾−３ＡＬ ＩＩをＳＡＬ Ｉ
ｆ ＤＮＡ配列の下流に存在するＳＡＬ Ｉ ！！識部
位で切断し開環した後、末端を大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩで処理し、−本鎖部分を埋めた０次にアルカリ性ホ
スファターゼシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
とＳＡＬ ＩＩをコードするＤＮＡ配列の間のスペーサ
ー領域に存在するＢａｍＨＩ認識部位で切断し、トリプ
トファンオペロン由来のＤＮＡ配列の下流にアルカリ性
ホスファターゼシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列が連結した構造を含むＤＮＡ断片を得た。一方、ｐＡ
Ｔ−ｔｒｐ−ｔＨＳＡを旧ｎｄｌｌ［で切断後、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩで処理し一本鎖部分を埋め、さらにＢａ
ｍＨＩで切断することにより短縮Ｈ３ＡをコードするＤ
ＮＡ配列を切り出した。これら２つのＤＮＡ断片を連結
し、アルカリ性ホスファターゼシグナルペプチドと短縮
Ｈ３ＡがＢａｍＨ■認識配列ＧＧＡＴＣＣによりコード
されるＧｌｙ−Ｓｅｔのジペプチドからなるスペーサー
にはさまれた形の融合タンパク質ｐｈｏＡ−ｔＨＳＡを
発現する組換えプラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−
ｔＨＳＡを構築した。 ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｔ
ｌ（ＳＡプラスミドを大腸菌ＨＢＩＯＩに形質転換法に
より導入し大腸菌）ＩＢＩＯＩ （ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐ
ｈｏＡ−ｔＨ９＾）を得た。この大腸菌は微工研菌寄第
１０９５１号（ＦＥＲ？’Ｉ Ｐ−１０５１）として工
業技術院微生物工業技術研究所に委託されている。
アルカリ性ホスファターゼシグナルペプチドとＳＡＬ
ｎの融合タンパク質を発現するための組換えプラスミド
ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏ＾−３ＡＬ ＩＩをＳＡＬ Ｉ
ｆ ＤＮＡ配列の下流に存在するＳＡＬ Ｉ ！！識部
位で切断し開環した後、末端を大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩで処理し、−本鎖部分を埋めた０次にアルカリ性ホ
スファターゼシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
とＳＡＬ ＩＩをコードするＤＮＡ配列の間のスペーサ
ー領域に存在するＢａｍＨＩ認識部位で切断し、トリプ
トファンオペロン由来のＤＮＡ配列の下流にアルカリ性
ホスファターゼシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列が連結した構造を含むＤＮＡ断片を得た。一方、ｐＡ
Ｔ−ｔｒｐ−ｔＨＳＡを旧ｎｄｌｌ［で切断後、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩで処理し一本鎖部分を埋め、さらにＢａ
ｍＨＩで切断することにより短縮Ｈ３ＡをコードするＤ
ＮＡ配列を切り出した。これら２つのＤＮＡ断片を連結
し、アルカリ性ホスファターゼシグナルペプチドと短縮
Ｈ３ＡがＢａｍＨ■認識配列ＧＧＡＴＣＣによりコード
されるＧｌｙ−Ｓｅｔのジペプチドからなるスペーサー
にはさまれた形の融合タンパク質ｐｈｏＡ−ｔＨＳＡを
発現する組換えプラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−
ｔＨＳＡを構築した。 ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｔ
ｌ（ＳＡプラスミドを大腸菌ＨＢＩＯＩに形質転換法に
より導入し大腸菌）ＩＢＩＯＩ （ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐ
ｈｏＡ−ｔＨ９＾）を得た。この大腸菌は微工研菌寄第
１０９５１号（ＦＥＲ？’Ｉ Ｐ−１０５１）として工
業技術院微生物工業技術研究所に委託されている。
ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｍＨ３Ａ ５ｐＡＴ−ｔｒ
ｐ−ｔＨ３Ａ又番よｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｔＨＳ
Ａを保有する大腸菌による大腸菌アルカリ性ホスファタ
ーゼのシグナルペプチドとヒト血清アルブミン断片の融
合蛋白質又は短縮型ヒト血清アルブミンＡ断片を単独で
次のようにして発現させた。
ｐ−ｔＨ３Ａ又番よｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｔＨＳ
Ａを保有する大腸菌による大腸菌アルカリ性ホスファタ
ーゼのシグナルペプチドとヒト血清アルブミン断片の融
合蛋白質又は短縮型ヒト血清アルブミンＡ断片を単独で
次のようにして発現させた。
竺−１
ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−＋５Ｈ５Ａ ５ｐＡＴ−ｔ
ｒｐ−ｔＨＳＡ又はｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｔＨＳ
Ａを持つ大腸菌８８１０１株を５ｊｄの、アンピシリン
を２５Ｒ／ｄ含むルリア（ＬＢ）培地（バタトトリプト
ン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣ１０，５％）に接
種し、３７℃１８時間振とう培養する。この培養液０．
２ ｍをアンピシリンを２５眉／−含む５ｄのＭ９−
ＣＡ培地（ＮａｚＨＰＯｎ ０．６％、 ＫＨｘＰＯ４
０，３％、ＮａＣ１０，５％、 ＮＨ４Ｃｊ！ ０．１
％、ＣａＣｊ！ｚＯ，１ｓＭ＋ Ｍｇ５Ｏａ ２１１Ｌ
カザミノ酸０．８％）に接種し、３０分３７℃で培養し
た後、誘導物質であ４３−β−インドールアクリル酸（
ＩＡＡ）を２０ｇ／ａｄとなるよう加えた。さらに３７
℃で５〜７時間振とう培養を行った。
ｒｐ−ｔＨＳＡ又はｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｔＨＳ
Ａを持つ大腸菌８８１０１株を５ｊｄの、アンピシリン
を２５Ｒ／ｄ含むルリア（ＬＢ）培地（バタトトリプト
ン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣ１０，５％）に接
種し、３７℃１８時間振とう培養する。この培養液０．
２ ｍをアンピシリンを２５眉／−含む５ｄのＭ９−
ＣＡ培地（ＮａｚＨＰＯｎ ０．６％、 ＫＨｘＰＯ４
０，３％、ＮａＣ１０，５％、 ＮＨ４Ｃｊ！ ０．１
％、ＣａＣｊ！ｚＯ，１ｓＭ＋ Ｍｇ５Ｏａ ２１１Ｌ
カザミノ酸０．８％）に接種し、３０分３７℃で培養し
た後、誘導物質であ４３−β−インドールアクリル酸（
ＩＡＡ）を２０ｇ／ａｄとなるよう加えた。さらに３７
℃で５〜７時間振とう培養を行った。
不」ｊＪＵｂゴ１匿
上記のように培養した培養液を７００Ｏｒｐｍ 、５分
遠心し、集菌した。沈殿した菌体を２０％シ日糖、２５
５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ！ （ｐＨ７，５）
、 １０５Ｍ Ｉ！ＤＴ＾ 、 １ｍＭＰＭＳＦ
（ふう化フェニルメチルスルホニル）に再浮遊させ、卵
白リゾチームを０．２■／ｄ加えた。３７”Ｃ１５分静
置することにより、外膜が消化され、プロトプラスト
（スフェロプラスト）が得られた。
遠心し、集菌した。沈殿した菌体を２０％シ日糖、２５
５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ！ （ｐＨ７，５）
、 １０５Ｍ Ｉ！ＤＴ＾ 、 １ｍＭＰＭＳＦ
（ふう化フェニルメチルスルホニル）に再浮遊させ、卵
白リゾチームを０．２■／ｄ加えた。３７”Ｃ１５分静
置することにより、外膜が消化され、プロトプラスト
（スフェロプラスト）が得られた。
この浮遊液を水中に移し、冷却した後、１１００００ｒ
ｐ、１０分遠心し、スフェロプラストを沈殿させた。こ
のスフェロプラストを２０％０％シラ〔２５鴎Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５） 、１０ａ＋Ｍ ＥＤ
ＴＡ中〕に再浮遊させ、水浴中でポリトロンホモゲナイ
ザ−（ダイアル値：８）により破砕した。４℃において
破砕液を１５．００Ｏｒｐｍ、２０分遠心し、菌体残香
を得た。この菌体残香を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ
（ｐＨ７，５３に再浮遊させ、４℃において浮遊液を
１５．００Ｏｒｐｍ 、 ２０分遠心した。
ｐ、１０分遠心し、スフェロプラストを沈殿させた。こ
のスフェロプラストを２０％０％シラ〔２５鴎Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５） 、１０ａ＋Ｍ ＥＤ
ＴＡ中〕に再浮遊させ、水浴中でポリトロンホモゲナイ
ザ−（ダイアル値：８）により破砕した。４℃において
破砕液を１５．００Ｏｒｐｍ、２０分遠心し、菌体残香
を得た。この菌体残香を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ
（ｐＨ７，５３に再浮遊させ、４℃において浮遊液を
１５．００Ｏｒｐｍ 、 ２０分遠心した。
この操作をさらにもう一回行い、得られた沈澱を不溶性
画分として得た。
画分として得た。
５ＤＳ−ボ アク ルアミ °ル
ｌ）菌体総蛋白質の分析
培養液０．５１ｄを７００Ｏｒｐｍ 、 ５分遠心し、
集菌した。菌体を１０４の５ＤＳ−サンプル液（６２，
５ｓＭＴｒｉｓ−ＨＣｆｆｉ （ｐＨ６，８） 、２
％ＳＯＳ、１０％ショ糖、５％２−メルカプトエダノー
ル〕に浮遊させ、１００℃５分処理した。これを分離ゲ
ル濃度ｌＯ％あ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｌａ
ｅｎ＋ｍｌｉの方法： Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）
２７７．６８０（１９７０） ）にアプライし、電気泳
動を行った。
集菌した。菌体を１０４の５ＤＳ−サンプル液（６２，
５ｓＭＴｒｉｓ−ＨＣｆｆｉ （ｐＨ６，８） 、２
％ＳＯＳ、１０％ショ糖、５％２−メルカプトエダノー
ル〕に浮遊させ、１００℃５分処理した。これを分離ゲ
ル濃度ｌＯ％あ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｌａ
ｅｎ＋ｍｌｉの方法： Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）
２７７．６８０（１９７０） ）にアプライし、電気泳
動を行った。
２）不溶性画分の分析
残香を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐｆ１７．
５ ）に再浮遊させ、一部をとり、５ＤＳ−サンプル液
で希釈した。
５ ）に再浮遊させ、一部をとり、５ＤＳ−サンプル液
で希釈した。
１００℃５分処理することにより、不溶蛋白質を可溶化
させ、ゲル電気泳動を行った。
させ、ゲル電気泳動を行った。
３）染色及び脱色
泳動終了後、ゲルは染色液（クマシーブリリアント・ブ
ルー０．２５％、エタノール４５％、酢酸１０％）に３
０分間〜１時間浸し、染色した。染色されたゲルは脱色
液（メタノール５％、酢酸１０％）を満たした脱色装置
（バイオラッド社製、モデル５５６型）に移し、脱色し
た。
ルー０．２５％、エタノール４５％、酢酸１０％）に３
０分間〜１時間浸し、染色した。染色されたゲルは脱色
液（メタノール５％、酢酸１０％）を満たした脱色装置
（バイオラッド社製、モデル５５６型）に移し、脱色し
た。
ウェス −ンブロ トと −
３ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動終了後、ゲル
をガラス板よりはずした。ゲルサイズに切断したニトロ
セルロースフィルター（Ｂｉｏ−ｒａｄ。
をガラス板よりはずした。ゲルサイズに切断したニトロ
セルロースフィルター（Ｂｉｏ−ｒａｄ。
Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔｌ［ｅ ） 、及びワットマン社
製３聞濾紙（２枚）をプロッティング液（０，３％Ｔｒ
ｉｓ、１．４４％グリシン、２０％メタノール）に浸し
た。プロッティング液であらかじめ浸したスコッチ・パ
ッド上に濾紙、ゲル、フィルター、濾紙の順に重ね合わ
せ、スコッチパッドではさみ、プロッティング装置（Ｔ
ＥＦＣＯ社製、Ｍｏｄｅｌ：ＴＣ−８０８）にセットし
た。プロッティング液をみたし、２００−＾、１時間電
気泳動を行った。
製３聞濾紙（２枚）をプロッティング液（０，３％Ｔｒ
ｉｓ、１．４４％グリシン、２０％メタノール）に浸し
た。プロッティング液であらかじめ浸したスコッチ・パ
ッド上に濾紙、ゲル、フィルター、濾紙の順に重ね合わ
せ、スコッチパッドではさみ、プロッティング装置（Ｔ
ＥＦＣＯ社製、Ｍｏｄｅｌ：ＴＣ−８０８）にセットし
た。プロッティング液をみたし、２００−＾、１時間電
気泳動を行った。
泳動終了後、フィルターをゲルからはがし、ＴＢＳ液
（２５ｍ？Ｉ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，
５） 、 ０．５ ＭＮａＣｌ ）で１０分処理した
。３％ゼラチン入りのＴＢＳ液で３０分処理した後、フ
ィルターを０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０の入ったＴＢ
Ｓ液（ＴＴＢＳ液と以下略す）に移し、５分処理し、さ
らに同操作をくり返した。
（２５ｍ？Ｉ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，
５） 、 ０．５ ＭＮａＣｌ ）で１０分処理した
。３％ゼラチン入りのＴＢＳ液で３０分処理した後、フ
ィルターを０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０の入ったＴＢ
Ｓ液（ＴＴＢＳ液と以下略す）に移し、５分処理し、さ
らに同操作をくり返した。
抗ヒトアルブミン−ウサギ血清のＩｇＧ画分（カッベル
社製）を１％ゼラチン入りのＴＴＢＳ液で２０００倍に
希釈し、この液中にフィルターを浸し、２〜１８時間処
理した０次に、フィルターをＴＴＢＳ液中に移し５分処
理した。この操作をさらに２回行った。
社製）を１％ゼラチン入りのＴＴＢＳ液で２０００倍に
希釈し、この液中にフィルターを浸し、２〜１８時間処
理した０次に、フィルターをＴＴＢＳ液中に移し５分処
理した。この操作をさらに２回行った。
抗つサギＩｇＧ−ヤギー西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ
標識抗体（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を１％ゼラチン含有の
ＴＴＢＳ液で３０００倍に希釈した液中にフィルターを
移し、２時間処理した。同処理後、フィルターをＴＴＢ
Ｓ液で２回、ＴＢＳ液で１回、それぞれ５分間洗った。
標識抗体（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を１％ゼラチン含有の
ＴＴＢＳ液で３０００倍に希釈した液中にフィルターを
移し、２時間処理した。同処理後、フィルターをＴＴＢ
Ｓ液で２回、ＴＢＳ液で１回、それぞれ５分間洗った。
０．０１５％ｎ、ｏｘ、 ０．０５％ＨＲＰカラー
デベロップメント・リージェント（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）
、１６．７％メタノール含有のＴＢＳ液にフィルターを
浸し、１５分反応させた０次に、フィルターを水につけ
３０分放置した。抗ヒト・アルブミン抗体と交差する物
がある所は、濃い紫色に発色した（第１２図）０分子量
約３７０００の位置にｐｈｏＡ−ｗ＋Ｈ５Ａ 、分子量
的４９０００の位置に短縮形ＩＳＡ、そして分子量的５
１０００の位置にｐｈｏＡ−ｔＨＳ＾、のそれぞれに相
当する抗ヒト血清アルブミン抗体と交差反応する発現生
成物が認められた。
デベロップメント・リージェント（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）
、１６．７％メタノール含有のＴＢＳ液にフィルターを
浸し、１５分反応させた０次に、フィルターを水につけ
３０分放置した。抗ヒト・アルブミン抗体と交差する物
がある所は、濃い紫色に発色した（第１２図）０分子量
約３７０００の位置にｐｈｏＡ−ｗ＋Ｈ５Ａ 、分子量
的４９０００の位置に短縮形ＩＳＡ、そして分子量的５
１０００の位置にｐｈｏＡ−ｔＨＳ＾、のそれぞれに相
当する抗ヒト血清アルブミン抗体と交差反応する発現生
成物が認められた。
正常ヒト血清アルブミンＡｃＤＮＡを含むクローンのプ
ラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングの
ため米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のλｇｔｌｌをベクターと
して作成されたヒト肝ｃＤＮＡライブラリィ−を用いた
。λｇｔｌ１組換え体ファージを大腸菌Ｙ １０９Ｇを
宿主として感染させ、形質転換プラーク合計５．５Ｘ１
Ｇ’個をＬＢ寒天培地（ルリア培地＋１．５％寒天）上
に形成させ組換えＤＮＡをメンブランフィルタ−（＾ｍ
ｅｒｓｈａ−社Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）に移した後、ａｓｐ
放射性同位元素で標識した合成オリゴヌクレオチド３種
（比活性≧１０’ｃｐｓ／ｎ）をプローブとして用いス
クリーニングした（Ｂｅｎｔｏｎ ＆ ＤａｖｉｓＳｃ
ｉｅｎｃｅ ■鉦、 １８０−１８２（１９７７） ）
、この３種のプローブは各々Ｌａｗｎら （Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ ９ ＋６１０３−６１１
４（１９８１）によって報告されたヒト血清アルブミン
ｃＤＮＡの配列のうち５′非翻訳領域（翻訳開始のＡＴ
Ｇコドンより１２ヌクレオチド上流からＡＴＧコドンの
前のヌクレオチドまでの部分）と翻訳領域（アミノ末端
のメチオニンコドンすなわちＡＴＧより９番目のアミノ
酸ロイシンをコードする部分）を含むもの（Ｉ（ＳＡ−
１）、２４８番目のグリシンから２６０番目のロイシン
をコードするもの（ＩＳＡ−２）、並びに５７６番目の
バリンからカルボキシル末端５８５番目のロイシンをコ
ードする部分とそれに続（６ヌクレオチドから成る３′
−非翻訳領域を含むもの（ｌｆｓＡ−３）と同じ配列で
ある。これらのプローブの塩基配列を第５図に示す、こ
のプローブの合成は自動ＤＮＡシンセサイザーにより行
い、標識は〔γ−”Ｐ）ＡＴＰとポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて行った。 ｌ５Ａ−２で陽性のシグナルを
与えた２００個のλｇｔｌｌクローンのうち４個のクロ
ーンからＤＮＡを調製（Ｂｌａｔｔｎｅｒら５ｃｉｅｎ
ｃｅ 匪＋１２７９−１２８４（１９７８）） Ｌ、こ
れをＥｃｏＲｌ酵素で消化し、消化物のサザーンプロッ
トをｌ５Ａ−２プローブとハイブリダイズさせた（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ、Ｂ、、Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ。
ラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングの
ため米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のλｇｔｌｌをベクターと
して作成されたヒト肝ｃＤＮＡライブラリィ−を用いた
。λｇｔｌ１組換え体ファージを大腸菌Ｙ １０９Ｇを
宿主として感染させ、形質転換プラーク合計５．５Ｘ１
Ｇ’個をＬＢ寒天培地（ルリア培地＋１．５％寒天）上
に形成させ組換えＤＮＡをメンブランフィルタ−（＾ｍ
ｅｒｓｈａ−社Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）に移した後、ａｓｐ
放射性同位元素で標識した合成オリゴヌクレオチド３種
（比活性≧１０’ｃｐｓ／ｎ）をプローブとして用いス
クリーニングした（Ｂｅｎｔｏｎ ＆ ＤａｖｉｓＳｃ
ｉｅｎｃｅ ■鉦、 １８０−１８２（１９７７） ）
、この３種のプローブは各々Ｌａｗｎら （Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ ９ ＋６１０３−６１１
４（１９８１）によって報告されたヒト血清アルブミン
ｃＤＮＡの配列のうち５′非翻訳領域（翻訳開始のＡＴ
Ｇコドンより１２ヌクレオチド上流からＡＴＧコドンの
前のヌクレオチドまでの部分）と翻訳領域（アミノ末端
のメチオニンコドンすなわちＡＴＧより９番目のアミノ
酸ロイシンをコードする部分）を含むもの（Ｉ（ＳＡ−
１）、２４８番目のグリシンから２６０番目のロイシン
をコードするもの（ＩＳＡ−２）、並びに５７６番目の
バリンからカルボキシル末端５８５番目のロイシンをコ
ードする部分とそれに続（６ヌクレオチドから成る３′
−非翻訳領域を含むもの（ｌｆｓＡ−３）と同じ配列で
ある。これらのプローブの塩基配列を第５図に示す、こ
のプローブの合成は自動ＤＮＡシンセサイザーにより行
い、標識は〔γ−”Ｐ）ＡＴＰとポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて行った。 ｌ５Ａ−２で陽性のシグナルを
与えた２００個のλｇｔｌｌクローンのうち４個のクロ
ーンからＤＮＡを調製（Ｂｌａｔｔｎｅｒら５ｃｉｅｎ
ｃｅ 匪＋１２７９−１２８４（１９７８）） Ｌ、こ
れをＥｃｏＲｌ酵素で消化し、消化物のサザーンプロッ
トをｌ５Ａ−２プローブとハイブリダイズさせた（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ、Ｂ、、Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ。
５０３−５１７（１９７５） ） 、ハイブリダイズし
たフラグメントは３つのクローンから得られ各々１．８
ｋｂ 。
たフラグメントは３つのクローンから得られ各々１．８
ｋｂ 。
１．４ｋｂ、 １．３ｋｂの長さであった。このうち１
．８ ｋｂと１．３ｋｂの長さのフラグメントをｐｕｃ
１９ベクターにサブクローニングした。このサブクロ
ーンをｌ５Ａ−１とｌ５Ａ−３を各々プローブとしてコ
ロニーハイブリダイゼーション（Ｇｒｕｌｓｔｅｉｎお
よびＨｏｇｎｅｓｓＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ７２．３９６１−３９６５（１９７５）
）によりスクリーンした。この結果Ｏ５＾−３のみにハ
イブリダイズするクローンλｇｔｌｌ（ｌ３Ａ Ｉ−Ａ
）が得られた。このクローンの各種ＤＮＡ断片を塩基配
列決定用ベクターＭ１３ｓ＋ｐ１８およびｎ＋ｐ１９
ＲＦ−ＤＮＡ上に移し、グイデオキシヌクレオチドター
ミネーション法（ＳａｎｇｅｒＪ、＋Ｎ１ｃｋｌｅｎ＋
Ｓ、およびＣｏｕｌａｏｎ、＾、Ｒ０Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１ＩＳＡ７４．５４６３−５４
６７（１９７７） ）により塩基配列を決定した。一方
Ｉｓ＾−２をプローブとして行ったλｇｔｌｌクローン
のプラークハイブリダイゼーションにおいて陽性のシグ
ナルを与えたクローンのうち２０個についてｌ５Ａ−１
をプローブとして再びプラークハイブリダイゼーション
を行い、１個の陽性のシグナルを与えるクローンλｇｔ
ｌｌ（ＩＳＡ−Ｉｔ ）を得た。これからファージＤＮ
Ａを調製しＥｃｏＲＩ消化物についてｌ３Ａ−１をプロ
ーブとして用いサザーンハイプリダイゼーシッンを行い
１．２５ｋｂのフラグメント（ｌ５Ａ−■）がプローブ
とハイブリダイズすることを確認した。このフラグメン
トの塩基配列をダイデオキシヌクレオチドターミネーシ
ッン法で決定した。ＵＳＡ−ＩｔはＵＳＡ−３プローブ
とはハイブリダイズしなかった。この結果１（ＳＡ−Ｉ
Ｉはカルボキシル末端側をコードする部分を欠き、ｌ５
Ａ−１−Ａはヒト血清アルブミンのアミノ末端側をコー
ドする部分を欠き、さらに３０４番目のセリンをコード
するコドン（ＴＣＡ）が翻訳終止コドンのオパールコド
ンＴＧＡに変化していることがわかった。この２つのＤ
ＮＡフラグメントの制限酵素地図を第６図に示す、酵素
認識サイトの正確な位置は最終的な塩基配列から得た。
．８ ｋｂと１．３ｋｂの長さのフラグメントをｐｕｃ
１９ベクターにサブクローニングした。このサブクロ
ーンをｌ５Ａ−１とｌ５Ａ−３を各々プローブとしてコ
ロニーハイブリダイゼーション（Ｇｒｕｌｓｔｅｉｎお
よびＨｏｇｎｅｓｓＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ７２．３９６１−３９６５（１９７５）
）によりスクリーンした。この結果Ｏ５＾−３のみにハ
イブリダイズするクローンλｇｔｌｌ（ｌ３Ａ Ｉ−Ａ
）が得られた。このクローンの各種ＤＮＡ断片を塩基配
列決定用ベクターＭ１３ｓ＋ｐ１８およびｎ＋ｐ１９
ＲＦ−ＤＮＡ上に移し、グイデオキシヌクレオチドター
ミネーション法（ＳａｎｇｅｒＪ、＋Ｎ１ｃｋｌｅｎ＋
Ｓ、およびＣｏｕｌａｏｎ、＾、Ｒ０Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１ＩＳＡ７４．５４６３−５４
６７（１９７７） ）により塩基配列を決定した。一方
Ｉｓ＾−２をプローブとして行ったλｇｔｌｌクローン
のプラークハイブリダイゼーションにおいて陽性のシグ
ナルを与えたクローンのうち２０個についてｌ５Ａ−１
をプローブとして再びプラークハイブリダイゼーション
を行い、１個の陽性のシグナルを与えるクローンλｇｔ
ｌｌ（ＩＳＡ−Ｉｔ ）を得た。これからファージＤＮ
Ａを調製しＥｃｏＲＩ消化物についてｌ３Ａ−１をプロ
ーブとして用いサザーンハイプリダイゼーシッンを行い
１．２５ｋｂのフラグメント（ｌ５Ａ−■）がプローブ
とハイブリダイズすることを確認した。このフラグメン
トの塩基配列をダイデオキシヌクレオチドターミネーシ
ッン法で決定した。ＵＳＡ−ＩｔはＵＳＡ−３プローブ
とはハイブリダイズしなかった。この結果１（ＳＡ−Ｉ
Ｉはカルボキシル末端側をコードする部分を欠き、ｌ５
Ａ−１−Ａはヒト血清アルブミンのアミノ末端側をコー
ドする部分を欠き、さらに３０４番目のセリンをコード
するコドン（ＴＣＡ）が翻訳終止コドンのオパールコド
ンＴＧＡに変化していることがわかった。この２つのＤ
ＮＡフラグメントの制限酵素地図を第６図に示す、酵素
認識サイトの正確な位置は最終的な塩基配列から得た。
１考ｔｉ −スミ゛ＵＣ−ＯＡの
大腸菌アルカリ性ホスファターゼのシグナルペプチドを
コードする化学合成りＮＡ配列を含むプラスミドｐＵｃ
−ｐｈｏＡを次の様にして作製した。
コードする化学合成りＮＡ配列を含むプラスミドｐＵｃ
−ｐｈｏＡを次の様にして作製した。
大腸菌アルカリ性ホスファターゼのシグナルペプチドを
コードする下記の塩基配列を有するＤＮＡ断片を化学合
成フラグメントから構築した。
コードする下記の塩基配列を有するＤＮＡ断片を化学合
成フラグメントから構築した。
両末端側のＥｃｏＲＩ認識配列はＰＵＣ系プラスミドの
ＥｃｏＲＩサイトに挿入するために設けられ、Ｈｐａ
ＩＩ認識配列は後にｌ５Ａ−Ａ成熟遺伝子を融合させる
ために設けられ、そしてＮａｅ Ｉ ２２識配列はシグ
ナルペプチドを構成する最後のアミノ酸（２１番目のア
ラニン）をコードするコドンの直後で当該制限酵素で切
断されて平滑末端を残し、これと成熟タンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列とを直接融合できるようにするために
設けられた。７２ヌクレオチドから成るＤＮＡ１ｉ２本
はＣａｒｕｔｈｅｒｓら（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ、［
）、ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ、Ｈ，Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ ２１．７１９（１９８０
））により開発されたホスホアミダイト法を応用した自
動ＤＮＡ合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
モデル３８０Ｂ）を用いて合成された０合成されたＤＮ
Ａｔｌｌ［はたとえば５０ｓ？Ｉ Ｔｒｉｓ −ＨＣ
ｊ！（ｐＨ７，６） 、１０ｓ＋Ｍ ＭｇＣｊ！ｚ 、
５ｍＭジチオスライトール及び０．２閣ＨのＡＴＰを含
有する溶液（５０ｉ１１）中で両方のＤＮＡ鎖の各々の
分量（２１ｐｓｏｌｅｓ）を６単位のＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（宝酒造株式会社）存在下で３７°Ｃ１６
０分処理することにより５′端をリン酸化した。
ＥｃｏＲＩサイトに挿入するために設けられ、Ｈｐａ
ＩＩ認識配列は後にｌ５Ａ−Ａ成熟遺伝子を融合させる
ために設けられ、そしてＮａｅ Ｉ ２２識配列はシグ
ナルペプチドを構成する最後のアミノ酸（２１番目のア
ラニン）をコードするコドンの直後で当該制限酵素で切
断されて平滑末端を残し、これと成熟タンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列とを直接融合できるようにするために
設けられた。７２ヌクレオチドから成るＤＮＡ１ｉ２本
はＣａｒｕｔｈｅｒｓら（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ、［
）、ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ、Ｈ，Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ ２１．７１９（１９８０
））により開発されたホスホアミダイト法を応用した自
動ＤＮＡ合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
モデル３８０Ｂ）を用いて合成された０合成されたＤＮ
Ａｔｌｌ［はたとえば５０ｓ？Ｉ Ｔｒｉｓ −ＨＣ
ｊ！（ｐＨ７，６） 、１０ｓ＋Ｍ ＭｇＣｊ！ｚ 、
５ｍＭジチオスライトール及び０．２閣ＨのＡＴＰを含
有する溶液（５０ｉ１１）中で両方のＤＮＡ鎖の各々の
分量（２１ｐｓｏｌｅｓ）を６単位のＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（宝酒造株式会社）存在下で３７°Ｃ１６
０分処理することにより５′端をリン酸化した。
上記のリン酸化された２本のＤＮＡ鎖を含む溶液を混ぜ
（計１００ｍ）１００°Ｃの水浴に入れ、ついで室温で
放冷してアニーリングを行った。アニールした２本鎖リ
ン酸化ＤＮＡをｐｕｃ １９プラスミドに組み込む際に
、当該ＤＮＡが組み込まれた組換えプラスミドを得る確
率を高めるために、ベクターであるｐｕｃ １９プラス
ミドをＥｃｏＲＩで切断後５′末端のリン酸基を除去す
ることによりＤＮＡリガーゼ処理により再結合が起こる
可能性を極力下げることができる。ｌｘのｐｕｃ １９
ＯＮＡを含む溶液２０１１Ｉ（５０ｍＭ ＮａＣｊ
、 １００ｓ＋Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣｊ！
（ｐＨ７，５） 、 ７醜ＭＭｇＣ１，！、８単
位のＨｃｏＲＩにッポンジーン））を３７℃、６０分処
理することにより、直鎖状のベクターＤＮＡを得た。こ
の反応溶液を９０℃、５分処理し制限酵素を不活性化し
た後ａｇｏを３８ｄ、バクテリアアルカリ性ホスファタ
ーゼ１単位（宝酒造株式会社）を加えて計６０１１１と
し、３７℃、６０分処理した。この溶液をフェノール処
理し、得られた水相をエタノール沈澱に供した。エタノ
ール沈澱物は凍結乾燥して次の反応に用いた。
（計１００ｍ）１００°Ｃの水浴に入れ、ついで室温で
放冷してアニーリングを行った。アニールした２本鎖リ
ン酸化ＤＮＡをｐｕｃ １９プラスミドに組み込む際に
、当該ＤＮＡが組み込まれた組換えプラスミドを得る確
率を高めるために、ベクターであるｐｕｃ １９プラス
ミドをＥｃｏＲＩで切断後５′末端のリン酸基を除去す
ることによりＤＮＡリガーゼ処理により再結合が起こる
可能性を極力下げることができる。ｌｘのｐｕｃ １９
ＯＮＡを含む溶液２０１１Ｉ（５０ｍＭ ＮａＣｊ
、 １００ｓ＋Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣｊ！
（ｐＨ７，５） 、 ７醜ＭＭｇＣ１，！、８単
位のＨｃｏＲＩにッポンジーン））を３７℃、６０分処
理することにより、直鎖状のベクターＤＮＡを得た。こ
の反応溶液を９０℃、５分処理し制限酵素を不活性化し
た後ａｇｏを３８ｄ、バクテリアアルカリ性ホスファタ
ーゼ１単位（宝酒造株式会社）を加えて計６０１１１と
し、３７℃、６０分処理した。この溶液をフェノール処
理し、得られた水相をエタノール沈澱に供した。エタノ
ール沈澱物は凍結乾燥して次の反応に用いた。
脱リン酸化されたｐｕｃ １９ベクター（３０ｎｇ）と
シグナルペプチドをコードするリン酸化２本！１ Ｄ
ＮＡ （１０ｎｇ）を２．８単位のＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造）を含む計３０Ｉ１１の反応溶液（６６ｍＭ
Ｔｒｉｓ ・ＨＣｆｆｉ （ｐＨ７、６） 、６
．６ｓｅＭ ＭｇＣ１富、 １０＋ｇｌｌジチオスライ
トール、１ｍＭＡＹＰ）中で１５℃、４時間処理し組換
えプラスミドを得た。この反応液の１０Ｉを宿主菌の大
腸菌ＴＢ−１株を形質転換するのに用いた。
シグナルペプチドをコードするリン酸化２本！１ Ｄ
ＮＡ （１０ｎｇ）を２．８単位のＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造）を含む計３０Ｉ１１の反応溶液（６６ｍＭ
Ｔｒｉｓ ・ＨＣｆｆｉ （ｐＨ７、６） 、６
．６ｓｅＭ ＭｇＣ１富、 １０＋ｇｌｌジチオスライ
トール、１ｍＭＡＹＰ）中で１５℃、４時間処理し組換
えプラスミドを得た。この反応液の１０Ｉを宿主菌の大
腸菌ＴＢ−１株を形質転換するのに用いた。
形質転換に用いる感受性大腸菌細胞はたとえば塩化カル
シウム法０１ａｎｄｅｌＪ、及びＨｉｇａ＋Ａ、、Ｊ、
Ｍｏｌ。
シウム法０１ａｎｄｅｌＪ、及びＨｉｇａ＋Ａ、、Ｊ、
Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、 ５３．１５９−１６２（１９７０））によ
り作成される。具体的には大腸菌（たとえばＴＯ−１株
）の−晩培養液〔天然培地中、たとえばルリア（ＬＢ）
培地〕を同じ培地で１００倍希釈し、００６００が０．
６になるまで３７℃で振とう培養し１．５ ｄを５．０
０Ｏｒｐｍ、 ５分遠心して集菌した。これを７５０Ｉ
の５０ａｅＭ ＣａＣｌ 、に懸濁し、氷上に２０分放
置した後遠心により集菌した。得られた沈澱を１００ｍ
の５０＋ｓＭ ＣａＣｌ ｚに再懸濁し、前記のＤＮＡ
リガーゼ反応液を加え、氷上に４０分放置した。４２℃
で１分保温した後、ｌｄのＬＢ培地を加え、３７℃で３
０分保温した。このうち０、１ ｍを２５ｘ／ａｄ、ア
ンピシリンを含むＸ−Ｇａ１寒天培地（５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド１５
５■、トリプトン１０ｇ、 ＭａｃｌＢ ｇ、 Ｄｉ
ｒｃｏ寒天１２ｇを水１２に溶かしｐＨを７．４にした
もの）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。寒天上に生
じたコロニーのうち白色を呈するコロニーを選抜し、新
しい寒天培地に移し、−晩保温した。その寒天培地から
菌体を一白金耳とり、ＬＢ培地に移し、−晩培養液を作
成した。
り作成される。具体的には大腸菌（たとえばＴＯ−１株
）の−晩培養液〔天然培地中、たとえばルリア（ＬＢ）
培地〕を同じ培地で１００倍希釈し、００６００が０．
６になるまで３７℃で振とう培養し１．５ ｄを５．０
０Ｏｒｐｍ、 ５分遠心して集菌した。これを７５０Ｉ
の５０ａｅＭ ＣａＣｌ 、に懸濁し、氷上に２０分放
置した後遠心により集菌した。得られた沈澱を１００ｍ
の５０＋ｓＭ ＣａＣｌ ｚに再懸濁し、前記のＤＮＡ
リガーゼ反応液を加え、氷上に４０分放置した。４２℃
で１分保温した後、ｌｄのＬＢ培地を加え、３７℃で３
０分保温した。このうち０、１ ｍを２５ｘ／ａｄ、ア
ンピシリンを含むＸ−Ｇａ１寒天培地（５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド１５
５■、トリプトン１０ｇ、 ＭａｃｌＢ ｇ、 Ｄｉ
ｒｃｏ寒天１２ｇを水１２に溶かしｐＨを７．４にした
もの）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。寒天上に生
じたコロニーのうち白色を呈するコロニーを選抜し、新
しい寒天培地に移し、−晩保温した。その寒天培地から
菌体を一白金耳とり、ＬＢ培地に移し、−晩培養液を作
成した。
１、５１ｄの一晩培養液を遠心して集菌し、プラスミド
ＤＮＡのミニプレパレーシッンを常法（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８２）により行っ
た。得られたプラスミドＤＮＡを適当な制限酵素（たと
えばＥｃｏＲＩ 、Ｎａｅ Ｉ 、 Ｈｐａ Ｉｆなど
の挿入された合成りＮＡ配列に含まれる認識配列を切断
するものやｐｕｃ １９ベクター中に存在する認識配列
を切断するもの、たとえばＰｖｕｌ 、Ｂｇｊ！ Ｉ
。
ＤＮＡのミニプレパレーシッンを常法（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８２）により行っ
た。得られたプラスミドＤＮＡを適当な制限酵素（たと
えばＥｃｏＲＩ 、Ｎａｅ Ｉ 、 Ｈｐａ Ｉｆなど
の挿入された合成りＮＡ配列に含まれる認識配列を切断
するものやｐｕｃ １９ベクター中に存在する認識配列
を切断するもの、たとえばＰｖｕｌ 、Ｂｇｊ！ Ｉ
。
Ｓｓｐ Ｉなど及びこれらの組合せ）で切断し、アガロ
ース及びポリアクリルアミドゲル電気泳動により、挿入
ＤＮＡの長さを調べ、適切な挿入ＤＮＡを含む組換えプ
ラスミドを同定した。この挿入ＤＮＡを含むＤＮＡフラ
グメントをＭ１３ｓｐ系ファージＤＮＡに再度組込み、
ジデオキシ法（ＳａｎｇｅｒｔＦ、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ
及びＣｏｒｌｓｏｎ＋ Ａ、 Ｒ，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ。
ース及びポリアクリルアミドゲル電気泳動により、挿入
ＤＮＡの長さを調べ、適切な挿入ＤＮＡを含む組換えプ
ラスミドを同定した。この挿入ＤＮＡを含むＤＮＡフラ
グメントをＭ１３ｓｐ系ファージＤＮＡに再度組込み、
ジデオキシ法（ＳａｎｇｅｒｔＦ、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ
及びＣｏｒｌｓｏｎ＋ Ａ、 Ｒ，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＩＪ、Ｓ、Ａ、７４．５４６３−１５６４＜１
９７７））によってヌクレオチド配列を決定し、最終的
に目的とするｐＵｃ・ｐｈｏＡプラスミドを同定した。
９７７））によってヌクレオチド配列を決定し、最終的
に目的とするｐＵｃ・ｐｈｏＡプラスミドを同定した。
皇ｍ ブースミ ＵＣ−ｈｏＡ−ＵＳＡ−Ａの（第
７−１図−第７−２図） 大腸面アルカリ性ホスファターゼ（ｐｈｏＡ）のシグナ
ルペプチドと正常ヒト血清アルブミンＡが融合したタン
パク賞をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＵｃ−ｐ
ｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａを次の様にして作製した。
７−１図−第７−２図） 大腸面アルカリ性ホスファターゼ（ｐｈｏＡ）のシグナ
ルペプチドと正常ヒト血清アルブミンＡが融合したタン
パク賞をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＵｃ−ｐ
ｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａを次の様にして作製した。
ヒト肝ｃＤＮＡライブラリィ−から得たＨ３ＡｃＤＮＡ
を含むクローンλｇｔｌｌ （ＩＳＡ−ＩＩ）からＥｃ
ｏＲＩとＸｂａ■消化によって生ずるフラグメントを調
製し、これをｐｕｃ １９プラスミドのＥｃｏＲＩとＸ
ｂａ Ｉとの二重消化物のうち大きな方のフラグメント
と↑４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ組換えプラス
ミドｐＵｃ１１ｓＡ−ＥＸを構築シタ。
を含むクローンλｇｔｌｌ （ＩＳＡ−ＩＩ）からＥｃ
ｏＲＩとＸｂａ■消化によって生ずるフラグメントを調
製し、これをｐｕｃ １９プラスミドのＥｃｏＲＩとＸ
ｂａ Ｉとの二重消化物のうち大きな方のフラグメント
と↑４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ組換えプラス
ミドｐＵｃ１１ｓＡ−ＥＸを構築シタ。
このプラスミドからＡｈａ ｍと５ａｌｌの二重消化に
より生ずる小さい方のフラグメントを精製した。
より生ずる小さい方のフラグメントを精製した。
このフラグメントは成熟正常ヒト血清アルブミンＡタン
パク質の１２番目のＬｙｓがら３５６番目のＴｈｒまで
をコードする。成熟正常ヒト血清アルブミンＡタンパク
賞をアミノ末端からコードする遺伝子を構築するために
５′端に相当するＤＮＡ配列を、化学合成したフラグメ
ント２本をアニールすることにより作成した。この合成
りＮＡ配列はアルカリ性ホスファターゼのシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ配列と融合できるようにＨｐａ
■及びＣ１ａ Ｉ酵素切断によって生ずる粘着末端配列
ＣＧを５′端側に有し成熟正常ヒト血清アルブミンＡタ
ンパク質の１番目のアミノ酸Ａｓｐから１１番目のアミ
ノ酸Ｐｈｅをコードする配列を有している。このアニー
ルさせたＤＮＡ配列にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを
作用させて５′端をリン酸化させたものと、ｐＵｃ−Ｈ
ＳＡ−ｔＥＸから生じたＡｈａＩＩＩ／５ａｉｌ二重消
化物とを混合し、さらにこれに大腸菌のマルチコピーク
ローニングベクターの代表的なものの一つｐＡＴ １５
３（Ａｍｅｒｓｈａ−社製、ＴＷ１ｇｇ＋Ａ、Ｊ、及び
５ｈｅｒｒａｔｔ、Ｄ、Ｎａｔｕｒｅ ＲＩＬ＋２１６
−２１８ｓ１９８０）のＣ１ａ Ｉ ／ Ｓａｌ Ｉの
立垂消化物のう・ち大きなフラグメントと混合し、この
３者をＴ４０ＮＡリガーゼにより結合させ、組換えプラ
スミドｐＡＴ−ＩＳＡ−ＣＸを得た。このプラスミド上
゛で正泗ヒト血清アルブミンＡの１位のアミノ酸Ａｓｐ
から１１位のアミノ酸ＰｈｅをコードするＤＮＡ配列が
つながった。
パク質の１２番目のＬｙｓがら３５６番目のＴｈｒまで
をコードする。成熟正常ヒト血清アルブミンＡタンパク
賞をアミノ末端からコードする遺伝子を構築するために
５′端に相当するＤＮＡ配列を、化学合成したフラグメ
ント２本をアニールすることにより作成した。この合成
りＮＡ配列はアルカリ性ホスファターゼのシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ配列と融合できるようにＨｐａ
■及びＣ１ａ Ｉ酵素切断によって生ずる粘着末端配列
ＣＧを５′端側に有し成熟正常ヒト血清アルブミンＡタ
ンパク質の１番目のアミノ酸Ａｓｐから１１番目のアミ
ノ酸Ｐｈｅをコードする配列を有している。このアニー
ルさせたＤＮＡ配列にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを
作用させて５′端をリン酸化させたものと、ｐＵｃ−Ｈ
ＳＡ−ｔＥＸから生じたＡｈａＩＩＩ／５ａｉｌ二重消
化物とを混合し、さらにこれに大腸菌のマルチコピーク
ローニングベクターの代表的なものの一つｐＡＴ １５
３（Ａｍｅｒｓｈａ−社製、ＴＷ１ｇｇ＋Ａ、Ｊ、及び
５ｈｅｒｒａｔｔ、Ｄ、Ｎａｔｕｒｅ ＲＩＬ＋２１６
−２１８ｓ１９８０）のＣ１ａ Ｉ ／ Ｓａｌ Ｉの
立垂消化物のう・ち大きなフラグメントと混合し、この
３者をＴ４０ＮＡリガーゼにより結合させ、組換えプラ
スミドｐＡＴ−ＩＳＡ−ＣＸを得た。このプラスミド上
゛で正泗ヒト血清アルブミンＡの１位のアミノ酸Ａｓｐ
から１１位のアミノ酸ＰｈｅをコードするＤＮＡ配列が
つながった。
ｐＡＴ−ＨＳＡ−ＣＸをＥｃｏＲＩ ／ Ｘｂａ Ｉで
二重消化し、正常ヒト血清アルブミンＡのＡｓｐｌ〜Ｐ
ｈｅ３５６をコードするＤＮＡ配列を含む小さい方のフ
ラグメントを得た。
二重消化し、正常ヒト血清アルブミンＡのＡｓｐｌ〜Ｐ
ｈｅ３５６をコードするＤＮＡ配列を含む小さい方のフ
ラグメントを得た。
一方Ｈ３Ａ−＾のカルボキシル末端側をコードするｃＯ
ＮＡは、ヒト肝ｃＤＮＡライブラリィ−から得たクロー
ンλｇｔｌｌ（ＨＳＡ Ｉ −Ａ））から外来ｃＤＮＡ
配列の挿入されているＥ！ｃｏＲｒフラグメントを調製
し、ｐ［Ｉｃ １８プラスミドの１！ｃｏＲＩサイトに
挿入することにより組換えプラスミドｐＵｃ−ＩＳＡ−
１中にクローニングした。
ＮＡは、ヒト肝ｃＤＮＡライブラリィ−から得たクロー
ンλｇｔｌｌ（ＨＳＡ Ｉ −Ａ））から外来ｃＤＮＡ
配列の挿入されているＥ！ｃｏＲｒフラグメントを調製
し、ｐ［Ｉｃ １８プラスミドの１！ｃｏＲＩサイトに
挿入することにより組換えプラスミドｐＵｃ−ＩＳＡ−
１中にクローニングした。
これによりＨＳＡ−Ａの３５８番目のアミノ酸Ｌｅｕか
らカルボキシル末端の５８５番目のＬｅｕをコードし、
さらに３′側の非翻訳領域６２不クレオチドを含むＸｂ
ａ Ｉ ／ Ｈｉｎｄ ｍの二重消化物を調製した。こ
れをｐＡＴ−ＩＳＡ−ＣＸより得たＥｃｏＲ１／ Ｘｂ
ａ に二重消化物及びｐｕｃ １ＢのＥｃｏＲＩ ／旧
ｎｄｌｌ二重消化物のうち大きなフラグメントと混ぜて
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより連結反応を行い、成熟正常
ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡ全体を含む組換えプラ
スミドｐＨｃ−ＩＳＡ−ＣＨを得た。
らカルボキシル末端の５８５番目のＬｅｕをコードし、
さらに３′側の非翻訳領域６２不クレオチドを含むＸｂ
ａ Ｉ ／ Ｈｉｎｄ ｍの二重消化物を調製した。こ
れをｐＡＴ−ＩＳＡ−ＣＸより得たＥｃｏＲ１／ Ｘｂ
ａ に二重消化物及びｐｕｃ １ＢのＥｃｏＲＩ ／旧
ｎｄｌｌ二重消化物のうち大きなフラグメントと混ぜて
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより連結反応を行い、成熟正常
ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡ全体を含む組換えプラ
スミドｐＨｃ−ＩＳＡ−ＣＨを得た。
成熟正常ヒト血清アルブミンへの全アミノ酸配列をコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を
第８−１図〜第８−３図に示す。
ドするｃＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を
第８−１図〜第８−３図に示す。
成熟正常ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡｔ−ｐｈｏＡ
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と連結するた
めに、ｐＵｃ−１（ＳＡ−ＣＩをＥｃｏＲＩ ／ Ｃ１
ａ Ｉで切断し、生ずる大きい方のフラグメントを得て
、これとｐＵｃ−ｐｈｏＡをＥｃｏＲＩ ／ Ｍｓｐ
Ｉ （Ｈｐａ Ｉｆと同じ認識配列を切断する）の二重
消化により得られる小さい方のフラグメントとＴ４ Ｄ
Ｎ＾リガーゼを用いて連結させた。これにより構築され
たプラスミドｐＵｃ−ｐｈｏＡＨ３Ａ−＾は、２１アミ
ノ酸から成るｐｈｏＡシグナルペプチドが融合した成熟
正常ヒト血清アルブミンＡタンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列を含み、大腸菌８８１０１株に常法により形質転
換法で導入されクローン化された。
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と連結するた
めに、ｐＵｃ−１（ＳＡ−ＣＩをＥｃｏＲＩ ／ Ｃ１
ａ Ｉで切断し、生ずる大きい方のフラグメントを得て
、これとｐＵｃ−ｐｈｏＡをＥｃｏＲＩ ／ Ｍｓｐ
Ｉ （Ｈｐａ Ｉｆと同じ認識配列を切断する）の二重
消化により得られる小さい方のフラグメントとＴ４ Ｄ
Ｎ＾リガーゼを用いて連結させた。これにより構築され
たプラスミドｐＵｃ−ｐｈｏＡＨ３Ａ−＾は、２１アミ
ノ酸から成るｐｈｏＡシグナルペプチドが融合した成熟
正常ヒト血清アルブミンＡタンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列を含み、大腸菌８８１０１株に常法により形質転
換法で導入されクローン化された。
皇Ａ」１エ −スＺ ＡＴ−ｔｒ−ｈｏＡ−ＩＳ
Ａ−Ａの正常ヒト血清アルブミンＡの発現プラスミドｐ
ＡＴ−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａを次の様にして造成した。
Ａ−Ａの正常ヒト血清アルブミンＡの発現プラスミドｐ
ＡＴ−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａを次の様にして造成した。
ｔｒｐプロモーターとｔｒｐＬのＳＤ配列を有するベク
ターを用いてｐｈｏＡ−ＨＳＡ−ＡｃＤＮＡの発現用ベ
クターを作製した。このようなベクターとしては例えば
ｐｈ−ＴＮＦ（Ｉｋｅｈａｒａら、ＣｈｅｔＰｈａｒｍ
、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ印刷中）がある、これはｐＢＲ３２
２ベクターにｔｒｐプロモーターとｔｒｐＬのＳＤ配列
が導入されているものである。
ターを用いてｐｈｏＡ−ＨＳＡ−ＡｃＤＮＡの発現用ベ
クターを作製した。このようなベクターとしては例えば
ｐｈ−ＴＮＦ（Ｉｋｅｈａｒａら、ＣｈｅｔＰｈａｒｍ
、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ印刷中）がある、これはｐＢＲ３２
２ベクターにｔｒｐプロモーターとｔｒｐＬのＳＤ配列
が導入されているものである。
組換えプラスミドのコピー数を高め遺伝子量効果を期待
する場合にはｐＢＲ３２２の複製阻害配列を除去して作
成したｐＡＴ１５３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｗｉｇｇ、
Ａ、Ｊ、ａｎｄＳｈｅｒｒａｔｔ、Ｄ、Ｎａｔｕｒｅ
２Ｂ３．２１６−２１８（１９８０））を基本とした組
換えプラスミドを利用するとよい。例えばｐｈ −ＴＮ
Ｆ上のｔｒｐプロモーター／１ｒｐＬＳＤ配列を含むＰ
ｓｔＩ ／ Ｃ１ａ Ｉの二重消化物をｐＡＴ１５３の
同じ酵素の組合せによる二重消化により生じた大きな方
のフラグメントと融合すればこの目的は達成される。こ
うして作成されたｐＡＴ−ｔｒｐベクターをＳＤ配列の
下流に１ケ所あるＣ１ａｌ認識部位で切断し、生じた粘
着末端の一本鎖部分を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１を作
用させて埋めてできた直鎖状ＤＮＡを５ａｉｌで消化し
た。ここで得られる大きい方のフラグメントをｐｈｏＡ
−ＨＳ＾−ＡｃＤＮＡとの接続に用いた。
する場合にはｐＢＲ３２２の複製阻害配列を除去して作
成したｐＡＴ１５３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｗｉｇｇ、
Ａ、Ｊ、ａｎｄＳｈｅｒｒａｔｔ、Ｄ、Ｎａｔｕｒｅ
２Ｂ３．２１６−２１８（１９８０））を基本とした組
換えプラスミドを利用するとよい。例えばｐｈ −ＴＮ
Ｆ上のｔｒｐプロモーター／１ｒｐＬＳＤ配列を含むＰ
ｓｔＩ ／ Ｃ１ａ Ｉの二重消化物をｐＡＴ１５３の
同じ酵素の組合せによる二重消化により生じた大きな方
のフラグメントと融合すればこの目的は達成される。こ
うして作成されたｐＡＴ−ｔｒｐベクターをＳＤ配列の
下流に１ケ所あるＣ１ａｌ認識部位で切断し、生じた粘
着末端の一本鎖部分を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１を作
用させて埋めてできた直鎖状ＤＮＡを５ａｉｌで消化し
た。ここで得られる大きい方のフラグメントをｐｈｏＡ
−ＨＳ＾−ＡｃＤＮＡとの接続に用いた。
一方ｐＵｃ−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−ＡをＥｃｏＲＩ ／Ｈ
ｉｎｄｌｎで二重消化することにより生じた小さい方の
フラグメント（ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−＾ｃＤＮ＾配列を含
む）をｐＡＴ１５３のｔｉｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌｎの二
重消化物のうち大きい方のフラグメントと結合し組換え
プラスミドｐＡＴ−ｐｈｏ＾−Ｈ５Ａを得た。これをＥ
ｃｏＲＩで消化して直鎖状ＤＮＡとした後大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩを作用させて末端の一本鎖部分を埋めた
後、Ｓａｌ １で切断し、小さい方のフラグメントをｐ
ｈｏＡ−ＩＳＡ−Ａ ｃＤＮＡを含む部分として回収し
た。このフラグメントを前述のｐＡＴ−ｔｒｐベクター
由来のフラグメントと連結し組換えプラスミドｐＡＴ−
ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−＾を得た。
ｉｎｄｌｎで二重消化することにより生じた小さい方の
フラグメント（ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−＾ｃＤＮ＾配列を含
む）をｐＡＴ１５３のｔｉｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌｎの二
重消化物のうち大きい方のフラグメントと結合し組換え
プラスミドｐＡＴ−ｐｈｏ＾−Ｈ５Ａを得た。これをＥ
ｃｏＲＩで消化して直鎖状ＤＮＡとした後大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩを作用させて末端の一本鎖部分を埋めた
後、Ｓａｌ １で切断し、小さい方のフラグメントをｐ
ｈｏＡ−ＩＳＡ−Ａ ｃＤＮＡを含む部分として回収し
た。このフラグメントを前述のｐＡＴ−ｔｒｐベクター
由来のフラグメントと連結し組換えプラスミドｐＡＴ−
ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−＾を得た。
この組換えプラスミドを大腸菌８８１０１株及び０６０
０株に導入し、形質転換株Ｅ、 ｃｏｌｉ ）ＩＢＩ
ＯＩ（ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＩＳＡ−Ａ）及びＣ
６００（ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−Ｏ３＾−Ａ）を得
た。
０株に導入し、形質転換株Ｅ、 ｃｏｌｉ ）ＩＢＩ
ＯＩ（ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ＩＳＡ−Ａ）及びＣ
６００（ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−Ｏ３＾−Ａ）を得
た。
この発明の正常ヒト血清アルブミンＡをコードするｃＤ
ＮＡを含有する組換プラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏ
Ａ−ＩＳＡ−Ａを含有する大腸菌Ｃ６００（ｐＡＴ−ｔ
ｒｐ−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａ）は工業技術院微生物工業
技術研究所に、微工研菌寄第９８７４号（ＦＥＲＭ Ｐ
−９８７４）として寄託された。
ＮＡを含有する組換プラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏ
Ａ−ＩＳＡ−Ａを含有する大腸菌Ｃ６００（ｐＡＴ−ｔ
ｒｐ−ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａ）は工業技術院微生物工業
技術研究所に、微工研菌寄第９８７４号（ＦＥＲＭ Ｐ
−９８７４）として寄託された。
第１図は、本発明のヒト血清アルブミン断片をコードす
るＤＮＡの内ｎｅｔ（１２３）からＡｌａ （１５１）
をコードする合成りＮＡの塩基配列及び対応するアミノ
酸配列を示す。 第２図は、ｃＤＮＡクローンλｇｔｌｌ （ＩＳＡ−１
）からプラスミドｐＵＣ−ＩＳＡ−１及びｐＳＡＬ Ｉ
Ｉの作成過程を示す。 第３図は、本発明の発現プラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐ
ｈｏＡ−５ＡＬ ＩＩの作製過程を示す。 第４図は、プラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏ＾−５Ａ
Ｌ Ｉｔからの発現生成物の電気泳動図であって、抗ヒ
ト血清アルブミン抗体と反応した蛋白質を示す。 第５図は、ｃＤＮＡのスクリーニングに使用した３種類
のプローブの塩基配列を示す。 第６図は、この発明のプラスミドの出発材料としての正
常ヒト血清アルブミンＡの全体をコードするｃＤＮＡ（
ＨＳＡｃＤＮＡ） 、並びにこのｃＤＮＡの造成に使用
された、３′末端側をコードするｃＤＮ＾（ＩＳＡ−Ｉ
Ａ）及び５′末端側をコードするｃＤＮＡ （）ＩＳＡ
−ＩＩ ）の制限酵素地図を示す。 第７−１図〜第７−２図は、この発明のプラスミドを作
製するための種々の中間体プラスミドの作製過程を示す
。 第８−１図〜第８−３図は、この発明の正常ヒト血清ア
ルブミンＡの全体をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示
す。図中、アミノ酸１５２からアミノ酸３０３までの〔
〕内の配列は本発明のヒト血清アルブミン蛋白質断片の
Ｃ−末端側のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配
列を示す。 第９図はプラスミドｐＵｃ−ｐｈｏＡ−ｍＨ３Ａ及びｐ
ＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｍＨ５Ａの作製の過程を示す
。 第１０図はプラスミドｐｕｃ−ｔｎｓＡ及びｐＡＴ−ｔ
ｒｐ−ｔＨｓＡの作製の過程を示す。 第１１図はプラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｔＨ
ｓＡの作製の過程を示す。 第１２図は、プラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｓ
＋Ｈ３Ａ （レーン４ ） 、ＰＡＴ−ｔｒｐ−ｔＨｓ
Ａ （レーン２）、及びｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｔ
ＨｓＡ （レーン３）からの発現生成物の５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動図であり、クマシーブリ
リアントプルーにより蛋白質バンドを染色しである。レ
ーン１はサイズマーカーで、ホスホリラーゼＢ（分子量
９４，０００） 、ウシ血清アルブミン（分子量６７．
０００） 、オバルプミン（分子量４３．０００） 、
炭酸脱水素酵素（分子量３０，０００）、大豆トリプシ
ンインヒビター（分子１２０，０００）、及びラクトア
ルブミン（分子１１４，４００）である。 矢印が各々の発現生成物に相当する。 第１３図はｐＡＴ−ｔｒｐ−ｍＨ３Ａ （レーンｌ ）
、ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｔＨｓＡ （レーン３ ） ｐＡ
Ｔ−ｔｒｐ−ｐｈｏ＾−ｔｏｓＡ（レーン２）からの発
現生成物のウェスターンプロット図であり、抗−ヒト血
清アルブミン抗体と反応した蛋白質を示す。 １”’Ｆｌ’！ １ＪｋＡ １１ｋ 甲Ａｎ
ｔ’＝’ｒｃ 〒ＡＣ（：Ｊｕ Ａ〒ＣＧＣＴ ＣＧＴ
ＣＧＴ ＣＡＣＬａｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｌ
ｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒ
ｑ ｔｕｓ第１図 Ｈ５Ａ−１ ５’−ＡＡＧＧＧＡＡＡＴＡＡＡＧＧＴＴＡＣＣＣＡＣ
ＴＴＣＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡＡＧＧＣ−ゴ）−ＩＳＡ−
２ ５’−ＡＡＧＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡ
ＣＡＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣ−３’Ｇｌｙ２４
８〜Ｌｅｕ２６０に相当する領域５Ａ−３ ５’−ＴＡＧＡＴＧＴＴＡＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＣＡ
ＧＣＴＴＧＡＣＴＴＧＣＡＧＣＡＡＣ−３’甘る領域 １ｊＡＡ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＬＵＴ Ｔに（
ｉ ＴＵＴ （Ｘ；Ｌ： ＡＡＡ にＡＧ
ＡＧＡ ＣＴＣＡＡＧ ＴＧＴＬｙｓ Ｇｌｕ Ｃ
ｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ ＣｙｓＡＡＧ
ＧＡＡ ＴＧＣＴＧＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＣＣＴ ＣＴ
Ｇ ＴＴＧ ＧＭ ＡＡＡ ＴＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＡ
ＡＡＴ ＴＧＴ ＧＡ（ｊ ｌ−；’ｌ’Ｔ
’ｌ”ｌ”工゛ ＬｙＡ（ｘ ｕＡ（ａ ｕ’
ｉ”ｉ’ ｔａＬ＋Ａ ＩＪＡＬＪ第８−２図 ＧＡＧ ＡＣＣＴＧＣＴＴＴ ＧＬ：Ｌ： ＧＡＧ （
ｉＡ（ｊ （ｊｌｊ”ｌ’ ＡＡＡ ＡＡＡ Ｌ；’ｉ
”ｌ’第８−３図 第１１図
るＤＮＡの内ｎｅｔ（１２３）からＡｌａ （１５１）
をコードする合成りＮＡの塩基配列及び対応するアミノ
酸配列を示す。 第２図は、ｃＤＮＡクローンλｇｔｌｌ （ＩＳＡ−１
）からプラスミドｐＵＣ−ＩＳＡ−１及びｐＳＡＬ Ｉ
Ｉの作成過程を示す。 第３図は、本発明の発現プラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐ
ｈｏＡ−５ＡＬ ＩＩの作製過程を示す。 第４図は、プラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏ＾−５Ａ
Ｌ Ｉｔからの発現生成物の電気泳動図であって、抗ヒ
ト血清アルブミン抗体と反応した蛋白質を示す。 第５図は、ｃＤＮＡのスクリーニングに使用した３種類
のプローブの塩基配列を示す。 第６図は、この発明のプラスミドの出発材料としての正
常ヒト血清アルブミンＡの全体をコードするｃＤＮＡ（
ＨＳＡｃＤＮＡ） 、並びにこのｃＤＮＡの造成に使用
された、３′末端側をコードするｃＤＮ＾（ＩＳＡ−Ｉ
Ａ）及び５′末端側をコードするｃＤＮＡ （）ＩＳＡ
−ＩＩ ）の制限酵素地図を示す。 第７−１図〜第７−２図は、この発明のプラスミドを作
製するための種々の中間体プラスミドの作製過程を示す
。 第８−１図〜第８−３図は、この発明の正常ヒト血清ア
ルブミンＡの全体をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示
す。図中、アミノ酸１５２からアミノ酸３０３までの〔
〕内の配列は本発明のヒト血清アルブミン蛋白質断片の
Ｃ−末端側のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配
列を示す。 第９図はプラスミドｐＵｃ−ｐｈｏＡ−ｍＨ３Ａ及びｐ
ＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｍＨ５Ａの作製の過程を示す
。 第１０図はプラスミドｐｕｃ−ｔｎｓＡ及びｐＡＴ−ｔ
ｒｐ−ｔＨｓＡの作製の過程を示す。 第１１図はプラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｔＨ
ｓＡの作製の過程を示す。 第１２図は、プラスミドｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｓ
＋Ｈ３Ａ （レーン４ ） 、ＰＡＴ−ｔｒｐ−ｔＨｓ
Ａ （レーン２）、及びｐＡＴ−ｔｒｐ−ｐｈｏＡ−ｔ
ＨｓＡ （レーン３）からの発現生成物の５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動図であり、クマシーブリ
リアントプルーにより蛋白質バンドを染色しである。レ
ーン１はサイズマーカーで、ホスホリラーゼＢ（分子量
９４，０００） 、ウシ血清アルブミン（分子量６７．
０００） 、オバルプミン（分子量４３．０００） 、
炭酸脱水素酵素（分子量３０，０００）、大豆トリプシ
ンインヒビター（分子１２０，０００）、及びラクトア
ルブミン（分子１１４，４００）である。 矢印が各々の発現生成物に相当する。 第１３図はｐＡＴ−ｔｒｐ−ｍＨ３Ａ （レーンｌ ）
、ｐＡＴ−ｔｒｐ−ｔＨｓＡ （レーン３ ） ｐＡ
Ｔ−ｔｒｐ−ｐｈｏ＾−ｔｏｓＡ（レーン２）からの発
現生成物のウェスターンプロット図であり、抗−ヒト血
清アルブミン抗体と反応した蛋白質を示す。 １”’Ｆｌ’！ １ＪｋＡ １１ｋ 甲Ａｎ
ｔ’＝’ｒｃ 〒ＡＣ（：Ｊｕ Ａ〒ＣＧＣＴ ＣＧＴ
ＣＧＴ ＣＡＣＬａｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｌ
ｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒ
ｑ ｔｕｓ第１図 Ｈ５Ａ−１ ５’−ＡＡＧＧＧＡＡＡＴＡＡＡＧＧＴＴＡＣＣＣＡＣ
ＴＴＣＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡＡＧＧＣ−ゴ）−ＩＳＡ−
２ ５’−ＡＡＧＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡ
ＣＡＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣ−３’Ｇｌｙ２４
８〜Ｌｅｕ２６０に相当する領域５Ａ−３ ５’−ＴＡＧＡＴＧＴＴＡＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＣＡ
ＧＣＴＴＧＡＣＴＴＧＣＡＧＣＡＡＣ−３’甘る領域 １ｊＡＡ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＬＵＴ Ｔに（
ｉ ＴＵＴ （Ｘ；Ｌ： ＡＡＡ にＡＧ
ＡＧＡ ＣＴＣＡＡＧ ＴＧＴＬｙｓ Ｇｌｕ Ｃ
ｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ ＣｙｓＡＡＧ
ＧＡＡ ＴＧＣＴＧＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＣＣＴ ＣＴ
Ｇ ＴＴＧ ＧＭ ＡＡＡ ＴＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＡ
ＡＡＴ ＴＧＴ ＧＡ（ｊ ｌ−；’ｌ’Ｔ
’ｌ”ｌ”工゛ ＬｙＡ（ｘ ｕＡ（ａ ｕ’
ｉ”ｉ’ ｔａＬ＋Ａ ＩＪＡＬＪ第８−２図 ＧＡＧ ＡＣＣＴＧＣＴＴＴ ＧＬ：Ｌ： ＧＡＧ （
ｉＡ（ｊ （ｊｌｊ”ｌ’ ＡＡＡ ＡＡＡ Ｌ；’ｉ
”ｌ’第８−３図 第１１図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒト血清アルブミンの中央部分からなるヒト血清ア
ルブミン蛋白質断片。 ２、ヒト血清アルブミンの１２３位のメチオニンから３
０３位のプロリンまでのアミノ酸配列を有する請求項１
に記載の断片。 ３、ヒト血清アルブミンの中央部と他のポリペプチドと
から成る融合蛋白質。 ４、大腸菌アルカリ性ホスファターゼのシグナルペプチ
ドと、ヒト血清アルブミンの１２３位のメチオニンから
３０３位のプロリンまでのアミノ酸配列を有するポリペ
プチドとから成る請求項３に記載の融合蛋白質。 ５、ヒト血清アルブミンのＣ末端部分が欠失したヒト血
清アルブミン断片。 ６、ヒト血清アルブミンの１位のアスパラギン酸から３
０３位のプロリンまでのアミノ酸配列を有する請求項５
に記載の断片。 ７、ヒト血清アルブミンのＣ末端部分の欠失したヒト血
清アルブミン断片と他のポリペプチドとから成る融合蛋
白質。 ８、大腸菌アルカリ性ホスファターゼのシグナルペプチ
ドと、ヒト血清アルブミンの１位のアスパラギン酸から
３０３位のプロリンまでのアミノ酸配列とから成る請求
項７に記載の融合蛋白質。 ９、ヒト血清アルブミンのＮ−末端部分が欠失したヒト
血清アルブミン断片。 １０、ヒト血清アルブミンの１２３位のメチオニンから
５８５位のロイシンまでのアミノ酸配列を有する請求項
９に記載のヒト血清アルブミン断片。 １１、ヒト血清アルブミンのＮ−末端部分が欠失したヒ
ト血清アルブミン断片と他のポリペプチドとから成る融
合蛋白質。 １２、大腸菌アルカリ性ホスファターゼのシグナルペプ
チドとヒト血清アルブミンの１２３位のメチオニンから
５８５位のロイシンまでのアミノ酸配列とから成る請求
項１１に記載の融合蛋白質。 １３、請求項１、５もしくは９に記載の蛋白質断片又は
請求項３、７もしくは１１に記載の融合蛋白質をコード
するＤＮＡ配列。 １４、請求項１３に記載のＤＮＡ配列を含有するプラス
ミド。 １５、前記ＤＮＡ配列の上流に、該ＤＮＡ配列を宿主内
で効率よく発現せしめるための制御配列を含有する発現
プラスミドである、請求項１４に記載のプラスミド。 １６、請求項１４に記載のプラスミドにより形質転換さ
れた宿主。 １７、請求項１６に記載の宿主を培養してヒト血清アル
ブミン蛋白質断片又は該断片を含む融合蛋白質を発現せ
しめ、融合蛋白質を発現せしめた場合には所望により該
融合蛋白質から該ヒト血清アルブミン蛋白質断片を切り
出すことを特徴とする、ヒト血清アルブミン蛋白質断片
又は該断片を含有する融合蛋白質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1217540A JPH02227079A (ja) | 1988-10-06 | 1989-08-25 | ヒト血清アルブミン断片 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63-250926 | 1988-10-06 | ||
| JP25092688 | 1988-10-06 | ||
| JP1217540A JPH02227079A (ja) | 1988-10-06 | 1989-08-25 | ヒト血清アルブミン断片 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02227079A true JPH02227079A (ja) | 1990-09-10 |
Family
ID=26522076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1217540A Pending JPH02227079A (ja) | 1988-10-06 | 1989-08-25 | ヒト血清アルブミン断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02227079A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6905688B2 (en) | 2000-04-12 | 2005-06-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US6946134B1 (en) | 2000-04-12 | 2005-09-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US7045318B2 (en) | 1995-12-30 | 2006-05-16 | Delta Biotechnology Limited | Recombinant fusion proteins to growth hormone and serum albumin |
| US8993517B2 (en) | 2001-12-21 | 2015-03-31 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
-
1989
- 1989-08-25 JP JP1217540A patent/JPH02227079A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7045318B2 (en) | 1995-12-30 | 2006-05-16 | Delta Biotechnology Limited | Recombinant fusion proteins to growth hormone and serum albumin |
| US8642542B2 (en) | 1995-12-30 | 2014-02-04 | Novozymes Biopharma Dk A/S | Recombinant fusion proteins to growth hormone and serum albumin |
| US6905688B2 (en) | 2000-04-12 | 2005-06-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US6926898B2 (en) | 2000-04-12 | 2005-08-09 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US6946134B1 (en) | 2000-04-12 | 2005-09-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US6994857B2 (en) | 2000-04-12 | 2006-02-07 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US8993517B2 (en) | 2001-12-21 | 2015-03-31 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US9221896B2 (en) | 2001-12-21 | 2015-12-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US9296809B2 (en) | 2001-12-21 | 2016-03-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
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